JPS60243022A - インタ−リユ−キン療法に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 この発明はインターリューキン療法に関するも−のであ
る。 〔背景技術および発明の記載〕 インターリューキン−２（以下、１．Ｌ−２と記す）は
、１９７６年に初めて発見された天然の蛋白質因子であ
る。これは抗原またはレクチンにより活性化されたＴ細
胞から生産され、■細胞の増殖にとって必要不可欠な因
ｒである。種々の構造を有するＩ　Ｌ　−，２は、例え
ばマウス並ひにてながさる（　ｇｉｂｂｏｎ　）　、ひ
とにさる（ａｐｅ　）およびひとのような霊長類等多く
の動物種から単離されてきた。ひとおよび他のＩＬ−２
は、末梢血液リンパ球、扁桃リンパ球、ひ臓リンパ球、
１−細胞白血病およびＴ細胞ハイブリドーマ培養物のよ
うな種々の原料から精製されてきた。 前述したようにＩＬ−２は゛ｒ細胞の増殖にとって必要
不可欠な因子であり、これ自体は体内の免疫応答機構に
密接にかかわるものである。ｉｒ・−２は、治療」−１
無限の広がりをもつ潜在能力を有するものと思われる。 特ｔこ、Ｉ　Ｉ−−−２は例えばＨｍ瘍抗原に対する抗
原特異的Ｔ細胞を増殖させるものであり、これらＴ細胞
はｌ餓瘍の成長を抑制することができるので、腫瘍の治
療に有効である。また、１Ｉ−−２は、ガンマ−インタ
ーフェロンの産生を誘発し、ナチュラルキラー細胞を活
性化することが知られている。また、Ｉ　Ｌ−２は、新
生物疾患、バクテリアまたはウィルス感染症、免疫不全
症、自己免疫疾患などのような免疫学上の疾患に対して
様々な適用性を有すると思われる〔ビー・ヘーハーマス
ター等、アドブ・イムノファーム（Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｐｈａｒｍ、　）　、１９８０年、５０７頁参照〕。 遺伝子工学の出現以前は、インターフェロンのような他
の天然の産生物と同様に、ＩＬ−２は少量でしか得られ
なかったゆ しかしながら、他の蛋白質（例、ガンマ−インターフェ
ロン）に関して以前に発表されたものと類似の方法体系
により、ひとＩＬ−２１Ｃついてのクローン遺伝子の構
造決定および表現がなされた〔ニス・タニグチ等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（１９８３年）３０２巻、
頁３０５〜３１０１およびヨーロッパ特許公開第９１５
３９号（この２つの内容を引用して説明の一部とする）
参照〕。この特定のＩＬ−２については、以下公知の１
Ｌ−２と称する。 ヌクレオチドの暗合化配列に基つき、ひとＩＬ＝２ポリ
ペプチドのアミノ酸配列、すなわち前記ネイチャー誌の
記事中第３ａ図で１〜１５３の番号付けされたアミノ酸
を含有する配列が推定されしたがって成熟したひとｔｔ
−２は、２１位のＡｌａから始まる１３３のアミノ酸で
構成されていることになる。 このひとＩＬ−２の構造は、これまで当研究所および他
の研究所で確認されてきた。 また、組換え体ＤＮＡ技術を用いて異なる構造のＩＬ−
２を製造することも可能である。例えば、前述のヨーロ
ッパ特許公開、特にその２３〜２５頁で記載されている
ような、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠けているか
、または他のアミノ酸と置き換えられている、ひとＩ　
Ｌ−２ポリペプチドの修飾体は、ひとＩＬ−２遺伝子に
対応する修飾を施して製造する。例えば、所望により、
システィン残基を、例えばシータス（Ｃｅｔｕｓ）ヨー
ロッパ特許公開第１０９７４８号およびベルギー国特許
第８９８０１６号に記載されている（ここに、その内容
を引用して説明の一部とする）、例えばＩ　Ｌ　−２−
セリン−１２５のように、セリンのごとき他のアミノ酸
と置き換えることができる。 このようなインターリューキン類のさらに別の例がＰＣ
Ｔ特許公開ＷＯ３５１００８１７に開示されており、こ
こに、その内容を引用して説明の一部とする。これらに
は、ｌ　Ｌ−２ＧＩｎ　−２６、Ｉ　Ｌ−２Ｐｈｅ−１
２１およびＩＬ２Ｓｔｏｐ１２１が含まれる。 さらに、てながさる、ひとにざるのような異なる原料由
来のＩ　Ｌ−２が組換え体ＤＮＡ技術により製造され、
またこれらの修飾体も同様の方法で製造される。また、
すでに述べたようにｌ　Ｌ−２は天然原料から（比較的
少量ではあるが）単離されるものであり、例えば糖蛋白
質化において組み換え体ＤＮＡ技術により製造される生
成物とは異なる。ざらに対立遺伝子変異体も生産される
。 また、Ｉ　Ｌ　−２類を、例えば誘導物質の存在下にお
いてひとの細胞を培養することにより製造することもで
きる。これらの例としては、デンマーク国特許出願第３
３１７／８４号およびヨーロッパ特許公開第１３２３５
９号に記載されているように、１Ｌ−２Ａ−１、Ｉ　Ｔ
−−２Δ−２、ＩＬ−２ｎ−１、ｔｒ−−２ｒ〜−２な
どが挙けられるが、これらの内容をここに引用して説明
の一部とする。 以下に用いる［インターリューキン」の語は、天然原料
から単離されるものであろうと、合成または生合成法に
より製造されるものであろうと、ＩＬ−２活性を有する
任意のポリペプチドを意味し、この明細書で既に記載さ
れているものを含むがこれに限定するわけてはない。こ
の発明によると、好ましいインターリューキンはひとＩ
　Ｌ　−２またはその修飾体であり、組換え体１）　Ｎ
　Ａ　０：により製造されるものが好ましい。インター
リューキンを実際に使用する場合、例えば静脈注射によ
る注入が試みられてきた。これらの試みの結果、例えば
ひとｉｔ、２には５分間未満という非常に短い半減期し
かないことがわかった。充分長い作用期間をもたらすイ
ンターリューキンの持効性非経口的投与形態が明らかに
必要であるが、しがしなから、これまでのところインタ
ーリューキンに関する個々のガレヌス剤形についてはほ
とんど発表されなかった。 さらに、当研究所で実施した試みの結果、例えば静脈内
投与のような投与法でもなおＩ　Ｌ　−２活性を示すリ
ポソーム形態中に、インターリューキンを含有させ得る
ことか判明した。さらに、この発明のリポソームは半減
期がこれまでより長いものであり、受動的に、ひ臓、肺
、骨髄またはリンパ節中４こ働きかけるものである。 したがって、この発明はインターリューキンを含有する
リポソームを提供するものである。 この発明によるリポソームは、リポソーム形成物質にイ
ンターリューキンを封入することにより製造することが
できる。 リポソームは、完全に密閉された２層膜（２分子膜）で
あり、その中にインターリューキンと共に水相を含有し
ている。インターリューキンは氷山および／または膜体
中ｌこ存在し得る。これらは単一ラメラ小胞、または水
層により互いに分離された同心膜性二層構造体の少ラメ
ラ（少重層）または多ラメラ（多重層）小胞の形をとり
得る。 これらは多くの異なる方法で製造され得るが〔エフ・シ
ョカおよびデー・パパハショポウロス、［リポソームズ
・アンド・ゼア・ユーズイーズ・イン・バイオロジー・
アンド・メディシン（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｔ
ｈｅｉｒ　ｕｓｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ　）コ、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨ
ーク・アカテミー・オブ・サイエンシーズ（Ａｎｎ、Ｎ
、　Ｙ、Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、　）　３　Ｑ　８巻、
１〜４６２頁（１９７８年）、およびアール・エル・ジ
ュリアノおよびディー・レイトン、ドラッグ・デリバリ
−・システムの［リポソームズ・アズ・ア・ドラッグ・
デリバリ−・システム（Ｌｉ　ｐｏｓ　ｏｍｅｓａｓ　
ａ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　）　
Ｊ、１８９〜２３６頁、オックスフォード・ユニバーシ
ティ・インコーホレイテッド、ニューヨーク（１９８０
年）参照。これらの記載をここに引用して説明の一部と
する〕、この発明は特に興味ある特性を有するリポソー
ムを堤供するという点で好ましいものである。すなわち
、この発明の方法で製造されたリポソームは、例えばイ
ンターリューキン漏出に対して特に安定しているため、
この発明の方法は商業生産に好適なものである。 リポソーム類は、小胞壁を形成し得る種々の脂質から作
ることができる。好ましい脂質としては、天然レシチン
（例、卵または大豆レシチン）、合成レシチン、ケファ
リン類およびスフィンゴミエリン類のようなホスホリピ
ドが含まれる。別のものとしては、他のホスファチジル
コリン類、ホスファチジン酸、リソホスファチジルコリ
ン類、スフィンゴリピド類、ホスファチジルグリセリン
、カルシオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類および
セレブロシド類が用いられ得る。 レシチンの例には、西ドイツ国ハンブルク２８在ルーカ
ス・マイヤー社市販のエピクロン（ＥＰＩＫＵＲＯＮＳ
）がある。−例としては、次の成分を含有するものがあ
る：ホスホリピドとして、ホスファチジルコリン４４〜
７％、ホスファチジルエタノールアミン２２〜２５％、
ホスファデジルイノジットＯ〜２％、脂肪酸として、飽
和：パルミチン酸９〜１１％、ステアリン酸２〜４９６
、不飽和：リノール酸６３〜６７％、リルン酸５〜８％
、オレイン酸１４〜１８％。この例はエピクロン１４５
Ｖとして知られている。 また別の例には、エピクロン２００として知られている
、次の成分から成るものかある：ホスファチジルコリン
９５％以」二（例、９５〜９８％）および主として例え
ばオレイン酸１０〜１２％、リノール酸６２〜６５％、
リノール酸５〜６％というような不飽和酸並びに例えは
パルミチン酸１５〜１７％、ステアリン酸３〜４９６の
ような飽ｍ酸、。 成分として不飽和酸を高率で含有するのが好ましい。所
望により、レシチンとして例えばステアリン酸のような
飽和酸を高率で含みホスファチジルコリンを９５９６ま
たはそれ以上含むもの、例ン〜ヤ・ホスフィチド・エフ
シー９５（ＳＯＪＡＰＨＯ５Ｐ■１１ＴＩＤ　Ｎｃ９５
）または医薬用途に適した純粋な均等物、例えば西ドイ
ツ国ケルン在、ナラチルマン・ヘミ−・ゲゼルシャフト
・ミツト・ベシュレンクテル・ハフラング市販のものを
用い得る。 合成ホスホリピドは、ヒドロキシル基、分校状炭素鎖環
状誘導体、芳香族誘導体、エーテル類、アミド類、ポリ
不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体のような変形脂肪族部
分、または炭水化物、グリコール、ホスフェート、ホス
ホネート、第四級アミン、スルフェート、スルホネート
、カルボキシ、アミン、メルカプトおよびイミダゾール
基を、例えばシミリストイル−、ジパルミトイル−また
はジステアロイル−ホスファトコリン誘導体の場合のよ
うに、含有してもよい。 所望により、最終的なリポソームにおいて、二層膜が例
えばコレステロールのごときステロイドのような他の脂
質を例えば５０（モル）パーセントまで含んでいてもよ
い。 ｊｌ的なリポソームにおいてはコレステロールのような
ステロイドの存在する方が好ましい。脂質対ステロイド
の好適な重量比率は６：１〜１：１が適当である。 所望により、二層膜は、例えはジセチルホスフ工−ト、
ホスファチジン酸、タウロコール酸ナトリウム、ホスフ
ァチジルセリン（メルク、Ｍｅｒｃｋ）のごとき酸類の
ようなアニオン化合物または例えばステアリルアミンの
ごときアミン類のようなカチオン化合物等、混合率を増
加させるような添加物を１０（モル）パーセントまでを
含有する、レシチン、ケファリンまたはスフィンゴミエ
リンを含んでいてもよい。ホスファチジルセリン（例西
ドイツ国メルク社より入手可能）を用いるのが好ましい
。 脂質が余分の賦形剤を含有する場合、例えば反応容器中
で、メチレンクロライドに入れた脂質と賦形剤の溶液を
濃縮し、脂質をインターリューキンと混合する前に容器
の表向に脂質フィルムを形成させるのが好ましい。 リポソームは、インターリューキンが破壊されるのを妨
げるような穏やかな条件下で例えば超音波処理のような
例えば照射による、公知技術により製造することかでき
る。脂質の均質混合物は、例えばクロロホルムのような
好適な有機溶媒に例えばレシチンやコレステロールのよ
うな脂質を溶かした溶液を形成することにより製造され
る。次いで反応容器中の溶液を濃縮して脂質フィルムを
化成する。 常套方法により、リポソームを単離し、滅菌することが
できる。 この発明により得られたリポソームにおいて、インター
リューキンの濃度は、水相１ミリリツトル中約５〜約５
００マイクログラム、好ましくは２０〜２００マイクロ
グラム／ミリリツトルである。 脂質濃度は、好ましくは水相１ｒｎｌ中約１〜約２００
ｍ２、特に１０〜１００ｍ７／ｒｎｌである。 次の処理に用いるリポソームの平均直径は、好ましくは
約２５ナノメートルないし２０ミクロン、特に好ましく
は１００〜５００ナノメートルである。 最終的なリポソームは、例えば−２０℃〜」−５℃の低
温中で保管するのが好ましい。 貯臓性を改良するためには、この発明によるリポソーム
を例えば担体物質としてマンニトール、シュクロース、
ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを用いて例えば凍
結乾燥することにより乾燥粉末にすればよい。その場合
工程Ａｂ）　に関して後述する凍結乾燥の場合と同じ条
件下で行なえばよい。使用する前に、滅菌水を加えてリ
ポソームを再構成する。次いで、このリポソームを、例
えば静脈注射液または注入液に適した系と混合する。 リポソームの純度は従来の分析技術で測定することがで
きる。 所望により、生成したリポソーム中に酸化防１Ｌ剤が例
えば脂質の１％以内好ましくは０．１％存在していても
よい。好ましい酸化防止剤には、ビタミンＥ（酢酸トコ
フェロール）、ビタミンＣ（パルミチン酸塩）およびＢ
　ＨＴ　（ブチル化ヒドロキシトルエン）がある。 他のインターリューキン安定剤として、例えばマンニト
ール、アラビノース、ソルビトールもしくはシュクロー
スなどの糖、または例えばひとセリン（血ａ）アルブミ
ンのようなアルブミンを用いることができる。これらの
安定剤は、リポソーム形成前に緩衝液中に混入すること
ができる。好ましくは、これらは生成したリポソーム中
