JPS6043380A - Ν−アセチルポリアミンアミドヒドロラ−ゼｍ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な酵素であるＮ−アセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼＭ及びその製造法に関する０ プトレシン、スペルミジン、スペルミン等のポリアミン
は広く生体中に分布しており、細胞増殖に関与している
とされている。１９７／年ラッセル等により癌患者の尿
中のポリアミンレベルが正常人に比べて有意に高いこと
が示されて〔キャンサー・リサーチ３１巻、ｌ！！！〜
／ｊｉｇ（／９７／））以来、癌と体液中のポリアミン
レベルとの関連性が注目されてきた。そして現在では、
血液、尿等の体液を対象とし臨床検査に使用可能な簡便
なポリアミンの定量方法が開発されるならば、癌の診断
にとって有用であろうと考えられている。

そして一般的にポリアミンの定量方法としては各種の方
法が用いられているが、臨床検査で使用可能な方法とし
ては、酵素法が適していると考えられる。

ところで、尿中に含まれるポリアミンは一部は遊離型と
して存在するものの、その大部分は複合体として存在す
ると言われている。このポリアミン複合体に関しては、
その実体は現在のところは必ずしも明らかにされていな
いが、マーモードらは尿中に含まれるポリアミン複合体
はアセチル４Ｌされたポリアミンであると報告している
〔ジャーナル・オブ・ファルマソイティヵル・サイエン
ス第６２巻、７２号、Ｉｔ、７／〜／　６７　Ｊ（１９
７１；）〕。

従って、これまで尿を対象として癌とポリアミンレベル
との関係を調べようとする際には、まず塩酸を用いて検
体を加水分解し、ポリアミン複合体を遊離型にした後、
これともともと遊離型で存在するものとの和として定量
していた。この際の加水分解操作の一例を示すと、尿と
同量の濃塩酸をガラスアンプル中に封じ、１００Ｃで３
時間加熱するというような方法であり、この操作が煩雑
である点がポリアミンの定量が臨床検査項目として一般
化しなかった１つの原因である。

ところで、最近開田らはストレプトミセス・アベラニウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｌｌａｎｉｕｓ
　）　Ｒ−１０にアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ
という酵素を見い出しく特開昭！乙−ｌグｔｏ　ｇ　ｇ
　号）　。

この酵素を用いて尿中のアセチルポリアミン複合体を遊
離４１Ｚする方法を報告している（特開昭！６−１．ｆ
ｌグ９グ号）０この方法は塩酸を用いる加水分解処理べ
操作が容易になったとは言え、この酵素の各種アセチル
ポリアミンに対するＫｍ値が大きいため、大量の酵素で
長時間の加水分解処理を必要とするなど問題点も多い。

そこで本発明者等は、各種のアセチルポリアミンに対し
脱アセチル化作用を有し、かつ公知のアシルポリアミン
アミドヒドロラーゼよりもＫｍ値の小さな酵素を得るべ
く土壌より分離した微生物を対象に生産菌の検索を行っ
た結果、下記するアルスロバクタ−属に属する微生物が
目的とする酵素を多量に生産すること、および生産され
た酵素が公知のストレプトミセス・アベラニウスＲ−一
〇のアシルポリアミンアミドヒドロラーゼとは後記の如
く多ぐの異なった性質を有する全く新規な酵素であるこ
とを認め、本酵素なＮ−アセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼＭと命名し、本発明を完成するに到った。

以下１本発明について詳細に説明する。

先ず、本発明のＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼＭは、アセチルプトレシン、アセチルカダベリン、
アセチルスペルミジン等のアセチルポリアミンのアミド
結合を加水分解し、下記の性質 （ａ）ｐＨ７，！、基質濃度ｊ　ｍＶ条件下におけるア
セチルプトレシン、アセチルカダベリン、アセチルスペ
ルミジンに対する反応速度の比がｉｏ。

ニゲま：３０、 （ｂ）ｐＨ７，ｊの条件下におけるアセチルプトレシン
、アセチルカダベリン、アセチルスペルミジンに対する
Ｋｍ値がそれぞれｇ−７×１０　Ｍ、１．１．×１０　
Ｍ、ｊ、Ｏ×ＩＯＭ。

