JPS6022914B2 - ３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は３Ｑ−ヒドロキシステロィド・デヒドロ ゲ
ナ ー ゼ（ ３ Ｑ −ｈｙｄｍｘ侭にｒｏｉｄ 、
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅＭｓｅ，ＥＣＩ．１．５．５０：以
下３Ｑ一日ＳＤと略称する）の製造法に関する。

さらに詳しくは本発明はシュードモナス属、バチルス属
またはコリネバクテリウム属に属し、３は一日ＳＤを生
産する能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養液
および／または菌体中に３Ｑ−ＨＳＤを蓄積せしめ、該
培養液および／または菌体から蓄積した該酵素を採取す
ることを特徴とする３Ｑ一日ＳＤの製造法に関する。そ
の目的とするところは、生体内の胆汁酸の定量に用いら
れる３Ｑ一日ＳＤを工業的安価に製造する方法を提供す
るにある。従来、３Ｑ−ＨＳＤはラットの肝臓、腎臓、
塁丸、ィヌやウサギの肝臓などから得られる動物起源の
ものと、シュードモナス・テストステロニに属する微生
物からの微生物起源のもの（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２１８，６６１，１９５６）が知られている。動物起
源のものは供給源が限られていて高価であり工業的に利
用できない。微生物起源からの３Ｑ−ＨＳＤの製造は、
微生物の培養物中に３Ｑ−ＨＳＤの他に胆汁酸などの３
Ｑ−ヒドロキシステロィドを特異的に定量することを妨
げる３８，１７８−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲ
ナーゼ（３８，１７ ６ ‐ ｈｙｄｒｏ奴ｓにｒｏｉ
ｄ ｄｅｈｙｄｒｏ袋ｎａｓｅ ，ＥＣＩ．１．１．５
１：以下３８，１７８一ＨＳＤと略称する）が併産され
る。該併産された３８，１７８一ＨＳＤを分離除去して
３Ｑ−ＨＳＤを得るためには煩雑な精製の操作が必要で
あり、微生物起源の場合も３Ｑ一日ＳＤを工業的安価に
製造することができない。本発明者らは、３Ｑ一日ＳＤ
の製造する方法について研究した結果、シュードモナス
属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微
生物の中に３８，１７８−ＨＳＤを餅産しないで３Ｑ−
ＨＳＤを生産する微生物を見出し、これらの微生物を用
いれば３Ｑ一日ＳＤを工業的安価に製造できることを見
出し本発明を完成するに到った。

以下本発明方法を詳細に説明する。本発明方法によれば
シュードモナス属、バチルス属またはコリネバクテリウ
ム属に属し、３Ｑ−ＨＳＤを生産する能力を有する微生
物を適当な炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養
素を含む栄養培地に培養すれば、培養液および／または
菌体中に３Ｑ一日ＳＤが生成蓄積してくるので、これを
採取する。

本発明に用いる微生物はシュードモナス属、バチルス属
またはコリネバクテリウム属に属し、３Ｑ−ＨＳＤを生
産する能力を有する菌株であれば、いかなる菌体も使用
できる。

具体的に好適な菌株の一例としては次のごときものがあ
げられる。１ シユードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）ＫＹ４６６７，ＮＲＲＬＢ−
１１０６４２ シユードモナス・プチダＫＹ３９６３
，ＡＴＣＣ４３５９，ＮＲＲＬ Ｂ−１１０６５３シユ
ードモナス・テトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ねｅｔｒｏｌｅ船 ） ＫＹ３９８５ ，ＡＴＣＣ４
６８３，ＮＲＲＬ Ｂ−１４４ バチルス・サーキユラ
ンス（Ｂａｄｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＹ３３２
４，ＡＴＣＣ４５１３，ＮＲＲＬＢ−１１０６６５
バチルス・スフエリカス（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｐｈａｅ
ｒｉＣ船）ＫＹ３３８０，ＡＴＣＣＩ０２０８，ＮＲＲ
ＬＢ−１１０６７６ コリネバクテリウム・ハイドロカ
ーボクラスタス（Ｃｏｎｎｅｂａｃ笹ｒ肌ｍ ｈｙｄｒ
ｏｃａｒｂｏｃｌａｓ山ｓ）ＫＹ４３１８，ＡＴＣＣＩ
５１１０，ＮＲＲＬ Ｂ−１１０６８７ コリネバクテ
リウム・アセトグルタミクム（Ｃｏびｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｕねｍｉｃ山ｍ ）ＫＹ３５
１３，ＡＴＣＣＩ５８０６，ＮＲＲＬＢ−１１０６９菌
株１および２は工業技術院微生物研究所にも寄託されて
おり、その菌寄番号はそれぞれ３８７９，３８７８であ
る。

