JPS6043390A - アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法 - Google Patents
アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法Info
- Publication number
- JPS6043390A JPS6043390A JP59120869A JP12086984A JPS6043390A JP S6043390 A JPS6043390 A JP S6043390A JP 59120869 A JP59120869 A JP 59120869A JP 12086984 A JP12086984 A JP 12086984A JP S6043390 A JPS6043390 A JP S6043390A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- alpha
- keto
- culture
- amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/222—Phenylalanine
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的にＬ−アミノ酸の生物学的製造に関する
ものである。更に詳細には、アルファーケト酸を栄養培
地中の適当な微生物の活性的に、６− 対数的に増殖する培養液に供給することにより、Ｌ−ア
ミノ酸をその対応するアルファーケト酸先駆体から製造
し得ることが見い出された。アルファーケト酸をＬ−ア
ミノ酸に生物的に転移１．得る微生物は多数わる。
ものである。更に詳細には、アルファーケト酸を栄養培
地中の適当な微生物の活性的に、６− 対数的に増殖する培養液に供給することにより、Ｌ−ア
ミノ酸をその対応するアルファーケト酸先駆体から製造
し得ることが見い出された。アルファーケト酸をＬ−ア
ミノ酸に生物的に転移１．得る微生物は多数わる。
アルファーケ）ＩＩが酵素的にその対応するＬ−アミノ
酸に転移し得ることは公知である。例えば米国特許第４
７４９．２７９号にアルファーケトグルタル酸及びアン
モニア＜５生物学的酵素−補酵素触媒で処理する方法が
開示されている。適当な生物学的触媒は動物組織、急速
に生長する植物またはバクテリアから自己溶解物（ａｒ
ｂｔｏｌｙｓαｔｅ）ｉだは細胞培養の抽出物の状態で
得ることができる。
酸に転移し得ることは公知である。例えば米国特許第４
７４９．２７９号にアルファーケトグルタル酸及びアン
モニア＜５生物学的酵素−補酵素触媒で処理する方法が
開示されている。適当な生物学的触媒は動物組織、急速
に生長する植物またはバクテリアから自己溶解物（ａｒ
ｂｔｏｌｙｓαｔｅ）ｉだは細胞培養の抽出物の状態で
得ることができる。
同様に、米国特許第４．３０４．８５８号に基質特異性
の脱水素酵素、アンモニウムイオン及びニコチン了ミド
ーアデニンージヌクレオチド（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＩＩ）
の存在下での水溶性アルファーケトカルボン酸の対応す
るアミノ酸へり転移が開示されている。休止細胞（ｒｅ
ｓｔｉｎｇ−ｃｅｌｌ ） 懸濁液を用いるアルファー
ケト酸のアミノ酸への転移（ｒ↑ヤマダらによるＴｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ
ｓ。
の脱水素酵素、アンモニウムイオン及びニコチン了ミド
ーアデニンージヌクレオチド（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＩＩ）
の存在下での水溶性アルファーケトカルボン酸の対応す
るアミノ酸へり転移が開示されている。休止細胞（ｒｅ
ｓｔｉｎｇ−ｃｅｌｌ ） 懸濁液を用いるアルファー
ケト酸のアミノ酸への転移（ｒ↑ヤマダらによるＴｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ
ｓ。
４４０〜４６負（１９７２）に報告されている。
活性的に増殖する微生物の培養によりアルファーケト酸
の対応するＬ−アミノ酸への生物的転移が更に効果的に
仲介され得ることが見い出された。
の対応するＬ−アミノ酸への生物的転移が更に効果的に
仲介され得ることが見い出された。
アルファーケト酸をＬ−アミノ酸に転移し得る微生物は
栄養培地中で増殖する。所望のＬ−アミノ酸のアルファ
ーケト酸先駆体は活性的に、対数的に増殖する培養液に
供給される。アミノ基転移は増殖する培養液の微生物に
よゆ与えられる共役した酵素系により実質的に完了され
、その際にアミノ供与体（Ｌ−グルタメート）及び補酵
素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤｐＨ’＋の連続的再循環が達
成される。このＬ−アミノ酸は培養肉汁から回収できる
。
栄養培地中で増殖する。所望のＬ−アミノ酸のアルファ
ーケト酸先駆体は活性的に、対数的に増殖する培養液に
供給される。アミノ基転移は増殖する培養液の微生物に
よゆ与えられる共役した酵素系により実質的に完了され
、その際にアミノ供与体（Ｌ−グルタメート）及び補酵
素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤｐＨ’＋の連続的再循環が達
成される。このＬ−アミノ酸は培養肉汁から回収できる
。
アルファーケト酸のその対応するＬ−アミノ酸への生物
学的”アミノ基転移に対する高効率の方法を提供するこ
とが本発明の第一の目的である。
学的”アミノ基転移に対する高効率の方法を提供するこ
とが本発明の第一の目的である。
更に、本発明の方法は広範囲の微生物に有用であり、そ
して広範囲のＬ−アミノ酸の製造に対（７て有用である
。
して広範囲のＬ−アミノ酸の製造に対（７て有用である
。
加えて早−の微生物の菌株が所定のアルファーケト酸を
Ｌ−アミノ酸へ転移するに必要なすべての酵素を十分な
瞳で生成１７得る方法を提供することが目的でおる。
Ｌ−アミノ酸へ転移するに必要なすべての酵素を十分な
瞳で生成１７得る方法を提供することが目的でおる。
咀に短かい反志ＩＧＩＩ間内での多量のアルファーケト
酸のＬ−アミノ酸への転移を提供することが目的である
。
酸のＬ−アミノ酸への転移を提供することが目的である
。
更にまた、低潰度のアミノ供与体の存在下でＬ−アミノ
酸が高収量で生じる方法を提供することが目的である。
酸が高収量で生じる方法を提供することが目的である。
＝９−
バクテリアの増殖は一般的に順次３つの期に分けること
ができる。遅滞期は培養中の微生物の数がほとんどか、
または全く増加しない期間である。
ができる。遅滞期は培養中の微生物の数がほとんどか、
または全く増加しない期間である。
対数的または指数関孜的増殖期においては細ｔＷ’ｌ／
）数は期間中に指数関数的に増加する。定常期において
は細胞の増殖または分裂はほとんどか、または全く起こ
らない。
）数は期間中に指数関数的に増加する。定常期において
は細胞の増殖または分裂はほとんどか、または全く起こ
らない。
アルファーケト酸のＬ−アミノ酸への生物的アミノ基転
移はアルファーケト酸を対数的に増殖する適当な微生物
に加えることにより更に効率的に行い得ることが見い出
された。本発明の方法に、しる供給−バッチ（ｆｅｄ−
ｂａｔｃｈ ）発酵により高転化率での高収率が得られ
る、この方法には増殖する微生物中に存在する共役ｌ〜
だ酵素系により反応が完了する利点がある。Ｌ−アミノ
酸生成物を培養肉汁から回収することができる。
移はアルファーケト酸を対数的に増殖する適当な微生物
に加えることにより更に効率的に行い得ることが見い出
された。本発明の方法に、しる供給−バッチ（ｆｅｄ−
ｂａｔｃｈ ）発酵により高転化率での高収率が得られ
る、この方法には増殖する微生物中に存在する共役ｌ〜
だ酵素系により反応が完了する利点がある。Ｌ−アミノ
酸生成物を培養肉汁から回収することができる。
反応
１０−
アルファーケト酸からＬ−アミノ酸への生物的転移は酵
素的アミノ基転移反応でおる。この生物的転移はアミノ
基転移酵素、グルタメート脱水素酵素、補酵素ＮＡＤＰ
−／ＩＶＡＤＰＨｌまたはＮＡＤ＋／！’ＪＡＤＩＩ）
、及び脱水素酵素からなる共役１−た酵素−補酵素系に
より仲介される。また、この酵素系の後者の成分はＮＡ
ＤＰ＋ （まだはＮＡＤ十）を再循環させてＮＡＤｐＨ
（またはＮＡＤｌｌ）に戻すだめの水素化酵素であるこ
とができる。
素的アミノ基転移反応でおる。この生物的転移はアミノ
基転移酵素、グルタメート脱水素酵素、補酵素ＮＡＤＰ
−／ＩＶＡＤＰＨｌまたはＮＡＤ＋／！’ＪＡＤＩＩ）
、及び脱水素酵素からなる共役１−た酵素−補酵素系に
より仲介される。また、この酵素系の後者の成分はＮＡ
ＤＰ＋ （まだはＮＡＤ十）を再循環させてＮＡＤｐＨ
（またはＮＡＤｌｌ）に戻すだめの水素化酵素であるこ
とができる。
共役した反応系は次のような図で或わすことができる：
ｔＮＡＤＰＨ） α−ケトグ Ｉ７−アミ（ＮＡＤ十）
＋２１ ＋１１
（３）
所望のアミノ基転移反応〔工程＋１））であるアルファ
ーケト酸からＬ−アミノ酸への工程は通常は可逆的であ
シ、且つ単なる）平衡におり、かくしてアミノ酸への転
移の効率を限定する。このアミノ基転移反応を他の酵素
反応と共役させることにより、とのアミノ基転移は理論
的には完了するが、化学的劣化反応が存在し、実際の収
率を減少させる。
ーケト酸からＬ−アミノ酸への工程は通常は可逆的であ
シ、且つ単なる）平衡におり、かくしてアミノ酸への転
移の効率を限定する。このアミノ基転移反応を他の酵素
反応と共役させることにより、とのアミノ基転移は理論
的には完了するが、化学的劣化反応が存在し、実際の収
率を減少させる。
上記の工程（２）で表わされる共役ｌ〜だ酵素反応ｄア
ミノ基転移生成物でおるアルファーケトグルタレートの
おるものを循環させてＬ−グルタメートに戻す、この工
程である還元的アミノ化はグルタメート脱水素酵素によ
り仲介され そしてアンモニウムイオンの存在を必要と
すＳ０アルフアーケト酸のＬ−アミノ酸へのアミン基転
移に対して得すれるＬ−グルタメートはこの循環１（よ
り連続的に要き換わる。
ミノ基転移生成物でおるアルファーケトグルタレートの
おるものを循環させてＬ−グルタメートに戻す、この工
程である還元的アミノ化はグルタメート脱水素酵素によ
り仲介され そしてアンモニウムイオンの存在を必要と
すＳ０アルフアーケト酸のＬ−アミノ酸へのアミン基転
移に対して得すれるＬ−グルタメートはこの循環１（よ
り連続的に要き換わる。