（ｅ）コバルト、マンガン、モノヨー）’酢酸、０−フ
ェナントロリンにより阻害されず、α、α′−ジピリジ
ル、３；、ｊ−’−ジチオビス（−ｍ＝トロベンゾエー
ト）により活性化されない。

を有することを特徴とするものであるが、この酵素の環
１ｉ学的性質を挙げると、次の如（である。

０作用 アセチルプトレシン、アセチルカダベリン、アセチルス
ペルミジン、アセチルスペルミン等のアセチルポリアミ
ンに作用してそのアミド結合を加水分解する。

■基質特異性 後記する本酵素の活性測定法において、−ｔｍＭ条件下
で各種の基質に対する反応速度をめ、アセチルプトレシ
ンを用いた場合をｉｏｏとして表示し、本酵素の基質特
異性を第１表に示す。なお比較のために、特開昭！６−
７グ１０ｇｇ号に示されているアシルポリアミンアミド
ヒドロラーゼの基質特異性をも第１表に併記した。

第　１　表 相対活性（係） 基　質　Ｎ−アセチルポリアミン　アシル、ｔ＜”＋７
アミンアミドヒドロラ一ゼＭ　アミドヒトｂラービアセ
チルプトレシン　１００　／θ０ アセチルカダベリン　ｌ夕　− アセチルスペルミジン　３０　９．１ アセチルスペルミン　３　０．グ 第１表から、Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼＲ１１ｌアシルポリアミンアミドヒドロラーゼとは基
質特異性において異なることがわかる。

■至適ｐＨ 後記の本酵素の活性測定法において、緩衝液のｐＨを６
〜９　（ｐＨ６〜ｇはリン酸緩衝液、ｐ）（７，ｊ〜９
はトリス塩酸緩衝液）まで変え作用至適ｐＨをめた。そ
の結果を第１図に示す０この結果。

本酵素の至適ｐＨは７．を付近にあることがわかる０■
安定ｐＨ範囲 本酵素を予め各ｐＨ（１）Ｈグル乙は酢酸緩衝液、ＰＨ
６〜ｇはリン酸緩衝液、ｐＨｇ〜９はトリス塩酸緩衝液
）にてユｊＣで６０分間処理した後、残存活性を測定し
た。その結果は第２図に示すとおりで、本酵素はｐＨ６
〜ｇの範囲で安定であった。

■至適温度 本酵素の作用至適温度は第３図に示すとおり３夕Ｃ付近
である。

■熱耐性 本酵素の熱安定性を調べるため、ＰＨ７、０のリン酸緩
衝液中で各温度に１０分間保った後の残存活性を測定し
た。その結果は第１図に示す通りで３ｊＣまで安定であ
った。

■活性測定法 本酵素の活性測定は、／　００　ｍＭ　’Ｊン酸緩衝液
（ｐＩ（７，３）　０　、　！ｍｅ１！　ＯｍＭＴ＋ｆ
ルプトレシン溶液０．１〜ｇ、水０．３！ｍｌ、酵素溶
液０、θｊ　ｍｌを混合し、３０Ｃでｉｏ分間反応させ
た後、直ちに沸騰水中に３分間浸漬して反応を停止させ
、生成したプトレシンなプトレシンオキシダーゼアッセ
イ法により定量する。即ち下記組成の反応液 ０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，ｊ　Ｏ！ｒｎｌＶＯ，コ
係（Ｗ／Ｖ）ダーアミノーｒ汗ピノ櫃　ｏ３ｍｅｏ、２
４ＣＶＩＶ）Ｎ、Ｎ−ジ：＃＃７＝す［ＯＡｍｌペルオ
キシダーゼ溶液（！ＯＵ／ｍＡ）　０　．７　ｍｌ水　
０７９ｍｂ に、上記の反応液ｏ、ｒｍｔを加え、ついでプトレシン
オキシダーゼ溶液（／　ＯＵ／ｒｕｂ）　ｏ　、ｏ　１
〜ｇを加え混合し、ＪＯＣでＩＯ分間反応させた後。

