JPS6047674A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミクロコツカス属に属する新規な微生物に関す
る。

従来、脂肪酸のω−末端のみを選択的に酪化することは
工業的には困難とされてきた。例えは、ラクトン系ムス
ク（じゃ香合成香料）の主成分であるヘキサデカノライ
ドの製造にはω−ヒドロキシパルミチン酸が使用される
が、ムスクか高価であるのは、この前駆体たるω−ヒド
ロキシパルミチン酸の製造が困難なことに起因する。即
ち、バルミチン酸のω−末端を選択的に酸化してω−ヒ
ドロキシパルミチン酸とすることは、合成化学上困難で
ある。

一方、微生物にノルマルパラフィンを資化すせてジカル
ボン酸を製造する際に副産物としてω−ヒドロキシ高級
脂肪酸も得られ−ることが報告されている（例えば特公
昭４８−２６２３８号）このようにω−ヒドロキシ高級
脂肪酸はノルマルパラフィンのアルカン資化性菌による
ジカルボン酸への代謝中間体であるが、その著量生産は
困難とされている。その理由としてはω−ヒドロキシ高
級脂肪酸の生成速度に比ベン系ムスクの主成分である大
環状ラクトンの有用な中間体としてはω−ハロカルボン
酸がある。ω−ハロカルボン酸はハロゲンに官能基を導
入することにより種々の誘導体にも導びくこともできる
。このω−ハロカルボン酸に関しては，アルスロバクタ
−属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属に属し、
アルキルハライドからω−ハロカルボン酸を生産する能
力を有する菌を培養し、ω−ハロカルボン酸を生産する
方法が報告されている（特開昭５７−５０８９３号）。

そこで、木発明者らは、斯かる現状に鑑みアルキル（又
はアルケニル）ハライドを対応するω−ハロカルボン酸
に変換する能力を有する閑を自然界より広く検索した結
果，ミクロコツカス属に属する微生物中に斯かる能力を
有するものかあることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はミクロコツカス属に属し、アルキル
（又はアルケニル）ハライドを資化してω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する新規なミクロコツカス・エ
スピー・ＫＳＭ−８−１（微工研菌寄第７００２号）に
関するものである。

球菌、直径０．５〜１ＪＬ ２）集団：不規則連鎖及び房状は認められない３）運動
性：　なし ４）胞子：　形成しない ５〕グラム染色性：　陽性 ６）抗酩性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 ｌ）肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。

うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落を生ずる。う
す緑色の光沢を有す。

３）肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、わずかに沈殿を生
ずる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する５）リドマスミ
ルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しない。リドマス
の還元はない。

（Ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）Ｍ　Ｒテスト：　陰性 ４）ＶＰテスト：　陰性 ５）インドールの生成：　陰性 ６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）二　四隅性７）デン
プンの加水分解：　陰性 ８）クエン酪の利用 Ｋｏｓｅｒの培地：　利用しない ’Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：　利用する８）無機
窒素源の利用 硝酸塩：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素１１）ウレア
ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地：　陰性 ＳＳＲ培地：　陰性 １２）オキシダーゼ：　陰性 １３）カタラーゼ：　陽性 １４）生育の範囲： １４〜４２℃（最適２８〜３５℃） ｐＨ５，０〜８．５（最適８．５〜８．０）１５）酸素
に対する態度：　好気性 １Ｂ）ＯＦテスト：　陰性 ｔ　”ｔ　）　ａ類からの酸、ガスの生成　：Ｌ−アラ
ビノース　：　− Ｄ−キシロース　：　− Ｄ−グルコース　：　− Ｄ−マンノース　：　− Ｄ−フラクトース　：　− Ｄ−ガラクードース　：　− 麦芽糖　・　− ショ糖　・　− 乳糖　・　− トレハロース　・　− Ｄ−ソルビット　°　− Ｄ−マンニット　°　− イノジット　°　− グリセリン　・　− デンプン　・　− １８）５％塩化ナトリウム酎耐：　生育する１８）採集
地：新潟県湯沢温泉の土壌から分離以上の菌学的性質を
有する菌について八−ジエイのマニュアル（Ｂａｒｇｅ
ｙ　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７５
年）に基づいて検索した結果、本菌株はミクロコツカス
（旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　）属に属する新菌株と認め、
ミクロコツカス・エスピーφＫＳＭ−Ｂ−１（Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ−Ｂ−１）と命名した
。なお、本菌株は、倣工研菌寄＄７００２号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパラフィン
含有培地を用い常法で行なった。

