JPH0363298A - コロニー形成刺激因子・脂質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （利用分野） 本発明はコロニー形成刺激因子および脂質からなるコロ
ニー形成刺激因子・脂質複合体に関する。

（従来技術） コロニー形成刺激因子（以下、Ｃ３Ｆ）は顆粒球やマク
ロファージの増殖と分化を促進する内因性因子である。

Ｃ３Ｆは骨髄の顆粒球・マクロファージの幹細胞（ＧＭ
−ＣＦＵ）に働き、１）顆粒球を形成するＧ−Ｃ３Ｆ　
（顆粒球−〇Ｓ　Ｆ）、２）単球マクロファージを形成
するＭ−Ｃ３Ｆ（マクロファージ−ＣＳＦ）、３）顆粒
球とマクロファージも両方形成するＧＭ−Ｃ３Ｆなどに
分類される。また、直接骨髄のＧＭ−ＣＦＵには作用せ
ず、血液中の単球に働きＧＭ−Ｃ８Ｆの分泌を促し、間
接的にマクロファージや顆粒球を増殖するＣ３　Ｆ−Ｈ
Ｕも、人尿から精製されている。

（発明が解決しようとする課題） ところが、Ｃ３Ｆは血中での半ｆＩｉ０が短いため、薬
理効果を発現させるためには比較的大量にしかも頻回に
用いなければならないという課題がある。

そこで、本発明者らは上記の事情に鑑みて種々検討を重
ねた結果、ＣＳＦを脂質との複合体とすることにより、
血中での半減期を延ばし、生物学的有用性（バイオアベ
イラビリティ−）を高めることを見出して本発明を完成
した。

（課題を解決するための手段） 本発明のＣ３Ｆは、顆粒球やマクロファージの増殖と分
化を促進する蛋白質因子であれば特に限定されない。

このようなＣ３Ｆとして、公知のＧ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ３
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、、Ｃ３Ｆ−ＨＵ　（人尿由来Ｃ３Ｆ
ともいう）　、ｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ　（Ｉ　Ｌ３）
などが例示される。

Ｃ３Ｆの調製方法としては、人尿からの精製、Ｃ３Ｆ産
生細胞の培養、遺伝子工学法などの手法が挙げられる。

具体的には、特開昭５４−１４０７０７　、同６３−５
４３９８、同６３−２９０９００　、同６３−２５０４
００等に開示されている。

又、本発明において、その有効成分として、上記Ｃ３Ｆ
の活性ペプチド断片を利用してもよく、あるいはその断
片誘導体を利用してもよい。

Ｃ３Ｆの比活性としては１０ｈ〜１０９単位／■蛋白程
度が例示される。

（ｉｉ　）脂質 脂質は小胞体（リポソーム）を作りうるちのであれば特
に限定されない、そのような脂質としては、リン脂質、
糖脂質、誘導脂質などが挙げられる。

当該複合体を形成するためのリン脂質は、生理的に許容
され、そして代謝されうる無毒のリン脂質であればいず
れも本発明に用いられる。たとえば、ホスファチジルコ
リン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホス
ファチジルグリセリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン
、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン（
リゾレシチン）、あるいはこれらの混合物である大豆リ
ン脂質、卵黄リン脂質などが用いられる。

好゛ましいリン脂質としては、大豆あるいは卵黄のリン
脂質が例示される。

糖脂質としてはセレブロシド、硫脂質 （Ｓｕｌｆａｔｉｄｅ）　、ガングリオシドなどが例示
される。

誘導脂質としてはコール酸、デオキシコール酸などが例
示される。

小胞体（リポソーム）の構造としてはマルチラメラベシ
クル（ＭＬＶ）、スモールユニラメラベシクル、ラージ
ユニラメラベシクル、リバースフェーズエバボレーシッ
ンベシクルなどが例示される。

（ｉｉｉ）複合体化 具体的にリン脂質の場合で説明する。

リン脂質は、溶媒、たとえばクロロホルム、エタノール
などに熔解して十分に混合し、容器を減圧乾燥して溶媒
を留去し、容器の内面にリン脂質を薄く付着させてリン
脂質のフィルムを形成させる。この場合、好ましくは、
リン脂質の安定化のために抗酸化剤、たとえばトコフェ
ロール（ビタくンＥ）を、好適にはリン脂質に対する重
量％が約０．０１〜０．５％（−八）程度になるように
添加する。

形成された脂質薄膜に（ｉ）のＣＳＦをｐＨ４〜１１好
ましくはｐＨ６〜７に調整した緩衝液（例えば、クエン
酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、生理食塩溶液な
ど）に加えて溶解した溶液と接触させ、すばやく振とう
又は撹拌する。ここにＣ３Ｆ含有溶液添加量は蛋白質と
して脂質薄膜の形成に用いたリン脂質の１に対し、ｏ、
ｏｉ〜１０重量部である。