ｊ　６Ｊ−ｎｍの吸光度（Ａ３６１１　）増加量を測定
する。この際、もとの反応液に存在する遊離化されたプ
トレシン量は ブトレジ７　ｔｔ　ｍｏｌ／ｍＡ　＝　Ａ５ａ５　Ｘ　
ｏ　、ａ　３　ｉによりめることができる。Ｎ−アセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼＭのｌ単位は上記反応
条件下１分間にｌマイクロモル（μｍｏｌ）のプトレシ
ンを生産せしめる酵素量と規定する。

■阻害剤および金属イオンの影響 本酵素に対する各種金属イオンおよび阻害剤の影響を調
べた結果を第２表に示す。

なお、比較のために特開昭タＡ−／＆ｑｏｇｇ号に示さ
れているアシルポリアミンアミドヒドロラーゼの性質を
も第２表に併記した。

第　２　表 相対活性　（憾） 金属イオンあるいは阻害剤　Ｎ−７セトーノアミン　ア
’ｓｂｍ）アミン（／　ｍＭ　）　アミドヒト５ラービ
Ｍ　アミドヒトｂラーＨビ無添加　ＪＯＣ１００ ＣｏＣ１ｔ　”　ＡＨ２０９ｇ　／　９ＦｅＣ１，・　
６Ｈ，Ｏｉ　ｏ　ｓ　Ａ　７ＭｎＳＯ４−ａ　〜６　Ｒ
２０／　０　／　ｇ　５ＭｇＳＯ４・　７Ｈ２０１１コ
　１０／、ｔＣａＣ１２ｍ　／　コＨ２０／　０　３　
／　／　ＧＺｎＳＯ４”　７ｎ２ｏ　Ｊ　コ　３ ＮｉＣ１ｚ　・　６Ｈ２０ｊ　ｊ　３ ＥＤＴＡ　／　θ　／　／／ｌ。

ＩＡＡ　９７　ａｓ ＮａＮ、　９９　ｑ　、７ α、α−ジピリジル　１０／　１３り ０−フェナントロリン　２グ　１ｇ。

ＰＣＭＢ　ｇ　。

ＤＴＮＢ　９　ｇ　Ｊ　、？　７ この第２表かられかるように、本酵素はコバルト、鉄、
マンガン、モノヨード酢酸、０−フェナントロリンによ
り阻害されず、α、α′−ジピリジル、％！、！′−ジ
チオビス（λ−ニトロベンゾエ。

−）　）（ＤＴＮＢ）Ｓにより活性化されない。これら
の性質は特開昭！６−ｌググ。ｇｇ号に示されているア
シルポリアミンアミドヒドロラーゼの性質とは明らかに
異なっていることがゎかる〇■安定化剤 コーメルカブトエタノール、ジチオスレイトール、グリ
セロールは本酵素を安定１しする〇［相］分子量 セファクリルＳ−一〇〇（ファルマシア社製）を用いた
ゲル濾過法により分子量は約６万であったＯ ０等電点 キャリアーアンホライトを用いる焦点電気泳動法により
めた本酵素の等電点はグ、０あった。

０精製方法 本酵素の精製は通常一般的に酵素の精製に用いられると
ころの各種の方法、即ち硫安塩析、有機溶媒沈澱、透析
、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、等電点分画、アフイニイティーク
ロマトグラフィー等を適当に組み合わせることにより行
うことができる。その具体例は後記実施例３に記載の連
りである。

ｏＫｍ値 ｐＩ（７、Ｊ−の条件下、本酵素のアセチルポリアミン
に対するＫｍ値をラインライ−バー・バーク・プロット
（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔ　）に
よりめた。その結果は第３表に示すとおりである。

なお、比較のために特開昭、ｆＡ−１４４０ｇ３号に示
されているアシルポリアミンアミドヒドロラーゼのＫｍ
値をも第３表に併記した。

第　３　表 Ｋｍ値 アセチルポリアミン　Ｎ−ア七升にρノアミン　アシＶ
悼）アミンアミド１ニド１コラー−ビＭ　アミド１ニド
１コラ−ビアセチルプトレシン　ｇ、７×ｌＯＭ　２．
０×１０　Ｍアセチルカダベリン　／、１．×１０　Ｍ
　−了セチルスペルミジン　ｊ、０×ノＯＭ　ｉ、１ｘ
ｔｏ　Ｍ第３表かられかるように、Ｎ−アセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼＭＵ−アシルポリアミンアミド
ヒドロラーゼとはＫｍ値において異なっている。

