JPS6036496A - 不動化された核酸プローブおよび核酸類の固体の支持体 - Google Patents

不動化された核酸プローブおよび核酸類の固体の支持体

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JPS6036496A JP59138046A JP13804684A JPS6036496A JP S6036496 A JPS6036496 A JP S6036496A JP 59138046 A JP59138046 A JP 59138046A JP 13804684 A JP13804684 A JP 13804684A JP S6036496 A JPS6036496 A JP S6036496A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸を固体の基質（ｓｕｂｓｔｒａｅ）へ結
合して、種々の試験、とくに特定のポリヌクレオナト配
列を決定するための交雑アッセイにおいて使用するため
に適当な固体のプローブに関する。
ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑およびＤＮＡ−ＲＮＡ交雑のアンセ
イにおいて、相補的な核酸の鎖の１木はふつう同体の支
持体へ結合される。これはバックグラウンドを減少する
ことを助け、かつ対応する核酸の分離または即離に使用
することができる。
固体の支持体へＤＮＡを結合する方法は、（１）１本鎖
のＤＮＡのこトロセルロース紙への非特異的な物理的吸
着、および（２）ジアゾカップリングを介する共有結合
を包含する。両者の方法は、１本鎖のＤＮＡについて特
異的である。これらの共有結合の反応は非特異的であり
、かついくつかの部位が結合される。これらは効果のな
い交雑を生じ、かつ完全な忠実度を損失させる。鎖当り
のいくつかの結合点は、ＤＮＡの柔軟性を減少させかつ
交雑速度を減少させる。その−に、このような付加物の
寿命は非常に長いというわけではない。
ＤＮＡは容易にはげ、そして放射能を使用しないと、固
体の支持体を定量することは困難である。
診断の目的でＤＮＡプローブを使用することは、核酸の
残部から容易に分離することができる相へＤＮＡを標識
付けする有効な方法を必要とする。
１９８３年７月５日に出願された現在係属中の米国特許
出願第５１１，０６３号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ、Ｒａ
ｅ　ａｎｄ　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ）は、核酸類についての
種々の試験、例えば、個体のＤＮＡの泌状赤血球貧血に
ついての試験を開示している。この試験は可溶性の標識
プローブおよび固体の支持体へ固定されたプローブを含
む。このプローブは、例えば一方の端において支持体、
例えば、セルロース分子のヒドロキシル基と反応しかつ
他方の端においてＤＮＡと反応する二官能性試薬により
、支持体へ化学的に１Ｍ定することができる。これは多
くの目的に対してきわめて満足すべきものであるが、あ
る場合において基質とＤＮＡとが多く結合しすぎて、こ
の試験におけるＤＮＡの感度を損傷することがある。
したがって、本発明の目的は、核酸を固体の支持体へ、
容易にかつ試験におけるＤＮＡの感度を損傷しないで結
合する方法を提供することである。
これらの目的および他の目的は、本発明に従い実現され
る。本発明によれば、（ａ）固体の基質、（ｂ）光化学
的に反応性の核酸結合性配位子、および（ｃ）前記基質
および前記核酸結合性配位子と化学的に結合する二価の
基からなる、適当に照射すると核酸を結合することがで
きる固体の支持体が提供される。
使用する特定のカップリング剤は、官能イヒされ、光化
学的に反応性の核酸結合性配位子１例えば、内位添加化
合物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｃｏｍｐｏｕｎｄ）、
例えば、アミノ置換フロクマリン類、例えば、アミノー
メチルージメチルーアンゲリシンおよびアミノーメチル
ートリメチループソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、およ
びアミノフェナントリシウムハライドならびにそれらの
密接に関連する化学的誘導体、および非内位添加化合物
、例えば、ネトロブシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジス
タマイシン（ｄ　ｉ　ｓ　ｔ　ａｍｙｃ　ｉｎ）、Ｈｏ
ｅｃｈｓｔ　３３２５Ｂおよびビス−ベンズイミダゾー
ルである。光活性化すると、これらの試薬は核酸と化学
的に結合するであろう。
これらの試薬は核酸反応性部位以外に官能化された部位
を有しかつ、このような他の部位により、それらは固体
の基質へ結合し、これにより順次に核酸をこのような基
質へ、核酸の機能の損傷を最小ｔこして、結合させる。
広範な種類の内位添加剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔ　ｉ　
ｎｇ　ａｇｅｒ＋ｔ）の明らかに官能化された光化学的
に反応性の形態を、結合剤として使用することができ、
そしてこれらをド表に例示する： 内位認加化合物および代 表的の化合物　文献 Ａ、アクリジン染料類　Ｌｅｒｍａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、３： １８　（１９６１）；Ｂ １　ｏ　ｏｍｆ　ｉ　ｅ　Ｉ　ｄ ｅｔ　ａｌ、”Ｐｈｙ ｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ”、Ｃｈａｐｔｅ ｒ　７．Ｐｐ、４２９ −４７６、Ｈａｒｐｅ ｒａｎｄＲｏｗ プロツバリン、アクリ　ｅ、ＮＹ（１９７ジンオレンジ
、ギナク　４） リン、７’７’）７／＜リ　Ｍｊ　１Ｊｅｒ　ｅＬｙ　
ａｌ、Ｂｉｏｐｏｌｙ ｍｅｒｓ　ｌ！Ｊ：２０ ９１　（１９８０） Ｂ、フエナントリジン類　ＢＩｏｏｍｆｉｅｌｄｅｔ　
ａｌ、ｓｕｐ エチジウム（ｅｔｈｊ　ｒａ；Ｍｊ　ＩＪｅｒｄｒｕｍ
）　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒ コラリン（ｃｏｒａｌ　ａ ｙｎｅ）　Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃ ｈｅｍ、１９：１２６ Ｌ（１９７６） エリブチシン、エリプ　Ｆｅ５ｔｙ　ｅｔ　ａチシン陽
イオンおよび　ｌ、ＦＥＢＳ　ＬＥＴ：Ａ４体　ＴＥＲ
３１７：３２ １　（１９７１）；ＫＯ ｈｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。
３５ニア１（１９７ ６）；ＬｅＰｅｃｑ ｅＬ　ａｌ、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）　７１　：　５ ０７８　（１９７４）； Ｐｅ１ａｐｒａｔ ｅｔａｌ、Ｊ、Ｍｅ ｄ、Ｃｈｅｍ、２３　： １３３０　（１９８０） Ｃ１ｙｘナジン類　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ５−メチルフ
ェナジン　ｅｔ　ａｌ、ｓｕｐ陽イオン　ｒａ Ｄ、フェノチアジン類　１ｂｉｄ クロブラマジン Ｅ、キノリン類　１ｂｔｄ クロロキン キニン Ｆ、アフラトキシン　１ｂｉｄ Ｇ、多環式炭化水素類お　１ｂｉｄ よびそれらのオキシラ ン誘導体 ３．４−ヘンズピレ　Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａン、ヘンズピ
レンジ　ｌ　、Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ。
オールエポキシド、ｌ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ−ピレニ