脂質の２０％モル重量以内で存在し得る。 好ましいリポソーム形成方法は、以下の工程からなる方
法ａ）である： Ａａ）　有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液
を形成し、 Ａｂ）　溶液から溶媒を除去して残留物を得、Ａｃ）　
緩衝液に残留物をけんだくし、Ａｄ）　ＩＪポンームか
生成するまでけんだく液を攪拌、ホモジネート化し、そ
して Ａｅ）　リポソームを単離する。 工程Ａａ）　において、「溶液」の語は、乳液のような
「プソイド（擬似）」溶液を包含する。しかしながら、
均質澄明な溶液を製造する方か好ましい。インターリュ
ーキンおよび脂質を溶解または可溶性にするならばいず
れの溶媒系でも用いることができる。この系は単一溶媒
でも複数の溶媒の混合物でもよい。また例えば１５％以
下の水を含み得る。所望により界面活性剤か存在しても
よい。溶媒系は、濃縮ｌこより脂質から除去され得る適
当な有機溶媒を包含することができる。広節な種類にお
よぶジエチルエーテルやジイソプロピルエーテルのよう
なエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類、メタノ
ールやＥ−ブタノールのようなアルコール類、およびメ
チレンクロライドやクロロホルムのようなハロゲン化炭
化水素類を用いることができる。所望により酢酸が存在
してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロライドま
たはｔ−ブタノールを用いるのか好ましい。 工程Ａ、ｂ）　において、高度真空下の場合は

【−ブタ
ノール、低度真空下の場合はメチレンクロライドが好ま
しいことが判明した。 工程Ａｂ）の場合、インターリューキンの感受性に留意
しながら多くの常套手段により溶媒を除去し得る。好ま
しいものとしては、例えば１０〜５゜Ｈｌ−１ｇの低度
真空下で濃縮するか、または例えば、０、ｌｍｍＨｇの
ような５　咽Ｈｇ以下の高度真空下で凍結乾燥を行う手
段がある。 この発明によると、凍結乾燥の方が特に好ましいことか
判明した。 この工程は好ましくは室温より低い温度で行ない、濃縮
される混合物が周囲より約１〜３℃低くなるように減圧
状態および温度を調整する。このような調整は従来方法
で行なえばよい。凍結乾燥の典型的プログラムは約−６
０℃で始まり、１２時間かけて一１５℃まで上昇させる
。次いで温度を＋１０℃まで上昇させたまま２時間維持
する。 工程Ａｃ）の場合、用いる緩衝液は例えばｐＨ４〜７（
例、５〜６．５）のりん酸緩衝液が好ましい。好ましく
は、水相は例えば３００モスモル／リットル以下、特に
２９０モスモル／リットル以下の低浸透性である。生成
したけんたく液は、好ましくは約０．００１〜約０．２
ｇ脂質／ｒｎｌを含有する。 工程Ａｄ）の場合、超音波照射によりホモジネート化を
もたらす。このような照射の好適な周波数は例えば３０
〜８ＱＫＩ（ｚ　である。通常の出力はホモジネート化
または攪拌される混合物約］〇−あたり２００〜４００
ワツトである。当然のことながらホモジネート化される
混合物を、金属による汚染を避けるため超音波発生器に
付随するチタニウム他の金属から離すことか好ましい。 温度は好ましくは約１０〜７０℃である。不飽釦脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は６０〜７０℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポ゛ノームの乳液が生
成する。 所望により、超に波処理後、例えば１００００〜２７０
０Ｏｒｐｍ　の速度で高床機械的攪拌器を用いて攪拌を
してもよい。しかしながら、この作業は省いた方が好ま
しく、ホモジネート化の場合と同じ条件下で、また超音
波処理により攪拌した方がよい。 工程Ａｅ）では、この発明のリポソームを常套技術、例
えば限外瀘過、遠心分離、イオン交換またはゲルクロマ
トグラフィー、透析などにより単離する。好ましくは例
えば０１１〜１ミクロンの微細孔のフィルターを通して
リポソームを沖過、滅菌することができる。所望により
、このｒ過を、脂質の相転移点より上の、例えば３０〜
７０℃の温度で行なう。好ましくはリポソームを例えば
１００００〜２００００ｇの高速遠心分離により単離す
る。 方法ａ）の例： ３′ａ）インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 ａ’ｂ）濃縮により水と有機溶媒を除去し、ａ’　ｃ）
　ｐＨ４〜７の緩衝液に残留物を吸収させてけんだく液
を得、 ａ’ｄ）けんだく液に超音波を照射してリポソームを形
成させ、そして ａ’ｅ）　リポソームを単離する。 方法ａ）の別の例： ａ’ａ）インターリューキンの親水性溶液と有機溶媒に
溶かした脂質を混合し、 λ’ｂ）混合物を凍結乾燥Ｌ７て凍結乾燥物を得、ａ’
ｃ）凍結乾燥物を緩衝ｒｉ、（ＰＨ４〜７）にけんだく
し、 ａ’ｄ）リポソームおよび／または集塊が生成するまで
溶液を攪拌し、 ａ　／　ｅ　）機械的手段により混合物をホモジネート
化し、そして ａ’ｆ）　リポソームを単離する。 これらの方法は、方法ａ）と類似の方法で行なえばよい
。 一方、この発明は、次の工程からなるインターリューキ
ン含有リポソームを製造する方２１）を提供する： ｂａ）インターリューキンの水性を基礎とする溶液と脂
質の有機溶液を混合し、 ｂｂ）ある程度リポソームおよび／または集塊か形成さ
れるまで混合物を超音波処理に付し、ｂｃ）例えば、 ｂｉ）Ｕ合物から有機溶媒を除去してゲル状中間相を形
成し、そして ｂｌｌ）ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回収する。 工程ｂａ）において、「溶液」の語は、乳液のような「
プソイド（擬似）」溶液を包含する。しかしながら、均
質澄明な溶液を製造するのが好ましい。脂質を溶解また
は可溶性にするものならいずれの溶媒系を用いてもよい
。この系は単一溶媒または複数の溶媒の解合物であり得
る。また例えば１５％以内の水を含んでいてもよい。所
望により、界面活性剤も存在し得る。 溶媒系は、蒸発により脂質から除去される適当な有機溶
媒を含むことができる。広範な種類のジエチルエーテル
やジイソプロピルエーテルのようなエーテル類、酢酸エ
チルのようなエステル類、メタノールや第三級ブタノー
ルのようなアルコール類およびメチレンクロライドやク
ロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類を用いること
ができる。 所望により酢酸が存在してもよい。第三級ブタノールま
たは好ましくはジエチルエーテルまたはメチレンクロラ
イドを用いるのが好ましい。 インターリューキンを水または好ましくはｐＨ４〜７，
４（例、５〜６．５）の水性緩衝系に溶解する。 水性緩衝液は例えば３００モスモル／リットル以−ド、
特に２９０モスモ、ｖ／’Ｊットル以下の低張液が好ま
しい。得られた混合物は好ましくは１　ｍｂ当たり約０
．００１〜約０．２ｇの脂質を含有する。 工程ｂｂ）の場合、照射は超音波により行なうことがで
きる。このような照射の周波数は例えば３０〜８ＱｋＨ
ｚであり得る。通常の出力は照射される混合物の各々１
０−に対して２００〜４００ワツトである。当然のこと