これら微生物の菌学的性質は次の文献に記載がある。

シユードモナス・プチダ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕ
ａｌｏｆＤｅｔｅｎｎｉｎａｔｉｖｅ 舷ｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ（以下パージ一と略称する）第８版２２２頁シ
ュードモナス・テト。

レンス バージー第７版１０８頁バチルス・サーキュラ
ンス バージ一第８版５３９頁バチルス・スフェリカス
バージー第８版５４２一５４３頁 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス ＵＳ
Ｐ３ ２２２，２５８コリネバクテリウム・アセトグル
タミクムＵＳＰ３，３３５，０６５ 本発明に用いる栄養培地は炭素源、窒素源、無機物およ
びその他の栄養素を適度に含む培地であれば天然培地、
合成培地のいずれも使用することができる。

本発明に用いる炭素源としては、グルコース、フラクト
ース、シユクロース、マルトース、マンノース、でんぷ
ん、でんぷん加水分解物、糖蜜など種々の炭水化物、グ
リセロール、ソルビトール、マンニトールなど種々の糠
アルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、フマール酸、ク
エン酸などの種々の有機酸、メタノール、エタノールな
ど種々のアルコール、エチレングリコール、プロピレン
グリコールなど種々のグリコール、各種アミノ酸、ｎ−
へキサデカンなど種々の炭化水素があげられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、炭酸
アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなど各種無機および有機アンモニウム
塩、尿素、アミノ酸、その他の窒素化合物、ベプトソ、
ＮＺーアミン、肉エキス、コーン・スチーブ・リカー、
カゼイン加水分解物、フィッシュミールなど各種窒素性
有機物質などがあげられる。

無機物としては、燐酸第１カリウム、燐酸第２カリウム
、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫
酸第１鉄、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどがあげ
られる。

本発明方法においては、コール酸 （Ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、ケノデオキシコール酸（Ｃ
ｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、デオキシ
コール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、リトコ
ール酸（１他ｏｃｈｏｌｉＣａｃｉｄ）、グリココール
酸（ｇｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、夕ゥロコール酸
（ねｕｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、５Ｑーアンドロス
タンー３ｏ、１７８ージオール（５ｏ−ａｎｄｒｏｓｔ
ａｎｅ一３Ｑ、１７８−ｄｉｏｌ）、アンドロステロン
（ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ）などの３Ｑ−ヒドロキシ
ステロィド類、あるいはこれらを含む動物臓器抽出物な
どを培地中に添加すれば３Ｑ−ＨＳＤが誘導され箸量の
３Ｑ−ＨＳＤを生成せしめることができる。

これらの酵素誘導物質は０．０５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）
の範囲で、好ましくは０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の範
囲で培地に存在せしめるとよい。

培養は好気的条件下、通常１５〜４０℃の範囲で、好適
には２８〜３３午○で行われる。

培養時のｐＨは通常６．０〜９．０の範囲で、好適には
６．５〜８．５の範囲で行われる。かくして１４〜３餌
時間培養すれば培養液および／または菌体中に３Ｑ一日
ＳＤが箸量に生成する。培養液および／または菌体中の
３Ｑ一日ＳＤは次のごとき方法で精製して得られる。