ルオキシラ　Ｓ、Ｃｏｍｍ、８２：ン　９２９　（１９
７８） ベンズアン）・ラセン−Ａｍｅａ　ｅｔ　ａ５．６−オ
キシド　ｌ　、５ｃｉｅｎｃｅ１７６（１９７２） Ｈ、アントラマイシン類　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄｅｔ　
ａｌ、ｓｕｐ アントラマイシンＤ　ｒａ ■、アンＩ・ラサイクリノ　１ｂｉｄ ン類 β−ロＦマイシンＡ ダウナマイシン Ｊ、チアキサンテノン類　１ｂｉｄ ミラシル Ｋ、アントラマイシン　１ｂｉｄ Ｌ、ミドマイシン　Ｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、５ｐ ｅｃ、Ｐｕｂｌ、３ニ ア９　（１９７７）、；　Ａ ｋｈｔａｒ　ｅｔ　ａ １　、Ｃａｎ、Ｊ　、Ｃｈ ｅｍ、５３：２８９１ （１９７５） Ｍ、白金錯体類　Ｌｉ　ｐｐａｒｄ　、Ａｃｃｔ　ｓ、
Ｃｈｅｍ、Ｒ ｅｓ、１１：２１１ （１９７８） Ｎ、ポリ内位添加化合物　Ｗａｒｉｎｇ　ｅｔｘ＊７マ
イシン　ａｔ、Ｎａｔｕｒｅ ２５２：６５３　（１９ ７４）；Ｗａｋｅ　ｌ　ｉ ｎ、Ｂｊｏｃｈｅｍ。
Ｊ、１５７：７２１ （１９７６） ギノマイシン　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ。
トリオスチン　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。
ＢＢＭ９２８Ａ　１７３：１１５　（１９タツデム　’
７８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ　ａｌ、Ｂｊｏｃ ｈｅｍ、１９：５５３ ７　（１９８０）：Ｖｉ Ｓ　Ｗ　ａ　ｍｆ　ｔｒ　ａ ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕ ｒｅ　２８９：８１７ （１９８１） シアクリジン類　ＬｅＰｅｃｑ　ｅｔ ａ　ｌ　、　ＰＮＡＳ　（ＵＳ Ａ）７２：２９１５ （１９７５）　：Ｃａｒ ｒｅｌｌａｓｋｉｓ ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｓ、Ａｃｔａ　４ １８：２７７（１９７ ６）　；Ｗａｋｅ　ｌ　ｉ、ｎ ｅｔ　ａｌ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ　１７：５０ ７５　（１９７８）　；ｗ ａｋｅｌｉｎ　ｅｔ ａｌ、ＦＥＢＳ　Ｌｅ ｔｔ、１０４：２６１ （１９７９）；Ｃａｐ ｅｌｌｅ　ｅｔ　ａ １　、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１８　：　３３５４　（１９ ７９）；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ　ａｌ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、１９　：　５８ ２５　（１９８０）　：Ｂ ｅｒｎｉｅｒ　ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｊ、１９９：４７ ９　（１９８１）；Ｋｉ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、２１： ４９８２　（１９８ ２） エチジウムニ量体　Ｇａｕｇａｉｎ　ｅｔａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅ ｍ、１７：５０−／８ （１９７８）；Ｋｕｈ １ｍａｎ　ｅｔ　ａ １、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、５：２ ６２９　（１９７８）　； Ｍａｒｌｃｏｖｉｔｓ ｅｔ　ａｌ　、Ａｎａ １、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、 ９４：２５９　（１９７ ９）　：Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ　ａｌ、ＪＡＣ５ １（１０：１９６８ （１９７８）；　ｉ　ｂ　ｉ ｄ　１０１：３６６４ （’１９７８） エリプチセンニ借体お　Ｄｅｂａｒｒｅ　ｅｔよ（Ｊａ
