JPH0533997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
による新規なアマドリ化合物の定量法及びそれに
用いられる定量用試薬に関する。 食品や生体内では還元性の糖、特にアルドース
と呼ばれるアルデヒド基を有する糖と蛋白質、ペ
プチド、アミノ酸等のようにアミノ基を有する物
質が共存する場合、両者が不可逆的に結合してケ
トアミン化合物が生成してくる。この化合物はア
ルデヒド基とアミノ基の結合物がアマドリ転移を
起こした結果生成されることからアマドリ化合物
と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンか
らは次式Ａのフルクトシルアラニンが生成する。
またグリセルアルデヒドとグリシンからは次式Ｂ
のハイドロキシアセトニルグリシンが生成する。 このようにアルドースとα−アミノ酸が結合し
てアマドリ転移を起こした化合物は、その分子内
に共通にイミノ２酢酸の基本骨格を含有してお
り、一般的に構造は次式で表わされる。 式中Ｘは基−〔CH（OH）〕_o−CH₂OH、ｎは０
〜４の整数、Ｙはα−アミノ酸の側鎖残基を示
す。一方アマドリ化合物はアルデヒド基を有する
物質とアミノ基を有する物質が接触した瞬間から
化学的にかつ不可逆的に生成蓄積されてくる。そ
の生成速度は原料物質の濃度、接触時間、温度な
どの関数で表わされる。それ故、その蓄積量を測
定することによつて、過去の糖及びアミノ化合物
の濃度、接触時間、保持温度などを推定すること
ができるが、その定量は比較的困難であり、処理
中の分解に起因する精度の低下を免れなかつた。 従来の定量法としては例えば下記の方法が知ら
れている。アミノ酸分析計を用いる方法（ジヤー
ナル・アグリカルチユアル・フード・ケミストリ
ー、24巻１号（1976）70頁参照）、アルドリ化合
物を水素化ホウ素ナトリウムで還元したのち塩酸
分解してカラムクロマトグラフイーで分離する方
法（アチーブス・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフイジツクス（1977）181、542〜
549頁参照）、アマドリ化合物を弱酸と加熱して生
成する５−ハイドロキシメチル−２−フルフラル
デヒドをチオバルビツール酸によつて比色定量す
る方法（FEBSレター（1976）71、356〜360頁参
照）など。しかしこれらの方法は操作の容易性及
び精度の点で満足できるものでなかつた。 そこで当業界では、食品や生体中に含まれるア
マドリ化合物を簡易に精度良く測定する方法の開
発が特に要望されている。このような実情に鑑
み、本発明者らは、迅速かつ正確なアマドリ化合
物の定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成した。 本発明はアマドリ化合物含有液に、酸素の存在
下でフルクトシルアアミノ酸オキシダーゼを作用
させ、酸化反応により消費される酸素量を測定す
るか、あるいは該反応により生成する過酸化水素
を測定することを特徴とする、アマドリ化合物の
定量法である。 本発明は更に、フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼを含有することを特徴とする、アマドリ化合
物の定量用試薬である。 本発明の定量法は下記の反応を基礎としてい
る。 この式中、R₁は基−OH、−〔CH（OH）〕_o−CH₂
OH又は−（CH₂）_o−CH₃、ｎは０〜４の整数、
R₂はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 本発明の定量法における被検液としては、上記
反応式中に示されたアマドリ化合物を含有する液
であればいかなるものでもよく、例えば醤油や蜂
蜜のようて高密度のアミノ酸又は糖を含有するも
のが好適に用いられる。また生体試料などに由来
する蛋白やポリペプチド鎖中に存在するものにつ
いては、温和な条件で遊離させる手段に解決すべ
き問題はあるが、定量の果たす効果が更に大き
い。 本発明の定量に用いられるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼとしては、如何なる起源のもので
も使用できるが、例えば微生物、殊にコリネバク
テリウム属に属する細菌から選ばれた菌を培養し
て得られるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを
用いることが好ましい。コリネバクテリウム属に
属する上記酵素生産菌としては、例えばコリネバ
クテリウム・sp・No.２−３−１〔微工研菌寄第
8245号（FERM ｐ−8245）〕等があげられる。
コリネバクテリウム・sp・No.２−３−１は本発明
者らが土壌中より分離した新菌株であり、その菌
学的性質は下記のとおりである。 (a) 形態：顕微鏡的観察（肉汁寒天培地30℃、１
〜３日間の観察） (1) 細菌の大きさ：0.3×0.9〜0.3×1.0ミクロ
ンの桿菌 (2) 細胞の多形性：わずかにわん曲した形態を