培養終了後の培養物を遠心分離して培養液と菌体に分け
る。

菌体は超音波破砕、磨砕、機械的圧縮、自己消化など公
知の方法で破砕して菌体抽出物とする。

菌体抽出物および培養液からの３Ｑ−ＨＳＤの抽出は次
のごとく行う。菌体抽出物および培養液に硫酸アンモニ
ウム、Ｅ硝などの塩、あるいはアセトン、メタノール、
エタノールなどの溶剤を加え沈殿物を得る。硫酸アンモ
ニウムを使用する場合は３０％飽和で溶け、５０％飽和
で沈殿する部分を採取する。アセトンを使用する場合は
６０％（Ｖ／Ｖ）で沈殿する部分を採取する。傾斜ある
いは炉過によって沈殿物を得、この沈殿物を透析あるい
はゲル炉過の処理を行うことによって、沈殿物に含まれ
る塩類や溶剤を除去する。

透析操作において用いる透析膜はセロフアン紙、腰肋膜
、コロジオン膜などがあげられる。透析液としては０．
１ｍＭメルカプトェタノール（ｍｅｒｃａｐｂｅｔｈａ
血１）を含む１０あるいは３仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐ
Ｈ７．０）を用いるのがよい。ゲル炉週の燥作において
は０．１ｍＭメルカプトェタノールを含む１０あるいは
３仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）で緩衝化したセ
フアデックスＧ−７５あるいはＧ−１００を用いるとよ
い。かくして得られる酵素液から本酵素を精製して得る
には次に述べるごときＤＥＡＥーセルロースカラムクロ
マトグラフイーを行えばよい。

酵素液を０．１ｍＭメルカプトェタノールを含む３肌Ｍ
燐酸バッファー（ＰＨ７．０）で平衡化しておし、たＤ
ＥＡＥ−セルロースのカラムに通塔する。

上記燐酸バッファーをさらに通塔すれば不純蛋白質が流
出してくる。次に０．１ｍＭメルカプトェタノールを含
む２０仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）を流す。溶
出液を一定量ずつ分画し、画分中に含まれる３Ｑ−ＨＳ
Ｄの活性を後に述べる方法で測定し、活性のある画分を
見出す。活性画分を集めて硫酸アンモニウムを加え、５
０％飽和で沈殿してくる沈殿を遠心分離して得る。かく
して得られる沈殿はかなり精製された３Ｑ−ＨＳＤであ
るが、セフアデツクスＧ−７５あるいはセフアデツクス
Ｇ−１００を用いるゲル炉過法でさらに精製することが
できる。たとえば上記沈殿０．１ｍＭメルカプトェタノ
ールを含む３仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）で溶
解し、同燐酸バッファーで平衡化しておいたセフアデッ
クスＧ−１００のカラムに通塔する。同燐酸バッファー
を流し、溶出液を一定量ずつ分画する。

画分中の３Ｑ−ＨＳＤの活性を後に述べる方法で測定し
、活性のある画分を見出す。活性の高い画分を集め、グ
リセロールを最終濃度１％（Ｖ／Ｖ）になるように添加
して凍結乾燥する。かくして３Ｑ−ＨＳＤの精製酵素粉
末を得ることができる。３Ｑ一日ＳＤの酵素活性はｌｍ
Ｍコール酸ナトリウム０．５の‘、１仇ｈＭＮＡＤＩ．
０のと、１０仇ｈＭホウ酸バッファー（ｐＨＩＯ．０）
１．０肌‘および酵素液０．５の‘からなる反応系（３
７０）で最初の１分間の３４仇ｍにおける吸光値の増加
量を読み、吸光値１．００を増加せしめる力価を１単位
と表示する。

３８，１７８一ＨＳＤの酵素活性は上記３Ｑ−ＨＳＤの
場合のコール酸ナトリウムに替えてデヒドロキシーェピ
ーアンドロステロソを用いる以外はすべて３Ｑ一日ＳＤ
の場合と同じ測定および単位表示をする。

酵素蛋白質の定量は２８仇ｍにおける分子吸収係数Ｅ三
瀦＝８．７を用いて２８仇ｍの吸収を測定して行つｏ次
に本発明方法で得られた酵素の性質をシュードモナス・
プチダＫＹ４６６７起源のものを代表例として示す。