Ｎ似体　ａｔ、Ｃｏｍｐｔ　。
Ｒｅｎｄ、Ｓｅｒ。
Ｄ、２８４：８１　（１ ９７７）；Ｐｅ１ａｐ ｒａｔ　ｅｔ　ａｔ。
Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅ ｍ、２３　：１３３６ （１９８０） ′＼テｏ、”−、−（ｈｅｔ　Ｃａ１ｎ　ｅｔ　ａｅｒ
ｏｄｉｍｅｒ）類　１．Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２１：
６５８ （１９７８）　；Ｇａｕ ｇａｉｎ　ｅｔ　ａ １　、Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ。
１７：５０７８（１９ ７８） 畳一体　Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ ａｔ、ＪＣ３Ｃｈｅ ｍ、ｃｏｍｍ、１６２ （１９８３）；Ａｔ　ｎ ｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ。
ＪＡＣ３１０５：２ ９１３（１９８３） Ｏ、ノルフィリ７Ａ　Ｌｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ、ＪＡＣ３
１０４ ：３２１３（１９８ Ｐ、フルオレン類および　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄフルオ
レノン類　ｅｔ　ａｌ、ｓｕｐ 　ａ フルオレノジアミン類　Ｗ　ｉ　ｔ　ｋ　ｏ　ｗ　ｓ　
ｋ　１ｅｔａｌ、Ｗｉｓ ｓ、Ｂｅ１ｔｒ、−Ｍ ａｒｔ　１ｎ−Ｌｕｔ　ｈ ｅ’ｒ−ＴＪｎｉｖ、）（ａ ｌｉｅ　Ｗｉｔｔｅｎ ｂｅｒｇ、１１　（１９ ８１） Ｑ、フロクマリン類 ７ンゲＩ）シン　Ｖｅｅｍａ　ｅｔ、ａｌ　、ＭＧＧ　
、Ｍｏ　ｌ　。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　。
１７９：　１　（９８０） ４．５°−ジメチルア　Ｖｅｄａｌｄｉ　ｅｔンゲリシ
ン　ａｌ、Ｃｅｍ−Ｂｉ ｏｌ、Ｉｎｔｅｒａｃ ｔ、３６：２７５（ｔ ９８１） プソラレン　Ｍａｒｃｉａｎｉ　ｅ ｔ　ａｌ、Ｚ、Ｎａｔ ｕｒｆｏｒｓｃｈ　Ｂ ２７　（２）：１９６ （１９７２） ８−メトキシブソラレ　Ｂｅｌｏｇｎｏｚ　ｅン　ｔａ
ｌ、Ｍｕｔａ ｔ　、Ｒｅｓ、８４：　１ １　（１９８１）；５ｃ ｏｔｔ　ｅｔ　ａｔ。
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ。
Ｐｈｏｔ　ｏｂｉ　ｏ　Ｉ　。
３４　：　６３　（１９８ ５−アミノメチル−８Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ−メトキシプ
ソラｌ／７　ａｌ、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ　、２２　：１８
４７ （１９８１） ４．５．８−１リメチ　Ｂｅｎ−Ｈｕｒ　ｅｔルブ’）
ｙし７　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ　３３１：１ ８１（１９７３） ４′−アミノメチル−１ｓｓａｃｓ　ａｔ４．５．８−
トリメチ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅルブソラレン　ｍ、１６
　：１０５８ （１９７７） 午サントキシ７　Ｂｅａｕｍｏｎｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈ ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ。