アシルポリアミンのアミド結合を開裂加水分解し遊離の
ポリアミンを生成する酵素としては、上記したストレプ
トミセス・アベラニウス’Ｂ、−ｘ。

の生産するアシルポリアミンアミドヒドロラーゼ早 が知られているが１本発明のＮ−アシルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼＭは、アシルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼとは上記したように種々の性質において異なるので
、これとは異なる酵素と認められ、新規な酵素と認めた
。

そして本発明のＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼＭのアセチルポリアミンに対するＫｍ値が小さいこ
とは該酵素が少量で短時間にアセチルポリアミンよりポ
リアミンの遊離化を可能にすることを示すものであって
１本発明の酵素は、アセチルポリアミンよりのポリアミ
ンの遊離化、さらに尿中のポリアミンの定量に対し非常
に有用テある。

上記のＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭは
、本発明にしたがいアルスロバクタ−属に属しＮ−アセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼＭを生産する能力を
有する微生物を培地に培養し、培養物よりＮ−アセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼＭを採取することにより
製造することができる。

本発明で用いるアルスロバクタ−属に属しＮ−アセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼＭを生産する能力を有す
る微生物の具体例としては１例えば本発明者等が東京都
八王子市の土壌より分離しタアルスロバクター・スピー
シーズＮＱ、７．７−６λが挙げられる。

本菌株は下記の菌学的性質を有している。

（Ｉ）形態学的性状 肉汁寒天培地上で３０７：、６〜２４時間培養し観察し
た所見は下記の通りである。

約６時間培養後の若いａｆ＠は、真直ぐまたはやや曲っ
た桿菌または短桿菌で端は丸（単独、二連または短連鎖
をなしており、その大きさば０、汐×ｌ〜３μｍである
。

−り時間以上培養した古い細胞は、球ないし短桿菌で端
は丸（、単独、二連または短連鎖をなしており、その大
きさはｏ、ｔｘｏ、ま〜０．７μｍである。水弟は運動
性がな（、芽胞を形成せず、ダラム染色は陽性であるが
、培養時間により陰性を示すことがある。また抗酸性染
色は陰性を示した。

（ＩＩ）培養性状 各種培地上で３ＤＣ，ｌ〜２日間培養した所見は下記の
通りである。

肉汁寒天斜面培地二円形で縁が波状で平坦な湿潤性のあ
る集落を形成し色相は灰白色である。

肉汁寒天斜面培地：糸状に生育し、生育度は中程度１色
は灰白色である。水浴性色素の生成なし。

肉汁液体培地：生育良好、菌膜を形成し、沈渣も認めら
れる。

肉汁ゼラチン穿刺培養：糸状、表面に生育するが、生育
度は悪いＯ ＩＪ　）マスミルク培地：培地はわずかに酸性となり、
ペプトン化が認められる。

（ＩＩＩ　）生理的性状 硝酸塩還元　陽性 脱窒反応　陰性 ＭＲテスト　陰性 ｖｐテス■・　陽性 インドールの生成　陰性 硫化水素の生成　陰性 澱粉の加水分解　陽性 クエン酸の利用 コーザー培地　陽性 クリステンセン培地　陽性 無機窒素源の利用 硝酸塩　陽性 アンモニウム塩　陽性 色素の生成　生成しない ウレアーゼ　陰性 オキシダーゼ　陰性 カタラーゼ　陽性 生育のｐＨ範囲　ｊ−９！ 生育温度範囲　Ｓ−グＯＣ 酸素に対する態度　好気性 ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ　−Ｌｅ　ｉ　ｆ　ｓ　ｏ　カ世
也）　不変糖類からの酸およびガスの生成 酸およびガスの生成が認められないものは次のとおりで
ある。

Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−フラクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース
、Ｄ−リボース、ラクトース。

