JPS6030680A - リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リパーゼにエステラーゼを付加する方法に関
する。更に詳しくは、シュードモナス属の産生ずるリパ
ーゼと非イオン界面活性剤を混合しリパーゼと非イオン
界面活性剤を結合せしめ、リパーゼ活性はそのまま保持
しつつ、新たにエステラーゼ活性を生ぜせしめることを
特徴とするリパーゼにエステラーゼを付加する方法に関
する。

ダニエル（Ｄｅｓｎｕｅｌ　ｌｅ　）らはバイオチミカ
・工ト・）＜イオフィジ力・アクタ（Ｂ）ｏｃｈｒｒａ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）第２３巻、２６４頁（１９５７年）において
リパーゼ及びエステラーゼの二つの酵素の酪酸メチルに
対する基質濃度依存性を比較した。その結果、リパーゼ
は水に溶けていない基質と水との界面で作用し、エステ
ラーゼは水に溶解した状態の基質に作用すると定義した
。即ちリパーゼは基質の飽和点以上で活性が出現するの
に対し、エステラーゼはその前後では急激な活性変化は
みられない。それ以後この定義がほぼ一般に受け入れら
れており、本願発明のリパーゼ及びエステラーゼの区別
もこの定義に従うものである。

近年、病気を診断する技術の発達力゛（著しく、シュー
ドモナス属菌の産生ずるリパーゼが、血清中のトリグリ
セリド定量用試薬として臨床検査においてさかんに用い
られている。しかしながら生体内の脂質の定量にはトリ
グリセリドの定量のみならず、モノ、ジグリセリド或い
はその抽水溶性エステル結合を有する脂質の定量も必要
であり、リパーゼのみならずエステラーゼをも同時に合
せ持つ酵素が存在するとすれば非富に有益となり得るも
のである。

本発明者らは、シュードモナス属細菌の産生ずるリパー
ゼについて研究中、たまたま本リパーゼに親水基として
ポリオキシエチレン基、親油基としてアルキル基を有す
る非イオン界面活性剤の水溶液を添加することにより、
リパーゼ活性はそのまま保持しつつ、新たにエステラー
ゼ活性を生ぜせしめることを見い出した。これまでシュ
ードモナス属菌の産生ずるリパーゼがコレステロールエ
ステラーゼ活性を同時に有する旨の報告（昭和４９年度
日本薬学大会講演要旨集第４６頁）はあるが、しかしリ
パーゼ活性とエステラーゼ活性を同時に持つ複合酵素の
報告がないことを知り本発明を完成したものである。

本発明において使用するリパーゼは、シュードモナス・
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏ
ｒ−ｅｓｃｅｎｓ）　ＩＡＭ　１０５７の産生ずるリパ
ーゼ（リボプロティンリパーゼ作用もある。）であり、
この酵素の諸性質については、バイオチミカ・エト・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｂｌｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ）第４８８巻、３５３〜３５８頁（’１９
７７年）、同誌第４８９巻、２６２〜２６８頁（１９７
７年）及び特開昭５３−１０４７９２号に記載されてい
る。しかしながらこれら文献記載のリパーゼはＳＤＳ電
気泳動、ゲル濾過では一応単一のタンパクであるが、デ
ィスク電気泳動的にはまだ微小蛋白が存在し、本発明者
らは調整用ディスク電気泳動によりこの微小蛋白（リパ
ーゼ活性を有する）の除去を行い、完全に単一なリパー
ゼとし、本願ではこのものを使用した。しかしながらこ
の精製品のみならず、各精製段階から得られるリパーゼ
標品の使用はむろん、培養液から得られる粗酵素溶液そ
のものをも使用ｂｉ供し得る。

尚、シュードモナス属菌の産生ずるリパーゼ以外の他の
リパーゼ、例えばブタ膵臓リパーゼ（生化学工業社製品
）、キャンシタ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃ
ｙｌｉｎｄｒａｃｅａ　）のリパーゼ（シグマ社製品）
、ムコール・リポリティヵ（Ｍｕｃｏｒ　１ｙｐｏｌ。