Ａｃｔａ　６０８：１ ８２９　（１９８０） Ｒ、ペンフジピロン類　Ｍｕｒｘ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｊ
　、Ｈｅｔ　、Ｃｈ ｅｍ、１２：４１７ （１９７５）；Ｈｏｒ ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ。
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ。
Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ。
２０：４０７　（１９７ ４） Ｓ、モノストラル・フ７　Ｊｕｏｒｒａｎｚ　ｅスト−
ブル−（Ｍｏｎ　ｔ　ａｌ、Ａｃｔａｏｓｔｒａｌ　Ｆ
ａｓ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。
ｔ　Ｂ　１ｕｅ）　７０　：１３０　（１９８２） アンゲリシン、さらに詳しくは４°−アミノメチル−４
，５′−ジメチルアンゲリシンは、次の構造式を有する
： ＣＢ。
ＣＤａｌｌ’Ａｃｑｕｚ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｈｏｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｃｌ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ
、Ｖｏｌ、３７．Ｎｏ、４．ｐｐ、３７３−３７９．１
９８３参照）。
プソラレン、さらに詳しくは４′−７ミノメチルー４．
５’、８−）リメチループソラレン（ＡＭＴ）は、次の
構造式を有する： ＣＩｆ　。
（Ｃａｄｅｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　ＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇＹ、Ｖｏｌ、３
７．Ｎｏ、４．ｐｐ、３６３”３７１．１９８３参照）
。
例えば、塩化メチジラムは、次の式を４１する： （Ｇｒａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、１９８１．Ｖｏｌ、２０．ｐｐ、１８８７−１８９
２参照）。その七ノ〜およびジーシジド類似体は、下に
示され、エチル対応化合物およびフェニル側鎖の４−（
３−アミノプロピル−Ｎ−カルハモイル）誘導体（ミチ
ンウムプロビルアミン）と匹敵して反応性である： メチジラムモノアシド 国体の基質は、反応性基を有するいかなる個体であるこ
ともで、キる。反応性基は、カルボキシル、アミンなど
でることができるが、好ましい反紀、性ノ、（はヒドロ
キシル、例えば、セルロース上にイｆ在するヒドロキシ
ルである。セルロースは、未変性のもの、例えば、綿ま
たは紙、あるいは丙生きれたもの、例えば、レーヨン、
あるいは部分的にエステル化されたもの、例えば、酢酸
セルロースまたはプロピオン酸セルロース、ことに硝酸
セルロース、あるいは部分的にエーテル化されたもの、
例工ば、メチルセルロ−ス メチルセルロースであることができる。
光化学的に活性な内位添加試薬は固体の基質と直接組み
合わせることができるが、有利には結合をつくる相互の
カプラーが存在する。ｉＩ！！当な試薬は、二官能性化
合物、例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、１，４−ブタ
ンジオールジグリシジルエーテルなどである。これらは
同体の基質および光化学的試薬の両者と同時に反応させ
るか、あるいはまず一方と反応させ、次いで他方と反応
させる。
その後，生成物をさらに核酸と光化学的に反応させる。
カプラーおよび核酸との反応は実質的に定着的であるの
で、試薬の使用量は核酸対固体の支持体の所望比に依存
する。大抵のＬＪ的に対して、固体の支持体のｔｇにつ
