JPS62146598A - 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法Info
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- JPS62146598A JPS62146598A JP60286665A JP28666585A JPS62146598A JP S62146598 A JPS62146598 A JP S62146598A JP 60286665 A JP60286665 A JP 60286665A JP 28666585 A JP28666585 A JP 28666585A JP S62146598 A JPS62146598 A JP S62146598A
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- enzyme
- reaction
- chitinase
- chitin
- acetylchitooligosaccharide
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は５惟体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造
方法に関する。
方法に関する。
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖は臨床検査秦におけるリゾチ
ームやβ−Ｎ−７セチルグルフサミニグーゼの測定基質
として有用である。特にリゾチーｌ、の基質としては、
５量体以」二のＮ−アセチルキトオリゴ糖が極めて有用
であり、また最近では６量体であるＮ−７セチルキトヘ
キサオ一人の免疫機能増強作用、抗胛鳴効果などが報告
され注目を集めている。
ームやβ−Ｎ−７セチルグルフサミニグーゼの測定基質
として有用である。特にリゾチーｌ、の基質としては、
５量体以」二のＮ−アセチルキトオリゴ糖が極めて有用
であり、また最近では６量体であるＮ−７セチルキトヘ
キサオ一人の免疫機能増強作用、抗胛鳴効果などが報告
され注目を集めている。
しかしながら現在、５ｍ体以北のＮ−７セチルキトオリ
コ糖は、大量生産することが非常ニ困炸である。例えば
従来からの酸によるキチンの限定加水分解では、２〜４
量体は比較的高い収率で得られるが５−に体以上のＮ−
アセチルキトオリゴ糖の収率は非常に低いものである。
コ糖は、大量生産することが非常ニ困炸である。例えば
従来からの酸によるキチンの限定加水分解では、２〜４
量体は比較的高い収率で得られるが５−に体以上のＮ−
アセチルキトオリゴ糖の収率は非常に低いものである。
そこで本発明者等は、５量体以上のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖の大量生産を目的に種々酵素を検索したところ、
メカルディア属に属する微生物の生産するキチナーゼは
、３革本以−ヒのＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、
糖転移反応により効率良く５最体以上のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖を生産することを見い出し本発明を完成した
。従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖のりゾチームによる
糖転移反応によって得られるオリゴ糖についてに報告は
あるがキチナーゼについての糖転移反応による報告は未
だ見当らない。本発明によれば、Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖に封して、リゾチーｌ、よりも強い糖転移反応性を
有してすＳす、効（・テ良＜ ５１．＋ｉｎ体以上のＮ
−＝７セチルＮトオリゴ糖が生産できる１、すなわち本
発明は５室体以りのＮ−アセナルキトオリゴ糖の製造法
を提供するしのて゛ある。
リゴ糖の大量生産を目的に種々酵素を検索したところ、
メカルディア属に属する微生物の生産するキチナーゼは
、３革本以−ヒのＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、