‘１’作用：本酵素は３Ｑ−ヒドロキシステロイド類の
３Ｑ水酸基を特異的に脱水素する。

３３，１７８一ヒドロキシステロィド類には作用しない
。

【２｝ 基質特異性： 基質を下表のもので行うほかは３Ｑ一日ＳＤの酵素活性
の測定法と同じようにして行い、コール酸の場合を１０
０として相対活性を下表に示す。

※（ ）中は３位の立体構造を示す。

この表からわかるごとく本酵素は３Ｑ−ヒドロキシステ
ロイド類に特異的に作用し、中でも胆汁酸類に対してよ
く作用する。

細 至薄ｐＨおよび安定ｐＨの範囲： ３７ｑＣ、１分間の処理でｐＨ１０．５〜１１．５に至
通ｐＨを有する。

３０００、３０分間処理でｐＨ５〜１０．５の範囲で１
００％安定である。

【４ー 力価の測定法： 前述する通り。

【５ー 作用適温の範囲： ｐＨＩＯ．０、１分間処理で４５Ｃ０に最適温度を有す
る。

■ ｐＨ、温度などによる失活の条件： ｐＨ７．止 ４５００、１５分間処理で活性が１５％失
活する。

の 阻害、活性化および安定化： ＰークロロマーキユリベンゾエイトおよびＡｇ十、Ｈｇ
日、Ｃｕ什などの重金属イオンで阻害される。

メルカプトエ夕／ール、ジチオスレイトールなどのＳＨ
保護剤を１０‐５〜１０‐３Ｍ添加することによって安
定化される。

またラクトーズ、ピロリン酸、グリセロールを１０‐５
〜１０‐３Ｍ添加することによって安定化され、これら
はとくに凍結による失活を防止する。

｛８１ 精製方法： 実施例に示すとおりである。

‘９１ 分子量： セフアデツクスＧ−１００を用いるゲル炉過法によって
測定した分子量は約４５，０００である。

（１００元素分析：Ｃ＝４０．６％、Ｎ＝１３．０％、
Ｈ＝６．９％（１１）アンホラィトを用いた蛋白質焦点
電気泳動法（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｓｔＢｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａＡｃｔａ２０、４３５、１９６７参照）によって
測定した等電点はｐＨ４．８である。

（１２）結晶構造： 実施例２で得た本発明酵素３Ｑ−ＨＳＤの結晶標品の写
真を第１図に示す。

（１３ 雷気泳動： 実施例２で得た結晶３Ｑ一日ＳＤについてＡｈｎ．Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１、ＡＪｔ．
２、４０４（１９６４）に記載の方法に従ってディスク
電気泳動を行った。

この結果酵素活性の染色（染色法は生物物理化学Ｖｏｌ
．１０Ｎｏ．１、２、１９７１に従い、基質としてコー
ル酸を使う）および蛋白染色（染色１％アミドブラック
を用いて行う）ともに単一の帯を示した。

酵素活性染色のディスク電気泳動図を第２図に、蛋白染
色のディスク電気泳動図を第３図に示す。

（１心 補酵素： ＮＡＤまたはＮＡＤＰ。

ＮＡＤＰはＮＡＤに比較して約１０％の活性を発現させ
る。（１５）Ｋｍ値： コール酸およびＮＡＤに対するＫｍ値はそれぞれ１．３
３×１０‐５Ｍ、１．３×１０‐３Ｍである。

シュードモナス・ブチダＫＹ４６６７以外の菌株から得
られる酵素も、上記と同様の性質を示す。以上の本酵素
の性質を、従来知られていたシュードモナス・テストス
テロニから得られる３Ｑ−ＨＳＤ（以下、従釆の酵素と
略記する）と比鮫すると次のごとき相違点を示す。■
至適ｐＨ：本酵素ｐＨＩＯ．５〜１１．５従来の酵素ｐ
Ｈ９．１＊■ 等電点：本酵素ｐＨ４．８ 従釆の酵素ｐＨ６．２ ■ 基質特異性 以上の比較から、本酵素はシュードモナス・テストステ
ロニの産生する３Ｑ一日ＳＤとは明らかに違う性質を備
えた酵素であることがわかる。