き約０．１−１０００ｍｇ、好ましくは約１〜１００ｍ
ｇの核酸は適当であるが、その量は、核酸の分子量，そ
の感受性およびそれを使用する特定の試験に依存して１
−下させすることができる。
各上程における反応条件は一般にそれ自体知られており
、そして反応を妨害せずに進行させる、いかなる溶媒お
よび温度をも使用することができる。温度は、例えば、
約−１０〜１００°Ｃ７好ましくは約１０〜５０°Ｃ１
最も好ましくはは室温であり、そして不活性溶媒、例え
ば、エーテル、四＋１１化炭素、ＴＨＦなどを使用する
。
本発明において使用する光化学的に活性な試薬は、好ま
しくはアミノ基を介して反応する。それをＲＮＨ２と表
示かつ側基ＯＨをもつ基質をＳと表示すると、段階的反
応は次のとおりである：＼ Ａ、ａ）ｗｉｔｈＣＮＢｒ ■−ＯＨ ↓ＲＮＨ。
ＮＨ １ ｂ）■−ＯＨ １ ０ＨＯ〃 −Ｎｊｉ　ｌイ ■□ＮＲ溪る杉済核酸 アンゲリシンおよびプソラレンのアミノ誘導体は、同一
でないにしても、相応して反応する。
選択する輻射の特定の波長は、特定の光試薬および１本
鎖の核酸または二本鎖の核酸のどちらに結合しようとす
るかに依存するであろう。両者の鎖の核酸に結合する場
合、それは核酸が変性されない方法および程度であるこ
とができる。
核酸は、必要に応じて、短い鎖（オリゴヌク［・オチト
）または長い釦、二本鎖または一本鎖のＲＮＡまたはＤ
ＮＡであることができる。
モノ付加物（ｍｏｎｏａｃｌｄｕｃｔ）の形成は交雑の
実験について望ましい。架橋物において、両者のＤＮＡ
鎖はプソラレンの発色団へ共有結合し、それゆえ交雑前
の分離は困難である。交雑すべきプローブをＤＮＡの他
の比特異的片へ結合する場合、比特異的部分は架橋物ま
たは七ノ伺加物の形成を介して結合することができる。
この場合において、照射は３００〜３９０ｎｍの波長に
おいて実施することができる。３９０ｎｍにおける照射
はモノ付加物を生成し、３６０〜３００ｎｍにおける照
射はモノ付加物および架橋物の両者を生成する。
アンゲリシン化合物を使用する場合、生成物は照射の波
長に無関係に主としてモノ付加物である。
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。すべて
の部は、特記しないかぎり、改量による。
実施例１ １、固体の支持体の活性化およびＡＭＴの結合後ｍｌΔ
する手ｊ賄はセファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ
ｅｘ）Ｇ２５およびセルロースを用いて実施したが、他
のヒドロキシ含有固体の支持体を同一の手順により活性
化することができる ａ）１．４−ブタン−ジオール−ジグリシジルエーテル
を使用する活性化 ０．５〜１ｇの固体の粉末を水で膨潤させ、洗浄し、次
いで１〜ｌ　Ｏｍ　ｌの水酸化ナトリウム溶掖（０，５
モルラを添加する。この濃厚な懸濁液に、Ｌｍｌの１，
４−ブタンジオールージグリシシルエーテルを協力１け
る。この懸濁液を一夜機械的振盪機七で振盪し、次いで
水酸化ナトリウム（０，５モル）溶滴で洗浄し、水中の
１．Ｏｍｌの４゛−アミノメチル−４，５’、８−トリ
メチルーブソラレン（２ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を添加
し、次いで１モルの水酸化ナトリウムを添加して濃厚な
懸／ｖ１液を得る。次いでこの懸濁液を室温において２
４１１ｉ１′問おだやかにかきまぜ、過剰の未反応の残
留物をリジンで破壊（ｑｕｅｎｃｈ）する。
この固体を次いで水で洗浄し１次いでＤＮＡの結合に所
望の水性緩衝液で洗浄する。
ｂ）紙のエポキシ化のため、ホヮッ１マン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）５４０．ｌおよび５４１型の濾紙を用いて回−の
手ｊ明を反復する。濾紙を時計皿またはビーカーのふた
の−１−に取り、毛で時々ひっくり返す。この手順の残
りは１−、と同一・である。
Ｃ）臭化シアンによる活性化およびＡＭＴの結合。セル