本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用する菌株が
良好に生育し、アルキル（又はアルケニル）ハライドか
らのω−ハロカルボン酸の生産を順調に行なわしめるた
めに適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、無機塩
などからなる。炭素源としては、炭水化物（例えば、グ
ルコース、フラクトース、シュクロース、ンルビトール
′４）、有機酸（例えば、クエン酸、有機栄養源として
は、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アン
モニウム等の硝酸塩類、酵母エキス、肉エキス、ペプト
ンが挙げられる。また、無機塩としては各種リン酸塩、
硫酸マグネシウムなどが使用できる。さらに微量の重金
属塩類が使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも
添加を必要としない。また栄養要求を必要とする変異株
を用いる場合には。

その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなければなら
ない。

培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種し、２８〜
３５°Ｃで３〜５日振盪又は通気攪拌すれは良い。ｐＨ
は６．５〜８程度に調整すると良い結果が得られる。水
に難溶性の炭素源等を使用する場合には、ポリオキシエ
チレンソルヒクン等の各種界面活性剤を培地に添加する
ことも可能である。

値上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源として用
いることもできるが、菌体を培養液より分離する場合は
、通常の固液分゛離手段が川（１）られる。このように
分離された生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体等）も
酵素源として用いることができる。

アルキル（又はアルケニル）／＼ライドを反応基質とし
て本菌株を上記の如く培養するとω−ハロカルボン酸か
生産される。これらの培養液から目的物質であるω−ハ
ロカルボン酸の採取および精製は、一般の有機化合物の
採取および精製の手段に準じて行うことができる。たと
えば培養液から菌体等を除去したろ液もしくは培養液そ
のものを酸性とし、エチルエーテル、酢酸エチル又はク
ロロホルム−メタノール混液等の有機溶媒で抽出する。

この抽出物をカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶
などの方法を用いてω−ハロカルボン酸を単離すること
ができる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 採取した土壌及び土壌付着の落葉藩校の小スパーチル１
杯分（約０．５ｇ）を１０ｍ１滅菌水に懸濁し、充分撹
拌した後放置する。かくして得られる土壌懸濁液上清の
１００倍希釈液０．１ｍｌを下記組成のｎ−ヘキサデカ
ン含有の分離用分離用寒天培地（Ｉ）　組成 ｎ−ヘキサデカン　２０　ｇ ＮＯ４ＮＯ３５ｇ ＫＨ，ＰＯ３０，６ｇ Ｎａ３　ＨＰＯ４’　１２　Ｈｔ　Ｏ４ｇＭｇ　Ｓｏ　
４φ　７Ｈ，，００，５ｇＦｅＳＯ４・？Ｈ２０３０ｍ
ｇ １：ａＧ１２　６０ｍｇ Ｃａ　ＳＯ４・５　Ｈ＠　Ｏｌ　５　ｇ　ｇＮａ２Ｂ４
０７１０Ｈ２０３０ｐｇ ＭｎＣｕ２−４ＪＯ６０１１−ｇ ＺｎＳＯ４・　７）１２０　１５０ｐＬｇＭａ２　Ｎｏ
　０４　ｍ　２　Ｈ２０３０ｇｇ酵１Ｍエキス　ｌ　Ｏ
０ｍｇ ポリオキシエチレン− ソルビタンモノラウリン酸エステル （平均ＥＯ数２０モル）　５０ｍｇ 寒天　２０　ｇ イオン交換水　１党 ＰＨ７ ンｋ　Ｊ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　、層化　、４　ｌ　、
Ｒ２？　〜Ｒ３３（１９１（７）」二記分離用寒天培地
（１）の調製法は、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ成分のみろ過
滅菌しておき、これを予めオートクレーブ滅菌して６０
℃付近に冷却を滅菌水で１００倍希釈し、この希釈液０
．１　ｍｌを上述の分離用寒天培地（ｒｒ）に移し、３
０’Ｃにて３日間培養する。生じた複数のコロニーが相
互間に相異しないことを肉眼的及び顕微鏡的に確認する
。なお、分離用寒天培地（１１）は、分離用寒天培地（
Ｉ）の組成よりｎ−ヘキサデカンとポリオキシエチレン
ソルビクンモノラウリン酸エステルを除いた寒天培地の
底にｎ−ヘキサデカンを含浸させたろ紙を敷いてｎ−ヘ
キサデカンを供給させたものである。

上記コロニーのうち１０個のコロニーをそれぞれ分離用
寒天培地（Ｉ）と同組成の斜面寒天培地に接種し、３０
°Ｃで３日間培養し、１０本の斜面イ＆地上の菌株が肉
眼的及び顕微鏡的に同一菌株であることを確認し、また
、これら１０菌株の各培地上の性状及び生理学的性質が
同一であることを確認した。上記菌株の各培地上の性状
及び生理学的性質は前述した通りである。