持つ、菌糸状の生育、分枝は認められない。 (3) 運動性：認められない。 (4) 胞子の有無：認められない。 (5) グラム染色性：陽性 (6) 抗酸性：陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：30℃、48時間の培養で
直径1.5ミリメートルの円型で表面平滑で光
沢のあるコロニーを作り、半透明で淡黄色を
帯びる。培養時間の経過とともに不透明にな
つていく、拡散性の色素は作らない。 (2) 肉汁寒天斜面培養：生育は良好で(1)に同
じ。 (3) 肉汁液体培地：静置培養では、生育悪くわ
ずかな混濁と菌の沈澱を認めるだけであるが
振盪すると均一に良く生育する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：25℃、３日程では
菌の生育はわずかに認められるが、溶解は認
められない。６日目程度になると菌の周囲だ
けわずかに液化する。 (5) リトマスミルク：紫色になり長時間の培養
を行うと凝固せずペプトン化する。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：弱い陽性 (7) 殿粉の加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：コーザー及びクリステン
センの両方で陽性 (9) 無機窒素源：NH₄ ⁺及びNO₃ ^-の両方とも
利用する。 (10) 色素の生成：淡黄色色素を作る。 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲温度：10〜39℃ PH：4.2〜10.0 (15) 酸素に対する態度：好気的 (16) Ｏ−Ｆテスト：極めて弱い酸化的 (17) 糖から酸及びガスの生成

【表】 その他セルロースの分解能は認められない。 前記の菌学的性質を有するコリネバクテリウ
ム・エスピーNo.２−３−１の分類学上の位置につ
いて、「バージエイズ・マニユアル・オブ・デタ
ミネイテイブ・バクテリオロジイ」第８版（1974
年）の分類と対比検討した結果、本菌株はグラム
陽性の好気的無胞子桿菌であり、カタラーゼ陽
性、運動性がない、ゼラチン、カゼインをわずか
ながら分解する、糖から酸の生成を行わない、生
活環にともなつて極端な細胞の多形性を示されな
い、セルロースを分解したことからコリネバクテ
リウム属に属するものと判定される。さらに本菌
株の分離源が動物質に由来しないこと、ゼチラン
を溶解すること、ウレアーゼを生産すること、37
℃で生育することから、コリネバクテリウム・フ
アシアンス（Corynebacterium fascians）に近
縁な菌株と認められるが、本菌株が土壌から分離
したものであり、植物病源菌でなく、グロスフア
クターを必要とせず、通常培地で良く生育する点
で異なつており、コリネバクテリウム属に属する
新菌種の菌と判定され、本菌株をコリネバクテリ
ウム・エスピーNo.２−３−１と命名した。なお、
コリネバクテリウム・エスピーNo.２−３−１は、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研菌寄第8245号（FERM Ｐ−8245）として
寄託されている。 上記菌株を培養する培地としては、炭素源、窒
素源、無機塩、その他栄養素を適宜含有していれ
ば合成培地、天然培地いずれでも使用可能であ
る。炭素源としては、例えばグルコース、フルク
トース、キシロース、グリセリン等を用いること
ができる。窒素源としては、ペプトン、カゼイン
消化物、大豆粉等の蛋白質又はその消化物、ある
いは酵母エキス等の窒素性有機物が好適に利用で
きる。無機物としては、ナトリウム、カリウム、
タルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバ
ルト等の塩類が使用できる。本発明においては、
フルクトシルアミノ酸を含有する培地で培養した
ときには、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが
最も収量よく得られる。該培地の好適な例として
は、例えばグルコース0.3％、フルクトシルグリ
シン0.5％、酵母エキス0.2％、ポリペプトン0.2
％、燐酸水素１カリウム0.2％、硫酸マグネシウ
ム0.05％、塩化カルシウム0.01％、硫酸第１鉄
0.01％（PH6.5）の培地が挙げられる。培養は通
常25〜37℃の範囲で、好適には30℃付近で行われ
る。培養開始のPHは６〜８の範囲であるが、好適
には6.5付近である。このような条件下で16〜24
時間振盪又は深部攪拌培養すれば、培養物中にフ
ルクトルシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生
産され、蓄積する。 本酵素は、培養時間を長くすると菌が溶解して
菌体外にも存在するようになるが、通常は菌体中
に存在するので、培養物を遠心分離又は過して
菌体を集め、適量の緩衝液に懸濁して菌体を破壊
することによつて酵素を可溶化することが必要で
ある。こうして得られた酵素含有液から、核酸、