マルトース、セロビオース、メリビオース、シュクロー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトー
ル、ソルボース、ラムノース、ラフィノース、α−メチ
ルグルコシド、イヌリン、サリシン、アルブチン、澱粉
、グリ七ロール。

ＤＮＡのグアニン、シトシン含９ｂＡ、ｂ優（Ｔｍ法に
よる）であった。

以上の性質をもとに［バージニーズ・マニュアル・オブ
・デターミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　１版（／９７＆）
Ｊを参照して分類すると、水弟はアルスロバクタ−（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属のアルスロバクタ−・グ
ロピフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂ
ｉｆｏｒｍｉｓ　）とい（つかの点で類似性が認められ
る。

しかしながら、水弟は多形性がほとんど認めらり、　ナ
イこと、ｌｌｏ’Ｑでも生育できること、Ｄ−キシロー
ス、イノシトール、ベタイン、チラミン、クレアチンの
資化性が認められないこと等においてアルスロバクタ−
・グロビフォルミスと明らかに相違点が認められること
により、本菌株を新菌と認め、アルスロバクタ−・スピ
ーシーズＮｏ　、　／　３−６コ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｓｐ、　Ｎｏ−／　３−６λ）と命名した。な
お１水弟株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第７／ｇユ号（Ｆ’ＥＲＭ　Ｐ−７１ｇ２）として
寄託されている。

上記したアルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ。

７３−６ユは本発明方法で使用する微生物の具体例であ
って１本発明方法においては、この菌およびその変種、
変異株ばかりでなく、アルスロバクタ−属に属しＮ−ア
セチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭを生産する能力
を有する微生物であればすべて使用することができる。

本発明方法において使用菌の培養は通常の微生物の培養
方法に従って液体培養、固体培養などで行うことができ
る。そして液体培養の場合には静置培養でもよいが、振
盪培養または通気攪拌培養の方が好ましい。

培養に用いられる培地としては、アルスロバクタ−属に
属する微生物が必要とする栄養源を含有するものであれ
ば、合成培地、半合成培地、天然培地のいずれも用いる
ことができるが、Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼＭ生産のためには、これらの培地にＮ−アセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼＭの生産に有効な誘導基
質、例えばモノアセチルプトレシンあるいはジアセチル
プトレシン等を添加してお（方が好ましい。

本発明において使用される培地の具体例としては、例え
ば可溶性澱粉／％、ポリペプトン０．３係、酵母エキス
ｏ、ｌｑｔ、リン酸二カリウム０．１係、硫酸マグネシ
ウム・７水塩０　、　Ｏｊ’ｌｒ、ジアセチルプトレシ
ン０．３ｑりよりなるｐＪ（７，２の培ポリアミンアミ
ドヒドロラーゼＭの生産に有効な誘導基質を含む培地に
、アルスロバクタ−属に属しＮ−アセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼＭを生産する能力を有する微生物を植
菌し、−！〜３２Ｃで／　Ｊ−−＆　１時間の培養が行
われる。この際、Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼＭは王として菌体内に蓄積される。

このようにして得られた培養物から通常の酵素の採取法
もしくは精製法に従ってＮ−アセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼＭを採取精製することができる。

即ち、培養物を濾過または遠心分離等により培養Ｐ液と
菌体とに分離する。この菌体はそのままあるいは乾燥し
て用いてもよいが、Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼＭをより精製した形で使用する必要がある場合
には、まず菌体を機械的方法、酵素処理する方法、自己
溶解性等公知の方法により破壊して粗抽出液を得る。次
に、一般的に酵素の精製に用いられる透析、限外濾過、
ゲル１過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画、アフイ
ニイテイークロマトグラフイー等の手段で、またはこれ
らの手段を組み合わせて用いることにより、更に高度の
精製標品な得ることができる。

また、これらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は
例えば凍結乾燥法などにより粗酵素粉末または精製酵素
粉末にすることができる。更にこのようにして得られた
Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭは適当な
担体に固定化することにより固定化酵素とすることがで
きる。

次にＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭの用
途について説明する。

上述したように、本酵素のアセチルポリアミンに対する
Ｋｍ値が小さいため、本酵素は少量で短時間にアセチル
ポリアミンよりポリアミンの遊離化を可能とするので、
本酵素は尿中のポリアミンの定量に非常に有効に用いる
ことができる。