次に実施例を挙げて本発明にかかる酵素の製造法を具体
的に示す。実施例 １ シュードモナス・プチダＫＹ４６６７をコール酸ナトリ
ウム０．３夕／ｄ夕、ＮａＮ〇３０‐２夕／ｄ〆、Ｋ２
ＨＰ〇４０‐１夕／ｄ そ、ＫＣＩＯ‐０２夕／ｄそ、
ＭｇＳ０４０．０２夕／ｄ〆、酵母エキス０．０５タノ
ｄその組成を有する種培地（殺菌前掛７．５）３０泌を
含有する２そ三角フラスコに楯菌し、３０ｑｏで２独寿
間振糧培養する。

この種培養液９００地を上記種培地と同じ培地１５夕を
含有する３０クジャーフアーメンタ一に植菌し、３０ｏ
ｏで１甥時間通気（１５夕／分）瀦梓（３５仇ｐｍ）培
養する。この培養液を連続遠心機にて処理し、菌体約１
００夕（湿重量）を得る。

この菌体を０．１ｍＭメルカプトェタノールを含む１仇
ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）５そで洗浄したのち
、同燐酸バッファー２〆に懸濁する。この懸濁液をＤＹ
ＮＯ−Ｍ比Ｌ（ＷｉｌｌｙＡ Ｂａｃｈｏおｎ社製、ス
イス）にかけ菌体を磨砕する。磨砕した後、冷凍遠心機
にて遠心分離（２０，０００×夕、２０分）し、上蒲液
をとる。得られた上蒲液の硫酸アンモニウム３０〜５０
％飽和区分をとり、０．１ｍＭメルカプトェタノールを
含む３仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）５０Ｍに溶
解する。透析膜としてセロフアンチューブを使い、透析
液として同上燐酸バッファーを使い、１幼時間おきに透
析液をとりかえながら、１０その透析液で４期時間透析
する。透析した酵素液を０．１ｍＭメルカプトェタノー
ルを含む３仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡
化しておいたＤＥＡＥセルロース（Ｓｅｗａ社製、Ｕ．
Ｓ．Ａ）のカラム（５．５×４０伽）に通す。この操作
で酵素は吸着される。

同上燐酸バッファー１そで不純蛋白質を洗い流す。つい
で０．１ｍＭメルカプトェタノールを含む２０仇ｈＭ燐
酸バッファー（ｐＨ７．０）１そで酵素を溶出する。

溶出液を一定量ずつのフラクションに集め、各フラクシ
ョンの活性を前記したごとき酵素活性の測定法で測定し
た。活性区分５００泌をあわせ、硫酸を５０％飽和にな
るよう添加し、酵素を沈殿させる。沈殿６１０肌夕を遠
心分離（２０，０００×夕、２０分）で回収し、０．１
ｍＭメルカプトェタノールを含む３ＭＭ燐酸バッファー
（ＰＨ７．０）５０の‘に溶解する。酵素溶液を上記の
燐酸バッファーで平衡化しておいたセフアデツクスＧ−
１００（ＰｈａｒｍａｃｌａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）のカラム（５．５×８０肌）に通す。同上燐酸バッ
ファー１〆を流し溶出液を得る。溶出液を一定量ずつの
フラクションに集め各フラクションの酵素活性、蛋白質
濃度を測定する。比活性の高いフラクション３００の‘
を合わせ、グリセロールを最終濃度１％（Ｖ／Ｖ）添加
して、凍結乾燥する。

かくして比活性１１．９の精製３Ｑ−ＨＳＤ１５０肌夕
を得る。

全体の活性収率は１６％であり、比活性は５２倍に上昇
した。

実施例 ２ 実施例１で得られた精製３Ｑ一日ＳＤの凍結乾燥際品１
５０机夕を０．１ｍＭメルカプトヱタノールを含む１瓜
ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）１０肌に溶解する。