ながら、金属による汚染を避けるため照射される混合物
を超音波発生器のチタニウムや他の金属から離すのが好
ましい。 温度は好ましくは約１０〜７０℃である。不飽和脂質の
場合は室温、飽和脂質の場合は６０〜７０℃が好ましい
。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳濁液が生
成する。 従来方法でリポソームを回収するととができ、最も収率
を良くするように処置する。 工程１）において、有機溶媒を例えば１０〜６００ｍ　
ｍ　ｌ−Ｉ　ｇ　の低度減圧下で除去するのが好都合で
あり、水相のほとんどはそのまま残る。例えば室温また
は例えば４５℃までの僅かな加温といった低温が好まし
い。 工程１１）において、得られたゲル状中間相を水または
所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製造す
る。 一方、この発明は次の工程からなるインターリューキン
含有リポソームを製造する方法Ｃ）を提供する： Ｃａ）インターリューキン、ｐＨ４〜８の水性に基つく
緩衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 ｃｂ）得られたけんだ（液に超音波を照射してリポソー
ムまたは集塊を形成し、および ｃｃ）例えば ｃｉ）例えばゲル状中間相により、混合物から溶媒を濃
縮し、および Ｃ１１）ゲル状中間相をリポソームに転化することによ
り混合物からリポソームを回 収する。 工程ｃａ）ｌこおいて、「溶媒」の語は、乳液のような
「プソイド」溶液を包含する。しかしなから、均質澄明
な溶液を製造するのか好ましい。脂質を溶解または可溶
化するものならいずれの溶媒系を用いてもよい。この系
は単一溶媒または複数の溶媒の混合物であり得る。また
例えば１５％以下の水を含んでいてもよい。所望により
、異聞活性剤が存在してもよい。溶媒系は、濃縮により
脂質から除去され得る任意の適当な有機溶媒を含み得る
。 広範な種頓のジエチルエーテルやジイソプロピルエーテ
ルのようなエーテル類、酢酸エチルのようなエステル類
、メタノールや第三級ブクノールのようなアルコール類
およびメチレンクロライドやクロロホルムのようなハロ
ゲン化炭化水素類を用いることができる。所望により酢
酸が存在してもよい。ジエチルエーテル、メチレンクロ
ライドまたは第三級ブタノールを用いるのが好ましい。 粉末形態のインターリューキンを用いることができ、例
えばその粒径は、直径６０ミクロンの最大粒径を有する
ものが好都合である。 工程ｃａ）の場合、用いる緩衝液は例えばｐｉ−ｉ３Ｎ
４．４、特に４〜７、特に５〜６．５のりん酸緩衝液が
好ましい。好ましくは水相は例えば３００モスモル／リ
ットル以下、特に２９０モスモル／リットル以下の低張
液である。生成したけんたく液は好ましくは１ｒｎ！当
たり約０．００１〜約０．２ｇの脂質を含有する。 工程ｃｌ））の場合、超音波により照射を行なうことが
できる。このような照射の好適な周波数は例えば３０〜
８０ｋＨｚである。通常出力は照射される混合物約１０
１ｎｌに対して２００〜４００ワツトである。当然のこ
とながら、金属による汚染を避けるため照射される混合
物を超音波発生器のチタニウムや他の金属から遠ざける
のが好まし温度は好ましくは約１０〜７０℃である。不
飽和脂質の場合は室温、飽和脂質の場合は６０〜７０℃
が好ましい。 この段階の間に集塊をともなうリポソームの乳液が生成
する。 従来方法によりリポソームを回収ずれはよいが、リポソ
ームの収率を最高にするような処置をとるべきである。 工程ｃｉ）において、例えば１０〜６００ｍｍＨｇの圧
力で例えば水流ポンプを用いて低度減圧下に有機溶媒を
除去するのが好便であり、一方はとんどの水相はそのま
ま残る。例えば室温または例えば４５℃以下の僅かな加
温といった低温が好ましい。 工程Ｃ１１）ｔこおいて、生成したゲル状中間相を水ま
たは所望により前述の緩衝液で処理してリポソームを製
造する。 けんだく液が生成し得る。所望によりさらに濃縮して有
機溶媒および酸リポソーム形成物の残留痕跡を除去する
。 この発明によるリポソームを、さらに例えば工程ａｅ）
の方法のように従来技術により単離する。 リポソームの純度は従来技術により測定することができ
る。 リポソーム中のインターリューキンの混入状態を測定す
るために、予備精製の粗製混合物を希釈し、例えば３〜
２４時間遠心分離を行ない、上清液中のインターリュー
キンの量を測定する。欠に残留したインターリューキン
をリポソーム沈澱物にとり込む。 さらに、後の実施例で記載するように、標準的高速液体
クロマトグラフィー技術により精製リポソーム中のイン
ターリューキン混入量を測定することができる。 また、投与後の本発明によるリポソームの分布を例えば
動物試験における従来の薬物動力学技術により追跡する
ことができる。よう素−１２５とインターリューキンを
反応させるか、または例えば硫黄３５により放射能で標
識付けしたアミノ酸からインターリューキンを製造する
ことにより、放射性インターリューキンを生成する。例
えば炭素−１４により放射能で標識付けした脂質から製
造されたリポソーム中にこのインターリューキンを混入
し、マウスに注入する。１時間後マウスを殺し、例えば
ひ臓のような各々の脂管に存在する放射能の量と型を測
定する。 この発明のリポソームは、インターリューキンについて
公知の、様々な適用形態に使用され得る。 これらの適用として、培養および他の試験管内実験にお
ける動物細胞の成長促進用途があり、また種々の状態を
処置するための治療用途もある。 バイオアッセイ試験として徒述する一試験τ（才、マワ
スーＴ　＝　ＩＪ　７バ球＃Ｉ胞系列（に　’Ｉ’　Ｉ
−Ｌ細胞ジ増殖のインターリューキン濃度依存刺激作用
に基づいてインターリューキンバイオアッセイを行なう
〔ニス・ギリスら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（
Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏｌ　、　）　１９７８年、１２０巻
、頁２０２７〜２０３２参照〕。 インターリューキン依存細胞培養のＴ細胞を洗浄してＩ
Ｌ−２を除去し、この発明によるリポソームで処理し、
Ｉ　Ｌ−２不含有培地でインキユベートシた。次いで試
験細胞を常套的な系列希釈試験（希釈培地ＲＰＭＩ　−
１６４０，１０％うし胎仔血清を追加）に付した。２４
時間にわたるインキュベーション後、リポソーム濃度の
増加に対応する細胞増殖状態を測定した。各希釈液につ
いて２．１０５の細胞を用いた。。 増殖は〔３Ｈ〕−チミジンの混和または光度測定ＭＴＴ
試験により測定する（ＭＴＴ　＝　３’　（’４．５−
ジメチルチアゾールー２−イル）−２，５−ジフェニル
テトラゾリンプロミド〕。生きている細胞の黄色ＭＴＴ
を対応する暗青色ホルマザンに変換し、これを酸性イソ
プＩ７バノール；ご溶解後分光化学的に測定する。 最大増殖率の５０％を示すサンプルの希釈液を測定する
。この発明によるリポソームの活性は、純粋なインター
リューキンの活性の約１，２〜２０倍以下である。前記
試験において１，３０ｇ／ｍｌ　より太き（宿性を有す
るリポソームを用いるのが好ましい。 また、■−リンパ球細胞が低下したマウス、例えばヌー
ドマウスにおけるＩＬ−２活性の標準的生体内試験によ