１ｔｉｃａ　）　（オリエンタル酵母社製品）、ヒトミ
ルクリポタンパクリパーゼ（Ｍａｔｓｕｏｋａ　ｅｔ　
ａｌ。

Ｂｉｏｃｈ’ｉｍ、Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、＾ｃｔａ第６２
０巻３０８〜３１Ｂ頁（１９８０年）記載の方法によっ
て製造した。）には酪酸メチル分解活性に対して本願の
非イオン界面活性剤の添加効果は全くな（、本願発明の
効果はシュードモナス属菌の産生ずるリパーゼに特異的
であることがわかった。

一方リパーゼに添加する非イオン界面活性剤としては、
親水基としてポリオキシエチレン重合体を、親油基とし
゛Ｃアル羊ル基を有するものがあげられ、具体的にその
構造式及び化学名をあげればＣ，ｎＨ２，０（Ｃ１１２
ＣＩ２０　）７　Ｈ：ポリオキシエチレン（７）デシル
エーテル；Ｃ１２１Ｈ２５０（ｃＨ２ｃＨ２ｏ）ｎＨ：
ポリオキシエチレンドデシルエーテル（ｎ＝２３のもの
をＢｒ１ｊ３５と称する。）；Ｃ１３Ｈ２７゜（ＣＨ２
ＣＨ２０）１ｏＨ：ポリオキシエチレン（１０）　Ｉ−
リゾシルエーテル；Ｃ１４Ｈ２，０（ＣＨ２Ｃ１１２０
）、１Ｈ：ポリオキシエチレン（１１）テトラデシルエ
ーテル；Ｃ，６Ｈ３３’Ｏ（ＣＨ２Ｃ１１２０）ｎ’Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎ＝１０
のものをＢｒ１ｊ５６、ｎ＝２０のものをＢｒ１３５８
とそれぞれ称する。）；ＣＡＢ　Ｈ３７０（Ｃ１１２Ｃ
Ｈ２０）ｎ　Ｈ’ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル（ｎ＝１０のものをＢｒ１ｊ７６と称する。）　；　
Ｃ−＋８　Ｈ２Ｓ　０　（ＣＨ２Ｃ１＋２０　）ｎ　Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）オレイルエーテル（ｎ＝１
０のものをＢｒ１ｊ９６、ｎ＝２９のものをＢｒ１ｊ９
８と称する。）；ポリオキシエチレン（１７）セチルー
ヌテアリルエーテル等がある。

非イオン界面活性剤の添加量としては、通電は酵素１分
子に結合する非イオン界面活性剤の分子の割合（以下Ｂ
ｒ１ｊとリパ一ゼの結合比又はＢ　／　ｅと称する。）
が５〜１００、好ましくは２０〜４０で、本結合体のエ
ステラーゼ活性が最大となるので、１、．５Ｘ　１０−
３μｍｏｌｅのリパーゼを用いに場合７．５×１０−３
〜１．５Ｘ　１０”　／Ｊ　ｍｏｌｅ程度が望ましい。

しかしながら反応系の食塩濃度を上げたり、基質として
用いる酪酸メチルの濃度を高めることによって、或いは
酵素量を少なくすることによって非イオン界面活性剤の
添加量をより低くすることができる。

尚、リパーゼと非イオン界面活性剤の結合は単なる混合
によって生じ添加の順序即ちリパーゼ、非イオン界面活
性剤のいずれが先に添加され他のものが後に加えられた
としても同様な効果を生じる。

以下に非イオン界面活性剤の１つ、即ちポリオキシエチ
レン（ｎ）セチルエーテルのｎが２０であるＢｒ１３５
８　（花王アトラス社製品）とシュードモナス属菌のリ
パーゼとを用い本発明を更に具体的に説明する。

