JPS6024712B2 - セルラ−ゼの生産方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ァクレモニウム属菌によるセルラーゼの緒造
方法に関するものである。

セルラーゼはセルロースをグルコースまたはセロビオー
スやセロオリゴ糖にまで分解する酵素反応系を触媒する
酵素群の総称であり、その作用様式により、Ｃ，酵素、
Ｃｘ酵素とＢ−グルコシダーゼあるいはエキソー８ーグ
ルカナーゼ、エンド‐Ｂーグルカナーゼとセロビアーゼ
など種々の名称で呼ばれる酵素で構成されているが、い
まだその実体は明らかでない。

それは、セルラーゼを生産する微生物起源により、結晶
性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）
、セロデキストリン、セロオリゴ糖、セロビオース等に
対する作用様式の異なる酵素が多種多様に存在すること
と、天然セルロースの構造上の複雑さに起因している。
しかし、セルラーゼは、これら複数の酵素が調和のとれ
た相互作用をすることによりセルロースをその構成糖に
分解する複合酵素である。近年、セルラーゼはバイオマ
ス資源の有効利用を図るという観点から注目を集め、盛
んに研究されるようになった。しかし、従来、よく知ら
れているトリコデルマ属やアスベルギルス属等の微生物
の生産するセルラーゼは天然セルロースに対する分解力
が充分でなく、またセルロースを完全にグルコースに分
解できないでセロビオースや、それ以上のセロオリゴ糖
を多量に生成するなどの問題があった。更にまた、従来
、知られているセルラーゼは、通常、熱安定性に劣って
いるため、長時間の糖化反応では４５〜５０ｑ０程度で
の反応しか行えないため、糖化中いまいま雑菌に汚染さ
れるという危険があった。本発明者らは、結晶性セルロ
ースに対する分解力が優れ、且つグルコースへの糖化力
の優れたセルラーゼ生産菌を求めて、広く自然界より微
生物の検索を行ってきた結果、土壌中より分離し、アク
レモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属と同定した糸状
菌を分離した。

そしてこの菌の生産するセルラーゼを工業的に使用すべ
く、生産力価の向上について、鋭意、研究を続けてきた
結果、セルラーゼを生産するアクレモニウム属菌をポリ
エチレングリコールの存在下で培養するとセルラーゼの
生産量が顕著に増加することを認めた。本発明はこの知
見にもとづいてなされたものである。すなわち、本発明
はセルラーゼを生産するアクレモニゥム属菌を培養して
セルラーゼを生産するに際し、ポリエチレングリコール
の存在下で培養することを特徴とするセルラーゼの生産
方法に関するものである。

以下に、本発明の詳細を説明する。

本発明において使用される、ポリエチレングリコールと
しては例えば、ポリエチレングリコール１０００ポリエ
チレングリコール２００ｕポリエチレングリコール４０
００など、重合度の異なる種々なものが知られており、
これらは、いずれも本発明に対し、有効に適用すること
ができるが、なかんずくポリエチレングリコール１００
鼠室度の低重合度のものがより効果であった。

ポリエチレングリコールは、培地に対して、通常、０．
０１〜５％程度、望ましくは、０．０５〜０．５％程度
添加される。

そして、このようなポリエチレングリコールを添加した
培地で、アクレモニウム属菌を培養すると、セルラーゼ
の生産量が、無添加の場合に比べ顕著に増加する。例え
ば、セルラーゼのうちアビセラーゼ活性は１．１〜１．
５倍、カルボキシメチルセルラーゼは１．５〜２．９倍
、３−グルコシダーゼは１．３〜２倍に増加する。本発
明において使用されるセルラーゼ生産菌の菌学的性質は
下記の通りである。

生育：麦芽エキス寒天上では生育は速く、３０００７日
で直径７仇岬こ達する。

集落は最初白色で後にやや黄色味をおびる。気生菌糸は
ゆるく盛り上がり羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸東を形
成する。培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を
呈する。ッァベック寒天上でもほぼ同様の生育を示すが
気生菌糸の盛り上がりはより少し、。生育ｐＨ範囲は３
．５〜６．０で最適ｐＨは４付近、生育温度範囲はｌ５
ｑｏ〜４３ｑｏで、最適生育温度は３０ｑｏ付近である
。形態：菌糸の直径は０．５〜２．５ムｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面である。
分生子：分生子形成能は非常に不安定でッアベック寒天
および麦芽エキス寒天培地による継代培養により消滅す
る。