」二記試験の結果、各１０本の培養菌はすべて自然界よ
り純粋に分離された単一菌株であるこ慈濁し、−８０℃
にて凍結保存する６かくして３ケ月凍結保存後、迅速に
解凍し得られる悲濁腋の一白金耳を普通寒天培地に蘇生
後、前記と同条件下に各培地上での性状及び生理学的性
質を調べた結果、凍結前とは変化が認められなかったｅ また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り返した菌
株について同様に、各培地上での性状及び生理学的性質
を調べた結果変化は認められなかった。

次いで、本菌株を利用してω−ハロカルボン酸を製造し
た例を参考例として挙げる。

参考例１ セチルクロライド５０ｇ、リン酸ニアンモニウム１０ｇ
、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）
　０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）０．０２ｇ、硫酸亜
鉛（７水塩）　０．０１’Ｏｇ、硫酸マンカン（４〜６
水塩）’　０．０１８ｇ、酵母エキス２ｃｃｕｓ　ｓｐ
、ＫｓＭ−Ｂ−１、）を−白金耳接種し、３０’Ｏで９
６時間振盪培養した。

培養終了後、この培養液に９Ｎ硫酸　１ｍｌを力１１え
ｐＨを強酸性として、クロロホルム−メタノール（２：
　ｌ）混液２０１で抽出した。この抽出液を減圧下濃縮
した後メタノール−ＢＦ。

触媒でメチル化し、ガスクロマ］・グラフィーにて生成
物のω−クロルバルミチン酸の定ＩＪを行なった。その
結果を第１表に示す。

なお生成物はガス−マス（ＧＣ−ＭＳ）によりω−クロ
ルバルミチン酸であることが確認された。図１にω−ク
ロルバルミチン酸のメチルエステル（測定にあたってエ
ステル化したもの）のマスパターンを示した。

第１表 ｌ事件の表示 昭和５８年特許願第５３８４６号 ２発明の名称 新規微生物 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 東京都千代田区霞ヤ関−丁目３−１ （＋１４）工業技術院長　ＩＩＩ田ネ径部４補正命令の
１コ付 昭和５８年８月２８日　（発送日） ５補正の対象 明細１書および図面 ６　？＋ｌｉ正の内容 別紙のとおり 明細書１８頁の第１表の後に次のとおり挿入する。

［４、図面の簡単な説明

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の性質を有する微工研菌寄第７００２号として
   寄託された新規なミクロコツカスΦエスピー・ＫＳＭ−
   Ｂ−１株。 （ａ）形態 １）細胞の形および大きさ： 球菌、直径０．５〜１ＩＬ ２）集団：不規則連鎖及び現状は認められない３）運動
   性：　なし　（。 ４）胞子：　形成しない ５）ダラム染色性：　陽性 ６）抗酸性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。 うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらがな集落を生ずる。う
   す緑色の光沢を有す。 ３）肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、わずかに沈殿を生
   ずる６ ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する５）リトマスミ
   ルク： ワスカニアルカリ性を示しペプトン化しない。リドマス
   の題元はない。 〕）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）ＭＲテスト：　陰性 ４）ＶＰテスト：　陰性 ５）インドールの生成：　陰性 ８）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）：　弱陽性７）デン
   プンの加水分解コ　陰性 ８）クエン酩の利用 Ｋｏｓｅ　ｒの培地：　利用しない Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：　利用する８）無機窒
   素源の利用 硝酸塩：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素１１）ウレア
   ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地：　陰性 ＳＳＲ培地：　陰性 １２、ｌオキシダーゼ：　陰性 １３）カタラーゼ：　陽性 １４）生育の範囲： １４〜４２℃（最適２８〜３５℃） ｐＨ５，０〜８．５（最適６．５〜８．０）１５）酸素
   に対する態度：　好気性 ＩＥＩ）ＯＦテスト：　陰性 ＋７）ｌ’Ｊ類からの酸、ガスの生成　：Ｌ−アラビノ
   ース　：　− Ｄ−キシロース　：　− Ｄ−グルコース　二　− Ｄ−マンノース　：　− Ｄ−フラクト−ス　： Ｄ−カラクトース　二　− 麦芽糖　・　− ショ糖　・　− 乳糖　・　− トレハロース　。 Ｄ−ソルビット　・　− Ｄ−マンニット−イ ノジット グリセリン　・　− デンプン　・　− １８）５％塩化ナトリウム酎耐：　生育する