糖転移反応により効率良く５最体以上のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖を生産することを見い出し本発明を完成した
。従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖のりゾチームによる
糖転移反応によって得られるオリゴ糖についてに報告は
あるがキチナーゼについての糖転移反応による報告は未
だ見当らない。本発明によれば、Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖に封して、リゾチーｌ、よりも強い糖転移反応性を
有してすＳす、効（・テ良＜ ５１．＋ｉｎ体以上のＮ
−＝７セチルＮトオリゴ糖が生産できる１、すなわち本
発明は５室体以りのＮ−アセナルキトオリゴ糖の製造法
を提供するしのて゛ある。
本発明のｙ７法に於いて用いられる酵素は、ノカルディ
ア属に属する全生物の生＋）ｒ：するキチナーゼであっ
て次に示す如き理化学的性質を有する。
ア属に属する全生物の生＋）ｒ：するキチナーゼであっ
て次に示す如き理化学的性質を有する。
輸）作用
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し強い糖転移反応を起
こす。本酵素の酵素量に灯し過剰のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を作用させた場合、糖転移反応により屯今度の高
いＮ−７セチルキトオリコ糖を生成する１、またキチン
またはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水
分解する。
こす。本酵素の酵素量に灯し過剰のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を作用させた場合、糖転移反応により屯今度の高
いＮ−７セチルキトオリコ糖を生成する１、またキチン
またはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水
分解する。
（ｂ）至適ｐＪｌ
コロイドキチンを基質として４０°Ｃで反応を行った場
合、本酵素はｐｔ（５，５に至適１）Ｉ］を有する。
合、本酵素はｐｔ（５，５に至適１）Ｉ］を有する。
（ｃ）ｐｌ−１安定性
本酵素は・ｔ″ｃｉ：″２４時間の処理において、Ｈ５
，０−８，Ｏで安定て゛あろ９ （ｄ）至適へ１度 フロイドキチンを基質としてｐＨ５，６で反応を行なっ
た場合、本酵素は７０”Ｃ付近に至適１）１１を有する
。
，０−８，Ｏで安定て゛あろ９ （ｄ）至適へ１度 フロイドキチンを基質としてｐＨ５，６で反応を行なっ
た場合、本酵素は７０”Ｃ付近に至適１）１１を有する
。
（ｒ）熱安定性
本酵素は１１Ｈ５，６で３０分間の処理において５０℃
以下で安定である。
以下で安定である。
（ｆ）分子に
５ＤＳ−ディスク電電泳動法による本酵素の分子量は約
４４，０００である。
４４，０００である。
（ｇ）等電点
アクリルアミドゲル焦点電気泳動による本酵素の等電点
はｐｌ−１９，１付近て゛ある。
はｐｌ−１９，１付近て゛ある。
上記の如き性質を有するキチナーゼは、次のようにして
５！遺することができる。
５！遺することができる。
酵素生産に用いるノカルディア属に属するキチナーゼ生
産菌としては、Ｚカルブイア属にスウ（しキチナーゼを
生産する菌であればいずれでも良い。その例としてはた
とえばノカルディア・オリエンタリス（Ｎ ｏｃａｒｃ
ｌｉａ Ｏｒｉｃｎｔａｌｉｒ、）が挙げられ、昼休
的にはノカルディア・オリエンタリ ス Ｉ
Ｐ ０ １２３６０． Ｔ Ｆ Ｏ１２
３６１，Ｉ ト’０ １２３６２゜ＩＬ：０
１２３０６． ＪＣＭ ４２３５． ＪＣＭ
４６００などが１（げられる。−に記１１−” ０ １
２３６０． Ｉ Ｆ ０１２３６１、 Ｉ ＋’″
０ １２３６２． Ｉ Ｆ Ｏ１２８０６株は、財団
法人発酵研究所のリスト・オブ・カルナニア−で１９８
４年第 ７ 版 （Ｉ ｎ５ｊｉＬｕｔｅ ｆｏ
ｒ Ｆ ｅｒｍｒｒｎ−ｔａｔｉｏ＋＋＋ （Ｊｓａ
ｋａ＋ Ｌ、ｉｓｔ ｏ「Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、 １９
８４＋７しｈ ト’、 ＣＩ ｉ Ｌｉ ｏ口）に掲載
されている。−上記Ｊ Ｃ＼ｉ ４２３５１ Ｊ ＣＮ