［程（２）は補酵素１’ＪＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの１
つを用い、その際にこのものはＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ
＋に転化される。三番目の酵素反応、工程（３）におい
てこのＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ ｌ−）生成物は脱水素酵素
反応または水素化酵素反応のいずれかを介して漂ＮＡＤ
ｐＨ（ＮＡＤＨ）に転化する。
つを用い、その際にこのものはＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ
＋に転化される。三番目の酵素反応、工程（３）におい
てこのＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ ｌ−）生成物は脱水素酵素
反応または水素化酵素反応のいずれかを介して漂ＮＡＤ
ｐＨ（ＮＡＤＨ）に転化する。
かくしてまた 工程（２）に必要とされるＮＡＤＰＨ（
ＮＡＤＨ）は連続的に補充される。工程（２）に必要と
されるＮＨ方は栄養培地中に供給する。
ＮＡＤＨ）は連続的に補充される。工程（２）に必要と
されるＮＨ方は栄養培地中に供給する。
１３−
酵素反応系はそれ自体公知である。しか１７ながら、こ
の系を使用する前に上記の米国特許第３． ｉ８３、１
７０号（キタイら）に表わされる３つの工程の反応成分
を供給するだめの３つの異なった微生物の添加、または
微生物、アミノ供与体及び補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ
）の添加〔ヤマダら、ＴｈｅＭｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏＡｃｉｄｓ、４４
０〜４６頁（１９７６）、）が必要である。更に、これ
ら従来の方法は休止細胞の懸濁液を用いる。
の系を使用する前に上記の米国特許第３． ｉ８３、１
７０号（キタイら）に表わされる３つの工程の反応成分
を供給するだめの３つの異なった微生物の添加、または
微生物、アミノ供与体及び補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ
）の添加〔ヤマダら、ＴｈｅＭｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏＡｃｉｄｓ、４４
０〜４６頁（１９７６）、）が必要である。更に、これ
ら従来の方法は休止細胞の懸濁液を用いる。
本発明はここに全体に共役した酵素反応系を提供するた
めに単一の微生物菌株を用いる。培養基中にアンモニウ
ムイオンを有する適当な微生物の対数的に増殖する培養
液はアルファーケト酸のそのそれぞれのＬ−アミノ酸へ
の生物的転移の３つの工程のすべてを仲介する。本・４
明の方法にしいて、共役した酵素系における工程（３）
はＮＡＩ）Ｐ十（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＰＦＩ （ＭＡＤ
Ｅ）に転化す１４− るだめの脱水素酵素反応を利用する。
めに単一の微生物菌株を用いる。培養基中にアンモニウ
ムイオンを有する適当な微生物の対数的に増殖する培養
液はアルファーケト酸のそのそれぞれのＬ−アミノ酸へ
の生物的転移の３つの工程のすべてを仲介する。本・４
明の方法にしいて、共役した酵素系における工程（３）
はＮＡＩ）Ｐ十（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＰＦＩ （ＭＡＤ
Ｅ）に転化す１４− るだめの脱水素酵素反応を利用する。
反応体
共役した酵素反応系は活性的に増殖する微生物において
存在する。この天然に生じる系をアルファーケト酸のＬ
−アミノ酸への効率的転移に利用できる。適当な基質と
共に適当な微生物を与えることにより、この転移は微生
物自体により高収率で行われる。
存在する。この天然に生じる系をアルファーケト酸のＬ
−アミノ酸への効率的転移に利用できる。適当な基質と
共に適当な微生物を与えることにより、この転移は微生
物自体により高収率で行われる。
この生物的転移方法に使用する際に適する微生物のタイ
プにはかなり種々のものがある、例えば、グルタミン酸
生成菌（ｐｒｏｄ′ｔＬｃｅｒ ）として公知であるバ
クテリア性１株を利用して成功した。これらのものには
プレビバクテリウムチオゲニタリス（ｔｈｉｏｇｅｎｉ
ｔａｌｉｓ ） （ＡＴＣＣ５３１７２３）、ブレビバ
クテリウムラクトファーメンタム（１ａｃ−ｔｏ、ｆｅ
ｒｍｅ％ｔｕｍ ） （ＡＴ ＣＣｌ１１３６５５ ）
、プレヒハクテリウムアンモニアゲン（α瓢ｏｎｉａｇ
ｅｎｅ）（，４７’（？（：’Ａｔ ａ ？ ４６ ）
、プレピノくクテリウムグルタミゲｙ （ｇｌｕｔａｒ
ｎｉｇｅｎｅ ） （Ａ Ｔ ＣＣｓ １３７４７）、
ブレビバクテリウムフラノ（ンＣｆｌα−ｖｕｍ） （
ＡＴＣＣＩｌｘ１３ Ｂ ２６ ）及びコリネノくクテ
リウム／’−キ：ｘ、ル（ｈｅｒｃｕｌｅ ） （Ａ
Ｔ ＣＣＡ１３８６８）が含まれる。ここに示されるＡ
Ｔ ＣＣ’息は各々Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｒｂｌｔｑｔ、ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
プにはかなり種々のものがある、例えば、グルタミン酸
生成菌（ｐｒｏｄ′ｔＬｃｅｒ ）として公知であるバ
クテリア性１株を利用して成功した。これらのものには
プレビバクテリウムチオゲニタリス（ｔｈｉｏｇｅｎｉ
ｔａｌｉｓ ） （ＡＴＣＣ５３１７２３）、ブレビバ
クテリウムラクトファーメンタム（１ａｃ−ｔｏ、ｆｅ
ｒｍｅ％ｔｕｍ ） （ＡＴ ＣＣｌ１１３６５５ ）
、プレヒハクテリウムアンモニアゲン（α瓢ｏｎｉａｇ
ｅｎｅ）（，４７’（？（：’Ａｔ ａ ？ ４６ ）
、プレピノくクテリウムグルタミゲｙ （ｇｌｕｔａｒ
ｎｉｇｅｎｅ ） （Ａ Ｔ ＣＣｓ １３７４７）、
ブレビバクテリウムフラノ（ンＣｆｌα−ｖｕｍ） （
ＡＴＣＣＩｌｘ１３ Ｂ ２６ ）及びコリネノくクテ
リウム／’−キ：ｘ、ル（ｈｅｒｃｕｌｅ ） （Ａ
Ｔ ＣＣＡ１３８６８）が含まれる。ここに示されるＡ
Ｔ ＣＣ’息は各々Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｒｂｌｔｑｔ、ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｇ 。
ｋｖｉｌｌｇ 。
Ｍａｒｙｌａｎｄ ３０８５２により培養液に与えられ
る呼称番号であ抄、そこに上記培養液の各々のものが預
託されている。また他のグルタミン酸生成幅も拳法に用
いる際に適していることが予１ｔＪ］ ｇれ＠。
る呼称番号であ抄、そこに上記培養液の各々のものが預
託されている。また他のグルタミン酸生成幅も拳法に用
いる際に適していることが予１ｔＪ］ ｇれ＠。
加えて、通常グルタミン酸生成菌とぐ、を考えられない
大腸菌７［？１０１が上記の微生物と匹敵する収率で拳
法に使用し得ることが見い出された。大腸菌は培地中に
グルタミン酸を汗泌しない点ではグルタミン酸生成菌で
はない。しか１７ながらすべての微生物はこのものを少
喰の細胞内物質として生成する。ここで興味あることは
酵素系では反応を開始させるために触媒計のみのグルク
ミン酸が必要であり、そして大腸幅は共役（２だ系の工
程＋２１を完了させるに十分な稲のグルタミンＣ浚を生
成するように見える。
大腸菌７［？１０１が上記の微生物と匹敵する収率で拳
法に使用し得ることが見い出された。大腸菌は培地中に
グルタミン酸を汗泌しない点ではグルタミン酸生成菌で
はない。しか１７ながらすべての微生物はこのものを少
喰の細胞内物質として生成する。ここで興味あることは
酵素系では反応を開始させるために触媒計のみのグルク
ミン酸が必要であり、そして大腸幅は共役（２だ系の工
程＋２１を完了させるに十分な稲のグルタミンＣ浚を生
成するように見える。
この生物的転移方法に有用な微生物は広範囲に存在する
ことは明らかである。４−の心安条件は微生物がアルフ
ァーケト酸を吸収し、そして対１，６するＬ−アミノ酸
に転移１〜得ることである。この生物的転移を最も効率
良く行うために、微生４勿が共役した酵素系の工程（１
）〜（３）に含まれる酵素を十分な量で生成し、実質的
に反応の完了に対する平衡点を越えるようにアミノ基転
移反応を誘導することができるべきである。最後に、こ
の微生物は好ましくは便利で、且つ経済的に回収される
ように培養病中にＬ−アミノ酸を分泌し得るべきでろ１
７− る。
ことは明らかである。４−の心安条件は微生物がアルフ
ァーケト酸を吸収し、そして対１，６するＬ−アミノ酸
に転移１〜得ることである。この生物的転移を最も効率
良く行うために、微生４勿が共役した酵素系の工程（１
）〜（３）に含まれる酵素を十分な量で生成し、実質的
に反応の完了に対する平衡点を越えるようにアミノ基転
移反応を誘導することができるべきである。最後に、こ
の微生物は好ましくは便利で、且つ経済的に回収される
ように培養病中にＬ−アミノ酸を分泌し得るべきでろ１
７− る。
拳法に用いるために選ばれるアルファーケトト−雌はい
かなるＬ−アミノ酸が所望の生成物で・わるかに依存す
る。例えば、フェニルピルビン酸・・ｔＬ−フェニルア
ラニンに、アルファーケトイソカブロン酸はＬ−ロイシ
ンに、アルファーケトイソ青草ＷＩはＬ−バリンに、ピ
ルビン酸はＬ−アラニンに、オキサロ酢酸はＬ−アスパ
ラギン酸に、β−ヒドロキシ−アルファーケト酪酸はＬ
−スレオニンに、ｐ−オ＊ｙフェニルピルビン酸１ｄＬ
−チロシンに、インドールピルビン酸はＬ−トリプトフ
ァンに、アルファーケト−β−メチル台草酸はＬ−イソ
ロイシン、などに転移する。このように、通常のＬ−ア
ミノ酸先駆体を本発明の方法に用いる。
かなるＬ−アミノ酸が所望の生成物で・わるかに依存す
る。例えば、フェニルピルビン酸・・ｔＬ−フェニルア
ラニンに、アルファーケトイソカブロン酸はＬ−ロイシ
ンに、アルファーケトイソ青草ＷＩはＬ−バリンに、ピ
ルビン酸はＬ−アラニンに、オキサロ酢酸はＬ−アスパ
ラギン酸に、β−ヒドロキシ−アルファーケト酪酸はＬ
−スレオニンに、ｐ−オ＊ｙフェニルピルビン酸１ｄＬ
−チロシンに、インドールピルビン酸はＬ−トリプトフ
ァンに、アルファーケト−β−メチル台草酸はＬ−イソ
ロイシン、などに転移する。このように、通常のＬ−ア
ミノ酸先駆体を本発明の方法に用いる。
アルファーケト酸を水溶液として培養液に加えることが
好ましく。その理由はこの状態が先駆体を培養肉汁中に