分離時における観察では、分生子柄は気生菌糸側面より
突出し、無色である。分生子は亜球形（２．５〜５×２
〜４．５〃ｍ）で糟面、無色で連鎖は非常にゆるく分散
しやすい。以上の菌学的性質について、Ｗ．ＧａｍＳの
「Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｌｕｍａれｉｇｅ Ｓｃｈｉ
ｍｍｅｌｐｉｌｇｅ」Ｐ８４、Ｇ．Ｆｉｓｈｅｒ（１９
７１年）及びＣ．日．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ．Ｍｙｃｏｌ
．Ｐａｐｅは１１５ＰＩ０（１９６母王）を参照した結
果、本菌はアクレモニゥム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｍｍ）属
に近縁の糸状菌と考えるのが妥当であると考えた。なお
、アクレモニウム属菌には、従来、強力なセルラーゼ生
産性が知られていなかったこと、及び、本発明の菌株が
強力、かつ特徴的なセルラーゼを生産することから、本
菌をアクレモニウム・セルロリテイカス（Ａｃｒｅｍｏ
ｍｍｍｃｅｌｌ山ｏｙｔｉｃｕｓ）と命名した。なお、
本菌は、ＦＥＲＭＰ−６８６７として、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている。アクレモニウム属
はＣａｍｓにより詳細な検討がなされ、以前にセフアロ
スポリゥム属として記載されていた属の再検討を行うこ
とにより、近年採用された属名であり、本発明の示すよ
うな結晶性セルロースに作用することのできる強力な真
のセルラーゼ、すなわちアビセラーゼやＦＰアーゼを生
産するアクレモニゥム属菌は、本発明以前には全く知ら
れていない。

本菌の生産するセルラーゼは、作用特性から結晶性の高
いセルロースであるアビセルに作用する酵素、すなわち
ァビセラーゼまたはＦＰアーゼで代表されるＣ，酵素、
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に作用する、い
わゆるＣＭＣアーゼで代表されるＣｘ酵素と、セロビオ
ースなどのセロオリゴ糖に作用する８ーグルコシダーゼ
の主として３種類の酵素群からなる複合酵素系である。

そして、これら酵素群の調和のとれた相互作用により、
天然のセルロースを完全にグルコースにまで分解するこ
とができるのである。以下にこれら酵素の性質を記載す
る。Ｗ アビセラーゼの酵素的性質 ‘１）作用 セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶性の高い不溶
性セルロースに対し作用してグルコース、セロビオース
等の還元糖を生成する‘２１ 作用ｐＨ及び最適作用ｐ
Ｈ 本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８、最適作用内は約４．５
に認められた。

（第１図ａ）【３’安定ｐＨ クエン酸ーリン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約６であった。

（第１図ｃ）‘４｝ 作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％アビセ
ル０．０８Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の下で１０分間
反応させたときの最適作用温度は約６５午Ｃに認められ
た。

（第１図ｂ）【５｝ 熱安定性 本酵素を０．０８Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の下で、
各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６０ｑ
ｏまでの温度ではほとんど失活せず、６５ｏ０、１び分
間の加熱で約５０％、そして７０℃、１０分間の加熱で
約８０％失活した。

（第１図ｄ）【６｝ 阻害剤 各種重金属イオンのうちでｌｍＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される。

また、ＳＨ阻害剤であるパラクロルマーキュリーベンゾ
ェイトによってもｌｍＭで約８０％の阻害を受ける。｛
７｝ 精製法 本酵素は培養猿液からホロフアィバー（アミコンＨＩ−
Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥーセフアロー
ス（ＣＬ‐紐）による力ラムクロマトグラフイ一（Ｎａ
ＣＩ○→ＩＭグラジェント）と同カラムによる再クロマ
トグラフィー（ＮａＣＩ Ｏ→０．８Ｍ）により、より
精製することができる。

‘８ー 分子量 Ｂｉｏ−ｇｅｌ（ＡＯ．即）力ラムによるゲル櫨過法に
より測定した分子量は約１４０，０００であった。

｛９１ 活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に０．５％濃度のアピセル懸濁物（
ｐＨ４．５）０．５の‘に適量の酵素液を加え、蒸溜水
で全量１．０泌とし、５０℃で反応を行った。

そして生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測
定した。この条件で、１分間に１りｍｏｌのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。‘
Ｂ｝ ＣＭＣアーゼの酵素的性質 ‘１１ ＣＭＣアーゼの多成分性 ＣＭＣアーゼはディスク電気泳動的に少くとも４成分に
分離され、それぞれは分子量と等露点により区別される
。

