JPS60233105A - 診断試薬用ラテツクスの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、免疫血清学的診断試薬に有効なラテックスの
製造方法に関する。

（従来技術） 免疫血清学の進歩に伴い、臨床検査における技術の向上
はめざましい。免疫血清学検査は、試験管を用いて行わ
れ、血清希釈にはメスピペットが使用される。このよう
な試験管やピペットによる作業の繁雑さと、検査件数の
増加に伴う大量の検体処理とが免疫血清学検査の精度を
低くしている原因でもある。しかし、臨床検査の自動化
導入によって、免疫血清学検査の領域においても患者か
らの採血量を少なくシ、微量の検査材料で正確な検査デ
ータが得られる微量検査法（マイクロタイター法）が実
施されるに至っている。　このマイクロタイター法は１
９５５年ハンガリーのＴａｋａｔｓｙによって考案され
、さらに、　１９６２年に、アメリカの５ｅｖｅｒによ
って改良された。１９６３年にアメリカでマイクロタイ
ターキットが市販されて以来、これが免疫血清学的検査
に採用され１世界中で使用されるようになった。　１９
６７年、アメリカのＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄ
ｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）がこれを補体結合反応
の標準検査法として採用した。　ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌ
ｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅのトレーニングマニュアルにマイ
クロタイター法の手法が使用されている。我国では、ウ
ィルス学の研究者によって比較的はやく紹介され、輸入
品によってウィルスの血清学的検査（血球凝集反応、血
球凝集阻止反応、補体結合反応など）や細胞・組織など
の培養が行なわれている。これらマイクロタイター法の
特徴は、■微量の血清で多項目の検査ができること；■
操作が簡便で多数の検体を′短時間で迅速に希釈するこ
とができること；■抗原、抗血清、試薬などが現行法に
くらべ少量ですみ経済的であること；０１枚のプレート
で全体の反応がみられ、凝築像や溶血が鮮明で判定しや
すいこと；■現行法との反応の感度や精度が変わらず、
再現性もよいことなどである。これらマイクロタイター
法に用いられる血球の主流はヒツジ赤血球およびニワト
リの血球である。これら動物血球を用いた場合には血球
の腐敗および変性が激しく、長期の保存性に欠けること
。

および個体差が大きいために検査値のバラツキ幅が広く
正確なデータがなかなか得られないこと等の問題点があ
る。そのうえ、血球そのもの自体に抗原を含んでいるた
め、これが検査を受ける血清中の種々の抗体と反応し、
その結果、まぎられしい反応を起こしやすい。これら血
球の代替品として近年９合成ラテックスが用いられつつ
ある。例えば、特開昭５１−９７１６号公報には合成ラ
テックス試薬が開示されている。この合成ラテックスは
界　、面活性剤（乳化剤）を用いて１造される。この他
にも界面活性剤を用いた合成ラテックス試薬が知られて
いる。その製法は９例えば、水中にアニオン系、ノニオ
ン系またはカチオン系の乳化剤を混合したもの、スチレ
ンモノマーや水溶性ラジカル開始剤等を共存させて、好
ましくは酸素を除いた雰囲気で、適当な温度に適当な時
間保つというものである。合成されたこれらラテックス
は、一般には２重合の際に用いた乳化剤の一部がポリス
チレンラテックス粒子の表面に吸着されるか化学的に結
合され、残りはラテックス中に遊離の状態で存在する。

これらの状態の間には乳化剤のポリスチレンラテックス
粒子表面に対する吸着脱着平衡が成立している。このよ
うに通常の方法で製造されるポリスチレンラテックスに
おいては乳化剤は安定なラテックスの形成に不可欠であ
るが、その反面、遊離の乳化剤は前述の抗原または抗体
によるラテックスの凝集反応に対して好ましくない影響
を与える。診断試薬を製造するには、まず、既述のよう
にポリスチレンラテックスに抗原または抗体を感作させ
る。しかし、遊離の乳化剤を含むラテックスを用いると
この段階ですでに凝集してしまう。次に、抗原または抗
体を感作させたラテックスを用いてこの抗原または抗体
に反応する抗体または抗原をラテックスの凝集反応によ
って検出する際には、検出されるべき抗体または抗原を
含む血清と接触すれば感作ラテックスは凝集し。