この溶解を透析膜としてセロフアンチュ−ブを使い同バ
ッファー５そで２回透析外液を替えて２４時間透析する
。透析後の酵素液を０．１ｍＭ〆ルカプトェタノールを
含む１仇ｈＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化し
ておいたヒドロキシアパタイトのカラム（５．５×２０
伽）に通す。同バッファー２５０私をさらに通し、溶出
液を一定のフラクションに回収する。活性のあるフラク
ション（細胞抽出液に比べて、収率１０％で比活性は５
４０倍に上昇している。比活性１２５）を集め、これに
硫酸アンモニウム６０％（Ｗ／Ｖ）を添加し、酵素を沈
殿させる。沈殿を遠心分離（１２，００比ｐｍ、１５分
、以下同じ）で回収し、０．１ｍＭメルカプトェタノー
ルを含む５仇Ｍ燐酸バッファー（斑７．０）１の‘で溶
解させる。不溶性のものを遠心分離で除去した後、硫酸
アンモニウムを酵素溶液が少し濁るまで少しずつ添加す
る。１〜２時間後に酵素の結晶化がみられ、３日間冷蔵
庫（０一５℃）に放置すると結晶化が完了する。

結晶を遠心分離で回収し、さらに上記の操作を繰返して
再結を行う。得られた結晶の顕微鏡写真（×６００）を
第１図に示す。結晶前の本酵素の分子量約４５ ０００
に対して、結晶酵素の分子量は約８８，５００であり、
結晶酵素は２量体であることがわかる。

実施例 ３ 下表に示すごとき函株をコール酸ナトリウム０．３夕／
ｄ夕、ＮａＮ〇３０．０２夕／ｄ夕、Ｋ２ＨＰ〇４０．
１夕／ｄぞ、ＫＣＩ ○．０２夕／ｄそ、ＭｇＳ〇４０
‐０２多／ｄ夕、酵母エキス０．０５夕／ｄその組成を
有する培地（殺菌前ｐＨ７．５）５０の‘を含有する５
００の‘坂口フラスコに植菌し、３０℃で１期寿間振顔
培養する。

培養液を冷凍遠心（２０，０００×夕、２戊分）にて処
理して菌体約０．５夕（湿重量）を得る。この菌体を０
．１ｍＭメルカプトェタノールを含む１仇ｈＭ燐酸バッ
ファー（ｐＨ７．０）５０泌で洗浄し、同燐酸バッファ
ー１０の‘に懸濁する。懸濁液を超音波破砕機（トミー
糟工社製）にて２０分間超音波処理し、さらに冷凍遠心
（２０，０００×夕、２０分）し、上情液を得る。得ら
れた上清液について３Ｑ−ＨＳＤ活性および３８，１７
８−ＨＳＤ活性を測定して下表の結果を得た。各種微生
物の酵素生産量 ※参考のために従来知られている３Ｑ一日ＳＤ生産菌を
挿入。

実施例 ４実施例３において、培地のコール酸ナトリウ
ムに替えグリセロール０．５夕／ｄ夕を用い、得られた
菌体が約０．７５夕（湿重量）である以外は実施例３を
同様に行い下表のごとき結果を得た。

各種微生物の酵素生産量

【図面の簡単な説明】

第１図は本給晶酵素（２量体）の顕微鏡写真（×６００
）を示す。 第２図は本結晶酵素（２量体）の酵素活性染色のディス
ク電気泳動図を示す。第３図は本結晶酵素の（２量体）
の蛋白染色のディスク電気泳動図を示す。第１図 第２図 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス属バチルス属またはコリネバクテリ
   ウム属に属し、３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロ
   ゲナーゼを生産する能力を有する微生物を栄養培地に培
   養し、培養液および／または菌体中に３α−ヒドロキシ
   ステロイド・デヒドロゲナーゼを蓄積せしめ、該培養液
   および／または菌体から蓄積した該酵素を採取すること
   を特徴とする３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲ
   ナーゼの製造法。