本酵素を用いて尿中のポリアミンを定量するには、一般
的には尿試料の一定量（例えば０．夕〜ｊｍｌ）に適当
な緩衝液〔例えば０　、　ｕ　Ｍ　）　ＩＪス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，ｊ））の一定量（例えば０．３〜２ｍ１）
を加えｐＨを７〜９とし、これにＮ−アセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼＭを反応液当りＯ，Ｓ−λ単位／
　ｍｌ、となるように加え、ユ０〜３０Ｃで夕〜ｌ！分
間処理する。しかる後、この反応液を陽イオン交換樹脂
（例えばアンバーライ）ＣＧＧＤ３のカラム（０，λ〜
／ｍｔＶ）に通す。

このカラムを充分水洗後、０．−〜／ＮＨＣｌあるいは
ｏ、ｉ〜（７，ＪＭ）＋１クロル酢酸溶液等によりポリ
アミンを浴出する。このようにして得られた溶出液に含
まれるポリアミンの定ｆｉｔ　方法トシては、従来から
用いられているいくつかの方法、例えば高速液体クロマ
トグラフィー、アミノ酸分析機、薄層クロマトグラフィ
ー、酵素法、免疫法等が挙げられる〔例えば［蛋白質核
酸酵素Ｊ　Ｖｏ　１　。

２６　、Ｎｏ、９（／９ｇ／）、ｐ、／２７３〜／２Ｋ
ｇ参照〕。これらの中でその簡便さからして最も臨床検
査に適した方法は酵素法である。

酵素法によるポリアミンの定量は一般的に次のようにし
て行われる。

即ち、ポリアミンを含む試料にプトレシンオキシダーゼ
あるいはポリアミンオキシダーゼを単独あるいは組み合
わせて作用させ、その際に消費される酸素あるいは生成
される過酸化水素を公知の方法、例えば消費される酸素
は酸素電極を用いる方法により、また生成される過酸化
水素はｌ−アミノアンチピリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リン、ペルオキシダーゼを用いる方法等で定ｉｆればよ
い。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

実施例　１ 可溶性＃扮／％、ポリペプトン０．３’Ｌ、酵母エキス
０．／（ｉ、リン酸二カリウム０．１０Ｊ、硫酸マグネ
シウム＠２水塩ｏ−ｏ、ｔ％、ジアセチルプトレシン０
．３係、ｐＪ（７、：１の組成を有する培地ｉｏｏｍｌ
ｊを坂ロフラスコに入れ、１ａｏｃで１３分間殺菌した
後、アルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ、　／　３−
　ｌ−一を一白金耳植菌した０しかる後、３０Ｃにて往
復振盪培養を１日行った。こうして得られた培養物を遠
心分離により菌体と培養Ｐ液とにわけた０得られた菌体
を／　ＯｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７、コ）にて洗浄
後、凍結保存し酵素給源とした。

実施例　２ グルコース／４、ポリペプトン０．３ｔｉ、酵母エキス
ｏ、ｉ４、牛肉エキスｏ、ｉｏ１．．リン酸二カリウム
Ｑ、１％、硫酸マグネシウムｏ　、　ｏ３ａ１．、モノ
アセチルプトレシン０．５係を含む培地（ｐＨ７，２）
−〇ｋを３０！容ジャーファーメンタ−に入れ、／２０
７：：で３θ分間加熱殺菌した後、同じ培地で２グ時間
培養したアルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ、　／　
３−　Ａλのシード３ｏｏｍｂを加え、ＪＯＣで通気量
１ｏＪ）／分、回転数グ００回転／分の条件下でコＯ時
間通気攪拌培養を行った。

培養後、遠心分離により菌体な得、これを／　０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，λ）で洗浄後、凍結保存し酵素給
源とした。

実施例　３ 実施例１あるいは２で得たアルスロバクタ−・スピーシ
ーズＮｏ、／、７−／＋ｕの菌体３０ｆを２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，コ）に懸濁し、冷却下超音波破砕機
にかけ菌体を破壊した。しかる後、１００００回転、−
０分の遠心分離にかげて上澄を得た。この際のＮ−アセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼＭ活性はｌ：１．？
θ年単位あった。