り、活性を確認することができる。 一つの試験では、９０■／ｋｇ　のシクロスポリンＡを
毎日投与してこのようなマウスを製造し、これをひつじ
赤血球（ＳＲＣ）で免疫処置すると、シャーンプラーク
細胞形成アッセイによりひ臓中の特異的抗体細胞（ＰＦ
Ｃ）の数が減少する（８０〜９７％）。抗原を静脈注入
した後、マウスを数群に分け（１群当たり動物６〜７匹
）、５日間にわたり１日２回皮下注射または好ましくは
静脈内注射により約２〜５マイクログラムのＩ　Ｌ　−
２を含有する用量のＩＬ−２製剤を与える。シャーン試
験によりひ臓中の特異的抗体細胞の数を測定して動物の
免疫回復を測定した。この発明のリポソームの活性は、
封入されていないインターリューキンと同じオーダーを
有する。 この発明のリポソームは、例えば本明細訂の冒頭で述べ
たようなインターリューキンに認められる免疫調整特性
に基づく特に興味ある治療用途、特に、重度複合免疫不
全症候群（ＳＣＩＤＳ）、後天的免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）、老齢による免疫不全症状および先天的免疫不全
症のような免疫不全に起因する状態の処置用途に用いる
のが好ましい。しかしながら、またインターリューキン
は、サイトメガロウィルス感染症およびヘルペスウィル
ス感染症のような種々のウィルス性疾患の処置、ならび
に結核やハンセン氏病のようなバクテリア感染症の処置
における抗真菌剤として用いることができる。これらの
治療用途に必要なリポソームの用量は、処置される状態
、症状の重さ、混入されたインターリューキンの効力や
量などの公知の要因により異なる。 しかしながら、０．１μｇ〜３０μｇ／ｋｇ　体重の範
囲のインターリューキンの１日用量を例えば人間の患者
のような哺乳動物に投与すると、一般に満足すべき結果
が得られる。一般ζこ好適な無菌媒体を用いた静脈内投
与が好ましい。 インターリューキンは、培養におけるＴ細胞成長促進能
力に基づく広範な種類の個別用途を有するが、その中に
は診断法および補助的治療処置における適用がある。診
断法上の用途は、尺度として細胞中における放射性チミ
ジンの取り込みを用い、インターリューキン添加後の試
験管内における一ｆ　ＩＪンパ球成長の程度を測定する
ことにより、ある種の病気の存在を検出するという公知
の能力に基つく。抗腫瘍処置のような補助的治療処置を
行なう場合、インターリューキンは、患者または他の融
和性ドナーから得た”［’　ＩＪンパ球の成長を試験管
内で促進するのに用いることができ、次いて得られた増
殖リンパ球を患者に再注入し、闘病を補助することにな
る。一般に、培養および他の試験管内実験においてＴ細
胞の成長を助けるのに用いるインターリューキンの量は
、その活性およびその系におけるひとインターリューキ
ンとの比較に関する文献から決定され、日常的な研空に
より、特定な状況に対して最も有効に用いられる。 以下、実施例によりこの発明を説明する。 以後用いられている「レシチン」の語は大豆レシチンを
指す。 特記しない限り、超音波放射は５０Ｋ）Ｉｚおよび３５
０Ｗで行なう。 工程Ａ 実施例Ａ１ リポソームの製造 ２”ＱのひとＬＬ−２を酢酸１ｍＡ’に溶かす。精製レ
シチン１グラムを別に第３ブタノール５ｍｇに溶かす。 ２つの溶液を一緒に混合し、−３０℃で凍結乾燥して５
凍結乾燥物を得る。この凍結乾燥物を、０．０５Ｍ％酸
緩衝液（１１５）に１０ＲｅにｆＸるまて吸収させ、け
んだ〈液をつくる。 けんだく液に５分間浴中て超音波を照射する。 つぎにけんだく液を窒素気流１約１５００　Ｏｒｐｍの
速度で高速撹拌器〔タイプ・ポリトロン・タイ７　（Ｔ
ｙｐｅ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　Ｔｙｐｅ）１０−３０　〕
を用０て１５分間ホモジネート化する。次にリポソーム
溶液を、レシチンの相転移点よりも高い温度、例えば２
０℃で滅菌フィルター（０，２ミクロン月こ抑圧する。 次に得られたリポソーム溶液を凍結乾燥する。 所望により、高速撹拌段階を省いてもよく、また照射を
１５分間続けてもよく、および／またはリポソームを遠
心分離により単離してもよい。 リポソームの分析 従来の逆相高速液体クロマ１グラフイー（１−Ｉ　ＰＬ
　Ｃ）　技術を用いてこの発明のリポソームを分析する
。 米国フローリー・ラボラトリーズ・インコーホレイテッ
ド市販の広い孔（約３００オングストローム〕の球状ｃ
＝、Ｂ炭化水素支持材、１０ミクロン〔例、カラム　技
Ｐ３００アクアポア（Ａｑｕａ−ｐｏｒｅ）　２０　Ｘ
　４．６　ｍｒｎ　〕　を用いるのか好ましい。 好ましい溶シＷ剤系は、０，１％トリフルオロ酢酸含有
水／アセトニトリル勾配系であり、例えは次の２つの溶
離剤形を用いる： 系Ａ２５０％アセトニトリル、ｌ−１２０（＋０．１チ
ドリフルオロ酢酸９ 系８１７０％アセトニトリル、１（２０（＋０．１饅ト
リフルオロ酢酸）。 模範的な流速は３ｒＩＬｅ／分で、１０分間にわたり１
００パーセント系Ａ〜１００パーセント系Ｂの勾配を有
する。このような好ましい条件丁、ひとＩＬ−２は約７
．５分の保持時間で溶離し、インクＩＪニーキンの量は
常法によるピークの集積によって得られる。 １−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃの前に、この発明のリポソームを以
下のように予備処理する： リ　Ｐ！（２，５〜４の酢酸緩衝液による希釈、その後
、リポソーム物質はインターリューキンを放出しなから
１−ｔ　ｐ　ｒ−ｃカラム上で分解する。 ｎ）　リポソームに混入されたインターリューキンから
リポソーム賦形剤を徹底的な除去、ホスホリピドを除去
するための例えば水およびメタノール／メチレンクロラ
イドの使用１次いで得られたインターリューキン含有水
溶液の注入。 Ｆｉ）　カラム切替技術により、この発明のリポソーム
に混入されたインターリューキンからリポソーム賦形剤
をカチオン型イオン交換剤上で分離する。その後インタ
ーリューキンをカチオン型イオン交換剤から逆相カラム
へ溶出して常法によりクロマトグラフィーに付す。好ま
しいカチオン型イオン交換剤カラムは３０　Ｘ　４．６
　ｍｍ　の大きさを有し、１０μｍの支持物を詰めこん
だものである（米国ブローリー・ラボラトリーズ・イン
コーホレイテッド市販のＳＣ×１０）。 リポソームは、ひとｊＬ−２の約５０％を含有している
ことが見い出されている。 活性および用途 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験の場合のひと
ＩＬ−２それ自体と同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例Ａ２ リポソーム（ｖ３）の製造 ０．５■のひとＩＬ−２を酢酸１ｍｅ＋ご溶解する。 レシチン（エピクロン（ＥＰＩＫＵＲＯＮ　）１４５　
Ｖ　）　５００〜を別に【−ブタノール５０ｍｇに溶解
する。この２つの溶液を一緒に混合し、約１６時間にわ
たり一１５℃で凍結乾燥して、凍結乾燥物を得る。この
凍結乾燥物を０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐｉ（６，５）
に吸収させてＩｏｎ／！とし、けんだ〈液を得る。 このけんだ〈液に室温（約２０℃）で５分間浴槽内で超