ポンプ導入する際に便利であるか１８− らである。しかしながら、所望に応じてアルファケト酸
を他の物理的状態、例えば固体−またはスラリーである
ことができる。
好ましく。その理由はこの状態が先駆体を培養肉汁中に
ポンプ導入する際に便利であるか１８− らである。しかしながら、所望に応じてアルファケト酸
を他の物理的状態、例えば固体−またはスラリーである
ことができる。
アルファーケト酸先駆体の純度はＬ−アミノ酸の生成に
、少なくともフェニルピルベートのフェニルアラニンへ
の転移の場合に（実施例５参照）やや劇的に影響するこ
とが示された。精製した先駆体中に得られるアルファー
ケト酸の増加量に加えて、微生物は精製したアルファー
ケト酸に対１゜てより少ない急変を示し得ることが考え
られる。
、少なくともフェニルピルベートのフェニルアラニンへ
の転移の場合に（実施例５参照）やや劇的に影響するこ
とが示された。精製した先駆体中に得られるアルファー
ケト酸の増加量に加えて、微生物は精製したアルファー
ケト酸に対１゜てより少ない急変を示し得ることが考え
られる。
ｌ音養液に供給する状態である場合、アルファーケト酸
の水溶液の濃度をかなり変えることができる。例えば、
本発明を連続的発酵に用いる場合、バッチ式発酵に対す
るより溶液を希釈する。濃ｉ変に対する上限は所望の溶
媒中のアルファーケト酸の溶解度に依存１７得る。特定
のアルファーケト酸、並びにヒｄ己の因子に依存する濃
度に関し、約１．０〜２００１／ｌの清が適当であり得
ることが予用］される。峡も好“ましくけアルファーケ
ト酸を水（ｔ（癖解させるが、所望に応じて発酵に適合
する他の溶媒、例えば追加の増殖培地を用いることがで
きる。
の水溶液の濃度をかなり変えることができる。例えば、
本発明を連続的発酵に用いる場合、バッチ式発酵に対す
るより溶液を希釈する。濃ｉ変に対する上限は所望の溶
媒中のアルファーケト酸の溶解度に依存１７得る。特定
のアルファーケト酸、並びにヒｄ己の因子に依存する濃
度に関し、約１．０〜２００１／ｌの清が適当であり得
ることが予用］される。峡も好“ましくけアルファーケ
ト酸を水（ｔ（癖解させるが、所望に応じて発酵に適合
する他の溶媒、例えば追加の増殖培地を用いることがで
きる。
用いる微生物に対して最適条件を与えるように栄養培地
を選ぶべきである。培地のＳｔ類醍び調・修は当該分野
に梢通せる者の能力の範囲内で良く、そしてここで詳４
Ｈに述べる必妥はない。
を選ぶべきである。培地のＳｔ類醍び調・修は当該分野
に梢通せる者の能力の範囲内で良く、そしてここで詳４
Ｈに述べる必妥はない。
しかしながら、基本的に必要な栄養に加えて、＋
この培地にはＮＨ４の原料が含壕れるべきである、。
このアンモニウムイオンは１“ｆｌｆｌ胞体を増殖させ
るためと共役した酵素反ら系の工程（２）のだめの両方
のために微生物により使用される。かくして、培１−基
中のアンモニウムイオンの（Ｊ−はアミン淑及び、＋、
ｌｌｉ胞体の所望の生成に合わせるべきである。またと
のＮＨ，＋量の調整は当該分野に梢通せる者には公知で
ある。例として、このイオンを約ｌθ〜約団１／ｌのａ
Ｉｆで硫酸アンモニウムを栄養培地に加えることにより
供給することが便利であり得る。
るためと共役した酵素反ら系の工程（２）のだめの両方
のために微生物により使用される。かくして、培１−基
中のアンモニウムイオンの（Ｊ−はアミン淑及び、＋、
ｌｌｉ胞体の所望の生成に合わせるべきである。またと
のＮＨ，＋量の調整は当該分野に梢通せる者には公知で
ある。例として、このイオンを約ｌθ〜約団１／ｌのａ
Ｉｆで硫酸アンモニウムを栄養培地に加えることにより
供給することが便利であり得る。
十
゛まだ、ＮＨ４供与体として尿素、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなトに用いること
ができる。
硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなトに用いること
ができる。
反応方法
本発明の生物的転移には活性的に増殖する微生物の培養
液が必要である。この培養液は所望の菌株の種子（５ｅ
ｅｄ ）培養液を無菌栄養液または増殖培地に接種する
ことによりこの培養液を調製することができる。栄養培
地に接種するために用いる種子培養液は接種物として用
いる前に約６〜４０時間増殖させることが好ましい。接
種前の種子培養液を増殖させる時間の長さは用いるバク
テリア菌株に依存して変える。種子培養液が発酵培養液
の確立及び増殖に対する良好な基礎を形成す２１− るに十分に正常で、成険１７ている細胞体からなること
が望ましい。
液が必要である。この培養液は所望の菌株の種子（５ｅ
ｅｄ ）培養液を無菌栄養液または増殖培地に接種する
ことによりこの培養液を調製することができる。栄養培
地に接種するために用いる種子培養液は接種物として用
いる前に約６〜４０時間増殖させることが好ましい。接
種前の種子培養液を増殖させる時間の長さは用いるバク
テリア菌株に依存して変える。種子培養液が発酵培養液
の確立及び増殖に対する良好な基礎を形成す２１− るに十分に正常で、成険１７ている細胞体からなること
が望ましい。
発酵反応器の大きさは拳法の特定の用途に依存する。培
地及び種子培養液の量を特定の反応器または所望の収率
に適合させることは当該分野に精通せる者の知識の範囲
内のものでめる。
地及び種子培養液の量を特定の反応器または所望の収率
に適合させることは当該分野に精通せる者の知識の範囲
内のものでめる。
この培養液を発酵反応器中でこのものが反応器の環境に
慣れ、そしてアルファーケト酸の添加に耐えるに十分な
細胞体に成長するまで増殖させる。
慣れ、そしてアルファーケト酸の添加に耐えるに十分な
細胞体に成長するまで増殖させる。
このことは不純物を含む先駆体を用いる場合に殊に重要
である。光学的な濃度は細胞増殖の便利な尺度であり得
る。約ｌＯの光学的濃度（ｒ□−Ｄ、Ｊ）（６４０ｎｆ
ｒＬ）は培養液にアルファーケト酸を加える準備ができ
ていることを一般的には示す。このことは生物及び培養
条件に依存するが約６〜４０時間の培養期間に対応する
。しかしながら、このことはある程度可変であり、そし
て厳密な必２２− 要条件としてμるべきではなく、作業者の経験及び選択
にまかせるべべである。
である。光学的な濃度は細胞増殖の便利な尺度であり得
る。約ｌＯの光学的濃度（ｒ□−Ｄ、Ｊ）（６４０ｎｆ
ｒＬ）は培養液にアルファーケト酸を加える準備ができ
ていることを一般的には示す。このことは生物及び培養
条件に依存するが約６〜４０時間の培養期間に対応する
。しかしながら、このことはある程度可変であり、そし
て厳密な必２２− 要条件としてμるべきではなく、作業者の経験及び選択
にまかせるべべである。
用いるバクテリア菌株の最大増殖に適合する温度で培養
を行恒、一般的な範囲は周囲温度から約３７℃までであ
ろう。コリネバクテリア及びブレビバクテリウムに対し
ては好適な温度は約３０°Ｃであり；大陽菌に対１．て
は好適な温度は約３７°Ｃである。培養液のｐ Ｉｔ値
は好ましくは約７〜８であるべきである。ノ＾んだバク
テリア菌株に対して必要に応じて通気を行うことができ
る。
を行恒、一般的な範囲は周囲温度から約３７℃までであ
ろう。コリネバクテリア及びブレビバクテリウムに対し
ては好適な温度は約３０°Ｃであり；大陽菌に対１．て
は好適な温度は約３７°Ｃである。培養液のｐ Ｉｔ値
は好ましくは約７〜８であるべきである。ノ＾んだバク
テリア菌株に対して必要に応じて通気を行うことができ
る。
この段階で、反応器に所望のアルファーケト酸を供給す
る。とのアルファーケト酸は−Ｈ記のしうに水溶液であ
ることが好ましい。この水溶液中でのアルファーケト酸
の濃度は約１．０チ〜約２０チ（重欧／重１）であるこ
とができる。この溶液。
る。とのアルファーケト酸は−Ｈ記のしうに水溶液であ
ることが好ましい。この水溶液中でのアルファーケト酸
の濃度は約１．０チ〜約２０チ（重欧／重１）であるこ
とができる。この溶液。
ｐＨ値は約７〜約１４であることができる。このｐ ｉ
Ｉ値は氷酢酸も１．＜は他の生物学的に適合する酸（例
えば硫酸またはクエン酸）士たはガス状二酸化炭素を用
いてより低いｐＨ値に調整することができる。この溶液
を水蒸気（例えば１２１°Ｃで１５分間）、ミリ−ボア
（Ｍｉｌｌｉ−ｐａｒｅ ）ろ過（例えば０２２μ細孔
径）まだは他の好都合な方法により殺菌することがで八
る。
Ｉ値は氷酢酸も１．＜は他の生物学的に適合する酸（例
えば硫酸またはクエン酸）士たはガス状二酸化炭素を用
いてより低いｐＨ値に調整することができる。この溶液
を水蒸気（例えば１２１°Ｃで１５分間）、ミリ−ボア
（Ｍｉｌｌｉ−ｐａｒｅ ）ろ過（例えば０２２μ細孔
径）まだは他の好都合な方法により殺菌することがで八
る。
培養増殖を続けるために必要に応じて根菌グルコースを
アルファーケト酸と一緒にか、また＋１はぼ同時に発酵
ｄ（中に供給することができる。しかしながら、発酵の
最後に培養肉汁中に残留する酌剰のグルコースはアミノ
酸生成物の回収を妨Ｍ！７得る。このことが生じた場合
、１９ 養液に与えられるグルコースの晴を発酵中に
細胞体（ｌこより使＋＋−１される計痒した量に制限す
べきである。
アルファーケト酸と一緒にか、また＋１はぼ同時に発酵
ｄ（中に供給することができる。しかしながら、発酵の
最後に培養肉汁中に残留する酌剰のグルコースはアミノ
酸生成物の回収を妨Ｍ！７得る。このことが生じた場合
、１９ 養液に与えられるグルコースの晴を発酵中に
細胞体（ｌこより使＋＋−１される計痒した量に制限す
べきである。
アルファーケト酸（及び所９Ｌに一スじてグルコース）
の添υ口は反応器の汚染を避けろために防Ｉｔズ状態で
（ｎ、ｓｅｇｔｉｃａｌｌｙ ）行うことが好マ１〜い
。反応器内のアルファーケト酸の培養肉汁１ｍ Ｉｔは
スラグ（ｓｌｕσ）供給バッチ式反応器に対して恐らく
約２０ｇ／ｌ〜約５ａｙ／ｇの範囲であろう。連続的発
酵に対ｌ〜では濃度はより低くてもよい。しかしながら
、対数増殖期中に做生物による使用を最大にするために
は破眼代謝（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｍｅ−ｔａｂｏｌ
ｉｓｍ）なしにできる限り高いアルファーケト酸濃度を
有することが望ましい。
の添υ口は反応器の汚染を避けろために防Ｉｔズ状態で
（ｎ、ｓｅｇｔｉｃａｌｌｙ ）行うことが好マ１〜い
。反応器内のアルファーケト酸の培養肉汁１ｍ Ｉｔは
スラグ（ｓｌｕσ）供給バッチ式反応器に対して恐らく
約２０ｇ／ｌ〜約５ａｙ／ｇの範囲であろう。連続的発
酵に対ｌ〜では濃度はより低くてもよい。しかしながら
、対数増殖期中に做生物による使用を最大にするために