３・１６００株は、理化学研究所微生物系統保存施設の
カタログ・オブ・ストレイアズ１９８４年第２ 代（、
Ｊ ａｐａｎ ＣｏｌｌｐｃＬｉｏｎ ｏｆ Ｍ １ｃ
ｒｏ−ｏｒ！：ａｎｉｓ＋ｎｒ、ｔ Ｃ，ａｎａｌｏ
ｇｕｅ ｏｆ Ｓ ｔａｉｎｔ、 １９８４，
２ｎｄＦ、ｄｉｔｉｏｎ）ｉこ掲（或されている。本発
明に、用いらｒしろキチナーゼは／カルヂイア属に属す
るキチナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物中に生産せ
しめること）：より製造される。Ｈ，：ｔ ｉＹ ｌこ
用いられる培地は、］二記徽生物が利用し得る栄養源を
含ら・らのて゛あればいづねて゛ち良いが、キチナーゼ
の生産能をより高めるには誘導基質であるキチンを添加
することが好ましい。例えばコロイドキチン０．５％、
Ｎ−７セチルグルコサミン０．５％、ペプトン０．２％
、酵母エキス０．０１％、リン酸２水素カリウム０．０
３％、リン酸１水素カリウム０．０７？５、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．０５％を含有するもの（ｐ）（７
，０に調整）が挙げられる。液体培地でも固体培地でも
良いが、大量に行う場合には液体培地が好ましい。培養
の方法は振盪培養が好ましい。培養の条件は培地の組成
、菌株の種類１こよって異なるが、培養温度は２０〜３
５°Ｃ１さらに好ましくは２５〜３０℃、培養時開は２
−７日、さら１こ好ましくは２〜５日である。目的とす
るキチナーゼは通常菌体外に蓄積されるので周知の分離
、精製手段により培養物から分離、精製される。たとえ
ば、培養物から遠心分離あるいは濾過により菌体を除去
した後、培養濾液に硫酸アンモニウムを加え塩析を行な
う。塩析により析出した蛋白質を遠心分離により採取し
、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）中で透析し、これ
を遠心分離してその上清液を粗酵素溶液とする。粗酵素
溶液中には目的とするキチナーゼの他、キトビアーゼや
他の理化学的性質を１丁するキチナーゼなどが含まね、
でいる。オ■酵素溶液から［Ｊ的とするキチナーゼの分
離、精製はＳＰ−セフ７デツクスＣ−５０（７アルマシ
ア硅製）のイオン交換クロマトグラフィーおよびバイオ
デルＰ−６０（バイオラド社！！りへの特異的吸着性を
利用して行うことができる。
産菌としては、Ｚカルブイア属にスウ（しキチナーゼを
生産する菌であればいずれでも良い。その例としてはた
とえばノカルディア・オリエンタリス（Ｎ ｏｃａｒｃ
ｌｉａ Ｏｒｉｃｎｔａｌｉｒ、）が挙げられ、昼休
的にはノカルディア・オリエンタリ ス Ｉ
Ｐ ０ １２３６０． Ｔ Ｆ Ｏ１２
３６１，Ｉ ト’０ １２３６２゜ＩＬ：０
１２３０６． ＪＣＭ ４２３５． ＪＣＭ
４６００などが１（げられる。−に記１１−” ０ １
２３６０． Ｉ Ｆ ０１２３６１、 Ｉ ＋’″
０ １２３６２． Ｉ Ｆ Ｏ１２８０６株は、財団
法人発酵研究所のリスト・オブ・カルナニア−で１９８
４年第 ７ 版 （Ｉ ｎ５ｊｉＬｕｔｅ ｆｏ
ｒ Ｆ ｅｒｍｒｒｎ−ｔａｔｉｏ＋＋＋ （Ｊｓａ
ｋａ＋ Ｌ、ｉｓｔ ｏ「Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、 １９
８４＋７しｈ ト’、 ＣＩ ｉ Ｌｉ ｏ口）に掲載
されている。−上記Ｊ Ｃ＼ｉ ４２３５１ Ｊ ＣＮ
３・１６００株は、理化学研究所微生物系統保存施設の
カタログ・オブ・ストレイアズ１９８４年第２ 代（、
Ｊ ａｐａｎ ＣｏｌｌｐｃＬｉｏｎ ｏｆ Ｍ １ｃ
ｒｏ−ｏｒ！：ａｎｉｓ＋ｎｒ、ｔ Ｃ，ａｎａｌｏ
ｇｕｅ ｏｆ Ｓ ｔａｉｎｔ、 １９８４，
２ｎｄＦ、ｄｉｔｉｏｎ）ｉこ掲（或されている。本発
明に、用いらｒしろキチナーゼは／カルヂイア属に属す
るキチナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物中に生産せ
しめること）：より製造される。Ｈ，：ｔ ｉＹ ｌこ
用いられる培地は、］二記徽生物が利用し得る栄養源を
含ら・らのて゛あればいづねて゛ち良いが、キチナーゼ
の生産能をより高めるには誘導基質であるキチンを添加
することが好ましい。例えばコロイドキチン０．５％、
Ｎ−７セチルグルコサミン０．５％、ペプトン０．２％