かかる抗体または抗原を含まない血清と接触しても感作
ラテックスは凝集しないことが必須要件とされるにもか
かわらず、これら遊離の乳化剤を含む感作ラテツクスの
場合には陰性血清と接触しても凝集してしまい、いわゆ
る非特異的凝集反応となることが多い。これら乳化剤を
ラテックスからイオン交換法や透析法の技術を用いて除
くことは可能ではあるが、これら遊離の乳化剤をラテッ
クスから除いてしまうと、前述の如く遊離の乳化剤とラ
テックス粒子表面に吸着された乳化剤との間の吸着脱着
平衡の成立によるラテックス安定化がくずれてしまい、
ラテックスの安定性は極端に悪くなり実際上は使用不可
能となってしまう。特開昭５７−１４６１０にはスチレ
ンを乳化剤の不存在下に過硫酸塩を重合開始剤として水
中で重合させた後アルカリ性条件下で加熱して得られる
ラテックスの開示がある。このようにして得られたラテ
ックスを試薬化すると乳化剤を使用していないため非特
異的凝集反応が起こらない。かつラテックスの安定性に
も優れている。しかし、このようなラテックスは比重が
小さいため、ラテックスを試薬化して、検体との凝集性
を調べる場合には長い時間を必要とする。

（発明の目的） 本発明の目的は、ロフト間のバラツキがなく長期間安定
に保持しうる診断試薬用ラテックスの製造方法を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、自己凝集および非
特異凝集が少なく誰もが簡単にしかも短時間で評価でき
る。マイクロタイター法に最適なソープフリー系ラテッ
クスの製造方法を提イ具することにある。本発明のさら
に他の目的は、高精度で検査値を得ることのできるラテ
ックスの製造方法を提供することにある。本発明のさら
に他の目的は、所望の粒径および比重のラテックスを製
造しうる方法を提供することにある。

（発明の構成） 本発明の診断試薬用ラテックスの製造方法は。

スチレンを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開始剤として
重合させ重合体粒子の懸濁液を得る工程。

該懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱処理する工程、そ
して該懸濁液を塩素化処理する工程を包含し、そのこと
により上記目的が達成される。

本発明において開始剤として用いられる過硫酸塩として
は５例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過
硫酸ナトリウムなどがある。これらの過硫酸塩のスチレ
ンに対する割合は８重量％以下、好ましくは０．０９〜
６重量％２さらに好ましくは０．１〜５重量％である。

本発明では共重合反応は、水の仕込まれた反応器にスチ
レンと開始剤とを加えて攪拌しながら加熱して重合反応
を行う。スチレンを単独重合させた後、アルカリ性条件
下で加熱する。アルカリ性条件下で加熱されることによ
り開始剤の過硫酸が分解される。このときの加熱温度は
１通常、５０〜１００℃好ましくは６０〜８５°Ｃであ
る。このときの加熱時間は０．３〜５０時間、好ましく
は５〜３０時間である。その際の反応系のｐ旧よ７．５
〜１２．５特に８．０〜１１．５の範囲に保たれるのが
よい。加熱処理された懸濁液は１次いで、塩素化処理に
供される。そのときの温度は、懸濁液の仕込み量および
処理条件により異なるが１通常、５〜６５℃好ましくは
１０〜６０℃である。最終塩素化量は５〜４０％好まし
くは１０〜３０％である。塩素化処理時間は１０〜５０
０分好ましくは３０〜４００分であり、より好ましくは
６０〜３６０分である。