ロースを使用する典型的な例：０．５ｇのセルロースを
５．Ｏｍｌの蒸留水中で１時間膨潤させる。膨潤した紙
を蒸留水でよく洗浄する。次いでそれをエルレンマイヤ
ーフラスコ内に取り、水冷した蒸留水を膨潤した紙に添
加し、５モルの水酸化ナトリウ１、溶液でｐＨｔｏ。
５〜１１に調節する。フラスコをその内容物と一゛諸に
水中で冷却して温瓜が１５°Ｃより、１−らないように
する。１ｇの臭化シアンをセルロースへ添加し、この溶
液を３０分間かきまぜ、ｐＨをＮａＯＨにより１０．５
〜ｔｉに維持する。この懸濁液を水冷蒸留水で洗浄し、
水を遠心により除去し、２０　ｍ　ｌの水冷リン酸カリ
ウム緩衝液（ｌＯミリモル；ｐＨ８）を添加する。この
活性化されたセルロースを褐色びん（小さいアリコート
で）内で一２０°Ｃに保持する。
２〜３　ｍ　ｌの膨潤した活性化ゲルを褐色びん内に取
り、０　、７ｍ　ｌ（７）ＡＭＴ　（２ｍｇ／ｍ　ｌ）
を添加し、そしてこの混合物を冷たい室内でおだやかに
振盪する。過剰の活性化残留物をリジンで破壊する。こ
の固体をＤＮＡ結合用水性緩衝液で洗浄する。
ｄ）２４ｆ；ノため、ホヮントマン（Ｗｈａｔｍａｎ）
５４０、ｌおよび５４１型定量的紙を用いて同様な手順
を反復した。紙が破けないように注意すべきである。
ｅ：）３Ｈ標識アミノエチルプソラレンまたはアンゲリ
シンを使用するｉｌｚｌ実行を用いて標識効率を棺′）
Ｊでする。
２．１．！ｉ１体の支持体へのフエナントリジウム化合
物の結合およびＤＮＡの光化学的結合： 固体の支持体の活性化を前述の方法により実施する。−
例として、メチジラムプロピルアミン（Ｒ，Ｐ、Ｈｅｒ
ｔｚｂｅｒｇ、５よびＰ、Ｂ、Ｄｅｖａｎ、ＪＡｃｓ、
１０４，３１３　（１９８２））を、１におけるのと同
一の緩衝条件を用いて、固体の支持体へ結合する。次い
で、単離されたメヂジウム含有固体の支持体をジアゾ化
し、そして次のようにしてアジド誘導体をつくる。ｊｌ
Ｈ化メチジウムを含有するＩｇのセルロースまたは活性
化された紙の１枚（２×５ｃｍ２）を２０ｍ１の水中に
取り、水中で冷却し、０．２ｍｌのＨＣＩを添加し、ア
ジ化ナトリウム（２０ｍ　ｇの固体；２×）を添加する
。この容器を水中で冷却し、硝酸ナトリウムの固体（１
００ｍｇ）を添加する。この反応を３０分ｉｉｉ、ｌ進
行させ、１−．１体の、支持体を所望の緩衝液で洗浄す
る。ＤＮＡの結合および交雑を、アミノメチルーブソラ
レンについて記・１表したのと同一の方法で実施する。
アミノメチルジメチルーアンゲリシンを同様に処理する
ことができる。
３、ＤＮＡの光化学的結合： ０．５ｍｌ　（０，２〜０．３ｇのゲル＋緩衝液）の活
性化された固体の粉末または０．８ＸＩＣｍ２の活性化
された紙を、ｌｅｍの通路の分光光度ｊｆのキュベント
（ｃｕｖｅｔｔｅ）中に取る。トリス（ｔ　ｒ　ｉ　５
）ＥＤＴＡ緩衝液（１０ミリモルのトリス、１ミリモル
のＥＤＴＡ、ＯＨ７，５）中のアデノウィルスのＤＮＡ
　（３Ｈで部分的に標識（＝１けされた）（濃度２５μ
ｇ／ｍｌ）を、キュベツトへ添加し、照射を将来の貿求
に依存して所望の波長で３０分間ないし２時間実施する
。ＡＭ、Ｔについて、３９０ｎｍにおける照射はモノ付
加物を生成するが、３６０〜３００ｎｍにおいてモノ付
加物および架橋物の両者が形成する。ｅ度およびＤＮＡ
配列を変更することにより、架橋物ないしモノ伺加物の
形成を調節することができる。光照射後、固体を洗浄し
、洗浄液および固体の支持体の放射能をベックマン（Ｂ
ｅｅｋｍａｎ）７８００シンチレーシヨンカウンターで
計数する。
慕遭重厚ダ級釆 ＤＮＡ 鼠止五叉且准　級ｎ５　絞合上」 ０　、５　ｍ　１０　、８または× ｌ対照紙（ＤＮＡを含よな　−− い） ＢＤＧＥ処理紙　８０　２０ セルロースセレツクス（Ｃ ｆｌｅｘ）ＣＮＢｒ活性　９１．５　２２．５化 セルロースセレックス（Ｃ １１ｅ　ｘ）ＢＤＧＥ活性　９３．４　２２．５化 セフアデックス　Ｇ２５　６９．５　１８．０ＣＮＢ　
ｒ活性化 ４、固体の支持体へ光化学的に結合したＤＮＡのＤＮＡ