、酵母エキス０．０１％、リン酸２水素カリウム０．０
３％、リン酸１水素カリウム０．０７？５、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．０５％を含有するもの（ｐ）（７
，０に調整）が挙げられる。液体培地でも固体培地でも
良いが、大量に行う場合には液体培地が好ましい。培養
の方法は振盪培養が好ましい。培養の条件は培地の組成
、菌株の種類１こよって異なるが、培養温度は２０〜３
５°Ｃ１さらに好ましくは２５〜３０℃、培養時開は２
−７日、さら１こ好ましくは２〜５日である。目的とす
るキチナーゼは通常菌体外に蓄積されるので周知の分離
、精製手段により培養物から分離、精製される。たとえ
ば、培養物から遠心分離あるいは濾過により菌体を除去
した後、培養濾液に硫酸アンモニウムを加え塩析を行な
う。塩析により析出した蛋白質を遠心分離により採取し
、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）中で透析し、これ
を遠心分離してその上清液を粗酵素溶液とする。粗酵素
溶液中には目的とするキチナーゼの他、キトビアーゼや
他の理化学的性質を１丁するキチナーゼなどが含まね、
でいる。オ■酵素溶液から［Ｊ的とするキチナーゼの分
離、精製はＳＰ−セフ７デツクスＣ−５０（７アルマシ
ア硅製）のイオン交換クロマトグラフィーおよびバイオ
デルＰ−６０（バイオラド社！！りへの特異的吸着性を
利用して行うことができる。
このようにして得られるキチナーゼの活性や糖転移反応
は次のようにして測定する。
は次のようにして測定する。
（１）キチナーゼの活性
０．２％コロイドキチンを含む０．２Ｍ酢酸緩衝’ａ
（ｐ Ｈ５，６）２． Ｏｍ 、Ｑにｌｖ素液を加えて
４０℃で１０分間反応させる。反応後シャール試薬（０
，５ｇのフェリシアン化カリウムを０．５Ｍ炭酸ナトリ
ウム溶Ｋ１．Ｉ−Ｑに溶解）３．０ｍ４Ｊを加え沸騰湯
中で１５分間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物
を除き上清液の４２０ｍｍにおける吸光度の減少を測定
する。還元糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用い
た標準曲線から求める。酵素活性Ｉ Ｕは１分間に１μ
＋ｎｏｔｅのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素
量とした。
（ｐ Ｈ５，６）２． Ｏｍ 、Ｑにｌｖ素液を加えて
４０℃で１０分間反応させる。反応後シャール試薬（０
，５ｇのフェリシアン化カリウムを０．５Ｍ炭酸ナトリ
ウム溶Ｋ１．Ｉ−Ｑに溶解）３．０ｍ４Ｊを加え沸騰湯
中で１５分間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物
を除き上清液の４２０ｍｍにおける吸光度の減少を測定
する。還元糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用い
た標準曲線から求める。酵素活性Ｉ Ｕは１分間に１μ
＋ｎｏｔｅのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素
量とした。
（２）糖転移反応
５％のＮ−アセチルキトテトラオースを含む０．１Ｍリ
ン酸緩９１液（ｐＨ５，６） ２ ｍ 、Ｑに酵素浴液
を加えて４０℃で４８時間反応させる。一定時間ごとに
反応液を採取し沸騰高中で１０分加熱し反応を停止させ
る。これら溶液を高速液体クロマトグラフィーに供し、
反応生成物を確認した。
ン酸緩９１液（ｐＨ５，６） ２ ｍ 、Ｑに酵素浴液
を加えて４０℃で４８時間反応させる。一定時間ごとに
反応液を採取し沸騰高中で１０分加熱し反応を停止させ
る。これら溶液を高速液体クロマトグラフィーに供し、
反応生成物を確認した。
本発明の原料としては、キチン部分加水分解物、Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖等が用いられる。
セチルキトオリゴ糖等が用いられる。
このキチン部分加水分解物は、キチンを濃塩酸で４０℃
で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した後、活性炭