音波を照射する。次いでけんだく液を室温において約１
５００Ｏｒｐｍの速度で高速撹拌器（タイプ・ポリトロ
ン　ＰＴ１５）を用いて１０分間ホモジネート化する。 リポソームを４時間４℃、１５００００ｇで遠心分離に
より単離する。 実施例Ａ３ リポソームの製造 超音波放射および室温の代わりに７０℃の温度で高速撹
拌ホモジネート化を行ない、実施例Ａ２を繰り返す。こ
こで用いるレシチンは、ソーヤ（大豆〕ホスファチドＮ
Ｃ９５Ｈであった。遠心分離時間は２時間であった。 実施例Ａ４ リポソームの製造 ０、５１ｎｇのひとＩＬ−２、レシチン（エピクロン（
ＥＰＩＫＵＲＯＮ）１４５　Ｖ　）　４５０　’？およ
びホスファチジルセリン５０■を【−ブタノール１０ｍ
ｅと一緒に混合し、室温で１０分間照射して溶液を生成
する。これを約１８時間−４０℃で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を形成する。 この凍結乾燥物を、１０ｒｕｌ！となるまて０．０５Ｍ
りん酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，’３　）に吸収させてけんだ
く液を得る。室温（２０℃）で１０分間浴槽中てこのけ
んだ〈液に超音波を照射し、次いで１０分間実施例２の
場合と同様ホモジネート化する。リポソームを４°Ｃ１
１’　５００００　！で、４時間遠心分離して単離する
。 実施例Ａ５ リポソームの製造 レシチン４５０■とホスファチジルセリン５０■の代わ
りにレシチン５ｏｏｖｔを用いて実施例へ４を繰り返す
。 実施例Ａ６ リポソームの製造 レシチン４５０”？とホスファチジルセリン５０〜の代
わりにレシチン４２５叩とコレステリンフ５ｍ９を用い
て実施例Ａ４を繰り返す。 実施例Ａ７ リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例Ａ２を繰り返す。 超音波照射を１５分間続ける。 実施例Ａ８ リポソームの製造 高速撹拌工程を除き、実施例Ａ３〜６をそれぞれ繰り返
す。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析すると、１０％以下の純粋ひとＩ
Ｌ−２を含有していた。 生物学的活性 リポソームを、前述の試験（ニス・ギルスら〕にしたが
い、ＩＬ−２依存ＣＴＬＬ−（ｉ６）細胞における３〔
Ｈ〕−チミジンの混入に基づく系列希釈試験により分析
する。２４時間後に１０４の細胞の最大成長の５０％を
もたらすＩ　Ｌ　−２の濃度を製造後直ちに測定する（
値Ａ、’　ｔｒｙ／ｍｅ）。この試験においてリポソー
ム形成のための出発原料として用いるひとＩＬ−２それ
自体は０．２μｆｊ／ｍｅの値を示した。 結果 実施例　Ａ’（ｎｇ／ｍＩ）　Ａ２（ｎｇ／ｉｎｌ）Ａ
４（ｎｇ／ＩＴ１す８Ａ２　０．２　０．７　３．２ Ａ３　９．５　８．４　ｎｔ Ａ４　０．７　ｎｔ　ｎｔ Ａ５　２．６　ｎｔ　ｎ１ Ａ６　１，６　ｎｔ　ｎｔ Ａ７””　ｌ、Ｑ　ｎ　（（＋　Ｌ 注９　×：４℃の温度で４週間の貯蔵 ××：Ｒ初＋７）　Ｉ　Ｌ−２チャージ０．８”Ｖｍｌ
　活性ｎｔ＝試験されていない 上記生体内試験において、前記試験で試験管内活性１．
７　ｎｇＡＬ１３を有する実施例Ａ２の貯蔵バッチのリ
ポソームについて以下の結果が得られた。 免疫された非低　−１６７，０００１００％下マウス（
対照９ 低下マウス　−２８，０００１７％ ＩＬ−２物質　５　１１１．０００　６６％リポソーム
　５　９６．７００　５８％ＩＬ−２物質　２　９６．
７００　５８％リポソーム　２　８７．１００　５２％
実施例９ リポソームの製造 ０．５■のひとＩ　Ｌ−２を酢＃　１　ｍｌに溶かし、
この溶液をメチレンクロライド５０ｍ１に溶かしたレジ
チア５００”？（−ｒ−ピクロ：／（ＥＰＩＫＵＲＯＮ
）１４５Ｖ）の溶液に加える。 混合物を１時間１０〜５０ｍｍＨ９の減圧下３０℃の温
度で、次いで３時間５０℃の温度で回転エバポレータに
入れて濃縮し、脂質フィルムを得る。 このフィルムをｐｆ１５におけるりん酸緩衝液（０，０
２Ｍ　）　１０ｎｔｅに分散する。次いて、分散液を超
跨波浴槽に入れ、室温（２０℃って３０分間照射すると
、リポソームが生成する。 リポソームを４時間４０℃、１．５０００　ｆ／で遠心
分離により単離する。 実施例ＡＩＯ リポソームの製造 超音波放射処理を室温ではなく７０℃の温度で行なって
実施例９を繰り返す。ここで用いるレシチンはソーヤ・
ホスファチツク（Ｓｏｊａ　ｐｈｏｓｐｈａｔ　−’Ｃ
）ＮＣ９５ｓ−１であった。遠心分離を２時間行なう。 リポソームの分析 実施例Ａ４と同様にして分析を行なう。 結果 実施例　Ａ’　（ｎｇ／ｍＱ　Ａ　２（ｎｇＡｎ、ａＡ
　９　０．８　０．９ ＡＩＯ２，５３，５ 方法Ｂ 実施例Ｂ１ リポソームの製造 レシチン１００ｍＰをメチレンクロライド５ｍｇに溶か
し、丸底フラスコに入れる。０．’２”９のひと工Ｌ−
２，２０〜のＬ−システィンおよび０．０５Ｍりん酸緩
衝液（Ｐ　Ｉ−１５）　１　ｍｌｉからなる水溶液を加
える。混合物を２０℃で５分間超音波浴槽内で乳化する
（周波数８０ＫＩ−１ｚ）。 次いて乳液（予備形成リポソームおよび集塊をある程度
會有している〕を減圧下（２０〜３０ｍｒｎＨり２０℃
で濃縮し、得られたゲルを２ｒｕｅの緩衝液に加え、混
合物をゆっくり撹拌する。水性リポソームけんだ〈液が
生成する。 次の工程にしたがい、リポソームを非混合活性剤から分
離する； ａ）遠心分離（５分、２０°、５０００Ｇ）。非混合活
性剤が上清液に残留。リボソーｉ沈澱物を再けんだくす
る。 ｂ）ゲルカラムクロマトグラフィー〔バイオゲ／ｌ／　
（Ｂｉｏｇｅｌ　）　Ａ　１．５または一１＝７アデツ
クス（ｓ−ｅｐＨａｄｅｘ　）　Ｇ　５０を用いる〕。 リポソーム含有％ 溶出液を限外濾過または０．マ塩水に対する透析により
濃縮する。 得られたリポソームけんだ〈液を凍結乾燥する。 分析 リポソームは、約５０〜９０チのひとＩＬ−２を含有し
ていることがわかる。 活性および実用匹 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
ＩＬ−２そのものと同じ活性オーダーを示すことがわか
る。 実施例Ｂ２ リポソームの製造 ５００１ｎｇのレシチン（エピクロン１４５ｖ）をメチ
レンクロライド２００　ｔｒｔｅに溶かし、丸底フラス
コに入ｔＬルｏ　Ｏ，５”Ｐ（７）ひとＩＬ−２，１０
０ｍＷのし一システィンおよび０．０５Ｍのりん酸緩衝
液（ｐ）１５　）１０ｎｅを加える。 混合物を室温（２０℃）で１０分間、超音波浴槽中で乳
化する。次に得られた乳液（予備形成リポソームおよび
集塊をある程度含有しているりを減圧下（２０〜３０鰭
Ｈダ）１０分間３５℃で濃縮して得られたゲルに緩衝液
１０ｍ１を加える。混合物を室温で３０分間撹拌する。 リポソームを、４時間、４℃、１５００００ｇで遠心分
離により単離する。 実施例Ｂ３ リポソームの製造 実施例Ｂ２と同様に行なうが、ただし１０分間３５℃で
はなく５分間８０℃で濃縮する。ここで用いるレシチン
はソーヤ・ホスフェートＮＢ９５１−１であった。４時
間ではなく２時間遠心分離を行なった。 実施例Ｂ４およびＢ５ リポソームの製造 実施例２および３と同様にして行なうが、ただしＬ−シ