細胞壁断片等を取り除くことによつてフルクトシ
ルアミノ酸オキジダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に
従つて、例えば(1)DEAE−セルロースカラムクロ
マトグラフイー、(2)硫安分画、(3)フエニルセフア
ロースカラムクロマトグラフイー、(4)セフアデツ
クスＧ−200カラムクロマトグラフイー等の方法、
又はその他の方法を必要に応じて組み合わせて用
いることにより精製酵素を得ることができる。本
酵素の精製の具体例を示すと下記のとおりであ
る。 培養物中から菌体を集めたのち、0.02Mリン酸
緩衝液PH7.5に懸濁し、10％量のグリセリンと１
％量のトリトンＸ−100を加え溶解したのち、ダ
イノミル（シンマルエンタープライブ社（スウエ
ーデン）製）を使用して菌体を破砕する。遠心分
離して上清を集め、DEAE−セルロースカラム
（0.02Mリン酸緩衝液PH7.5に平衡化してある）に
かけて酵素を吸着させる。食塩0.25Mを含んだ
0.02Mリン酸緩衝液PH7.5で洗浄したのち、0.5M
食塩濃度にして酵素を溶出させる。活性画分を集
め、16％になるように硫安粉末を加える。これを
16％硫安を含有した0.1Mリン酸緩衝液PH7.5に平
衡化したフエニルセフアロースカラムに通過させ
て酵素を吸着させる。この酵素を硫安濃度で16％
→０％の逆濃度勾配とエチレングリコール濃度で
０→25％の濃度勾配をあわせ持つた0.1Mリン酸
緩衝液で溶出し、その活性部について、0.1M食
塩を含有したリン酸緩衝液PH7.5で平衡化したセ
フアデツクスＧ−200のカラムクロマトグラフイ
ーを行い精製酵素を得ることができる。 上記の精製手段により得られた酵素の理化学的
性質は下記のとおりである。 (1) 作用及び基質特異性： 酸素の存在下で、イミノ３酢酸又はその誘導体
を酸化して、グリオキシル酸又はα−ケトアルデ
ヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する下
記の酵素反応を触媒する酵素である。 この式中、R₁は基−OH、−〔CH（OH）〕_o−CH₂
OH又は−（CH₂）_o−CH₃、ｎは０〜４の整数、
R₂はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−アラニ
ン等、イミノ酸例えばプロリン等、メチルアミ
ン、エタノールアミン等のアマドリ化合物に対し
ては作用しない。またケトンを還元したもの例え
ばグルシトリルグリシン等にも作用しない。 (2) 至適PH： 本酵素の至適PHは、フルクトシルグリシンを基
質とした場合、第１図に示すごとくPH8.0〜8.5で
ある。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニタ
ーで計測することにより行つた。なお図中の使用
緩衝液は下記のとおりである。 ○−○：0.1Mリン酸カリウム緩衝液 ×−×：0.1Mベロナール−塩酸緩衝液 △−△：0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (3) PH安定性： 本酵素0.1単位を含有する各種緩衝液0.2mlを40
℃、10分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。
その結果は第４図に示すとおりである。なお図中
の使用緩衝液は下記のとおりである。 ○−○：0.1Mリン酸カリウム緩衝液 △−△：0.1Mリン酸ナトリウム−0.1M炭酸ナ
トリウム緩衝液 ×−×：0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (4) 力価の測定法： 第１法：生成される過酸化水素を発色定量する方
法 0.05％４−アミノアンチピリン及び0.015％２，
４−ジクロロフエノールサルホネートを含有する
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）2.8mlを試験管にと
り、400U／mlのパーオキシダーゼ溶液10μを加
える。温度平衡を37℃に達せしめたのち、適当な
活性を有する酵素溶液0.1mlを加え、さらに0.5M
フルクトシルグリシン−0.1mlを加えて10分間反
応させ、生じた色素を光電比色計を用いて510nm
における吸光度を測定する。別にあらかじめ過酸
化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との
関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用
いて、37℃、１分間当りに生成される過酸化水素
のマイクロモルを計算し、この数字を使用酵素液
中の活性単位とする。 第２法：酵素反応にともなつて吸収される酸素量
を測定する方法 0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）2.9mlをYSI社製オ
キシゲンモニターの測定容器にとり、0.5Mフル