に吸着させアルコール″Ｃ′溶出することによって調製
できる。キチン部分加水分解物は、２〜８量体のＮ−７
セナルキトオリゴ糖を含み、それぞれのＮ−アセチルキ
トオリゴ糖は、上記アルコール溶出時に、アルコール濃
度勾配をかけて溶出したり、あるいは、デル濾過や高速
液体クロマトグラフィー等の手段により分離し調製する
ことができる。
で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した後、活性炭
に吸着させアルコール″Ｃ′溶出することによって調製
できる。キチン部分加水分解物は、２〜８量体のＮ−７
セナルキトオリゴ糖を含み、それぞれのＮ−アセチルキ
トオリゴ糖は、上記アルコール溶出時に、アルコール濃
度勾配をかけて溶出したり、あるいは、デル濾過や高速
液体クロマトグラフィー等の手段により分離し調製する
ことができる。
本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させるには、
キチン部分加水分解物ある５・はＮ −アセチルキトオ
リゴ糖を０．５〜３０重量％を含むしのを基質とし、ｐ
Ｈ３〜７、温度３０〜６０℃で、酵素量は基質１ｇ当た
り５０〜２，０ＯＯＬＪを用す・で反応させると良い。
キチン部分加水分解物ある５・はＮ −アセチルキトオ
リゴ糖を０．５〜３０重量％を含むしのを基質とし、ｐ
Ｈ３〜７、温度３０〜６０℃で、酵素量は基質１ｇ当た
り５０〜２，０ＯＯＬＪを用す・で反応させると良い。
反応時間は、基質蜀、反応ｐ）（、温度、酵素量等に上
って大きく異なるが、通常３０′Ｊ＞＝４８時間である
。かくして酵素反応を終了した反応混合物は沸騰高中で
１０分′加熱し反応を停止させる。
って大きく異なるが、通常３０′Ｊ＞＝４８時間である
。かくして酵素反応を終了した反応混合物は沸騰高中で
１０分′加熱し反応を停止させる。
上記酵素反応により５猜体以」二のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を多く含む反応混合物が得られろ。：のようにし
て得られる反応混合物からの５量体以トのＮ−アセチル
キトオリゴ糖の分離、精製は、周知の分離、精製手段に
より行なうこし 講（つ 為 Ｌ ン・ シ 斗
ｒゼ ９壬枕 岸 げ Ｆｖ ｌ＃： ；ＥＸ今
物 を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離落出
させる方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
等の手段により分離、精製することができる。
リゴ糖を多く含む反応混合物が得られろ。：のようにし
て得られる反応混合物からの５量体以トのＮ−アセチル
キトオリゴ糖の分離、精製は、周知の分離、精製手段に
より行なうこし 講（つ 為 Ｌ ン・ シ 斗
ｒゼ ９壬枕 岸 げ Ｆｖ ｌ＃： ；ＥＸ今
物 を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離落出
させる方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
等の手段により分離、精製することができる。
次に、本発明の参考例及び実施例について史に具体的に
説明するが、かかる説明によって本発明が何ら限定され
るものでないことは勿論である。
説明するが、かかる説明によって本発明が何ら限定され
るものでないことは勿論である。
参考例１
キチナーゼの調製
グルツース１％、ベフ゛トン１％、酵はエキス０．５％
、リン酸２水素カリウｌ、０．０３％、リン酸１水素カ
リウノ、０，０７％、硫酸マグネシウム・７水和物ｏ、
ｏ５ｙ６ （Ｌｌ ）−１７，０に調整）の組成の前培
養培地１０ ＋ｎ 、Ｑを含む１００ｍ、Ｑ容フラスコ
に、ノカルディア・オリエンタリスＩ ＦＯ＋２８０６
の一白金ｌ［を接＋１Ｔ！Ｌ、３０゛Ｃで１日間振壺培
養した。
、リン酸２水素カリウｌ、０．０３％、リン酸１水素カ
リウノ、０，０７％、硫酸マグネシウム・７水和物ｏ、
ｏ５ｙ６ （Ｌｌ ）−１７，０に調整）の組成の前培
養培地１０ ＋ｎ 、Ｑを含む１００ｍ、Ｑ容フラスコ
に、ノカルディア・オリエンタリスＩ ＦＯ＋２８０６
の一白金ｌ［を接＋１Ｔ！Ｌ、３０゛Ｃで１日間振壺培
養した。
次にフロイドキチン０．５％、 Ｎ−アセチルグルコサ