スティンは存在させない。 リポソームの分析 上清液 遠心分離後の上清液を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー技術により分析する。１０％以下の原形ひとＩＬ
−２を含有する。 生物学的活性 前述の試験（ニス・ギルスら）にしたがい、ＩＬ−２依
存ＣＩ−ＩＬ−（１６）細胞中の３　［Ｉ−１）−チミ
ジンの混入に基づく系列希釈試験により、リポソームを
分析する。２４時間後に１０４　の細胞の最大成長の５
０％をもたらすＩＬ−２の濃度を、製造直後（値Ａ０、
”Ｖｒａｌ！　）および４℃で貯蔵２週間後（値Ａ２．
　ｎｇ／ｒｒｔｅ）に測定する。この試験において、ひ
とＩＬ−２物質自体は０．２　ｎｇＡｅの値を示した。 結果 実施例　Ａ’　（ｎｇＡｕｌ）　Ａ２ＣｎｇＡｎｅ）Ｂ
２　０．８　２．４ Ｂ３　２０．０　３５．０ 方法Ｃ 実施例Ｃ１ リポソームの製造 精製レシチン５０マイクロモルおよびコレステロール５
０マイクロモルをクロロホルム２０ｍｅに溶かし、窒素
気流下回転エバポレータで濃縮する。 残留物をジエチルエーテル５ｍ／？に吸収させる。 ６００マイクログラムのひとＩＬ−２（例えば粒径５〜
５０ミクロンの粉末で）を加える。この溶液に、０．０
５モルのりん酸緩衝液１．５鮮を加える。 次に混合物を５分間５℃で超音波ブローベを用いて照射
し、ホモジネート化物を得る。生成した乳液を２段階に
分けて回転エバポレータで濃縮する。第１段階では圧力
は約４００トールＨｇであり、粘稠性ゲルが生じるまで
そのままにしておく。 このゲルを０．０．５　Ｍりん酸緩衝１（ｐ１４ｓ）１
．５ｒｒｔｅで処理し、軽く容器ごと振ると、水性けん
だ〈液が得られる。次いてこの水性けんだ〈液を室温お
よび常圧で１５分間第２濃縮段階に進め、リポソームの
不透明けんだく液を得る。 有機溶媒の最終痕跡を除去するために、イオン交換カラ
ム（セファデックス６５０）上で限外ｒ濾過を行なう。 リポソームの分析 リポソームは、約５０〜９０チのびとＩ　Ｌ　−２を混
入していることがわかる。 活性および実用性 リポソームは、前述のバイオアッセイ試験におけるひと
ＩＬ−２自体と同じ活性オーダーを示すことがわかる。 実施例Ｃ２ リポソームの製造 ５００ｍ７のレシチン（エピクロン（ＥＰＩＩ（ＵｋＯ
Ｎ）　１４５　Ｖ　）　オ、Ｊヒ’ｏ、５ｍｙノ０トＩ
　Ｌ−２をメチレンクロライド２０ａｌ！に溶かす。０
０５モルのりん酸緩衝液１０罰を加える。 次に混合物を室温（約２０℃って５分間、超音波浴槽内
で照射する。得られた乳液を、粘稠性ゲルが生じるまで
、１０分間３５℃で回転エバポレータに入れて濃縮する
。次に０．０５Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ５）１０ｍ、ｅを
加え、室温で３０分間容器を回転する。 ４時間４℃、１５００００ｇで遠心分離を行ない、リポ
ソームを単離する。 実施例Ｃ３ リポソームの製造 実施例Ｃ２を繰り返して濃縮するか、ただし３５℃で１
０分間ではなく８０℃で５分間続ける。 レシチンとしてソーヤ・ホスファティックＮＣ９５１４
を用いた。２時間遠心分離を行なった。 リポソームの分析 −Ｌ清液 遠心分離後の上清液を、前述の逆相高速液体クロマトグ
ラフィー技術により分析する。１０％以上の原形ひとＩ
Ｌ−２を言有する。 生物学的活性 前述の試験（ニス・ギルスら）にしたが０、ｌＬ　−’
２依存ＣＨＬＬ−（’１６　）細胞における３〔Ｈ〕−
チミジンの混入に基づく系列希釈試験によりリポソーム
を分析する。 ２４時間後に１０　の細胞の最大成長の５０％をもたら
すＩＬ−２の濃度を、製造直後（値Ａ０゜ｎｇＡｎｅ）
および４℃で貯蔵２週間後（値Ａ２．　ｎｇ鷹つに測定
する。この試験では、ひとＩ　Ｌ　−２物質自体はｏ、
　２　ｎｇＡｕｅの値を示した。 結果 実施例　ＡｏＣ，ｎｇ／ｍｅ）　；ｊ’（ｎｇ／ｍｅ）
Ｃ２１，２２，９ Ｃ３１２，５１２０，０ 方法Ａ、ＢまたはＣに関する任意の１ＪＩＪ記実施例に
おいて、ひとＩｌ、、−２をＩ　Ｉ−−２−セリン１２
５、ＩＬ−２Ａ−１、ＩＴ、２　Ａ−２，ＩＬ−２Ｂ−
１，ＩＬ−２Ｂ−２＋ＩＬ−２Ｇｌｎ　２６゜ＩＬ−２
ｐＨｅ−１２１またはｌｌ−−２５ｔｏｐ１２１と置き
換えることができる、 特許出願人　サンド・アクチェンゲゼルシャフト代　理
　人　弁理士　青　山　葆　はか】名第１頁の続き 優先権主張　［相］１９８４４月９日０イギ１、［相］
１９８拝４月９日［相］イギー 〇１９８稗４月９日［相］イギＩ。 ６１Ｍ８月１０日［相］イギー 〇１優体竿９月１９日［相］イギ１」 ０１康４年９月１９日［相］イギリ ；ス（ＧＢ）［相］８４０９１２６ ［ス（ＧＢ）［株］８４０９１２７ □ス（ＧＢ）［相］８４０９１２８ ス（ＧＢ）［相］８４２０３８１ ス（Ｇ　Ｂ　）ｏ８４２３７００ ス（ＧＢ）［相］８４２３７０１ 手続補正書（、イ、 昭和６０年４月 特許庁長官　殿 １事件の表示　乙。−１っｆ２４９ ２、発明の名称　・ インターリューキン療法に関する改良 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　スイヌ国バーゼルｃ番地の表示なし）名称　サン
ド・アクチェンゲゼルシャフト４代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内氏名
　弁理士（６２１４）青　山　葆　はか　１名５補正命
令の日付：自発 ６、補正の対象：明細書の特許請求の範囲の欄７、補正
の内容：別紙の通り。 特許請求の範囲 （１）　インターリューキン含有リポソーム。 （２）　インターリューキンがひとＩＬ−２である、特
許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （３）　インターリューキンがＩＬ−２−セリン１２５
である、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （４）　インターリューキンかＩＬ−２Ａ−１、ＩＬ−
２Ａ−２、ＩＬ−２８−１またはＩＬ−２Ｂ−２である
、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （５）　インターリューキンかＩＬ−２ＧＩｎ−２６、
ＩＬ−２Ｐｈｅ　−１２１またはＩＬ−２Ｓｔｏｐ−１
２１である、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （６）特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載
のインターリューキン含有リポソームを静派内注入によ
り投与するこ・とからなる、インターリューキン処置を
必要とする対象に対するインターリューキン投与の改良
法。 （７） ａ）有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を形
成し、 ｂ）溶液から溶媒を除去して残留物を得、Ｃ）残留物を
緩衝液に懸濁し、 ｄ）リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
ート化し、および ｅ）リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソー（８） ａ）インターリューキンの水溶液と脂質の有機溶液とを
混合し、 ｂ）リポソームおよび／または集塊が形成するまで混合
