JPS60232084A - 多孔性含フツ素高分子膜を用いた培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は多孔性含フツ素高分子膜を用いる培養法に関す
る。

微生物を培養する目的どしては、大別して微生物そのも
のを得ること、および微生物が代謝する物質を得ること
という２つがある。いずれの場合も生産性の観点からす
れば、微生物濃度が高ければ高いはと好ましい。しかし
ながら一方では、培養が進行するにつれ、微生物の生育
を阻害する阻害物質が蓄積したり、あるいは生産物質で
ある代謝産物自体がその生産に対する阻害物質となるこ
とが多く、このため培養後半で微生物の増殖や代謝産物
の生成が妨げられ、微生物の最終濃度を高くするには限
界がある。

微生物濃度を高め、あるいは代謝産物を効率よく回収し
、さらには阻害物質を培養液から除去するために微孔膜
を利用する考えがあり、第１図に示した基本フローシー
トで試られているが、まだＴ業的実用性において満足ナ
ベきものは見出されでいない。

その最大の伸出は、スチーム殺菌操作に耐え得る材質の
膜が得られていなかったことによる。微生物の培養を行
なうに当っては、雑菌の混入による汚染を防ぐために装
置全体にスチーム＜１００〜１２０°Ｃ）を通し、′Ｍ
Ｚ同内部を無菌状態にするが、この時、透析装置（限外
濾過装置を含む）もやはりスチームを通さなければなら
ず、１００〜１２０’Ｃの高温に耐える膜を使用しない
と透析操作そのものが不可能となってしまう。

現在透析膜として最もよく使用されているアセチルセル
ロース膜やナイロンおよび塩化ビニル膜の使用可能温度
は４０〜７０　℃であり、培養液の透析膜としては使用
できない。

さらに培養液の透析膜として使用するために満了すべき
条件としては、（１）ρト１の変化に対して耐性があり
、透過に影響を及ぼさないこと、（２）微生物が生産す
る酵素のような代−（産物によって分解されないこと、
（３）化学的処理に対Ｃて安定であること等が挙げられ
る。例えば、アセチルセルロース膜は１）１７１９以上
になると膜自体が加水分解を起こすため、耐腐蝕性とい
う点で問題がある。また。ポリエステル膜はリパーゼ、
■ステラーゼ等の酵素によって分解されるので、この様
な酵素を分泌する微生物の培養に対しては使用できない
。

以上の問題を解決するため、多孔性含フツ素高分子膜が
開発されている。これらの膜、例えばポリテトラフルオ
ロエチレン微孔膜は２４０℃まで安定であり、１２０℃
のスチーム殺菌に十分耐えられ、また薬品に対しても溶
融アルカリ金属をのぞくほとんどの薬品に侵されず、さ
らに酵素で分解されることもないので培養液の透析には
非常に好ましい性質を備えている。しかしながら、含フ
ツ素高分子膜は通常強い疎水性を示し、そのため水およ
び親水性物質を透過しにくく、これを透過するためには
相当の圧力をかける必要がある。その結果、膜および透
析装置自体をがなりの耐圧性のものとしなければならな
ず、さらに操作効率そのものが低下してしまう。従って
、これらの膜については醗酵工業においては実用的成功
を収めていない。

本発明者らは上記多孔性含フツ素高分子膜の表面に親水
化処理を施し、さらにはこれに安定化処理を施した膜を
使用すると、含フツ素高分子膜の耐熱性および耐薬品性
に関する優れた特性を損うことなく透水量を著しく向上
さゼることができることを見出し、かつそれによって培
養工程中に生ずる阻害物質が有効に除去でき、重要な代
謝産物を有効に取出し、かつ微生物の培養系における最
終濃度を著しく高くすることが可能となることを見出し
た。

即ち、本発明は微生物は保持するが、培養イ曵謝生成物
および／または阻害物質は通過する多孔性の躾またはチ
ューブを用いて培養液を処理し、培養代謝生成物および
／または阻害物質を培養系外に取出す培養法において、
多孔性の膜また（よチューブとして表面に親水化処理を
施した多孔性含フツ素高分子膜を用いる培養法を提供す
る。