−ＤＮＡ交ｉについてのアッセイ：アデノウィルスＤＮ
Ａを上のように固体の支持体へ共有結合し、そして３Ｈ
標識アデノウイルスＤＮＡを用いる交雑を、Ｎｏｙｅｓ
および５ｔａｒｋ　、　Ｃｅ　ｌ　ｌ　、　５　、３０
１−３１．０　（１９７５）の手順に従って実施する。
５、餅状赤血球の診断についての光化学的に結合したＩ
）　Ｎ　Ａの使用： ＡＭＴ結合ＤＮＡを２６０ｎｍにおける照射により遊離
Ｄ　Ｎ　Ａとして回収することができる。分離プローブ
（米国特許出願第５１１，０６３号、５ｕｐｒａ）を固
体の支持体へ前述の方法により結合する。次いで、結合
したＤＮＡを有する支持体を、４におけるような交雑条
件のもとに、未知の検出プローブと混合する。次いで、
固体の支持体標識の存在で処理する。放射能で標識付け
した検出プローブを使用する場合、放射能が計数される
。
５ａ、４の生成物をそれ以外３におけるのと同一の方法
で２６０ｎｍにおいて照射すると、ＤＮＡは固体の支持
体から分離し、溶媒、すなわち、水性緩衝液中に入る。
次いで、この液体、１ａＨにっいてアッセイする。
特許出願人　モレキュラー・ダイアグノステイ゛ンクス
Φインコーボレーテット

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ■、　（ａ）固体の基質、（ｂ）光化学的に反応性の核
    酸結合性配位子、および（Ｃ）前記基質および前記核酸
    結合性配位子と化学的に結合する二価の基からなること
    を特徴とする照射すると核酸を結合することができる固
    体の支持体。 ２、核酸結合性配位子はアクリジン染料類、フェナント
    リシン類、フェナジン類、フロクマリン類、フェノチア
    ジン類、およびキノリン類から選らばれた内位添加化合
    物であることを特徴とする特＋’４請求の範囲第１ノ５
    １記載の支持体。 ３、）、（質（ａ）は遊離の状態で遊離のＯＨ基をイｆ
    し、前記ＯＨ基を介してそれは二価の基（Ｃ）により結
    合されることを特徴とする特許請求の範囲第１または２
    項記載の支持体。 ４、　′＆質（ａ）はセルロースまたはセルロース誘導
    体であることを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項の
    いずれかに記載の支持体。 ５、二価の基（Ｃ）は臭化シアンまたは１，４−ブタン
    ジオール−ジグリシジルエーテルかか誘導されることを
    特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載
    の支持体。 ６、（ｂ）はプソラレン、アンゲリシン、エチジウムま
    たはそれらの誘導体であることを特徴とする特許請求の
    範囲第１〜５項のいずれかに記載の支持体。 ７、　（ａ）核酸、（ｂ）核酸へ光化学的に結合した核
    酸結合性配位子、および（ｃ）前記核酸結合性配位子（
    ｂ）へ二価の基を介して化学的に結合した固体の基質か
    らなることを特徴とする不動化された核酸プローブ。 ８、核酸結合性配位子はアクリジン染料類、フエナント
    リジン類、フェナジン類、フロクマリン類、フェノチア
    ジン類、およびキノリン類から選らばれた内位添加化合
    物であることを特徴とする特−請求の範囲第７項記載の
    不動化されたプローブ。 ９、基質（ｃ）は遊離の状態で遊離のＯＨ基を有し、前
    記ＯＨ基を介し７てそれは二価の基により結合されるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第７または８項記載の不
    動化されたプローブ。 １０、　（ｂ）はプソラレン、アンゲリシン、エチジウ
    ムまたはそれらの誘導体であることを特徴とする特許請
    求の範囲第７〜９項のいずれかに記載の不動化されたプ
    ローブ。
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