液に超音波放射線を照射し、 Ｃ）混合液からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 （９） ａ）インターリューキン、ｐＨ４〜８の水性に基づ（緩
衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 ｂ）生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
集塊を形成し、 Ｃ）混合物からリポソームを回収する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 αｌ　緩衝液がｐＨ４〜７のものである、特許請求の範
囲第９項記載の方法。 ■ ｉ）混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中間相を形成し
、そして ｌ）ゲル状中間相をリポソームに転化させることにより
リポソームを特徴する特許請求の範囲第９項記載の方法
。 ■ １）混合物から溶媒を蒸発させてゲル状巾中間相を形成
し、 −）ゲル状中間相をリポソームに゛転化させることによ
りリポソームを特徴する特許請求の範囲第８項記載の方
法。 ３ ａ）インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 ｂ）水および有機溶媒を蒸発留去し、 ｃ）　ｐＨ４〜７の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液
を形成し、 ｄ）懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し、詔
よび ｅ）リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 １１４） λ）インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
した脂質と混合し、 ｂ）　１１１合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、Ｃ）
凍結乾燥混合物を緩衝剤溶液（ｐＨ４〜７）に懸濁し、 ｄ）リポソームおよび／または集塊が生成するまで溶液
を攪拌し、 ｅ）混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 ｆ）リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
造方法。 （１５）実質的に実施例のいずれか１つにつｌ、＞て後
述する、インターリューキン含有リポソームの製造方法
。 （１６）特許請求の範囲第６〜１５項のし）ずれ力）１
項に記載の方法により製造されるリポソーム。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　インターリューキン含有リポソーム。 （２）　インターリューキンがひとＩＬ−２である、特
   許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （３）　インターリューキンがＩＬ−２−セリン１２５
   である、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （４）　インターリューキンがＩＬ−２Ａ−１、ＩＬ−
   ２Ａ−２、ｌｌ−−２Ｂ−１またはＩＬ−２Ｂ−２であ
   る、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （５）　インターリューキンがＩＬ−２ＧＩｎ−２６、
   ＩＬ−２Ｐｈｃ　−１２１または１ｔ−２Ｓｔｏｐ−１
   ２１である、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム。 （６）特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載
   のインターリューキン含有リポソームを静脈内注入によ
   り投与することからなる、インターリューキン処置を必
   要とする対象１こ対するインターリューキン投与の改良
   法１゜ （７）有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を
   用いる方法であって、 ａ）有機溶媒中の脂質とインターリューキンの溶液を形
   成し、 ｂ）溶液から溶媒を除去して残留物を得、Ｃ）残留物を
   緩衝液に懸濁し、 ｄ）リポソームが生成するまで懸濁液を攪拌、ホモジネ
   ート化し、および ｅ）リポソームを単離する ことからなる方法。 （８） ａ）インターリューキンの水溶液と脂質の有践溶液とを
   混合し、 ｂ）ＩＪポソームおよび／または集塊が形成するまで混
   合液に超音、波放射線を照射し、Ｃ）　ｆｆｉ合液から
   リポソームを回収することからなる、インターリューキ
   ン含有リボン−ムの製造方法。 （９） ａ）インターリューキン、ｐＨ４〜８の水性に基づく緩
   衝液および有機溶媒に溶かした脂質を混合し、 ｂ）生成懸濁液を超音波処理してリポソームまたはその
   集塊を形成し、 Ｃ＞　ａ合物からリポソームを回収することからなる、
   インターリューキン含有リポソームの製造方法。 （１０）緩衝液がｐＨ４〜７のものである、特許請求の
   範囲第９項記載の方法。 （１１） １）混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中間相を形成し
   、そして １１）ゲル状中間相をリポソームに転化させることによ
   りリポソームを特徴する特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 （１２） １）混合物から溶媒を蒸発させてゲル状中中間相を形成
   し、 １１）ゲル状中間相をリポソームに転化させることによ
   りリポソームを特徴する特許請求の範囲第８項記載の方
   法２ （１３１ ａ）インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
   した脂質と混合し、 ｂ）水および有機溶媒を蒸発留去し、 ｃ）ｐＨ４〜７の緩衝液に残留物を吸収させて懸濁液を
   形成し、 ｄ）懸濁液に超音波を照射してリポソームを形成し：お
   よび ｅ）リポソームを単離する ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
   造方法。 （１４） ａ）インターリューキンの親水性溶液を有機溶媒に溶か
   した脂質と混合し、 ｂ）混合物を凍結乾燥して凍結乾燥物を得、Ｃ）凍結乾
   燥混合物を緩衝剤溶液（ｐＨ４〜７）に懸濁し、 ｄ）リポソームおよび／または集塊が生成するまで溶液
   を攪拌し、 ｅ）混合物を機械的手段でホモジネート化し、および、 ｆ）リポソームを単離する。 ことからなる、インターリューキン含有リポソームの製
   造方法。 ０５ノ　実質的に実施例のいずれか１つｔこついて後述
   する、インターリューキン含有リポソームの製造方法。 （１６）　特許請求の範囲第６〜１５項のいずれか１項
   に記載の方法により製造されるリポソーム。