本発明で用いる含フッ素高分子月料として（ま、例えば
ポリテトラフルオロエチレン、ポＩＪヘキサ）　フルオ
ロプロピレン、ポリ上２ノフルオロエチレン、テトラフ
ルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体等
の他、含フツ素モノマーとイ也の炭ルオロエチレンーエ
チレン共重合体等が例示される。特に好ましくは、ポリ
テトラフルオロエチレンから生成された多孔性膜である
。これらの多孔１１１（７）ウチ、特ニ０．０５〜１０
ｔ１ｍ　、特に０゜１〜１μｍの孔径を有する多孔性膜
が本発明の目的にとって好ましい。

これらの多孔性含フツ素高分子膜を表面親水４ヒ処理す
るためには、例えば、グロー放電処理（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Δ　ｐｐｌｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ上１．１４６１〜１４７４　（１９６７）および
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｅ
ｒ　５ｃｉｅｎｃｅユ、１２３１〜１２３７　（１９６
８）等に報告されているケーシング法）やアルカリ金属
を用（また処理法（例えば、アンモニアとアルカリ金属
を用いる方法）およびアルカリ金属、ナフタレンおよび
テトラヒドロフラン混合溶液で処理する方法（例えば、
ＵＳＰ２，８０９，１３０，１．Ｅ。

Ｃ，ユ（Ｎｏ　、３）ｐ　、３２９〜３３０゜Ｍａｒｃ
ｈ　１９５８等〉、あるいは、それらの変法とみなされ
る有機アルカリ金属化合物等を用Ｉ／）る方法（「新実
験化学講座」第１２巻゛有機金属イし学″第４３．２０
．１２頁；日本化学会編；発（１所　丸首）も知られる
。また、本発明者らによっで開発されたアルカリ金属、
ナフタレンおよびジアミン混合液で処理する方法等もあ
る。上記の方　・法はいずれも含フツ素高分子膜表面を
脱フッ素化することにより親水性を付与するものである
。本発明者らが開発したアルカリ金属を用いる処理方法
では、ナフタレンをジアミン、例えばエチレンジアミン
、プロピレンジアミン等に溶解し、これにアルカリ金属
、例えばナトリウムを溶解し、ナフタレンと反応せしめ
た液中に１０〜６０℃で含フツ素高分子膜を浸漬し、乾
いた不活性ガス雰囲気中で処理する方法である。上記の
親水化処理によって得られた多孔性含フツ素高分子膜は
、そのままで培養液の透析膜（限外濾過膜を含む）とし
て使用し得るが、未だ処理面は耐アルカリ性、耐酸性お
よび耐熱性において不充分であり、高温滅菌、特に１０
０℃以上の滅菌を行なう場合、ならびに高濃度アルカリ
処理を必要とするような場合には必ずしも満足すべきも
のではない。従って、そのような目的には上記脱フッ素
化した親水化処理表面をアルデヒドを溶解した濃硫酸で
安定化処理を施す。脱フツ素化処理表面をホルマリン／
硫酸混液で処理することにより、脱フツ素化表面はアル
デヒｇ−ｙ−１ｍ　Ｍｋ★れ、耐薬品性および耐熱性が
著しく向上する。本発明で云うアルデヒド架橋とは、不
飽和炭素結合を飽和結合に代えたりすることを含み、近
接する炭素鎖間の架橋をすることも意味する。

アルデヒドとしては、例えばホルムアルデヒド、パラホ
ルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデ
ヒド、グリオキサール、スクシンジアルデヒド、アクロ
レイン、クロトンアルデヒド、プロピオールアルデヒド
、ベンズアルデヒド、テレフタールアルデヒド等が例示
されるが、特に好ましくはパラホルムアルデヒドである
。アルデヒドはｍ硫酸に飽和濃度溶解されたものを用い
るのが最も好ましいが、半飽和濃度以上であれば相当に
有効である。通常は、例えば、パラホルムアルデヒドは
固体であり、飽和量溶解させても、さらに多量のパラホ
ルムアルデヒドを混在させておく。