なお、脂質薄膜の調製に際し、コレステロール、ホスフ
ァチジン酸、ジセチルホスフエート、ステアリルアミン
、バルミチン酸などの脂肪酸等を安定化剤として添加し
てもよいゆ また、本発明製剤はアルブミン、デキストラン、ビニル
重合体、非イオン性界面活性剤、ゼラチン、ヒドロキシ
エチル澱粉から選ばれた高分子物質を安定化剤として配
合してもよい。

当該高分子物質安定化剤は、薬物と共にリポソーム内の
空隙に取りこまれていてもよいし、また薬物を取りこん
だリポソーム製剤に添加配合（即ち、リポソーム外に添
加・配合）してもよい。もちろんリポソームの内外とも
に配合してもよいことはいうまでもない。

当該安定化剤の添加量は脂質１重量部に対して０．５〜
１０重量部、好ましくは１〜５重量部である。

好ましくは次いで超音波処理を施し、粒子径を３μ以下
に調整する。超音波処理の条件としては０°Ｃ〜７０℃
、好ましくは３５°Ｃ〜４５℃、ｌ〜６０分間程度であ
る。

かくしてＣ３Ｆ・リン脂質複合体が形成される。

粒子径は約０．０２〜３μｍ、好ましくは約０．０２５
〜０．１　μｍとなる。

複合体の単離・精製は遠心分離、ゲル濾過など自体既知
の手段にて行うことができる。

複合体は、次いで要すれば生理的に許容される水溶液で
洗浄し、除菌濾過、分注を行い、液状製剤、ペレット状
、懸濁状製剤として調製する。製剤化は医薬品の製法に
おいて広く公知の方法に準する。又本製剤は、液状製剤
を凍結させた後減圧下で乾燥させ、凍結乾燥製剤として
も提供される。

本発明の複合体は白血球減少症、感染症、白血病、骨髄
・顆粒球減少症、造血器疾患、骨髄性白血病、悪性腫瘍
、免疫系増強、血症板減少症の治療に用いられる。

その投与量としては、症状等に応じて患者成人−回当た
り１０″〜１０＆単位／ｋｇ体重程度が例示される。ま
た、投与経路としては、たとえば静注または点滴静注、
筋肉内、皮下などが挙げられる。

（効果） 本発明の複合体はＣ３Ｆそのものに比べて、生体内、特
に血中での消失を抑え、血中濃度を上昇させることがで
きる。

従って、Ｃ３Ｆ本来の性質と併せて、Ｃ３Ｆの薬理活性
を増強することができる。

（実施例） 本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

ただし、実施例および実験例中で用いられる略号は以下
の通り。

ＥＰＣ：　　ｅｇｇ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏ
ｌｉｎｅＭＬＶ：　　　ｌｌｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ
　　ｖｅｓｉｃｌｅＳ＾：　　ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎ
ｅ 実施例１ ボソームＭＬＶ　　の ２５麟Ｉ容のナシ型フラスコにＥＰＣ３００μｍｏｌ　
のクロロホルム溶液を入れ、ロータリーエバポレーター
で溶媒を除去し、脂質薄膜を調製した。これを−旦クロ
ロホルム溶解し再度、ロータリーエバポレーターで溶媒
を除去し、脂質薄膜を調製した。

このクロロホルムによる再溶解・蒸発操作を３回繰り返
した。フラスコをデシケータ−に入れ真空ポンプで１時
間吸引した。フラスコに参考例１により調製したｍ−Ｃ
３Ｆ（１０’単位／ｍｌ）　　０．６ｍｌ入れ、Ｖｏｒ
ｔｅｘミキサーで懸濁させた。

ニ　−ション 脂質懸濁液の入ったナシ型フラスコをソニケークーにセ
ットし、試験管の液相部を恒温水槽の水中に浸してソニ
ケーションした。ソニケーション条件はプローブ型ソニ
ケーターを用い、液温ｓｏ’ｃ以下で行った。

−ｉ」ｄ見場− リポソーム分散液を次のようにしてゲル濾過を行った。

　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ〜４００ゲルを充填したカラ
ム（φ　１．ＯＸ１８ｃｍ）をゼラチン人りトリス緩衝
液ｐｌＩ７．４で平衡化したものでゲル濾過を行った。

ボイド付近に溶出された脂質溶出画分を回収した。

実施例２ ＥＰＣ３００ａ　ｍｏｌ　の代わりに［＋ＰＣ２４０ｕ
　＋ｓｏｌ　およびＳＡ　６０　μ１ｌｏｌ　を用いる
以外は全て実施例１に準じて行い、同様に乾燥品を得た
。