クトシルグリシン0.1mlを加え、37℃で10分間攪
拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる。これ
に酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液
50μを注入し、生じる酸素吸収をモニターに接
続した記録計で連続的に計測し、その最初の速度
を測定する。あらかじめ同様にして容器内の酸素
濃度と記録値の間で標準曲線を作成し、これを用
いて測定値から酸素濃度を求める。37℃、１分間
当り１マイクロモルの酸素吸収を起こす酵素の活
性を１単位とする。 (5) 作用適温の範囲： フルクトシルグリシンを基質にして、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）中で、酵素反応により生成
するグリシンを液体クロマトグラフイで分離定量
する方法によつて測定した。その結果は第２図に
示すとおりで、本酵素の作用適温の範囲は35〜45
℃である。 (6) 熱安定性： 精製酵素0.1単位を含有する酵素液0.5ml（0.1M
リン酸緩衝液、PH8.0）を各温度で10分間放置し
たのち、残存した酵素活性を調べた。その結果は
第３図に示すとおりで、35℃以下では安定である
が、45℃で90％が失活する。 (7) 阻害活性化及び安定化： 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で、酸素
吸収を測定することによつて調べた。濃度2mM
の各物質の本酵素に対する影響は、下記のとおり
である。Hg⁺⁺、Pb⁺⁺、SDSは強く阻害し、
Ni⁺⁺、Zn⁺⁺は中程度に阻害する。各種キレータ
ー及びSH試薬は微弱な阻害しか与えなかつた。
また本酵素に対する活性化剤及び安定化剤につい
ては未知である。 (8) 精製方法： 本酵素は前記の精製方法によつて精製すること
ができる。 (9) 分子量： 本酵素の分子量は、セフアデツクスＧ−200を
用いたカラムゲル過法で測定した結果、0.1M
食塩含有0.05Mリン酸緩衝液中では65000であつ
た。 (10) 等電点： デイスク焦点電気泳動法により測定した結果、
PI＝4.6であつた。 (11) デイスク電気泳動： デービスのPH9.4のゲルを用いて3mA／ゲルで
５℃、80分泳動を行い、酵素蛋白をクマジ−ブリ
リアントブルーＧ−250で染色した。その結果、
ゲルのアクリルアミド濃度7.5％の時は陽極側に
4.1cm（ブロムフエノールブルーは4.5cm）、15％
の時には同じく陽極側に1.7cmの所に酵素活性を
持つ単一なバンドを認めた。 以上のように本酵素は、その作用及び基質特異
性において従来全く知られていない新規な酵素で
ある。 上記のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをア
マドリ化合物の含有液に作用させる場合には、PH
6.5〜10及び温度50℃以下、好ましくはPH7.5〜９
及び温度37〜45℃の条件で、通常は10〜20分間程
度反応させる。PHの調整には、前記反応のPH範囲
を維持することができ、かつ酵素反応を阻害しな
い任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウ
ム緩衝液、ベロナール緩衝液、リン酸カリウム−
炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソーダ緩衝
液等が好ましい。フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼの使用量は、通常は0.5単位／ml以上である。 本発明においては、下記の何れかの測定法によ
りアマドリ化合物を定量する。 (1) 酵素反応により生成する過酸化水素の測定
法： 反応により生成する過酸化水素を、過酸化水素
定量の常法に従つて、例えば発色方法、過酸化水
素電極を用いる方法等により定量し、あらかじめ
別に用意した過酸化水素量とアマドリ化合物量と
の標準曲線よりアマドリ化合物を定量する。なお
発色法により過酸化水素を測定する場合には、例
えば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と
同様に操作する。 (2) 酸素消費に基づく定量法： この定量法は、反応開始時の酸素量より反応終
了時の酸素量を差引いた値（酸素消費量）を、測
定し、あらかじめ別に用意した酸素消費量とアマ
ドリ化合物量との標準曲線よりアマドリ化合物含
有量を定量するもので、酸素量の測定は常法に従
つて、例えばワールブルグ検圧法、酸素電極法等
により行われる。なお酸素電極法により酸素消費
量を測定する場合には、例えば前記の「力価の測
定法」に記載した測定法と同様に操作する。 本発明のアマドリ化合物定量用試薬は、フルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ及び酵素作用を行わ
しめるに好適なPH範囲、一般にPH6.5〜10好まし
くはPH7.5〜９を与える緩衝剤、更に反応生成物