その理由は親水化処理層は本来酸に不安定であるので、
アルデヒドの濃度が低くなるほど、アルデヒドによる安
定化反応の進行する度合が遅くなり、酸による分解の割
合が増加していくためである。

ｍ硫酸としては、９０％以上の濃硫酸が好ましく、特に
９８％濃硫酸において優れた結果が得られる。

安定化処理は１０〜１００℃、好ましくは２０〜７０℃
で行なう。処理時間は処理温度によって左右されるが、
２０分〜２日間が適当である。

上記親水化処理および安定化処理によって得られた膜は
、膜表面が親水性を示し、しかも耐熱性如耐薬品性等の
性質をほとんど失っておらず、従って、あらゆる種類の
培養液の透析が可能となる。

特にこの膜が、１２１℃で１５分間のオートクレーブ滅
菌を２０回繰返し行なっても透過性能が劣化しない性質
は、透析装置を培養装置と連結させて使用する場合には
非常に有利である。この場合、透析装置も培養系に組込
まれるので、培養に先立つ培養装置の滅菌操作に当って
は、透析装置も滅菌操作を行なう必要があるが、本発明
の膜を使用すると培養装置と透析装置を同時にスチーム
に通すことができ、２つの装置を同時に滅菌することが
可能となる。従来の膜では、スチームが使用できないた
め、滅菌は１〜５％のホルマリン水、あるいは１〜５０
　ｐｐｍの塩素水を用いた化学的方法によっているが、
それらの方法では十分滅菌状態にはならず、さらにはホ
ルマリンや塩素を除くためにさらに滅菌水で洗浄しなけ
ればならないので、操作が手間どるねりには充分な滅菌
が行ない得ない。この点で・本発明による方法は非常に
簡単な操作で、確実にしかも化学的にみても安全な方法
で滅菌できるので実用的に優れたものである。

さらにこの改良膜は再生処理を行なうことにより、何回
も繰返し使用することができる。培養液の透析を長時間
行なうと、膜表面に培地由来の有機物や微生物の代謝物
が付着して、透析速度を低下せしめるが、このような汚
れはアルカリないし酸処理で取除くことができる。この
ためには強アルカリ、強酸に耐える膜材でなければなら
ないが、本発明改良膜はｐＨの変化に対して非常に安定
であり、膜を取替える必要はなく、簡単に再生できる利
点を有している。

汚れを取除く酸およびアルカリとしては塩酸、硝酸、硫
酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アン
モニア水等があり、使用する濃度は汚れの度合により調
整すればよいが、一般的には０．１〜ＩＯＮである。ま
た常温でとれなければ６０〜８０℃に温めて処理される
。０．１１’Ｊ以下で必ると洗浄時間が長引き、汚れが
ひどい場合は完全に取除くことができず、ＩＯＮを越え
ると、膜自体は問題ないがパイプラインや透析装置の材
質の腐食が問題となり、これ以上の高い温度を敢えて使
用する必要はない。このような化学処理を行なった後、
純水で洗浄すれば膜を劣化させずに汚れを完全に除去す
ることができ、さらにスチームを通して行なえば滅菌状
態を再現できるので、化学的処理とスチーム滅菌操作を
組合せることにヨリ、膜を取替えることなく反復使用す
ることが可能となる。これにより使用ごとに膜を取替え
る゛というメンテナンス上の繁雑な操作に時間をかけず
にすみ、生産性は倍増する。

本発明の基本的フローシートは、従来培養液の膜処理と
して使用されていた第１図のフローシートと同様にすれ
ばよい。図中、（１）は培地（栄養源）、（２）は培養
槽、（３）は攪拌器、（４）は透析器、（５）は多孔性
膜、（６）は微生物を含む培養液、（７）は透過液およ
び（８）は温疾計を示す。