は破眼代謝（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｍｅ−ｔａｂｏｌ
ｉｓｍ）なしにできる限り高いアルファーケト酸濃度を
有することが望ましい。
次に好まｌ〜くけ約２０〜約７２時間の１１加の期間＋
８養液を増殖さｌ七る。アルファーケト酸をＬ−アミノ
酸に生物学的に転移するこの期間はできる限り短かいこ
とが好ましく、収率は最高のままである。本発明の方法
により、最高として予期される収率は本明細丼の実殉例
６におけるＬ−フェニルアラニンの製造に対１７て示さ
れる２３時間程＋ｉ（の短かい期間で１００−程度の高
さになり得る。
８養液を増殖さｌ七る。アルファーケト酸をＬ−アミノ
酸に生物学的に転移するこの期間はできる限り短かいこ
とが好ましく、収率は最高のままである。本発明の方法
により、最高として予期される収率は本明細丼の実殉例
６におけるＬ−フェニルアラニンの製造に対１７て示さ
れる２３時間程＋ｉ（の短かい期間で１００−程度の高
さになり得る。
増殖期間の後、Ｌ−アミノ酸生成物を通常の方法２５−
により培養肉汁から回収することができる。
説明の目的のみのために次の実施ｉｌＪを示１７、そし
てこのものは本明細書に示される発明を１服定すること
を意味するものではない。
てこのものは本明細書に示される発明を１服定すること
を意味するものではない。
実施例１
次の種子培養基を調製１．た：
３０、００ ｇ グルコース” １００．００ｇ２．５
０．！９ ）ウモロコシ浸漬液 ２．５０．！？２．５
０９ ＮＺアミンＢ ２．５１ ｔｏｏｙ Ｋ、ＨＰＯ４１４０ｇ ０．２５ｇ Ｍｇ５０４− ’ＩＨ，００，２５ｇ１０
．０ＯＪｉ’ （ＮＨ４）、Ｓｏ、 ５０．００ｇ１．
０ＯＣｅ ビオチン貯蔵溶液” １．ｏｏｃｃｌ、 ０
０ ｃｃ チアミン−ＨＣｌ貯蔵心液４ １．ＱＱＣＣ
２０，９０ｇ ＭＯＰＳ緩筒液５ ２０．９０．９１−
脱イオン止水１１当り。
０．！９ ）ウモロコシ浸漬液 ２．５０．！？２．５
０９ ＮＺアミンＢ ２．５１ ｔｏｏｙ Ｋ、ＨＰＯ４１４０ｇ ０．２５ｇ Ｍｇ５０４− ’ＩＨ，００，２５ｇ１０
．０ＯＪｉ’ （ＮＨ４）、Ｓｏ、 ５０．００ｇ１．
０ＯＣｅ ビオチン貯蔵溶液” １．ｏｏｃｃｌ、 ０
０ ｃｃ チアミン−ＨＣｌ貯蔵心液４ １．ＱＱＣＣ
２０，９０ｇ ＭＯＰＳ緩筒液５ ２０．９０．９１−
脱イオン止水１１当り。
２６一
２−７０襲（屯曖／容ｉｔ）グルコース貯蔵ｍ液。
３−説イオン化水ｌｌ当りｉ ｏ ｏ ｍｙのｄ−ビオ
チン。
チン。
４−説イオン化水１１当り１．０９のチアミン−Ｃ１０
５−ＭｏＰＳ−モルホリノプロパン−スルホン酸。
グルコース以外のすべての成分を一緒にし、そして１２
１℃で１５分間水蒸気殺１石した。グルコース溶液全同
様の方法で別々に殺菌し、次に培地の残りのものに防腐
状態で加えた。６つのグルタミン酸−生成バクチリア菌
株の各々に対する２つの種子培養液を増殖させるために
種子培養基のフラスコ（２５０ｃｃ）を用いた。菌株及
び種子培養液を８時１ｒｆｉ培養した後の各々の菌株に
対する光学的）９度は次の通りであった。
１℃で１５分間水蒸気殺１石した。グルコース溶液全同
様の方法で別々に殺菌し、次に培地の残りのものに防腐
状態で加えた。６つのグルタミン酸−生成バクチリア菌
株の各々に対する２つの種子培養液を増殖させるために
種子培養基のフラスコ（２５０ｃｃ）を用いた。菌株及
び種子培養液を８時１ｒｆｉ培養した後の各々の菌株に
対する光学的）９度は次の通りであった。
菌 株 光学的濃度
（ｅ４ｏｐｐｍ）
ブレビバクテリウム チオゲニタリス ３．９±０１（
Ａ７’（？（’３１７２３） ブレビバクテリウム ラクトファーメ １１．２十〇、
８ンタム（Ａ７’ＣＣｌ３６５５） ブレビバクテリウム アンモニアゲン ６．０±０．４
（ＡＴＣＣ１３１４６） ブレビバクテリウム グルタミン酸 （Ａ７’（：’Ｃ１３７４７） ブレビバクテリウム フラバン １３．３±０．３（Ａ
ＴＣＣ１３８２６） 殺菌した増殖培地を５６ｃｃずつ２５０ ＣＧの目盛付
き振盪フラスコに加えた。各々のフラスコにｌチ容量／
容量を基準として単一種子培養液を接種した。この振盪
フラスコ培養液をブレビバクテリウム及びコリネバクテ
リウムの両方に対して３００ＲＰＭの振儀速度で３０℃
にて１７時間培養した。
Ａ７’（？（’３１７２３） ブレビバクテリウム ラクトファーメ １１．２十〇、
８ンタム（Ａ７’ＣＣｌ３６５５） ブレビバクテリウム アンモニアゲン ６．０±０．４
（ＡＴＣＣ１３１４６） ブレビバクテリウム グルタミン酸 （Ａ７’（：’Ｃ１３７４７） ブレビバクテリウム フラバン １３．３±０．３（Ａ
ＴＣＣ１３８２６） 殺菌した増殖培地を５６ｃｃずつ２５０ ＣＧの目盛付
き振盪フラスコに加えた。各々のフラスコにｌチ容量／
容量を基準として単一種子培養液を接種した。この振盪
フラスコ培養液をブレビバクテリウム及びコリネバクテ
リウムの両方に対して３００ＲＰＭの振儀速度で３０℃
にて１７時間培養した。
フェニルピルビン酸ナトリウム（Ｎα−ＰＰＡ）水溶液
を用いた。この溶液は未精製の５−ベンジリデンヒダン
トインの水酸化ナトリウムの加水分解生成物であった。
を用いた。この溶液は未精製の５−ベンジリデンヒダン
トインの水酸化ナトリウムの加水分解生成物であった。
この５−ペンジリデンヒダントイ７ （ｌｌａｍｓｐｉ
ｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、）の加水分解生成物の
ＡｙＪは次の方法に従った：脱イオン死水２２３３、？
及びＮαＱ Ｈ２２３，３、！ｉ’を容醋３１のステン
レス・スチール製ビーカー中で一緒にし、そして沸点に
加熱１〜だ。沸騰を続けながら、５−ベンジリデンヒダ
ントインを徐々に加えた。１０１〜１０３°Ｃで２時間
沸騰を続けた。この溶液を反応中に眠気混合器で混合し
た。ｌ１Ｉｌｌ嶋後、この混合物を氷水浴中で迅速に冷
却した。この加水分解生成物の最終容−二は１，８１０
−であり、Ｎα−Ｐｌ）Ａ−１ｆ、Ｏ，良度は１６２Ｉ
ｉ／ｌであり、ｐＨ値は１３．５１であり、色は透明な
琥珀色であった。
ｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、）の加水分解生成物の
ＡｙＪは次の方法に従った：脱イオン死水２２３３、？
及びＮαＱ Ｈ２２３，３、！ｉ’を容醋３１のステン
レス・スチール製ビーカー中で一緒にし、そして沸点に
加熱１〜だ。沸騰を続けながら、５−ベンジリデンヒダ
ントインを徐々に加えた。１０１〜１０３°Ｃで２時間
沸騰を続けた。この溶液を反応中に眠気混合器で混合し
た。ｌ１Ｉｌｌ嶋後、この混合物を氷水浴中で迅速に冷
却した。この加水分解生成物の最終容−二は１，８１０
−であり、Ｎα−Ｐｌ）Ａ−１ｆ、Ｏ，良度は１６２Ｉ
ｉ／ｌであり、ｐＨ値は１３．５１であり、色は透明な
琥珀色であった。
このフェニルピルビン酸ナトリウム（加水分群生−２９
＝ 成＊＞の１モル溶液には１．２ Ｍ ＮａＯＨ、０，５
ＡＩ炭酸ナトリウム及び０．５Ｍ尿素が含まれていた。
＝ 成＊＞の１モル溶液には１．２ Ｍ ＮａＯＨ、０，５
ＡＩ炭酸ナトリウム及び０．５Ｍ尿素が含まれていた。
２Ｎ酢酸を用いてこの溶液のｐＨ＋＊を８に調整！〜、
次にミリ−ボアフィルター（０２２μ１ｌｌｔｌ孔径）
を用いて滅菌した。
次にミリ−ボアフィルター（０２２μ１ｌｌｔｌ孔径）
を用いて滅菌した。
別にグルコース溶液（脱イオン化水中で７０ ｔｌｊ酸
／容曖チ）を調製１２、そして１２１℃で１５分間水蒸
気殺菌した。このグルコース溶液を３ニアの容量比で殺
菌したＮα−ＰＰＡ溶液に防腐状態で加えた。培養肉汁
中で１０ ｆ／／ｌのフェニルピルビン酸Ｈａの濃度が
得られるような容睦てこの複合溶液を各々の振盪フラス
コに加えた。
／容曖チ）を調製１２、そして１２１℃で１５分間水蒸
気殺菌した。このグルコース溶液を３ニアの容量比で殺
菌したＮα−ＰＰＡ溶液に防腐状態で加えた。培養肉汁
中で１０ ｆ／／ｌのフェニルピルビン酸Ｈａの濃度が
得られるような容睦てこの複合溶液を各々の振盪フラス
コに加えた。
各々のＷＲ＠フラスコ培養液を更に２３時間、全体で４
０時間の生長期間培養１．た。この時点で肉汁試料を除
去し、そして高速液体クロマトグラフ（ＨｐＬｃ）シス
テムを用いてＬ−フェニルアラニンを測定１７た。ＨＰ
ＬＣに注入する前にダン７３０− ルクロライド（１）ａｎｓｙＬｃｈＬｏｒｉｄｅ ）法
を用いてミリ−ボアフィルター（０，２２μ細孔径）で
ろ過した肉汁試料を誘導体にした。
０時間の生長期間培養１．た。この時点で肉汁試料を除
去し、そして高速液体クロマトグラフ（ＨｐＬｃ）シス
テムを用いてＬ−フェニルアラニンを測定１７た。ＨＰ
ＬＣに注入する前にダン７３０− ルクロライド（１）ａｎｓｙＬｃｈＬｏｒｉｄｅ ）法
を用いてミリ−ボアフィルター（０，２２μ細孔径）で
ろ過した肉汁試料を誘導体にした。
また各々の肉汁試料に対して乾燥細胞重酸を測定１−だ
。各々のフラスコからの肉汁の試料ＩＱｃｅを１０，０
００ＲＰＡｆで３０分間遠心分離１〜だ。湿潤Ｌ＊細胞
ペーストを乾燥器中にて８０℃で２４時間乾ｌ栗し、続
いて真空デシケータ中で１５分間乾・操（〜だ。次に乾
燥細胞を装置した。
。各々のフラスコからの肉汁の試料ＩＱｃｅを１０，０
００ＲＰＡｆで３０分間遠心分離１〜だ。湿潤Ｌ＊細胞
ペーストを乾燥器中にて８０℃で２４時間乾ｌ栗し、続
いて真空デシケータ中で１５分間乾・操（〜だ。次に乾
燥細胞を装置した。
各々の振盪フラスコに対し、２３時間の期間にわたるわ
一フェニルアラニン生成の平均割合を細胞体の乾燥ｉ縫
１ｇ当りで計算した。各々の微生物の菌株について２回
の振盪フラスコに対する試験結果を第１表に示す。
一フェニルアラニン生成の平均割合を細胞体の乾燥ｉ縫
１ｇ当りで計算した。各々の微生物の菌株について２回
の振盪フラスコに対する試験結果を第１表に示す。
３１−
実施例２
次の培養基を調製した：
バクトートリブトン２ １０．０．９
バクトーイースト抽出＊２５．０．！ｉ’ＮａＣ１５，
Ｏｊｉ ＭＯＰＳ緩衝液” ２０．９ 、！ｉ’１−説イオン化
水１７！当り。
Ｏｊｉ ＭＯＰＳ緩衝液” ２０．９ 、！ｉ’１−説イオン化
水１７！当り。
２− Ｄｉｆｃｏから入手。
３−１ｓ１０．Ｐ、Ｓ−モルホリノプロパン−スルホン
酸。
酸。
この成分を一緒にし、そして１２１℃で１５分間殺萌し
だ。この殺菌した培地を５６ｃｃずつ２５０ＣＣの目盛
付きの振盪フラスコに加えた。各々の振盪フラスコに１
％（好酸／容曖）を基準として犬腸萌ＨＢ１０１の培養
液を接種した。
だ。この殺菌した培地を５６ｃｃずつ２５０ＣＣの目盛
付きの振盪フラスコに加えた。各々の振盪フラスコに１
％（好酸／容曖）を基準として犬腸萌ＨＢ１０１の培養