１．５Ｘ　１０−３μｍｏｌｅのシュードモナス属リパ
ーゼを含む溶液１００ｍに７．５Ｘ　１Ｏ−２ｐ　ｍｏ
ｌｅのＢｒ１ｊ５８を含む水溶液１００度を混合するこ
とによってリパーゼとＢｒ１ｊＳ８の結合が生じる。こ
のものをセファデックスＧ−２００ゲル濾過による分子
量を推定した結果、約６５．０００〜８０，０００であ
り、ちとのりバーゼの分子量が３３，０００であること
からリパーゼ１分子あたり３０〜４０個のＢｒ１３５８
が結合していることがわかった。このＢｒ１ｊ５８とシ
ュードモナス属リパーゼの結合はきわめて強固なもので
あり、そのことは水溶液中にシュードモナス属リパーゼ
を添加するだけでごく短時間で活性型になることから予
測されるが、またジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡＥ
と称する。）セルロースカラムクロマトグラフィー、フ
ォータナライズドアミノエチル（以下ＱＡＥと称する。

）セファデックスＡ−５０に非吸着となり、ディスク電
気泳動でも泳動されなくなり、ショ糖濃度を段階的に積
層させたカラムでの電気泳動では非イオン性のＢｒ１ｊ
５Ｂもリパーゼと共に泳動されることからも証明されう
る。

この結合体からなる反応系に基質の酪酸メチルを添加す
ると即座に活性化が起った。そして添加時の基質濃度依
存性を開べたところ活性化は基質が水溶性の時のみ高く
、そのパターンはダニエルの提言した所謂エステラーゼ
型を示しており（第１図に示す）、更に酪酸メチルにか
え、トリブチリン、コハク酸メチル、α−ナフチルアセ
テートなどの他の水溶性基質に対しても活性化が起って
いるので本結合体はエステラーゼ活性を明らかに獲得し
たといいうるものであった。

一方、この結合体は５ｍＭのトリオレインを基質にした
場合には活性に変化を生じながった。これはリパーゼ活
性に対しては変化がないことを意味する。更に又、８０
ｍＭ酪酸メチル分解活性に対するＢｒ１ｊ５８の効果は
Ｂ　／　ｅの分子比に相関していた。

即ち、リパーゼを１／２に減らした場合、１／２のＢｒ
１ｊ５８で最大活性を示し、その活性化のパターンはほ
ぼ同様であった（第２図に示す。）。これはリパーゼと
３ｒｉｊ５８が直接インターラクションしている証拠の
一つと考えられる。

リパーゼとＢｒ１３５Ｂの結合物の酪酸メチルに対する
活性化は、当然のことながら他のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルでも同様な効果が得られた。又、ポリオ
キシエチレンｐ−ノニルフェニルエーテルのエマルゲン
９０３（花王石けん社製品）、第２級直鎮アルコールエ
トキシレートのアデカトール５０８０、アデカトールＳ
　０１０５、アデカトールＳ　０１３５　（いずれも旭
電化社製品）などでも２０〜３０％の効果がみられた。

Ｂｒ１ｊ３５は約４５％の相対活性を示した。トリトン
メ−１００、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、プルし１ニツクＦ
５８、エマルゲン８１０、工マルゲンＰＩ　２０５、ア
デカトールＮＰ　１１０では活性化効果は得られなかっ
た。又酢酸、パルミチン酸、オレイン酸などの脂肪酸ナ
トリウム塩も活性に影響を与えなかった。

以上で明らかなように、シュードモナス属リパーゼと非
イオン界面活性好ましくはポリオキシエチレンアルキル
エーテルを構造式に持つものを混合することによりリパ
ーゼ活性はそのまま保持しかつ新たにエステラーゼ活性
を有する本発明の目的の複合酵素が得られることがわか
る。次にＢｒ１ｊ５８添加前後のシュードモナス属リパ
ーゼの性質を比較した結果を表−１に示す。

（以°下余白） 表−１ 次に本発明において使用したエステラーゼ及びリパーゼ
活性測定法について述べる。

エステラーゼ活性： 基質（８０ｍＭ酪酸メチルなど）を０．１Ｍ　ＮａＣ１
を含む０．５％アラビアゴムに入れ１０ｍβにフィルア
ンプし共栓をして３０秒間強く振り溶解させたのち３７
℃でｐＨ８，０に調整後スタラーで攪拌し、Ｎ２ガス気
流下で５０μｇの酵素を加え、０．００２Ｎな、いしＯ
，ｌＮＮａ０１１で滴定しながら５分間反応させた。尚
、ｐＨ調整したＢｒ１３５８の０．０８４％水溶液１０
０度を酵素添加直前に添加した。力価は１分間に１マイ
クロモルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１単位とした。