培地を培養槽中に入れ、攪拌しながら培養を進行させる
。透析器にかけない場合、培養槽中の微生物は一定の濃
度に達すると、培養中に生成した阻害物質または有用な
代謝生成物自体によってその繁殖限界に達する。従って
、これ以上に微生物濃度を増加させることはできない。

しかしながら、これを透析器にかけて培養槽中の培養液
を透析膜で通過させると、透析器の多孔性膜の孔径を適
宜選択することにより、有用物質および／または阻害物
質を系外に取出づ゛ことが可能となる。一方、微生物を
含む培養液は透析器によって保持されるので、これを再
び培養槽に戻す。培養槽中の代謝生成物および有害物質
は系外に取出されるため、微生物の繁殖は抑制されず、
培養槽中の微生物濃度は一層向上する。これらの処理を
連続的もしくは間欠的に行なうことにより、代謝生成物
中の有用物質の回収および微生物の大量生産が可能とな
る。

この培養法は酵素反応、醗酵いずれにも利用することが
できる。またこの透析装置は環状膜反応器としても使用
することができる。

以下、実施例をあげて本発明を説明する。

参考例１ ［透析装置の製造法］ 共摺栓付き１００−試験管に、エチレンジアミン７５戴
とナフタレン７ｇを入れ溶解後、細片（約１　ｍｍｘ　
１　ｍｍｘ　２０　ｍｍ）に切った金属ナトリウム２ｇ
を投入し、密栓した。この試験管を乾燥窒素ガスを充満
させたポリエチレンの袋の中に封入し、よく振盪してナ
トリウムとナフタレンとを反応させた。反応温度が４５
℃になった時、平均孔径約０．１μｍ、厚さ８０μｍの
多孔性ポリテトラフルオロエチレン平面膜（住友電工株
式会社製）を直径５ｃｍに切り、投入した後、４５℃で
２分間処理した。処理フィルムをメタノールで処理して
ナトリウムを失活させた後、テトラヒトＯフランで洗浄
し、さらに水洗した。得られたフィルムを３時間風乾し
、さらにホルムアルデヒドの飽和硫酸溶液中に２４Ｒ間
浸漬し、水洗後、風乾した。

この膜は平均膜孔径的０，１μｍの表面黒色膜であり、
親水性表面を有していた。また濃硫酸に１週間浸漬して
も表面に異常は観測されず、また５Ｎ苛性ソーダで室温
１週間浸漬しても異常は認められなかった。この膜を透
析装置に設置して、以下の実施例に供した。

実施例１ 内容量３（ｌの培養槽に温度語、攪拌器、培地用容器、
および透析装置を第１図に示すごとく設置し、培養槽に
グルコース換算３０％の糖蜜液（Ｎｌとして（ＮＨ４）
２　ＳＯａおよびＰ源として８３　ＰＯ４を加えたもの
）を含む培地２０℃を加える。培養液ｐＨは４．５に調
整した。これにサツカロマイセス・セレビシアエ（３ａ
ｃｃｈａｒｏ　−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）
を２００ＣＩ接種し、３３℃、□ 通気１２（１／分および攪拌数５０　Ｏｒｐｍの条件下
で培養を行なった。

上記培地を用いて、培養液中のグルコース８１度が約１
００ｐｐＩＩｌとなるように培地を供給した。同時に培
地供給量と等しい量の透過液が得られるよう培養液を透
析器で処理し、菌体または微生物保持液を培養槽へ返し
た。２時間ごとに培養液中の微生物濃度を測定し、１６
時間培養を継続した。

培養液中の微生物濃度を第２図＜Ａ）に示す。

比較として、透析装置を使用しないで同様の試験を行な
った時の微生物８１１度を同じく第２図（Ｂ）に示す。

第２図から明らかなごとく、透析処理を施した培養液で
は生育阻害物質が透析除去されていることが理解される
。

実施例２ 実施例１において培養終了後、培養槽および透析器から
培養液を抜き出し、培養装置にスチーム（１００℃〉を
通して、１時間滅菌操作を行ない、再び実施例１と同じ
培養を行なって透析速度を測定した。透過液量を測定し
たが実施例１と大きな差は見られず、また培養時間に伴
う微生物濃度の上昇も実施例１とほぼ同様であった。以
上のことから、スチーム滅菌操作による膜の劣化は認め
られないことが解る。