液を接種した。
このフラスコ中の培４ｍを３７℃で８時間、そシア−Ｃ
４ｍ子倍養液として使用するために３０ＯＲＰＭの４）
４マ、酢・ホＩＷで培養しに０この期間の最後での光学
的濃度（６４ｏｎｍ）は２回の振盪フラスコ実験に対し
て６．２７ ＋ｏ、 ０３であった。次にこの種子培４
液を新たな２５０ ｃｃの振鴬フラスコに接種するため
に用い、このものをアルファーケト酸を供給する前に１
７時間培養した。
４ｍ子倍養液として使用するために３０ＯＲＰＭの４）
４マ、酢・ホＩＷで培養しに０この期間の最後での光学
的濃度（６４ｏｎｍ）は２回の振盪フラスコ実験に対し
て６．２７ ＋ｏ、 ０３であった。次にこの種子培４
液を新たな２５０ ｃｃの振鴬フラスコに接種するため
に用い、このものをアルファーケト酸を供給する前に１
７時間培養した。
ｅ ｍ Ｌ ＊フェニルピルビンｔｅｌ Ｎ ａ −ク
ルコース水溶液を実施例１の通り調製ニアた。この溶液
を実施例１と同様に１０ Ｅｌ／ｌの最終的なフェニル
ピルビン酸Ｎａ肉汁が得られるように１７時間の培養ｍ
１間の最終時（光学的端度−１０，３±１．３）に試；
倹用振儒フラスコ培養液に供給した。更に２３時間培養
した後、試別を除去１７、そして乾燥細胞１「量及びＬ
−フェニルアラニン濃縮物を実施例１と同様に４１１１
定した。その結果を第２表に示す。
ルコース水溶液を実施例１の通り調製ニアた。この溶液
を実施例１と同様に１０ Ｅｌ／ｌの最終的なフェニル
ピルビン酸Ｎａ肉汁が得られるように１７時間の培養ｍ
１間の最終時（光学的端度−１０，３±１．３）に試；
倹用振儒フラスコ培養液に供給した。更に２３時間培養
した後、試別を除去１７、そして乾燥細胞１「量及びＬ
−フェニルアラニン濃縮物を実施例１と同様に４１１１
定した。その結果を第２表に示す。
−３５−一
実施例３
次の種子培養基を調製した：
１１ｙｓｏｙ’ ３．０１／
Ｌ−イソロイシン １．０ＩＩ
ＭｇＳＯ４・’ＩＩＩ、ＯＯ，４ｇ
（Ｎｌ１４）、５ｏ４１０． Ｏ＃
に／７． Ｐｏ、３．０ ｇ
微＠：成分” １．Ｑ ｅｃ：
ＣａＣＯ３１５，０１１
ビオチン貯蔵溶液３１．□ ｃａ
チアミン−ＨＣｌ貯蔵溶液’ １．０ ｃｃ脱イオン化
水 ７００．０ｃｃ １−５ｈｅｆｆｉａｌｄ Ｃｏ、から入手２−下記のも
のからなる微量成分貯蔵溶液：Ｚｎ５Ｏ，−ＴＥ０１
Ｂ、 ８１１ ３６一 Ｆｅ 、５０４− ’ｌＨ２Ｏ１０，０９Ｃｕ、５０．
−５Ｈ２００，０１ ＮαｔＢ４０’ｌ・１０Ｈ２００，０８８ｇＨａ２Ｈａ
、０４・２１１．Ｏｏ、（１５３！Ｊｕｎ 、’＞ ０
４ ・Ｅ２０ ？、 ５ ｇＣｏＣｌ、−６Ｈ，００，
１２，９ ＣαＣ’ｌ、 ０．０５５ｇ 脱イオン化水 ９０ Ｑ、００ｒ、ｃ 農Ｈ，ＳＯ，を用いて微量成分貯蔵ｍ液を７）Ｈ２にｒ
Ａ整し、そして脱イオン化水を加えて最終容瞳を１００
０ ｃｃにしだ。
水 ７００．０ｃｃ １−５ｈｅｆｆｉａｌｄ Ｃｏ、から入手２−下記のも
のからなる微量成分貯蔵溶液：Ｚｎ５Ｏ，−ＴＥ０１
Ｂ、 ８１１ ３６一 Ｆｅ 、５０４− ’ｌＨ２Ｏ１０，０９Ｃｕ、５０．
−５Ｈ２００，０１ ＮαｔＢ４０’ｌ・１０Ｈ２００，０８８ｇＨａ２Ｈａ
、０４・２１１．Ｏｏ、（１５３！Ｊｕｎ 、’＞ ０
４ ・Ｅ２０ ？、 ５ ｇＣｏＣｌ、−６Ｈ，００，
１２，９ ＣαＣ’ｌ、 ０．０５５ｇ 脱イオン化水 ９０ Ｑ、００ｒ、ｃ 農Ｈ，ＳＯ，を用いて微量成分貯蔵ｍ液を７）Ｈ２にｒ
Ａ整し、そして脱イオン化水を加えて最終容瞳を１００
０ ｃｃにしだ。
３−説イオン化水ｌＪ当り１００■のｄ−ビオチン。
４−説イオン化水ｌｌ当り１．０ｇのチアミン−ＣＩＱ
ＢＮＮａＯＨを用いて上記の培地をｐ ＩＩ ７．５に
調整し、そして脱イオン化水を加ぐ−て容歇を９００ｃ
ｃにした。この培地を１２１℃で１５分間水蒸気、役１
者１．た。別にグルコースの貯蔵溶＊（５０９／１００
ｃ、ｃ脱イオン化水）を１２１℃で１５分間水蒸気殺
菌した。冷却後、この殺菌したグルコース１番液金防）
１冨キに態でＲ菌した培地に那えて岐路の培地容鎗を１
０００ｃｃにした。５Ｎ氷酢酸でｐＨ値を７に調整した
。
調整し、そして脱イオン化水を加ぐ−て容歇を９００ｃ
ｃにした。この培地を１２１℃で１５分間水蒸気、役１
者１．た。別にグルコースの貯蔵溶＊（５０９／１００
ｃ、ｃ脱イオン化水）を１２１℃で１５分間水蒸気殺
菌した。冷却後、この殺菌したグルコース１番液金防）
１冨キに態でＲ菌した培地に那えて岐路の培地容鎗を１
０００ｃｃにした。５Ｎ氷酢酸でｐＨ値を７に調整した
。
、１子培養基を５０Ｑｅずつ各々２つの２５０８Ｃの目
盛付き振盪フラスコに加えた。このフラスコにプレビバ
クテリウムテオゲニタリスＡＴＣＣ＆３１７２３全接種
し、そして振盪しながら（３００Ｒｐ Ａｔ振盪速度）
３０°Ｃで８時間培養して種子培養液を生成した。８時
間の培養の最終時の光学的濃度（６４ｏｎｍ）は約１０
．０であった。
盛付き振盪フラスコに加えた。このフラスコにプレビバ
クテリウムテオゲニタリスＡＴＣＣ＆３１７２３全接種
し、そして振盪しながら（３００Ｒｐ Ａｔ振盪速度）
３０°Ｃで８時間培養して種子培養液を生成した。８時
間の培養の最終時の光学的濃度（６４ｏｎｍ）は約１０
．０であった。
（Ｎｌｌ、）、５０４ｓ Ｏ、！ｉ＋を用いる以外は種
子培地と同様の方法で増殖培地を調製した。増殖培地５
０ＣＣずつを２つの２５０ ｃｃの目盛付き振盪フラス
コに分配した。次にこの各々のフラスコに種子培養液の
１つからの試料２．５ｃｃを接種した。接種後、この振
盪フラスコを振盪１７ながら（３００ＲＰＭ）３０℃で
３３時間培養した。
子培地と同様の方法で増殖培地を調製した。増殖培地５
０ＣＣずつを２つの２５０ ｃｃの目盛付き振盪フラス
コに分配した。次にこの各々のフラスコに種子培養液の
１つからの試料２．５ｃｃを接種した。接種後、この振
盪フラスコを振盪１７ながら（３００ＲＰＭ）３０℃で
３３時間培養した。
実施例１と同様に殺菌したグルコース溶液（脱イオン化
水中７０重量／容ｔ％）を調製した。アルファーケトイ
ソカプロン酸の未精製の１７．５％（重量７重り溶液（
比重−１，１２５１／ ｃｃ 。
水中７０重量／容ｔ％）を調製した。アルファーケトイ
ソカプロン酸の未精製の１７．５％（重量７重り溶液（
比重−１，１２５１／ ｃｃ 。
ｐＨ−１３，５）を用いた。この溶液は沸騰前に水及び
ＮａＯＨ中に１５チの溶液を生成させるに十分な訃のイ
ソブチリデンヒダントインを用いる実施例１に記載され
る方法により調製されるイソブチリデンヒダントインの
水酸化ナトリウム加水分解生成物であった。アルファー
ケトイソカプロン酸Ｎαの溶液（加水分解生成物）１モ
ルには約１、２ Ｍ ＮａＯＨ，０，５Ｍ炭酸ナトリウ
ム及び０．５Ｍ尿素が含まれていた。濃厚氷酢酸溶液を
用いてこ３９− のアルファーケトイソカプロン酸Ｎα溶液をｐ ＩＩ７
に調整し、そして１２１°Ｃで１５分間水蒸気殺 ・菌
（７た。尋容瞼の殺菌したグルコース溶液及び殺菌した
アルファーケトイソカプロン酸Ｎα溶液を防腐状態で混
合し、そして氷酢酸を用いてｐ １１値を７に再調整し
た。
ＮａＯＨ中に１５チの溶液を生成させるに十分な訃のイ
ソブチリデンヒダントインを用いる実施例１に記載され
る方法により調製されるイソブチリデンヒダントインの
水酸化ナトリウム加水分解生成物であった。アルファー
ケトイソカプロン酸Ｎαの溶液（加水分解生成物）１モ
ルには約１、２ Ｍ ＮａＯＨ，０，５Ｍ炭酸ナトリウ
ム及び０．５Ｍ尿素が含まれていた。濃厚氷酢酸溶液を
用いてこ３９− のアルファーケトイソカプロン酸Ｎα溶液をｐ ＩＩ７
に調整し、そして１２１°Ｃで１５分間水蒸気殺 ・菌
（７た。尋容瞼の殺菌したグルコース溶液及び殺菌した
アルファーケトイソカプロン酸Ｎα溶液を防腐状態で混
合し、そして氷酢酸を用いてｐ １１値を７に再調整し
た。
この−緒にｌ〜た容置の溶液を最終的なアルファーケト
イソカプロン酸の肉汁濃度が第３表に示される値になる
ように振盪フラスコ培養液に加えた。
イソカプロン酸の肉汁濃度が第３表に示される値になる
ように振盪フラスコ培養液に加えた。
この培養液を更に６２時間培養した。この培養朋間後に
試料を取り出し、ミリ−ボアフィルター（０，２２μ細
孔径）でろ過して細胞を除去し、そして実施例１に記載
した通り高速液体クロマトグラフ（ｎ ｐ Ｌ Ｃ）測
定法を用いてＬ−ロイシンを分析した。その結果を第３
表に示す。
試料を取り出し、ミリ−ボアフィルター（０，２２μ細
孔径）でろ過して細胞を除去し、そして実施例１に記載
した通り高速液体クロマトグラフ（ｎ ｐ Ｌ Ｃ）測
定法を用いてＬ−ロイシンを分析した。その結果を第３
表に示す。
−４〇−
実施例４
アルファーケトイソ吉草酸をＬ−バリンに生物的に転移
する目的でプレビバクテリウムチ、オゲニタリスＡＴＣ
Ｃ＆３１’１２３を培養するために実施例３の種子培養
基及び増殖培地を用いた。この菌株を用い、実施例３に
記載された方法により種子培養液及び試験）ｆｌ振盪フ
ラスコ培養液をｔ周製した。
する目的でプレビバクテリウムチ、オゲニタリスＡＴＣ
Ｃ＆３１’１２３を培養するために実施例３の種子培養
基及び増殖培地を用いた。この菌株を用い、実施例３に
記載された方法により種子培養液及び試験）ｆｌ振盪フ
ラスコ培養液をｔ周製した。
アルファーケトイソ青草１ｆｌＮａ溶液の未精製の４．
５３チ（重−：／電縫）水溶液を用いた。この溶液は沸
騰前に水及びＮａＯｆｌ中の約６係廖液を生成するに十
分な鎗のイソプロピリデンヒダントインを用いて実施例
１に記載された方法により調製されたイソプロピリデン
ヒダントインの水酸化ナトリウム加水分解生成物であっ
た。アルファーケトイソ吉草酸Ｎａの１モルの溶液には
約１．２ＭＮａ０１１ 、 ０．５ Ｍ炭酸ナトリウム
及び０．５ Ｍ尿素が含まれていた。氷酢酸を用いて１
３．８の４液ｐＨ値を７．０に調整した。この溶液を１
２１’Ｃで１５分間水蒸気殺菌した。
５３チ（重−：／電縫）水溶液を用いた。この溶液は沸
騰前に水及びＮａＯｆｌ中の約６係廖液を生成するに十
分な鎗のイソプロピリデンヒダントインを用いて実施例
１に記載された方法により調製されたイソプロピリデン
ヒダントインの水酸化ナトリウム加水分解生成物であっ
た。アルファーケトイソ吉草酸Ｎａの１モルの溶液には
約１．２ＭＮａ０１１ 、 ０．５ Ｍ炭酸ナトリウム
及び０．５ Ｍ尿素が含まれていた。氷酢酸を用いて１
３．８の４液ｐＨ値を７．０に調整した。この溶液を１
２１’Ｃで１５分間水蒸気殺菌した。
別にグルコース溶液（脱イオン化水中で７０′市量／容
量係）を調製１２、そして１２１’Ｃで１５分間水蒸気
殺菌した。この殺１岩したアルファーケトイソ吉草酸溶
液７０部を殺菌１．たグルコース溶液３０部に防腐状態