この粗抽出液を予め一〇ｍＭ’）ン酸緩衝液（ｐＨ２，
２）で緩衝化したＤＥＡＥセルロースカラム（２，３×
３ｏｃｍ）に吸着せしめた。同じ緩衝液で充分洗浄後、
食塩濃度な０から／Ｍまで直線的に上げるグラジェント
溶出法により酵素を溶出した。

この酵素溶液（９ｇθ単位）を限外沢過失にて濃縮後、
ウルトロゲルＡＣ！Ａ３４　（Ｌ　Ｋ　Ｂ社製、スウェ
ーデン）のカラム（２，３Ｘ　／　ｏ　Ｏｃｍ　）にか
け、ゲル濾過を行った。

こうして得られた活性画分（Ｋ！θ単位）を限外ｆ過失
により濃縮後、／　ＯｍＭ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，
−１）（−２ｍＭ　コーメルカブトエタノールを含む）
に透析した後、同じ緩衝液にて緩衝化したハイドロキシ
アパタイトカラム（Ｊ、ｔｘ２０ｃｍ）に通した。非吸
着部を集め（２６０単位）、これを１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，λ）（−２ｍＭ−２−メルカプトエタノー
ルを含む）にて緩衝化したＮ−アセチル−／、１０−ジ
アミノデカンをリガンドとするセファロース４ＡＢのア
フイニイテイークロマト用カラム（／　、、ｔｘ−１ｏ
ｔｙｎ）に吸着せしめた。

この方ラムを同じ緩衝液にて充分洗浄後１食塩濃度を０
から／Ｍまで直線的に上げるグラジェント溶出法により
酵素を浴出した。こうして得られたＮ−アセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼＭの精製酵素は６−〇単位であ
り、比活性は１２０単位／ｍ９であった。

実施例　４ 尿試料３　ｍｌに０６−Ｍ　）　ＩＪス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７、ｊ）ｊｍｂおよびＮ−アセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼＭ溶液０．ｊｍｂ（ｑ単位）を加え、３０
Ｃにて１０分間反応させた。しかる後、この反応液をア
ンバーライトＣＧｊＯ（Ｎａ　）のミ二カラム（ｏ、ｔ
ｍｂ）に通した。このカラムを水１０ｍ乙で洗浄後、／
Ｍ　ＨＣｌ　２ｍｂにてポリアミンを溶出した。この溶
出液に／、３Ｍ）リス浴液０−５１ｎｈを加えｐＨを２
〜ｇとした後、プトレシンオキシダーゼ溶液０．０−ｍ
ｌ（／単位）を加え３０Ｃにて１０分間反応させた。次
にこの反応液にｏ、ｊＭ酢酸緩衝液（ｐＨｌ　、０　）
　０　、　ｊ　ｍＡを加えｐＨを６付近とし、ポリアミ
ンオキシダーゼＭ（％開昭３７−３７−３Ｏ号公報に記
載の製造法にしたがって得たもの）溶液０．０λｍ６（
／単位）を加え。

３０Ｃにて１０分間反応させた後、水を加えてグｍ６と
した。かぐして、これら二種類の酵素の処理により尿中
に存在したポリアミン量に対応した過酸４Ｌ水素を生成
させることができた。

次にこの試料／＋１を用い、次に示す組成の反応系をつ
＜’４Ｑ、３０Ｃで一１０分間反応させ３６ｊ　ｎｍの
吸光度の増加量Ａ５０．を測定した。

ｏ　１．ｔＭす７ｆｆｌ緩衝液ｐＨ５００ｊｍｌ（７、
−２％　（Ｗ７’Ｖ　）　ｌ／、−７ミ／’７４ヒ１Ｊ
　ン溶Ｗ　（７Ｊ　ｍｌｏ、Ｊ４（Ｖ／Ｖ　）Ｎ、Ｎ−
ジメｆｋ”！＝ニリン＠　０６ｍ１ペルオキシダーゼ溶
液（ｊ−ＯＵ／ｍｌ）　０　２ｍｂ試料　ｌｏｍｂ 水　Ｏグｍ１ 合計、３．Ｏｍｂ この結果測定されたＡ、６．は０．１０コであった。