ミン０．５％、ペプトン０．２％、酵母エキス０．０１
％、リン酸２水素カリウム０．０３％、リン酸１水素カ
リウム０．０７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０
５％の組成の本培養培地１５０ｍ、ＱＱ含む１０００ｍ
す容７ラスフ【こ、前記１）１ｊ培養終了液を接種し３
０’Ｃで３日間振盪培養した。この上うな繰作により得
られた培養液４５０ｍΩ（１５０ｍ夏Ｘ３）を１１０１
０００ｒｐ、１５分間遠心分離して菌体を除き、上清液
を７５％飽和となるように固型硫安を加え、１°Ｃで塩
析を行なった。塩析により沈澱した蛋白質を４°Ｃて’
８．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間遠心分離シテ採取し、これ
を少量の水に溶解し１０ｍＭ酢酸緩衝液（ＴＩ８５．０
）ｌこ透析した。透析液を４℃で１０．０００ｒｐｍ。
ミン０．５％、ペプトン０．２％、酵母エキス０．０１
％、リン酸２水素カリウム０．０３％、リン酸１水素カ
リウム０．０７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０
５％の組成の本培養培地１５０ｍ、ＱＱ含む１０００ｍ
す容７ラスフ【こ、前記１）１ｊ培養終了液を接種し３
０’Ｃで３日間振盪培養した。この上うな繰作により得
られた培養液４５０ｍΩ（１５０ｍ夏Ｘ３）を１１０１
０００ｒｐ、１５分間遠心分離して菌体を除き、上清液
を７５％飽和となるように固型硫安を加え、１°Ｃで塩
析を行なった。塩析により沈澱した蛋白質を４°Ｃて’
８．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間遠心分離シテ採取し、これ
を少量の水に溶解し１０ｍＭ酢酸緩衝液（ＴＩ８５．０
）ｌこ透析した。透析液を４℃で１０．０００ｒｐｍ。
１５分間遠心分離して上清？ｌｌｊ；ｉ０ｍＱを得、こ
れを粗酵素液とした。
れを粗酵素液とした。
（１■酵’Ｊｔ５ ？ａ：（Ｏｍ−Ｑを１０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐｉ−１５，０２で・ＶＫｌｉ化したｓ ｐ−セ
フ１デックスＣ−５０（７アルマシア社ｔＡ）のカラム
（２，５Ｘ４０ｃｍ）に吸、ａさせた。溶出は０→０．
５Ｍの食塩を含む同上緩衝液による塩濃度勾配溶出法で
行なった。なお流速は６０憤り一７’ ｈ ｒであった
。ここで得られた活性画分１４９１１ＩＱに８０％飽和
となるように固形硫安を加え４°Ｃで塩析を行なった。
衝液（ｐｉ−１５，０２で・ＶＫｌｉ化したｓ ｐ−セ
フ１デックスＣ−５０（７アルマシア社ｔＡ）のカラム
（２，５Ｘ４０ｃｍ）に吸、ａさせた。溶出は０→０．
５Ｍの食塩を含む同上緩衝液による塩濃度勾配溶出法で
行なった。なお流速は６０憤り一７’ ｈ ｒであった
。ここで得られた活性画分１４９１１ＩＱに８０％飽和
となるように固形硫安を加え４°Ｃで塩析を行なった。
塩析により沈澱した蛋白質を４゛Ｃで８，０００ｒｐ＋
ｎ、１５分間遠心分離して採取し、０．５Ｍ食塩を含ｂ
５０ｍＭ酢酸緩衝ａ（ｐＨ５，６）に透析した。透析液
を４°Ｃで１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して
上清液３＋ｎ Ｑを得た。上記で得られた上清液３ｍ、
Ｑを０．５Ｍ食塩を含む５０ｍＭ＃酸緩衝液（ｐＨ５，
６）で平衡化したバイオデルＰ−６０（バイオラド社製
）のカラム（２，２Ｘ７７ｃ＋ａ）に供した。溶出は同
上緩衝液により行ない、バイオデルＰ −６０への特異
的吸着性により遅れて分離された活性画分１００蹟交を
得た。なお流速は１２．８随交／ｈｒであった。以上の
精製の要約を第１表に示す。このようにして得られたキ
チナーゼは、５ＤＳ−ディスク電気泳動で均一であった
。
ｎ、１５分間遠心分離して採取し、０．５Ｍ食塩を含ｂ
５０ｍＭ酢酸緩衝ａ（ｐＨ５，６）に透析した。透析液
を４°Ｃで１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して
上清液３＋ｎ Ｑを得た。上記で得られた上清液３ｍ、
Ｑを０．５Ｍ食塩を含む５０ｍＭ＃酸緩衝液（ｐＨ５，
６）で平衡化したバイオデルＰ−６０（バイオラド社製
）のカラム（２，２Ｘ７７ｃ＋ａ）に供した。溶出は同