参考例１ 健常人の尿２００　ｆｆｉをＰ　Ｉ＋　８　、５に調整
し、沈殿物を濾過除去し、分画分子量５０．０００ダル
トンの限外濾過膜（アミコン社、Ｈ１０Ｘ５０）で濃縮
と脱塩を行った、次に、濃縮液をｐＨ７，０に調整し、
密封容器内で６０°Ｃ１１０時間加熱殺菌した。殺菌後
、遠心骨ｊｌ　（５，０００にｇ　３０分間）して沈殿
物を除去した後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースと混合し、吸着さ
せた。ＤＥＡＥ−セルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液
、０．０５Ｍ食塩添加０゜０２ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）で溶出させた。

溶出液を限外濾過膜（アミコン社ＨＩ　Ｐ　１０　）で
濃縮して、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　−３００（ファ
ルマシア社、φ４Ｘ８０ｃｍ）を用い、１Ｍ硫安添加緩
衝液（ｐＨ７，２）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子
量範囲７０，０００〜１５０．０００ダルトンの両分を
上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラム（ファルマシア社製、
φ２Ｘ２０ｃｍ）に吸着させ、次いで０．５Ｍ１ｊｉｌ
安添加緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出させた。溶出液を限
外濾過膜（旭化戒製、ＮＭ−３）でｆｉ！ｉして、ＴＳ
ＫＧ−３，０００ＳＷカラム（東洋曹達型、φ４　Ｘ　
６００ｍｍＸ　２　）で高速液体クロマトグラフィーに
かけ、分子量範囲７０，０００〜１５０．０００ダルト
ンの両分を得た。この両分を再度′ａ縮し、！（＋−Ｐ
ｏｒｅ　ＲＰ−３０４（バイオラド社製、φ４Ｘ１５０
１１１１）の逆相カラムで０．１Ｍ）リフルオロ酢酸を
含む、アセトニトリルｏ−ｔｏｏ％（ｐＨ２，０）の直
ｖＡｖ：４度勾配による高速液体クロマトグラフィーに
かけ、Ｃ３Ｆを溶出し、精製された比活性１．４　Ｘ　
１０’単位／ｍｇ・蛋白質のＣ３Ｆを得た。

得られたＣ３Ｆの性状は以下の如くであった。

ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が７０，０００〜９０、０００ダ
ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、３５
，０００〜４５．０００ダルトンである。

ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、第１表に
示す２１４個乃至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２
２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）はそれぞれ、アスパラ
ギン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（
Ｓｅｒ）で表される典型的なＮ−グリコシド結合部位を
有する。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。

Ｃ）等電点 ポリアクリルア稟ドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐ！
　）は、３．１〜３．７である。

ｄ）糖鎖のｔｉ戒単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルゲルコサ５ン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸である。

ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散針による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８ｎｓ及び２２２ｎｓにそれぞれ極小ピークがあり、
α−ヘリックス構造を含んでいる。

ｒ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失われ
ない。

ｇ）赤外線吸収スペクトル 凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ窓）によりフ
ーリエ変換赤外分光袋Ｗ　（Ｎｉｃｏｌｅｔ社製）諏 を用いて測定した。本Ｃ３Ｆは１６５０ｃ１１−’、１
２０１ｃｍ−および１１３３ｃｍ−’に強い吸収、１５
３７Ｃ！１−’、１４３２ｃｍ及び１０６８ｃｍ−’に
中程度の吸収を示した。

ｈ）生理活性 哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成
刺激作用を有する。

なお、本発明のＣ３Ｆのコロニー刺激活性は、マウス骨
髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で
測定した。Ｃ３Ｆ試料を０．３％寒天、２０％牛脂児血
清（ＦＣ３’）及びマウス骨髄細胞ｌＸｌ０’個を含む
−ｃＣｏｙ’ｓ　５　Ａ培地１ｍｌと混合し、７．５％
ＣＯｔ通気下、３７℃で７日間培養した。

培養後、５０個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形
成されたコロニー数を計測した。コロニー刺激活性は単
位で表現し、１単位は１コロニーを形成させるに必要な
Ｃ３Ｆｉｌと規定した。また比活性は、Ｃ３Ｆ蛋白Ｘ１
ｍ１ｇ当り形成されるコロニー数（単位）で表した。そ
の結果、本発明のＣ３Ｆは、１．４　Ｘ　１０”単位／
■・蛋白質の比活性を有していた。また形成されたコロ
ニーをヘマトキシリン−エオシン染色して形態学的に分
類したところ、９５％以上のコロニーが単球−マクロフ
ァージから形成されていた。

（ほか３名）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）コロニー形成刺激因子および脂質からなるコロニ
   ー形成刺激因子・脂質複合体。