ここでもとの尿試料中に存在するポリアミン量は次式に
より計算される。

ポリアミン量（ｎｍｏｌ／ｍｂ尿）　＝Ａ、６．　ｘ　
３０　θこれよりこの尿試ｆ［中に存在したポリアミン
量は３０．　ｂ　ｎ　ｍｏｌ　ｊｍｂであった。

実施例　５ 実施例４で用いた尿試料とは異なる別の尿試料ｊ　ｍｂ
　Ｋ　０１−Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，ｊ）ｏｔｍ
ｔおよびＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭ
溶液０．λｍｌ（ｇ単位）を加え、３０Ｃにてｌｊｆ分
間反応させたｏしかる後、この反応液をアンバーライト
ＣＧ−ｔｏ（Ｎａ）のミ二カラム（ｏ、ｊｍｂ）に通し
た。この方ラムを水１０ｍｂで洗浄後、／ＮＨＣｌλｍ
ｂにてポリアミンを溶出した。この溶出液をロータリー
エバポレーターにて濃縮乾固し、塩酸を除去した０この
乾固物をｌａｈの水にて溶解し、高速液体クロマトグラ
フィーにてポリアミンを定量するための試料とした。

ＬＫＢ　ＵＬＴＲＯＰＡＣ−Ｓスルホン酸型陽イオン交
換樹脂カラム（０，１ｘｌＯｃｒｎ）を装備したウォー
ターズ高速液体クロマトグラフ（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、製）を用い、これに上記試料
を！θμノ注入後、まず第１液（０，／ＭＩＪン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨｓ、ｒ　）（ｔ、ａｙ塩化ナトリウム
と２０％メタノールを含む）〕にてプトレシンとカダベ
リンを溶出し、次いで第１液〔０，１Ｍリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨｊ、ｔ）（−２，コ！Ｍ塩化ナトリウムと
コ０係メタノールを含む）〕にてススペルミンとスペル
ミンを溶出した。カラムからの溶出液ば０−フタルアル
デヒド試薬と反応させ、溶出されたポリアミンをポスト
ラベルした後、螢光検出器にて定量した。このようにし
て得られたもとの尿中に含まれるポリアミン量はＪＪ　
、　２ｎｍｏｌ／ｍＡであった。

【図面の簡単な説明】 図面は本発明のＮ−アセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼＭに関するもので、第１図は至適ｐＨを示す図であ
り、第一図は安定ｐＨ範囲を示す図であり、第３図は至
適温度を示す図であり、第１図は熱安定性を示す図であ
る。 出願人名糖産業株式会社 第１１記 ￥ま因 ′亨　３　巳 盲　→　巴

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アセチルプトレシン、アセチルカダベリン、アセ
   チルスペルミジン等のアセチルポリアミンのアミド結合
   を加水分解し、下記の性質 （ａ）　ｐＨ７、ｊ、基質濃度！ｍＭの条件下における
   アセチルプトレシン、アセチルカダベリン、アセチルス
   ペルミジンに対する反応速度の比がｉｏ。 ：４ｔｒ＝３ｏ、 （ｂ）ｐＨ２，ｔの条件下におけるアセチルプトレシン
   、アセチルカダベリン、アセチルスペルミジンに対する
   Ｋｍ値がそれぞれｇ、７Ｘ１０””Ｍ、／、６×１０　
   Ｍｌ、！ｔ、Ｏ×１０　Ｍ。 Ｃｃ）コバルト、マンガン、モノヨード酸ｙ、　。 −ト）により活性化されない、 を有することを特徴とするＮ−アセチルポリアミ　１− ンアミドヒドロラーゼＭ０
2. （２）アルスロバクタ−属に属しＮ−アセチルポリアミ
   ンアミドヒドロラーゼＭを生産する能力なを特徴とする
   Ｎ−アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼＭの製造法
   。
3. （３）微生物がアルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ、
   　／　３−　Ａユである特許請求の範囲第一項記載の方
   法。