で加えた。この容−！−の混合物をアルファーケトイソ
吉草酸Ｎαの岐路的な肉汁濃度が第４表に示すように１
０まだは１５１１／ｌのいずれかになるように種々の増
殖の段階で試験用振盪フラスコ培養液に加えた。各々の
試験用振盪フラスコ培養液に対する全体の培養期間は４
０時間でめった。この時点で、試料を引き出し、ミリ−
ボアフィルター（０，２２μ細孔径）でろ過し、そして
実施例１と同様にＨｐＬＣ測定法を用いてＬ−バリンを
分析した。
量係）を調製１２、そして１２１’Ｃで１５分間水蒸気
殺菌した。この殺１岩したアルファーケトイソ吉草酸溶
液７０部を殺菌１．たグルコース溶液３０部に防腐状態
で加えた。この容−！−の混合物をアルファーケトイソ
吉草酸Ｎαの岐路的な肉汁濃度が第４表に示すように１
０まだは１５１１／ｌのいずれかになるように種々の増
殖の段階で試験用振盪フラスコ培養液に加えた。各々の
試験用振盪フラスコ培養液に対する全体の培養期間は４
０時間でめった。この時点で、試料を引き出し、ミリ−
ボアフィルター（０，２２μ細孔径）でろ過し、そして
実施例１と同様にＨｐＬＣ測定法を用いてＬ−バリンを
分析した。
４３−
同様の微生物及び方法を用いる対照実験において、アル
ファーケトイソ吉曜岐Ｎａを発酵から除外した。この対
照はグルコースから平均してｏ、。
ファーケトイソ吉曜岐Ｎａを発酵から除外した。この対
照はグルコースから平均してｏ、。
２０５Ａ（（２，４１／ｌ）のＬ−バリンを・生成した
。
。
このことは第４表に示す試）倹結果中では説明されてい
ない。
ない。
４４−
実施例５
この実施例はＫ ＯＩＩ ５−ベンジリデンヒダントイ
ン加水分解生成物（フェニルピルビン酸Ｋ）を供給する
場合と、純度９８チのフェニルピルビン＠ Ａ’ ａを
供給する揚重のプレビバクテリウムチオゲニタリスＡＴ
ＣＣＡ３１７２３の生物的転移効率を比較するものであ
る。アルファーケト酸癖液は次のように調製した： フェニルピルビン酸に一実施例１の通り５−ペンジリデ
ンヒタントイ７ （Ｉｌａｍｐａｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ製）１モル当り３ＭのＫＯＨから未精製の５−ベ
ンジリデンヒダントインのＫＯＨ加水分解生成物を調製
［また。振盪フラスコに供給する前にＣＯ２ガスを用い
てこの加水分解生成物のｐＨ値を８０ｖｃ−ｌｉ！ｉｌ
整した。
ン加水分解生成物（フェニルピルビン酸Ｋ）を供給する
場合と、純度９８チのフェニルピルビン＠ Ａ’ ａを
供給する揚重のプレビバクテリウムチオゲニタリスＡＴ
ＣＣＡ３１７２３の生物的転移効率を比較するものであ
る。アルファーケト酸癖液は次のように調製した： フェニルピルビン酸に一実施例１の通り５−ペンジリデ
ンヒタントイ７ （Ｉｌａｍｐａｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ製）１モル当り３ＭのＫＯＨから未精製の５−ベ
ンジリデンヒダントインのＫＯＨ加水分解生成物を調製
［また。振盪フラスコに供給する前にＣＯ２ガスを用い
てこの加水分解生成物のｐＨ値を８０ｖｃ−ｌｉ！ｉｌ
整した。
フエニ／ｌ／ ｔ：？ Ａ／−（ｄ東■土−固体のフェ
ニルピルビｙ ）９ Ｎ ａ−水和物（９８％ ） （
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏ、肩）を９８
Ｆｌ／ｌの慣度になるように〔フェニルピルビンａＮα
−水和’Ｊｆｌｌ）（Ｎα・ＰＰａ・ｌＩ２０）として
〕水性の０．６ＭＫＯＨに溶解さ【ｔだ。振盪フラスコ
に供給する前にＣＯ２ガスを用いてｐ Ｉｆ値を８，０
にＡ整した。
ニルピルビｙ ）９ Ｎ ａ−水和物（９８％ ） （
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏ、肩）を９８
Ｆｌ／ｌの慣度になるように〔フェニルピルビンａＮα
−水和’Ｊｆｌｌ）（Ｎα・ＰＰａ・ｌＩ２０）として
〕水性の０．６ＭＫＯＨに溶解さ【ｔだ。振盪フラスコ
に供給する前にＣＯ２ガスを用いてｐ Ｉｆ値を８，０
にＡ整した。
ＭＯＰＳ媛衝液を２０９７１ ＣαＣＯ３に変え、そし
てグルコース＋他の培地成分を１１０℃で１０分間オー
トクレーブ中で一緒に加熱（別々に水蒸気殺菌する代り
に）する以外は実施例１に記載した通りに種子及び増殖
培地を調製した。プレピバクテリウムチオゲニタリスＡ
ＴＣＣ１ａ３１７２３を用いて実施例１と同様に種子培
養液を調製した。
てグルコース＋他の培地成分を１１０℃で１０分間オー
トクレーブ中で一緒に加熱（別々に水蒸気殺菌する代り
に）する以外は実施例１に記載した通りに種子及び増殖
培地を調製した。プレピバクテリウムチオゲニタリスＡ
ＴＣＣ１ａ３１７２３を用いて実施例１と同様に種子培
養液を調製した。
実施例１に記載した通り振盪フラスコに接種するために
種子培養液を用いた。最初の１７時間の培養期間後、最
終的なフェニルピルベートの４養肉汁濃度が７６．２２
ｍＭ （フェニルピルビン酸トして１λｓｔ、９／／）
になるような量でフェニル４７− ピルビン酸溶液を別の振盪フラスコに加えた。この振盪
フラスコを培養し、そしてモル収率を２３時間（全体で
４０時間培養）及び２８時間（全体で４５時間培養）で
測定した。実施例１と同様にＨＰＬＣ測定を行った。第
５表に示す結果から未ｆ＃Ｍの先駆体を拳法に用いる場
合、フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンに生物
転移するプレビバクテリウムチオゲニタリスＡＴＣＣ＆
３１７２３の活性は十分に発現されないことが示されて
いる。
種子培養液を用いた。最初の１７時間の培養期間後、最
終的なフェニルピルベートの４養肉汁濃度が７６．２２
ｍＭ （フェニルピルビン酸トして１λｓｔ、９／／）
になるような量でフェニル４７− ピルビン酸溶液を別の振盪フラスコに加えた。この振盪
フラスコを培養し、そしてモル収率を２３時間（全体で
４０時間培養）及び２８時間（全体で４５時間培養）で
測定した。実施例１と同様にＨＰＬＣ測定を行った。第
５表に示す結果から未ｆ＃Ｍの先駆体を拳法に用いる場
合、フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンに生物
転移するプレビバクテリウムチオゲニタリスＡＴＣＣ＆
３１７２３の活性は十分に発現されないことが示されて
いる。
４８−
実施例６
５−ベンジリデンヒダントインの水酸化ナトリウム加水
分解生成物からの沈殿により梢映したフェニルピルビン
酸ナトリウム（Ｎａ−Ｊ’ｐＡ）を用いてこの実施例を
行った。実施例１の方法に従ってとの加水分解生成物を
調製した。
分解生成物からの沈殿により梢映したフェニルピルビン
酸ナトリウム（Ｎａ−Ｊ’ｐＡ）を用いてこの実施例を
行った。実施例１の方法に従ってとの加水分解生成物を
調製した。
次に酢酸沈殿物を加水分解生成物から調製した。
容置１．５００ ＋ｎｌの加水分解生成物を氷水浴中の
容ｉｔ ２０ ｏ ｏ ｃｃのガラス製ビーカーに入れ
た。ｐＨ値を９に低下させるために攪拌しながら氷酢酸
（＃＋ｆｓ ９．７４．ｔ ７．４Ｍ）を徐々に加えた
。温度は３０℃以上に一ト昇させ女かっだ。約ｐ７７１
２．９５で沈殿が生じ始め；１５分後にｐＨ値は９に達
した。
容ｉｔ ２０ ｏ ｏ ｃｃのガラス製ビーカーに入れ
た。ｐＨ値を９に低下させるために攪拌しながら氷酢酸
（＃＋ｆｓ ９．７４．ｔ ７．４Ｍ）を徐々に加えた
。温度は３０℃以上に一ト昇させ女かっだ。約ｐ７７１
２．９５で沈殿が生じ始め；１５分後にｐＨ値は９に達
した。
この混合物をカバーをし、そしてフード下で２３℃で１
時間静＋ｔ＋、た。このスラリーを洗浄せずに＋４ Ｗ
ｈａｔｔｎａｎ紙を通１〜てろ過した。湿潤し７た沈−
に ０− 殿を５０℃で１８時間真空乾燥器中に置いた。乾燥した
沈殿を＋４０メツシユのふるいにかケフζ。
時間静＋ｔ＋、た。このスラリーを洗浄せずに＋４ Ｗ
ｈａｔｔｎａｎ紙を通１〜てろ過した。湿潤し７た沈−
に ０− 殿を５０℃で１８時間真空乾燥器中に置いた。乾燥した
沈殿を＋４０メツシユのふるいにかケフζ。
最終生成物は純度７９チのＮａ −ＰＪ’Ａ−Ｈ２Ｏで
あり、他の成分として酢酸塩、Ｎａ十及び少艙のｃ’
ＯＳ −並びに有機性窒素を言んでいた。
あり、他の成分として酢酸塩、Ｎａ十及び少艙のｃ’
ＯＳ −並びに有機性窒素を言んでいた。
実施例５に記載した通りに４″１１子及び増殖Ｊ４’ｆ
養基を１４製した。実！ｒｉＩｉ例５と同様にプレビパ
クテリウムチオゲニタリスＡＴＣＣ５３１７２ａを種子
培地上で培養した。このｉ子培髪液は２５０ｃｃのｊｊ
ｆｆ盪フラスコに接種するために用いた。
養基を１４製した。実！ｒｉＩｉ例５と同様にプレビパ
クテリウムチオゲニタリスＡＴＣＣ５３１７２ａを種子
培地上で培養した。このｉ子培髪液は２５０ｃｃのｊｊ
ｆｆ盪フラスコに接種するために用いた。
最初の１８時間の増＋１ｑ期＋ｔＪ］ ｒｌ： 、沈殿
したＮａ−ｐｐＡ−Ｂ、０を０．３ＭＫＯＨに再溶解さ
せ（Ｎａ−ＰＰＡ−Ｈ，０としてｘｏＯ，９／Ａｔ）、
第６表に示す最終的な肉汁濃度が得られるように＋ｊｔ
４フラスコに加えた。この培養液を更に２３時間培養し
た。実施例１に記載するようにＬ−フェニルアラニンに
対してＨｐＬＣ測定を行なった。その結束−５１− を′−■６表に示す。振盪フラスコからの液体の蒸発損
失を０１１１定しなかったので、この結果は概略的なも
ので、ｂる。
したＮａ−ｐｐＡ−Ｂ、０を０．３ＭＫＯＨに再溶解さ
せ（Ｎａ−ＰＰＡ−Ｈ，０としてｘｏＯ，９／Ａｔ）、
第６表に示す最終的な肉汁濃度が得られるように＋ｊｔ
４フラスコに加えた。この培養液を更に２３時間培養し
た。実施例１に記載するようにＬ−フェニルアラニンに
対してＨｐＬＣ測定を行なった。その結束−５１− を′−■６表に示す。振盪フラスコからの液体の蒸発損
失を０１１１定しなかったので、この結果は概略的なも
ので、ｂる。
＼、
第６表
試険Ａ’ Ｎα−ＰＰＡ−１１２０” Ｌ−フェニルア
ラニン８１ ０ ０ ２ １．７＋（±、１２ ｔ、ｓ±、０９３ ３０６±
０ ３６９±、０２ ４ ３．３ ＋−、１１８３，５７± 、 １９５ ５
．７１±０ ６．３２±、１９ ６ ５．７５±、３６ ６．１８±、１１７ ６．８０
−１７．０５ ６．０５±、０５８ ８１６±、４４
７．４．１．０ ９ ９．１３±、３６ ６．９９士、１４１０ ９．４
５ｙ−ｔ＝Ｏｓ、ａ ５土、１５１１ ９．４９土Ｑ
７．８２±、１２１２ １２．９１七、０４ １０．０
５±、９５３２３峙＋ｌＪｉ中に生成したＬ−フェニル
アラニンの濃度（ｇ／ｅ２３時面での踊り１（Ｘ モル