上緩衝液により行ない、バイオデルＰ −６０への特異
的吸着性により遅れて分離された活性画分１００蹟交を
得た。なお流速は１２．８随交／ｈｒであった。以上の
精製の要約を第１表に示す。このようにして得られたキ
チナーゼは、５ＤＳ−ディスク電気泳動で均一であった
。
ｆｊＳＩ表
実施例ｌ
Ｎ−−アセチルキトテトラオース１号を４０ ＋ｎ 、
ＱのＣ）、１＼１リン酸緩衝液１＋）１５．６）に溶解
し４０″Ｃに保った後、参考゛例１と同様の７７法で調
製したえ千ナーゼを、＄００Ｕ添加して、４０ ’（：
で６時間反応させた。
ＱのＣ）、１＼１リン酸緩衝液１＋）１５．６）に溶解
し４０″Ｃに保った後、参考゛例１と同様の７７法で調
製したえ千ナーゼを、＄００Ｕ添加して、４０ ’（：
で６時間反応させた。
反応路ｒ後、１００°Ｃで１０分間加熱し反応を停止ヒ
させる。得られた反応混合物はイオン交換！Ｉ脂によろ
脱塩を行ない、さらに減圧濃縮後凍結乾燥−することに
より０．９５ｇの白色粉末となった。この白色粉末の生
成物組成は、高速液体クロマトグラフ（−１ごよって確
認したところ、Ｎ−アセチルキトヘキサオー久１８％、
Ｎ−アセチルキトテトラオース６０％、Ｎ−７セチルキ
トビオ一ス２０％であった。
させる。得られた反応混合物はイオン交換！Ｉ脂によろ
脱塩を行ない、さらに減圧濃縮後凍結乾燥−することに
より０．９５ｇの白色粉末となった。この白色粉末の生
成物組成は、高速液体クロマトグラフ（−１ごよって確
認したところ、Ｎ−アセチルキトヘキサオー久１８％、
Ｎ−アセチルキトテトラオース６０％、Ｎ−７セチルキ
トビオ一ス２０％であった。
プＳ ；布（列 ？
Ｎ−７セナルキトベンタオ一７５１ｇを２０＋ｎＱの０
．１〜・１リン酸緩衝液（、，１−１５，６）にｌ）を
解し４０°Ｃに保った後、参考゛例１と同様のｔ７法で
調装したキチナーゼを２００Ｕ添加して、４０°Ｃて・
１５時間反応させ？−百＋、’、＝ ４ｋ −７’
４東１Ａ ／ｌ ’／’ 情１凸／−％ ｔ’ｌｌ ｌ
ｖ＋ ａｋ、 ｌ ｌ；＋ ｒＱ−九停止ヒさせろ
。得られた反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行
ない、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより０．９
２ｇの白色粉末となった。この白色粉末の生成物組成は
、高速液体クロマトグラフィーによって確認したところ
、Ｎ−アセチルキトへブタオース５％、Ｎ−７セチルキ
トペンタオ一ス３３％、Ｎ−７セチルキトテトラオ一ス
１０％、Ｎ−アセチルキトトリオース３１％、Ｎ−７セ
チルキトビオ一ス２０％、Ｎ−７セチルグルコサミン１
％であった。
．１〜・１リン酸緩衝液（、，１−１５，６）にｌ）を
解し４０°Ｃに保った後、参考゛例１と同様のｔ７法で
調装したキチナーゼを２００Ｕ添加して、４０°Ｃて・
１５時間反応させ？−百＋、’、＝ ４ｋ −７’
４東１Ａ ／ｌ ’／’ 情１凸／−％ ｔ’ｌｌ ｌ
ｖ＋ ａｋ、 ｌ ｌ；＋ ｒＱ−九停止ヒさせろ
。得られた反応混合物はイオン交換樹脂による脱塩を行
ない、さらに減圧濃縮後凍結乾燥することにより０．９
２ｇの白色粉末となった。この白色粉末の生成物組成は
、高速液体クロマトグラフィーによって確認したところ
、Ｎ−アセチルキトへブタオース５％、Ｎ−７セチルキ
トペンタオ一ス３３％、Ｎ−７セチルキトテトラオ一ス
１０％、Ｎ−アセチルキトトリオース３１％、Ｎ−７セ
チルキトビオ一ス２０％、Ｎ−７セチルグルコサミン１
％であった。
実施例３
Ｎ−７セナルキトテＦラオ一スｌＯｇを１６０１１Ｉす
の０．ＩＭ！Ｊン酸緩衝波緩衝液 ５．６）に溶解し４
０°Ｃに保った後、参考例１と同様の方法で調製したキ
チナーゼを２，３００ｔｌ添加して、４０℃で２６時間
反応させた。反応終了後、１００°Ｃで１０分間加熱し
反応を停止させる。得られた反応混合物は、活性炭カラ
ム（４，４Ｘ １００ｃｍ）に供して生成したオリゴ糖
を吸；？′Ｆさせ、（）→５０％のエタノール濃度勾配
法で、溶出ｆｉ１６９本用いでオリゴ糖本分鵬シ！８！
出１た。次いで得られたそれぞれの両分を減圧濃縮後、
凍結乾燥して、Ｎ−アセチルキトヘキサオースｌ 、６
、− 、 そのｌ、Ｎ−７セチルキトビオース２．５ｇ
、 Ｎ−７セチルキトテトラオース５．５ｇを得た。