リパーゼ活性： 均一なエマルジョンを作成した５ｍＭトリオレインを２
％牛血清アルブミンを含む同上の反応系に入れ、上記の
方法に準じて活性を測定した。

以下に本発明の実施例について記載する。

実施例１ シュードモナス属リパーゼ（リパーゼ活性２５００Ｕ／
■、エステラーゼ活性２．８ｕ　／■、天野製薬社製品
）　１．５ｘｌＯ−３μｍｏｌｅを含む溶液１００−と
、Ｂｒ１ｊ５８　（花王アトラス社製品）の７．５Ｘ　
１Ｏ−２Ｉ　ｍ。

ｌｅを含む水溶液１００ｇを室温下混合し、リパーゼと
Ｂｒ１ｊ５Ｂを結合せしめたところ、このものはエステ
ラーゼ活性として２０ｕ／■（７倍上昇）を有していた
（　８０ｍＭ酪酸メチルを基質とした場合）。又リパー
ゼ活性は２５００ｕ／ｍｇであった。

実施例２〜１３ 実施例１と同様のシュードモナス属リパーゼ１．５Ｘ　
１０’　ｐ　ｍｏｌｅを含む各溶液１００ｄに各種界面
活性剤の８０μｇを含む水溶液各１ｏｏｐ１！をそれぞ
れ混合し、リパーゼと各種界面活性剤を結合せしめ該結
合物の酪酸メチル分解活性を測定した。その結果を表−
２に示す。

（以下余白） 表−２ 尚、表−２中のＰＯＥはポリオキシエチレン基の略であ
り、相対活性はＢｒ１ｊ５８を１００としたときのエス
テラーゼ相対活性である。

実施例１４ ５％ＮａＣ１及び実施例１と同様のシュードモナス属リ
パーゼ２．ＯＸ　１Ｏ−３ｐ　ｍｏｌｅを含む水溶液１
００４にＢｒ１ｊ５８０．５Ｘ　１０−２＃　ｍｏｌｅ
を含む水溶液１００ｇを加え混合し、リパーゼとＢｒ１
ｊ５８を結合せしめた。

４０ｍＭ酪酸メチルを基質として結合物のエステラーゼ
活性を測定したところ０．ＩＭ　ＮａＣ１を含む系では
２８ｕ／ｗであったが、２　Ｍ　ＮａＣ１存在下でば２
０ｕ／■であった。

実施例１５〜２０ シュードモナス属リパーゼ１．５Ｘ１０−３μｍｏｌｅ
の各　１００ｐ１にＢｒ１ｊ５Ｂの　１．５Ｘ　１０″
２〜９　Ｘ　１０μｍｏｌｅの各濃度を含む水溶波谷１
００越ずつを加え、それぞれのＢｒ１ｊ５８とリパーゼ
の結合比（Ｂ／ｅで示す）からなる結合物を形成せしめ
、基質踊酸メチルを用いてエステラーゼ活性とリパーゼ
とＢｒ１ｊ５８の結合比との関係をみた。その結果を表
−３に示す。

（以下余白） 表−３ 実施例２１ 実施例１と同様のシュードモナス属すパーゼ品１．５Ｘ
　１Ｏ−３ｐ　ｍｏｌｅを含む水溶液にｌｌｒ　ｉ　ｊ
　５Ｂの３．７５Ｘ１０’　ｐ　ｍｏｌｅ〜７．５Ｘ　
１０’μｍｏｌｅを含む水溶液１００ｇを加え混合し、
リパーゼとＢｒ１ｊ５８を結合せしめたのち４０〜１２
０ｍＭの酢酸メチルを加えて基質の各濃度におけるリパ
ーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比（Ｂ／ｅ）とエステラーゼ
活性との関係をみたところ第２図の通りであった。