実施例３ 実施例２に述べた滅菌操作、培養サイクルを繰返し、培
養サイクルの繰返し回数と透析速度との関係を調べた。

結果を第３図に示す。第３図に示すごとく、培養および
滅菌操作を繰返すと、次第に透析速度が低下した。この
操作を５回繰返した後、膜の表面を観察すると培地成分
に基く色素が沈着しており、膜面が汚れていることが解
った。

この汚れを取るため、ＩＮ　ＮａＯＨ液で３０分間洗浄
し、純水で洗った後、さらにＩＮ　ＨＣ，、ｇ液で３０
分間洗浄し、純水で洗い、さらにスチームで１時間滅菌
操作を行なった。この膜を用い、実施例１で述べたごと
く培養を行なって、再度透析速度を測定した。その結果
、透析速度は初期の値まで回復した。従って、この膜は
強アルカリ、強酸で洗浄しても全く劣化せず、長期間使
用できることが解った。

【図面の簡単な説明】

第１図は透析装置を用いた培養法の基本フローシート、
第２図は培養時間と培養液中の微生物濃度の関係を示す
グラフおよび第３図は透析膜の繰返し使用回数と透過液
量の関係を示すグラフ。 図中、（１）は培地、（２）は培養槽、（３）は攪拌器
、（４）は透析器、（５）は多孔性膜、（６）は微生物
を含む培養液、（７）は透過液、（８）は温度計、＜Ａ
＞は透析器を用いた方法、（Ｂ）は透析器を用いない方
法での結果を示す。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　微生物は保持するが、培養代謝生成物および／′
   または阻害物質は通過する多孔性膜を用いて培養液を処
   理し、培養代謝生成物および／また）　は阻害物質を培
   養系外に取出す培養法において、多孔性膜として表面に
   絹本化処理を施した多孔性含フツ素高分子膜を用いる培
   養法。 ２、　多孔性含フツ素高分子膜がポリテトラフルオロエ
   チレン、ポリへキザフルオロプロピレン、ポリトリフル
   オロエチレン、テトラフルオロエチレン−プロピレン共
   重合体、テトラフルオロエチレン−エチレン共重合体の
   多孔性膜から選ばれる第１項記載の培養法。 ３、　多孔性含フツ素高分子Ｈｒ；！がポリテトラフル
   オロエチレンの多孔性膜である第２項記載の培養法。 ４、　多孔性含フツ素高分子膜が孔径０．０．５〜１０
   μｍを有４る第１項記載の培養法。 ５、　多孔性含フツ素高分子膜の表面親水化処理を脱フ
   ツ素化処理によって行なう第１項記載の培養法。 ６、　脱フツ素化処理をアルカリ金属、ナフタレンおよ
   びジアミンを含む混合液で行なう第５項記載の培養法。 ７、　表面親水化処理が、多孔性含フツ素高分子、膜の
   表面を予め脱フツ素化処理した後、アルデヒドを溶解し
   た濃硫酸で安定化処理する工程を含む第１項記載の培養
   法。 ８、　アルデヒドがパラホルムアルデヒドであり、硫酸
   が９０％以上の濃硫酸である第７項記載の培養法。 ９、　アルデヒドをｌｉｌ硫酸に飽和して用いる第７項
   記載の培養法。 １０、安定化処理を１０〜１００℃で行なう第７項記載
   の培養法。 １１、培養液を表面親水化処理を施した多孔性含フツ素
   高分子膜を通し、保持液を培養槽に返す工程を連続的ま
   たは間欠的に行なう第１１．記載の培養法。 １２、表面親水化処理を施した多孔性含フツ素高分子膜
   を培養槽底部に設置する第１項記載の培養法。 １３、培養液がｒＩＪ酵液である第１項記載の培養法。 −１４，培養液が酵素反応液でおる第１項記載の培養法
   。