の０．ＩＭ！Ｊン酸緩衝波緩衝液 ５．６）に溶解し４
０°Ｃに保った後、参考例１と同様の方法で調製したキ
チナーゼを２，３００ｔｌ添加して、４０℃で２６時間
反応させた。反応終了後、１００°Ｃで１０分間加熱し
反応を停止させる。得られた反応混合物は、活性炭カラ
ム（４，４Ｘ １００ｃｍ）に供して生成したオリゴ糖
を吸；？′Ｆさせ、（）→５０％のエタノール濃度勾配
法で、溶出ｆｉ１６９本用いでオリゴ糖本分鵬シ！８！
出１た。次いで得られたそれぞれの両分を減圧濃縮後、
凍結乾燥して、Ｎ−アセチルキトヘキサオースｌ 、６
、− 、 そのｌ、Ｎ−７セチルキトビオース２．５ｇ
、 Ｎ−７セチルキトテトラオース５．５ｇを得た。
Claims (1)
- ノカルディア属の生産するキチナーゼを用い、キチン部
分加水分解物、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖等を基質とし
て５量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を製造する方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60286665A JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60286665A JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62146598A true JPS62146598A (ja) | 1987-06-30 |
| JPH0568239B2 JPH0568239B2 (ja) | 1993-09-28 |
Family
ID=17707365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60286665A Granted JPS62146598A (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62146598A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262310A (en) * | 1991-05-31 | 1993-11-16 | Akebono Brake Industry Co, Ltd. | Enzymatic decomposition method of chitin-containing materials |
| JP2001261565A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-26 | Food Industry Research & Development Inst | 細胞の酸化窒素の生産を阻害するためのキチン質物質の使用 |
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
-
1985
- 1985-12-19 JP JP60286665A patent/JPS62146598A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262310A (en) * | 1991-05-31 | 1993-11-16 | Akebono Brake Industry Co, Ltd. | Enzymatic decomposition method of chitin-containing materials |
| JP2001261565A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-26 | Food Industry Research & Development Inst | 細胞の酸化窒素の生産を阻害するためのキチン質物質の使用 |
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0568239B2 (ja) | 1993-09-28 |
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Legal Events
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