実施例２２ 実施例１と同様にしてシュードモナス属リバーゼとＢｒ
１ｊ５Ｂ　（花王アトラス社製品）を混合し、結合せし
め、このもののエステラーゼ活性を基質として０．５ｍ
Ｍ）リブチリンを用いて測定したところＢｒ１ｊ混合前
のエステラーゼ活性が３４０ｕ　／■であったものが混
合後２１２０ｕ／ｍｇに上昇した。尚リパーゼ活性は２
５００ｕ　／■であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス属リパーゼのＢｒ１３５Ｂ存在
、非存在下における酪酸メチル濃度依存性をみ　、＝肩 たものであり、第２図は各濃度におけるシュード　＼モ
ナス属リパーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステツー　
ｌゼ活性との関係をみたものであり、第３図は各酪　−
酸メチル濃度におけるシュードモナス属リパーゼ　帳と
Ｂｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステラーゼ活性との関係を　
癩みたものである。　謳 姻 特許出願人　天野製薬株式会社 第１図 酪酸メチル濃度（ｍＭ） 第２図 Ｂ／ｅ　（ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 第３図 Ｂ／ｅ　（ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 手続補正書（自発） 昭和５９年５月λど日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１３９９１９号 ２、発明の名称 リパーゼにエステラーゼ活性を付加する方法３、補正を
する者 事件との関係　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号発明の詳細
な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第１５頁〜第１６頁の表−２を下記の表と
（２）明細書第１６頁下から第４行〜第３行に「相対活
性は・・・エステラーゼ相対活性である。」とあるを「
活性比率とは、界面活性剤無添加のエステラーゼ活性を
１としたとき、各種界面活性剤を添加した場合のそれぞ
れのエステラーゼ活性の示す値である。」と補正する。 （３）明細書第１８真下から第９行の’　Ｂｒ１ｊ５Ｂ
の」とあるを’　Ｂｒ１ｊ５８」と補正する。 （４）明細書第１８頁下から第８行〜第７行の「含む水
溶液１００１１Ｆを」とあるを削除する。 （５）明細書第１８真下から第６行の「酢酸メチル」と
あるを「酪酸メチルｊと補正する。 （６）明細書第１８頁下から第２行〜第１９頁第６行の
実施例２２を下記の文に入れかえる。 ｒ実施例２２ 実施例１と同様のシュードモナス属すパーゼ品１．５Ｘ
１０−３μｍｏｌｅあるいば７．６Ｘ　１０−６μｍｏ
ｌｅを含む水溶液にＢｒ１ｊ５Ｂの４．５Ｘ　１０＝　
μｍｏｌｅあるいは２．２８Ｘ　１０−４　＃　ｍｏｌ
ｅを加え混合し、リパーゼとＢｒ１３５８を結合せしめ
たのち、種々の水溶性の基質あるいは不溶性の基質の活
性を測定したところ表−４に示、すように水溶性の基質
のみ活性が上昇した。 なお基質は０．５％アラビアゴムを含む０．１Ｍ食塩溶
液に溶解あるいは乳化した。 （以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　シュードモナス属菌の産生ずるリパーゼと非イオン
   界面活性剤を混合し、リパーゼと非イオン界面活性剤を
   結合せしめ、リパーゼ活性はそのまま保持し、かつエス
   テラーゼ作用を生ぜしめることを特徴とするリパーゼに
   エステラーゼ活性を付加する方法。 ２　非イオン界面活性剤が親水基としてポリオキシエチ
   レン重合体を持ち、親油基としてアルキル基を持つとこ
   ろの特許請求の範囲第１項記載のリパーゼにエステラー
   ゼ活性を付加する方法。 ３　親水基としてポリオキシエチレン重合体を持ち、親
   油基としてアルキル基を持つ非イオン界面活性剤がポリ
   オキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンド
   デシルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテ
   ル、ポリオキシエチレンテトラデシルエーテル、ポリオ
   キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
   アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
   、ポリオキシエチレンセチル−ステアリルエーテルのい
   ずれかである特許請求の範囲第１項又は第２項記載のリ
   パーゼエステラーゼ活性を付加する方法。 ４　リパーゼと非イオン界面活性剤の結合がリパーゼ１
   分子あたり非イオン界面活性剤分子１０以上からなって
   いるところの特許請求の範囲第１項記載のリパーゼにエ
   ステラーゼ活性を付加する方法。