ＣＭＣアーゼ１は分子量約１６０，０００で等露点５．
０８以下同様に０は約１６０，０００、４．９５、ｍは
約１２０，０００、４．６０、Ｗは約１２０，０００、
４．４８であり、これらアィソザィムの複合物よりＣＭ
Ｃアーゼは成つている。‘２’カルポキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）等の可溶性セルロース誘導体に作用し、
これをグルコース及びセロビオース等に分解する成分（
ＣＭＣアーゼ１および０）とグルコースを極わずかしか
生成せずセロビオース以上のセロオリゴ糖に分解する作
用を持つ成分（ＣＭＣアーゼｍ，Ｗ）が存在する。

【３｝ 作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ ＣＭＣアーゼ複合体の作用ｐＨ範囲は、ほぼ２〜８にわ
たり最適作用ｐＨは約４．５に認められた。

（第１図ａ）‘４｝ 安定ｐＨ クエン酸ーリン酸塩緩衝液の下で４５００で２０時間放
置したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定斑範囲は約３．
５〜約６であった。

（第１図Ｃ）｛５｝ 作用温度範囲及び最適作用温度 このＣＭＣアーゼ複合体は約９０ｑｏまでの高温に作用
するが、１％ＣＭＣ、０．０９Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）の下で１０分間反応させたときの最適作用温度は約
６５ｏｏに認められた。

（第１図ｂ）‘６’熱安定性 本酵素を０．０８ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の下「
で、各温度で１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６
０ｑｏまでの温度ではほとんど失活せず、６５ｑＣ、１
び分間の加熱で約４０％、そして７０℃、１０分間の加
熱で約７０％失宿した。

（第１図ｄ）‘７）阻害剤 各種重金属イオンのうちでｌｍＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより強く阻害される。

【８’精製法 本酵素は培養猿液からホロフアイバー（アミコンＨＩ−
Ｐ５）により脱塩濃縮してのち、ＤＥＡＥ‐セフアロー
ス（ＣＬ−組）による力ラムクロマトグラフイ一（Ｎａ
ＣＩ Ｏ→ＩＭグラジェント）と同カラムによる再クロ
マトグラフィー及びクロマトフオーカシングにより各成
分に精製できる。

‘９）活性測定法 ０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％ＣＭＣ溶液（ｐＨ
４．５）０．５肌に、適量の酵素液を加え、蒸溜水で全
量１．０の‘とし、５０午０で反応を行った。

そして、生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により
測定した。この条件で、１分間に１仏ｍｏｌのグルコー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

‘Ｃ１ ８−グルコシダーゼの酵素的性質【１｝作用 サリシン、セロビオース、セロトリオー ス、セロテトラオース、セロベンタオース、セロヘキサ
オースのようなセロオリゴ糖に作用して、これをグルコ
ースに分解する。

また、本酵素はアビセルのような高分子セルロースにも
作用するがＣＭＣやＨＥＣ（ヒドロキシェチルセルロー
ス）にはほとんど作用しない。

サリシン、セロビオース、セルトリオ−ス、セロテトラ
オース、セロベンタオース及びセロヘキサオースに対す
るＫｍ値は、それぞれ３．４０、２．２６、１．１６、
０．８２、０．５２そして０．５１ｍＫであった。■
作用柵及び最適作用ｐＨ 本酵素の作用餌範囲は２〜８、最適作用斑は約４．５に
認められた。

（第１図ａ）【３｝ 安定− クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４９０で２０時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約５であった。

（第１図ｃ）｛４｝ 作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素は約９０つ０までの高温に作用するが、１％サリ
シン、０．０９Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の下で１０
分間反応させたときの最適作用温度は約６ｙｏに認めら
れた。

（第１図ｂ）■ 熱安定性 ０．０９Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の下で、各温度で
１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６５℃までの高
温ではほとんど失活せず、７０℃、１０分間の加熱で約
４０％失活し、そして８０ｑｏ、１０分間の加熱で９０
％以上失活した。

（第１図ｄ）‘６｝ 阻害剤 各種重金属イオンのうちｌｍＭ以上の水銀イオンおよび
銅イオンにより強く阻害される。

また、グルコース−６ーラクトンは基質に対して桔抗阻
害剤とした作用する。｛７）精製法 本酵素は培養櫨液からホロフアィバー（アミコンＨＩ−
Ｐ５）により脱塩濃縮したのち、ＤＥＡＥ−セフアロー
ス（ＣＬ−班）による力ラムクロマトグラフイ一（Ｎａ
ＣＩＯ→ＩＭグラジエント）とクロマトフオーカシング
（ｐＨ６一４）とＢｉｏ−ｇｅｌ（ＡＯ．軌）によるゲ
ル樋過により、亀気泳動笛に均一なまで精製することが
できる■ 分子量 Ｂｉｏ‐ｇｅｌ（ＡＯ．弧）を用いるゲル櫨過法により
測定した分子量は約２４０，０００であった。