上記処理条件を外れると、得られるラテックスの表面の
損傷が激しく自己凝集の原因となる。かりにうまく処理
できても今度はラテックス自体の比重が大きずぎてマイ
クロタイター法等で評価したとき早く沈降しすぎ、±（
１０分以内に起こる明らかな凝集）〜十（３分以内に起
こる明らかな凝集）付近の凝集がすべて逆転してしまい
正確なデータが得られない。

本発明によれば２重合および塩素化の反応条件をコント
ロールすることにより所望の粒径と比重のラテックスが
得られる。このようにして得られたラテックスは、非特
異的凝集反応を起こさないためマイクロタイター法に用
いられるラテックスとして特に好適である。ラテックス
の比重は１．４前後がマイクロタイター用として適して
いる。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実施例１ （Ａ）ラテックスの８周製：スチレンモノマー７５ｇ５
過硫酸カリウム０．４０ｇおよびイオン交換水４５０ｇ
を反応容器に仕込んだ。そして、容器を窒素ガスで置換
し反応温度を６８℃〜７２℃の範囲におさまるようコン
トロールしながら２８時間重合させた。

重合終了後、ラテックス懸濁液のｐＨを８．５に調節し
た。これを２次いで、７０°Ｃで２４時間ｐＨ８，５に
保ちながら反応させた。反応器を停止し容器からラテッ
クスを取り出し東洋濾紙Ｎｏ、２（直径１２．５ＧＭ）
を用いて濾過精製処理を行なった。次いで、７０’Ｃ乾
燥機を用いてこのラテックスを乾燥し、得られた精製固
型分を秤量したところ、　１２．１　（Ｗ／Ｗ）％であ
った。次に、３１反応容器に水１８００ｇと。

精製ラテックスを蒸留水で１０％に希釈したラテックス
４３０ｇとを投入したのち、１００−の水銀灯下におい
て反応温度を２５〜２７°Ｃに保ちながら１６０分間塩
素ガスを吹きこみ塩素化処理した。窒素ガスで容器内を
１２７分間置換した後、得られた塩素処理ラテックスを
取り出し東洋濾紙隘２を用いて濾過精製処理した。塩素
化処理後のラテックス中の塩素量は反応溶液中のＨＣβ
分析を行なった結果２６．４％であった。塩素処理後の
ラテックスを電子顕微鏡で観察した結果、平均粒径は０
．４９μｍそして粒径のバラツキは変動係数（粒径の標
準偏差／平均粒径）で表して０．００９であった。この
ラテン０ クスの比重は１．４０であった。

（Ｂ）Ｒ−ＰＨＡ法凝集反応によるラテックス評価：　
（Ａ）項で得られたポリスチレンラテックスをｐＨ７，
４のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％としたもの１容
と１モルモットの産生したＨＢｊモノスペシフィックス
抗体（セファローズ４Ｂに固定したＨＢｓ抗原のカラム
に２回通液したアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製品）を同じくリン酸緩衝液中に４０μｇ／ｍβの
濃度に溶解したちの１容とを混合し、３７℃で６０分間
インキュベートしてラテックスに抗体を結合させた。次
に、この感作ラテツクスを１５００Ｏｒｐｍにて１５分
間遠心分離し、未吸着の抗体を除去した。この上澄中の
抗体価はＰＨＡ　（受身赤血球凝集反応）法により測定
され少なくとも９９．５％以上の抗体がラテックスに吸
着していることがわかった。　この沈降したラテックス
を１８００Ｏｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄み液を捨
て、沈降した処理後の感作ラテツクスをｐＨ７，０のリ
ン酸緩衝液に再分散してラテックス試薬の調製を終了し
た。このようにして調製されたう１ テックスを用い現在市販されているリバーセイア（ＨＢ
ｓ抗原検出ＥＩＡキット　山の内製薬製）を用いてＲ−
ＰＨＡ（逆受身血球凝集反応）試験法を試みた。