を測定する場合には、必要により発色剤等を適宜
組合せて成る。 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、
液状、粉末状の何れでもよく、１検体当りの酵素
量は通常は0.5単位／ml以上である。緩衝剤とし
ては、例えばリン酸カリウム緩衝液、ベロナール
緩衝液、リン酸カリウム−炭酸ソーダ緩衝液、ク
エン酸−リン酸ソーダ緩衝液等が好ましい。反応
生成物を測定する際の発色剤としては、該生成物
として反応して発色する物質が用いられ、過酸化
水素の発色剤としては、パーオキシダーゼと例え
ば４−アミノアンチピリン／Ｎ，N′−ジエチル
アミン、４−アミノアンチピリン／フエノール、
４−アミノアンチピリン／Ｎ，N′−ジメチルア
ニリン、ABTS、MBTH／Ｎ，N′−ジメチルア
ニリン、４−アミノアンチピリン／２，４−ジク
ロロフエノールサルホネート等の組合せがあげら
れる。本発明のアマドリ化合物定量用試薬は冷暗
所、特に５℃以下に保存することが好ましい。 本発明によれば、従来困難であつたアマドリ化
合物の測定が容易になり醤油等の食品や輸液等の
製造時及び保存中の状態を反映するアマドリ化合
物を効率良く測定することができる。また、尿や
血液及び生体に由来する蛋白質やポリペプチド鎖
に結合したものも、適当なペプチダーゼを作用さ
せ、遊離状態にしたのちには同様に測定すること
ができ、特に糖尿病の病態測定に利用できる。 実施例 １ ４−アミノアンチピリン 0.5％ 0.3ml 2.4−ジクロロフエノールサルホネート 0.15
％ 0.3ml リン酸緩衝液 0.2M、PH8.0 1.5ml パーオキシダーゼ 400単位／ml 10μ フルクトシルバリン1.5mM ０〜100μ 蒸留水を加えて全量を2.95mlに調整した。 上記反応液の入つた試験管にフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ（198単位／ml含有）50μづ
つを加えて、37℃にて10分間反応させたのち、発
色した色素を510nmで比色定量とした。その結
果、加えたフルクトシルバリンと吸光度の間に比
例関係が認められた。 実施例 ２ オキシゲンモニター（米国YSI社製）の酸素測
定容器に0.2Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.2）を
1.5mlとり、カタラーゼ（50000単位／ml）10μ、
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（198単位／
ml含有）50μ及び蒸留水1.25mlを加えて37℃で
10分間攪拌を続けて平衡に達せしめた。酸素電極
をさしこんで密閉したのち、醤油溶液（PH7.0に
調整後、水で２倍に希釈したもの）20μを加え
て反応させた。反応経過はモニターに接続した記
録計ですべて記録し、20分後に反応結果を測定し
たところ、反応前から11.8目盛の酸素濃度の変化
が読みとれた。同様にしてフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼの代りに水を用いて操作した場合に
は、1.2目盛の変化が読みとれた。その差は10.6
目盛であつた。醤油溶液の代りにフルクトシルグ
リシンの標準液を用いて同様に操作して得た検量
線から、この値は0.26μモルと算出された。 実施例 ３ ４−アミノアンチピリン６mg、0.2Mリン酸カ
リウム水溶液32ml及び02M炭酸ナトリウム水溶液
28mlを混合して分析用キツトＡとした。また添付
液として0.1％２，４−ジクロロフエノールサル
ホネート水溶液B18ml並びにフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ300単位及びパーオキシダーゼ132
単位を含有する60％グリセリン液C5mlを調製し
た。使用に際しては３者を混合して蒸留水を加え
全量100mlとした。試料溶液0.5mlに対し試薬溶液
2.5mlを使用する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いられる酵素の一例につい
ての至適PHを示すグラフ、第２図は至適温度を示
すグラフ、第３図は各温度における失活を示すグ
ラフ、第４図は各PHにおける失活を示すグラフで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アマドリ化合物含有液に、酸素の存在下にフ
   ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、酸
   化反応により消費される酸素量を測定するか、あ
   るいは該反応により生成する過酸化水素を測定す
   ることを特徴とする、アマドリ化合物の定量法。 ２ アマドリ化合物が、アルドースとα−アミノ
   酸から生成された化合物であることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有す
   ることを特徴とする、アマドリ化合物の定量用試
   薬。