‘９’活性測定法０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた１％
サリシン溶液（ｐＨ４．５）０．５の‘に適量の酵素液
を加え、蒸溜水で全量１．０の【とし、５０℃で反応を
行った。

そして生成するグルコースをソモギー・ネルソン法によ
り測定した。この条件で、１分間にｌｒｍｏｌのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした
。

本発明のＢ−グルコシダーゼは、サリシンやセロビオ−
スのような小さい分子の基質よりもセロヘキサオースや
セロベンタオースのようなオリゴ糖に対してより親和性
が大きく、かつ本酵素はアビセルのような高分子量の基
質に対しても作用する。

特にセロビオースを分解し、かつアビセルを相当程度分
解できる基質特異性を持った酵素の存在は本発明により
初めて明らかになったものであり、しかも生成物はすべ
てグルコースであることなど本菌の生産する８−グルコ
シダーゼは、従来知られていない新規な８ーグルコシダ
ーゼであって、澱粉に対するグルコアミラーゼとよく似
た作用特性をもつことから本発明者らはこの酵素をグル
コセルラーゼと命名した。このように、本発明のアクレ
モニウム属菌により生産されるセルラーゼは、新規な８
ーグルコシダーゼを含む新規なセルラーゼ複合酵素剤で
ある。

次に実施例により本発明の詳細を説明する。

実施例 １セルロース４％、ＫＨ２Ｐ０４１．２％、バ
クトベプトン・％、ＺｎＳ〇４．７日２〇１×１０‐３
％、ＫＮ〇３０．６％、ＭｎＳ０４・７日２０１×１０
‐３％、尿素０．２％、ＣｕＳ０４・８ＬＯＩ×１０‐
３％、ＫＣＩＯ．１６％、ＰＨ４．０、Ｍ簿０４・７比
００．１２％、の組成からなる培地と、これにポリエチ
レングリコール１０００を０．０５〜０．４％量添加し
た培地、各２０の‘を２００Ｍ客三角フラスコに入れ、
常法により殺菌後、アクレモニウム・セルロリティカス
（ＦＥＲＭ Ｐ−６８６７）を接種し、３０午○で８日
間好気的に培養した。

培養後、遠心分離して得た上燈液について、生産された
セルラーゼのアビセラーゼ、力ルボキシメチルセルラー
ゼ（ＣＭＣアーゼ）及び８−グルコシダーゼ活性を測定
した。結果は第１表に示す通りであった。１表 表から明らかなように、０．０５％量のポリエチレング
リコール１０００の添加によりアピセラーゼは、無添加
の場合に比べ１．２倍に増加した。

ＣＭＣアーゼは、０．４％量のポリエチレングリコール
１０００の添加により２．１倍に増加した。そして、８
−グルコシダーゼは０．４％量のポリエチレングリコー
ル１０００の添加により１．７倍に増加した。実施例
２実施例１で使用した基本塔地にポリエチレングリコー
ル１０００、２０００と４０００をそれぞれ０．１％添
加した倍地にアクレモニウム・セルロティカス（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−６８６７）を接種し、３０００で６日間好気的
に培養した。

培養後、遠心分離して得た上燈液について、生産された
セルラーゼのアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼと８ーグルコ
シダーゼ活性を測定した。得られた結果は第２表に示す
通りであった。表から明らかなように、試験したポリエ
チレングリコール１０００ ２０００及び４０００はい
ずれもアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼと８ーグルコシダー
ゼの生産に対して有効であったが、中でもポリエチレン
グリコール１０００はより効果的であった。

第 ２ 表

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム（ＦＥＲＭＰ一般６７）の生産
するセルラーゼのアビセラーゼ、ＣＭＣアーゼ及び８ー
グルコシダーゼについて、ａ・・・…最適作用ｐＨ、ｂ
・・・・・・最適作用温度、ｃ・・・・・・刊安定性そ
してｄ…・・・熱安定性を示している。 次′楓

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ セルラーゼを生産するアクレモニウム属菌を培養し
   てセルラーゼを生産するに際し、ポリエチレングリコー
   ルの存在下で培養することを特徴とするセルラーゼの生
   産方法。