マイクロタイターにマイクロドロンバーを用い緩衝液５
０μｌを容管に分注した。そして、ｌμｇのＨＢｓ抗原
を含む検体２５μｌを取り出し、ずみやかにダイリュー
タ−で倍々希釈した。そして、上記方法で得られたラテ
ックスを２５μｌ各管に分注したのちミキサーで分注し
、３０秒間振盪した。これを２７０分間・　４２０分間
静置後凝集像を判定した。

比較のために、ラテックスの代わりにあらかじめヒツジ
赤血球に抗ＨＢｓ抗体を吸着させたＲ−ＰＨＡセルを同
時に用いラテックス凝集との比較として評価した。その
結果を第１表および第２表に示す。第１表および第２表
は、それぞれ２７０分間静置後および４２０分間静置後
の凝集像の判定結果である。

２ 第１表 ３ 第２表 以上の試験結果から１本発明によるラテックスは。

乳化剤が使用されていないため、自己凝集および非特異
凝集が少なく、保存性に優れロット間のバラツキもない
ことがわかる。粒子がよく揃いかつ比重が比較的大きい
ため凝集反応を、だれもが簡単に、しかも短時間で評価
できる。しかも検査値４ への影響が少なくマイクロタイター法等にもっとも適し
たラテックスであることが明らかである。

止較炎 （Ａ）ラテックスの調製：スチレンモノマ−９０ｇ、ノ
ニオン乳化剤（第一工業製薬社製、エマルシソｌ１−４
９）２．過硫酸カリウム０．６ｇおよびイオン交換水４
５０ｇを反応容器に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反
応温度を７０〜７２℃の範囲におさまるようコントロー
ルしながら２４時間重合した。

得られたラテックスを電子顕微鏡で観察した結果。

平均粒径は０．７５メ！ｍそして粒径のバラツキは変動
係数で表して０．１２７であった。このラテックスの比
重は１．０４であった。

（Ｂ）Ｒ−ＰＨＡ法凝集反応によるラテックス評価：　
（Ａ）項で得られたポリスチレンラテックスをｐＨ７，
４のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％としたもの１容
と９モルモットの産生じたＨＢｓモノスペシフィソクス
抗体（セファローズ４Ｂに固定したＨＢｓ抗原のカラム
に２回通液したアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製品）を同し５ くリン酸緩衝液中に４０μｇ／ｒｎβ濃度に熔解したち
の１容とを混合し、３７℃で、６０分間インキユヘーヒ
トてラテックスに抗体を結合させた。次に。

この感作ラテツクスを１５００Ｏｒｐｍにて１５分間遠
心分離し、未吸着の抗体を除去した。この沈降したラテ
ックスを１５００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄
み液を捨て、沈降した処理後の感作ラテツクスをｐＨ７
，０のリン酸緩衝液に再分散してラテックス試薬の調製
を終了した。このようにして調製されたラテックスを用
い市販のリバーセイア（ＨＢｓ抗原検出ＥＩＡキット　
山の内製薬製）を用いてＲ−ＰＨＡ（逆受身血球凝集反
応）試験法を試みた。

マイクロタイターにマイクロドロッパーを用いて緩衝液
５０μｌを名前に分注した。次に、ｂｕｇのＨＢｓ抗原
を含む検体２５μｌを取り出し、すみやかにグイリュー
タ−で倍々希釈した。そして、上記方法で得られたラテ
ックスを２５μβ各管に分注したのちミキサーで分注後
３０秒間振優した。そして、これを２７０分間および４
２０分間静置して後。

得られる凝集像を判定した。２７０分間・　４２０分間
６ 後の判定では静置前と全く凝集像の変化は認められなか
った。（Ａ）項で得られたラテックスを用い実施例に準
じてラテックス試薬を調製し、これを用いて種々の濃度
のＨＢｓ抗原を含むヒト血清に対する凝集の強さを測定
した。その結果を第３表に示す。