収率４ ３４−１＝４−一 ４１−１２ １００ ４０士２ １００ ２４１．１ １００ ２７±１ １００ ２３土Ｏ１００ ４３，４，２８８ ４３１、＋１ ９０ ２７ ｊｉ： ０ ７６ ３６士７ ８８ ２４±１ ８２ １３７士５ ７８ ）。
ラニン８１ ０ ０ ２ １．７＋（±、１２ ｔ、ｓ±、０９３ ３０６±
０ ３６９±、０２ ４ ３．３ ＋−、１１８３，５７± 、 １９５ ５
．７１±０ ６．３２±、１９ ６ ５．７５±、３６ ６．１８±、１１７ ６．８０
−１７．０５ ６．０５±、０５８ ８１６±、４４
７．４．１．０ ９ ９．１３±、３６ ６．９９士、１４１０ ９．４
５ｙ−ｔ＝Ｏｓ、ａ ５土、１５１１ ９．４９土Ｑ
７．８２±、１２１２ １２．９１七、０４ １０．０
５±、９５３２３峙＋ｌＪｉ中に生成したＬ−フェニル
アラニンの濃度（ｇ／ｅ２３時面での踊り１（Ｘ モル
収率４ ３４−１＝４−一 ４１−１２ １００ ４０士２ １００ ２４１．１ １００ ２７±１ １００ ２３土Ｏ１００ ４３，４，２８８ ４３１、＋１ ９０ ２７ ｊｉ： ０ ７６ ３６士７ ８８ ２４±１ ８２ １３７士５ ７８ ）。
５３一
本発明の操作の原理、好適な具体例及び方文金以りの明
細与に述べた。しかしながら、不明ｉ＋＋１ ｉ！ｔで
保護される発明は開示された特定の形式に対（−７て限
定するものとして解釈してはならず、その叩出はこれら
のものは制限するものではなく、謄１明のだめのもので
あるからである。本光明の１８神から１？Ｉれずに種々
の方法文び変法が当１亥分野にパｄ、市せるものにより
なされることがで〜る。
細与に述べた。しかしながら、不明ｉ＋＋１ ｉ！ｔで
保護される発明は開示された特定の形式に対（−７て限
定するものとして解釈してはならず、その叩出はこれら
のものは制限するものではなく、謄１明のだめのもので
あるからである。本光明の１８神から１？Ｉれずに種々
の方法文び変法が当１亥分野にパｄ、市せるものにより
なされることがで〜る。
特許出願人 ダブリュー・アール・ブレイス・アンド・
カンパニー ５３３−
カンパニー ５３３−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｔ （ａ） アルファーケト酸を対応するＬ−アミノ酸
に転換し得る微生物を選択し、 （ｂ） 該微生物を栄養培地中で培養し、（Ｃ） 所望
のアルファーケト酸を対数的に増殖する微生物に対して
供給し、そして （の 増殖する微生物により該アルファーケト酸を対応
するＬ−アミノ酸に転換させることからなるＬ−アミノ
酸の製造方法。 ２、該微生物が単一のバクテリア菌株から実質的になる
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該微生物がグルタミン酸分泌バクテリア及び大腸菌
よりなる群から選らばれる特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ４、該グルタミン酸生成分泌バクテリアがブレビバクテ
リウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） ４１１＋
及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂｔｔｃｔｅｒ
ｉｕｍ ） １ｔｆよりなる群から選らばルる特許請求
の範囲第３項記載の方法。 ｓ、Ｌ−アミノ酸を培養培地から回収する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ６ 工程（ｂ）の増殖期間が約６〜約４０時間であり、
そして工程（ｄ）の増殖期［−が約２０〜約７２時間で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、工程ｆＣ）の該アルファーケト酸が培養肉汁中にて
約０５チ（重量／容量）〜約５０チ（重管／容量）の量
で存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、該アルファーケト酸が水溶液中に存在する特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ９、該水溶液の濃度が約１０チ（重量／容量）〜約２０
チ（電縫／容量）である特許請求の範囲第８項記載の方
法。 １０、該アルファーケト酸がフェニルピルビン酸、アル
・ファーケトインカプロン酸、アルファーケトイソ吉草
酸、ピルビン酸、オキザロ酢酸、β−ヒドロギシーアル
ファーク”ト酪酸、ｐ−オキシフェニルピルビン酸、イ
ノドールピルビン酸及びアルファーケト−β−メチル吉
修酸よりなる群がら慮らばれる特許請求の範囲８１項記
載の方法。 ＋ｔ、（ａ） アルファーケト酸をその対応するＬ−ア
ミノ酸に転換１．得る対数的に増殖する微生物の培養液
（ｃｒｂｌｔ、ｗｒｅ ）を、栄養培地の存在ｆで、所
望のアルファーケト酸と接触させ、そして（ｂ） 増殖
する該培養液の共役！７た酵素系によりアルファーケト
酸をＬ−アミノ酸アミノ粘転換反応に誘導する、ことか
らなる、対数的に増殖トるバクテリア培養液の共役した
酵素系τ用いるアルファーケト酸のその対応するＬ −
ｒミノ酸への生物学的アミノ基転換方法。 １２、該アミノ基転換反応のＬ−アミノ酸生成物を培地
から回収する特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、微生物がグルタミン酸生成分泌バクテリア及び大
腸菌よりなる群から選らばれる特許請求の範囲第１１項
記載の方法。 １４、該グルタミン酸生成バクテリアがブレビバクテリ
ウム種及びコリネバクテリウム種よりなる群から選らば
れる特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、アルファーケト酸がフェニルピルビン酸、アルフ
ァーケトイソカプロン酸、アルファーケトイソ吉草酸、
ピルビン酸、オキザロ酢酸、β−ヒドロキシ−アルファ
ーケト酪酸、ｐ−オキシフェニルピルビン酸、インドー
ルピルビン酸及びアルファーケト−β−メチル吉草酸よ
りなる群から選らばれる特許請求の範囲第１１項記載の
方法。 １６ アルファーケト酸が水溶液中に存在する特許請求
の範囲第１５項記載の方法。 １７、該水溶液の濃度が約１．０チ〜約２０チである特
許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、対数的に増殖する該培養液を約２０〜約７２時間
の期間、該アルファーケト酸と接触させる特許請求の範
囲第１１項記載の方法。 １９、（（２） 先駆体アルファーケト酸を所望のＬ−
アミノ酸に転換し７得る微生物を栄養培地中で培養し、 （ｂ）この培養液を、活性的に、対数的に増殖する相と
し、 ＋Ｃ）対数的に増殖する培養液を該先駆体アルファーケ
１１と接触させ、そして ５− （の 増殖する該培養液により、アルファーケト酸を対
応するＬ−アミノ酸に転換する ことによって製造されたＬ−アミノ岐。 ２０、培養基から回収された特許請求の範囲第１９項記
載のＬ−アミノ酸。 ２１、フェニルピルビン酸、アルファーケトイソカプロ
ン酸、アル７アーケトイン吉草酸、ピルビン酸、オキザ
ロ酢酸、β−ヒドロキシ−アルファーケト酪酸、ｐ−オ
キ７フエニルビルビン酸、インドールピルビン酸及びア
ルファーケト−β−メチル吉草酸よりなる群から選らば
れる先１１ハ体アルファーケト酸から製造される特許請
求の範囲第１９項記載のＬ−アミノ酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52063283A | 1983-08-05 | 1983-08-05 | |
| US520632 | 1983-08-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6043390A true JPS6043390A (ja) | 1985-03-07 |
Family
ID=24073432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59120869A Pending JPS6043390A (ja) | 1983-08-05 | 1984-06-14 | アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6043390A (ja) |
| AU (1) | AU3040784A (ja) |
| DE (1) | DE3427495A1 (ja) |
| FR (1) | FR2550801A1 (ja) |
| GB (1) | GB2147579A (ja) |
| IT (1) | IT1176404B (ja) |
| NL (1) | NL8401049A (ja) |
| SE (1) | SE8403933L (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236196A (ja) * | 1985-04-15 | 1987-02-17 | Ajinomoto Co Inc | アラニンの製造法 |
| JPS6261594A (ja) * | 1985-09-11 | 1987-03-18 | Kuraray Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| JPS62205790A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Daicel Chem Ind Ltd | Ｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JPH01305589A (ja) * | 1988-06-03 | 1989-12-08 | Hitachi Ltd | 電極配線加工法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3423936A1 (de) * | 1984-06-29 | 1986-01-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin |
| JPS62151191A (ja) * | 1985-09-09 | 1987-07-06 | Kuraray Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製法 |
| DE3533198A1 (de) * | 1985-09-18 | 1987-03-19 | Kernforschungsanlage Juelich | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketocarbonsaeuren |
| DE3613952A1 (de) * | 1986-04-24 | 1987-10-29 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren durch transaminierung |
| DE3614586A1 (de) * | 1986-05-02 | 1987-11-05 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketocarbonsaeuren |
| DE3721838A1 (de) * | 1987-07-02 | 1989-01-12 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin aus benzylidenhydantoin |
| CA2008702A1 (en) * | 1989-02-27 | 1990-08-27 | Ronald L. Hanson | Process for transformation of hydroxyketo acids to hydroxyamino acids |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB842679A (en) * | 1957-06-27 | 1960-07-27 | Int Minerals & Chem Corp | Process for producing l-glutamic acid |
| GB903312A (en) * | 1959-03-17 | 1962-08-15 | Ajinomoto Kk | Improvements in or relating to the production of l-tryptophan |
| US3183170A (en) * | 1961-10-03 | 1965-05-11 | Sanraku Ocean Kabushiki Kaisha | Method of l-amino acid manufacture |
| US3502544A (en) * | 1966-10-31 | 1970-03-24 | Noda Inst For Scientific Res | Process for producing l-isoleucine by fermentation |
| JPS5146836B1 (ja) * | 1968-03-09 | 1976-12-11 | ||
| CH537904A (de) * | 1969-08-16 | 1973-06-15 | Sankyo Co | Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalaninderivaten |
| GB2084155B (en) * | 1980-09-17 | 1984-01-11 | Grace W R & Co | Process for production of l-amino acids using immobilized microorganisms |
| NL8401255A (nl) * | 1983-08-05 | 1985-03-01 | Grace W R & Co | Werkwijze voor de biologische bereiding van l-aminozuren. |
-
1984
- 1984-04-03 NL NL8401049A patent/NL8401049A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-06-14 JP JP59120869A patent/JPS6043390A/ja active Pending
- 1984-07-09 AU AU30407/84A patent/AU3040784A/en not_active Abandoned
- 1984-07-17 IT IT21921/84A patent/IT1176404B/it active
- 1984-07-26 DE DE19843427495 patent/DE3427495A1/de not_active Withdrawn
- 1984-07-27 GB GB08419142A patent/GB2147579A/en not_active Withdrawn
- 1984-07-31 SE SE8403933A patent/SE8403933L/ not_active Application Discontinuation
- 1984-08-03 FR FR8412354A patent/FR2550801A1/fr active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236196A (ja) * | 1985-04-15 | 1987-02-17 | Ajinomoto Co Inc | アラニンの製造法 |
| JPS6261594A (ja) * | 1985-09-11 | 1987-03-18 | Kuraray Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| JPS62205790A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Daicel Chem Ind Ltd | Ｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JPH01305589A (ja) * | 1988-06-03 | 1989-12-08 | Hitachi Ltd | 電極配線加工法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL8401049A (nl) | 1985-03-01 |
| GB2147579A (en) | 1985-05-15 |
| SE8403933D0 (sv) | 1984-07-31 |
| DE3427495A1 (de) | 1985-02-14 |
| SE8403933L (sv) | 1985-02-06 |
| AU3040784A (en) | 1985-02-07 |
| IT8421921A0 (it) | 1984-07-17 |
| GB8419142D0 (en) | 1984-08-30 |
| FR2550801A1 (fr) | 1985-02-22 |
| IT8421921A1 (it) | 1986-01-17 |
| IT1176404B (it) | 1987-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6043390A (ja) | アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を製造する方法 | |
| JPS6041596B2 (ja) | ２，５−ジケト−ｄ−グルコン酸の製造方法 | |
| DE3688864T2 (de) | L-Phenylalanindehydrogenase und deren Verwendung. | |
| DE3307095A1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung | |
| US4104124A (en) | Process for the production of single cell protein and amino acids | |
| EP0737246A1 (fr) | SOUCHES BACTERIENNES DU GENRE $i(BACILLUS), PHENOTYPIQUEMENT PROCHES DU GENRE $i(LACTOBACILLUS), PROCEDE DE CULTURE ET APPLICATIONS | |
| CN110387387A (zh) | 一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺 | |
| JPS6043391A (ja) | アルフア−ケト酸からｌ−アミノ酸を生物学的に製造する方法 | |
| CA2362926A1 (en) | Method for producing l-sorbose | |
| JPH0376591A (ja) | Ｌ―カルニチンの微生物学的方法による断続的製造方法 | |
| US4278766A (en) | Mutant microorganisms useful for the production of single cell protein and amino acids | |
| JPS62289192A (ja) | アミノ酸の連続発酵生産方法 | |
| JPS608113B2 (ja) | 微生物菌体の製造法 | |
| JPH03236786A (ja) | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 | |
| JPS5829078B2 (ja) | 補酵素ｑ↓１↓０の製造法 | |
| JPH0716428B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸の製造法 | |
| SU1124034A1 (ru) | Штамм @ @ @ -5-продуцент @ -лизина | |
| JP3129773B2 (ja) | Ｄ−リボースの製造法 | |
| JPH04330291A (ja) | 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 | |
| JPS5816692A (ja) | 酵素によるｌ−トリプトフアンの製造方法 | |
| JPS5939296A (ja) | 微生物を利用するｌ−トリプトフアンの製造法 | |
| JPS5857155B2 (ja) | 発酵法によるコエンチ−ムｑ↓１↓０の製造法 | |
| JPS60256393A (ja) | 分枝鎖脂肪又は芳香族ｌ‐アミノ酸の発酵的製法 | |
| JPS62296895A (ja) | Ｄ，Ｌ−α−ヒドロキシブチレ−トからのＬ−イソロイシンの製造法、およびコリネバクテリウム・グルタミクムの突然変異体 | |
| FR2611743A1 (fr) | Procede pour la production de l-aminoacides ou d'acide 5'-inosinique par fermentation |