第３表 次に、リバーセイア（ＨＢｓ抗原検出ＥＩＡキット　山
の内製薬製）を用いて、血清中のＨＢｓ抗原が０．４ｎ
ｇ／　ｍβ以下であることが判明している１５８人の正
常なヒト血清について同様のテストを行った。１５８検
体中、陽性が２０件そして偽陽性が２７件であった。

以上の試験結果より、比較例のラテックスを使用し試薬
化したラテックスは非特異的凝集反応を７ 起こすことが明らかである。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、乳化剤を全く含まないに
もかかわらず、常時は安定で抗原抗体反応に鋭敏に感応
して高凝集性が得られるラテックスが製造される。この
ラテックスはしかも粒径がよく揃っている。このラテッ
クスは、乳化剤を全く含まないために免疫血清学的診断
試薬として用いると、非特異的凝集反応による検査値の
バラツキがない。ラテックスの調製時に反応条件をコン
トロールすることにより所望の粒径および比重のラテッ
クスを得ることができる。そのため、このラテックスは
マイクロタイター法等に特に偉力を発揮しうる。

以上 出願人　積水化学工業株式会社 ８ 手続補正書（自発） 昭和６０年２月２６日 １、事件の表示 昭和５９年　特許願第８９．８９７号 ２、発明の名称 診断試薬用ラテックスの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５３０ 住　所　大阪市北区西天満二丁目４番４号特許部東京駐
在　置東京（０３）　４３４−９５５２４、補正の対象 翫　補正の内容 （１）明細書第９頁第２〜４行に、 「±（１０分以内：こ起こる明らかな凝集）〜＋（３分
以内に起こる明らかな凝集）ｆ＃近」とあるのを 「十〜十吋近」と訂正する。

（２）　明細書第１２頁第１０行に、 「ミキサーで分注し、３０秒間振盪した。」とあるのを ［ミキサーで３０秒問振盪した。」と訂正する。

（３１明細書第１２真下から第２〜１行目に、「判定結
果である。」とあるのを 「判定結果である。なお以下の表における符号の意味は
次の通りである。

ｍ：凝集が認められない ±：ゆるやかな＃！県が認められる ＋：明瞭な凝集が認められる 廿：完全な凝集が顕著１〔認められる」２− 手続補正書（Ｉｌ釦 昭和６０年　８月　５８ １、事件の表示 昭和５９年特許願第８９８９７号 ２、発明の名称　。

妙断試薬用之テックスの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５３０ 住　所　大阪市北区西天満二丁目４番４号特許部　Ｔ［
！Ｌ　（０６）　３６５−２１８１特許部東京駐在置　
（０３）　４３４−９５５２明細書の発明の詳細な説明
の欄 玩　補正の内容 （１）′明細書第１２頁第１〜３行及び第１６頁第１θ
〜１１打に、 「リバーセイア（ＨＢＳ抗原検出Ｅ１’Ａキット　山の
内製薬製）を用いて」 とあるのを、 ［リバーセル（山の内製薬製）のうちの感作赤血球を該
ラテックスにおきかえて」 と訂正する。

（２）第１２頁第７行及び第１６頁第１５行Ｋ、「検体
２５μｌ」とあるのを 「検体５０μ・ｌ」と訂正する０ （Ｂ）第１２頁第９行及び第１６頁第１７行に、「２５
μｌ」とあるのを 「５０μｌ」と訂正する。

以　上 ２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スチレンを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開始剤と
   して重合させ重合体粒子の懸濁液を得る工程、該懸濁液
   をアルカリ性の条件下で加熱処理する工程、そして該懸
   濁液を塩素化処理する工程を包含する診断試薬用ラテッ
   クスの製造方法。 ２、前記アルカリ性条件下での加熱処理が５０〜１００
   °Ｃにて５〜３０時間行なわれる特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ３、前記塩素化処理が５〜６５℃にて０．３〜５０時間
   行なわれる特許請求の範囲第１項に記載の方法。