JPS6048159B2 - コレステロ−ル酸化酵素およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規コレステロール酸化酵素（以下ｃｈ、Ｏ、
と略す）およびその製造法に関する。

近・年、ｃｈ、Ｏ、を用いるコレステロール定量法が開
発され、従来の化学的定量法に代る方法として注目され
ている。本発明によるｃｈ、Ｏ、は上記コレステロール
定量用の酵素として有用である。ｃｈ、Ｏ、を生産する
微生物としては、ノカルジア門属、ブレビバクテリウム
属に属する菌などが知られており、これらはいずれもコ
レステロールを含有する培地においてのみ誘導的にｃｈ
、Ｏ、を生成する。

また、非適応的にｃｈ、Ｏ、を生産する微生物としては
ストレプトミセス属に属する菌や担子菌のフスエヒロタ
ケが知られている。これらの微生物の生産するｃｈ、Ｏ
、は全てΔ５−３β−ヒドロキシステロイドに作用した
場合、生成物はΔ’−３−すキソステロイドであること
が知られている。また特開昭５１−７９７８１号にはス
エヒロタケ（ＳｃｈｌｚＯｐｈｙｌｌｕｍＣＯｍｍＵｌ
ｌｅ）ＩＦＯ４９２７由来のＣｈ．Ｏ．が記載されてい
るが、これに記載されたＣｈ．Ｏ．を使用して臨床的に
コレステロールの測定をせんとするとき、その酸化反応
に長時間を要し、満足できるものではない。本発明者ら
はある種の担子菌が非適応的に培地中に強力なＣｈ．Ｏ
．を生成することを知り、しかもこのＣｈ．Ｏ３はΔ５
−３β−ヒドロキシステロイドに作用して、Δ４−３−
オキソステロイドでなくΔ５−３−オキソステロイドを
生成する新規酵素てあることを見い出し、本発明を完成
した。

本発明に使用される担子菌は、しめじ科（ＴｒｉｃｈＯ
ｌＯｍａｔａｃｅａｅ）まつおおじ属（ひＮｔｉｎｕｓ
）に属する菌株、例えばしいたけＫ−３３９株（？Ｎｔ
ｉｎｕｓｅｄＯｄｅｓＫ−３３９）、同科つえたけ属（
０ｕｄｅｍａｎｓｉｅ１１ａ）に属する菌株、例えばつ
えたけＫ−１４４９株（０ｕｄｅｍａｎｓｉｅ１１ａｒ
ａｄｉｃａｔａＫ一１４４９）およびぬめりつばたけＫ
−１９７株，（０ｕｄｅｍａｎｓｉｅ１１ａｍｕｃｉｄ
ａＫ−１９７）、同科えのきたけ属（Ｆｌａｍｍｕｌｌ
ｎａ）に属する菌株、例えばえのきたけＫ−１６３８株
）（Ｆｌａｍｍｕｌｌｒｌａｖｅｌｕｔｉｐｅｓｋ−１
６３８）；はらたけ科（Ａｇａｒｉｃａｃｅａｅ）きつ
ねのからかさ属（ＬｅｐｉＯｔａ）に属する菌株、例え
ば；からかさたけＫ−９９９株（？ＰｉＯｔａｐｒＯｅ
ｅｒａＫ一９９９）；ひとよたけ科（ＣＯｐｒｉｒｌａ
ｃｅａｅ）ひとよたけ属（ＣＯｐｒｉｎｕｓ）に属する
菌株、例えばささくれひとよたけＫ−２９屹株（ＣＯｐ
ｒｉｎｕｓｃＯｍａｔＬｌｓＫ−２９０２）、もえぎた
け科（ＳｔｒＯｐｈａｒｉａｃｅａｅ）しび，れたけ属
（ＰａｉｌＯｃｙｂｅ）に属する菌株、例えばふとんた
けＫ−１８７３株（ＰｓｉＩＯｃｙｂｅｃＯｐｒＯｐｈ
ｉＩａＫ−１８７３）：こうやくたけ科（ＣＯｒｔｊｃ
ｉａｃｅａｅ）ねばりこうやくたけ属（ＧｌＯｅＯ−Ｃ
ｙｓｔｉｄｉｕｍ）に属する菌株、例えばこがねねばり
こうやくたけＫ−１５３９３株（ＧｌＯｅＯｃｙｓｔｉ
ｄｉｕｍｃｈｒｙｓＯｒｅａｓＫ−１５３λ別名ＣＯｌ
ｌＣｌＵｍｃｈｒ．ｙｓＯｃｒｅａｓＫ−１５３９）
；きこぶたけ科（ＭｕｃｒＯｎＯｐＯｒａｃｅａｅ）き
こぶたけ属（Ｐｈｅｌｌｌｎｕｓ）に属する菌株、例え
ばねんどたけＫ一７５？（Ｐｈｅｌｌｌｎｕｓｇｉｌｖ
ｕｓＫ−７５９）、きくらげ４科（ＡｕｒｉｃｕＩａｒ
ｊａｃｅａｅ）きくらげ属（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）
に属する菌株例えばあらげきくらげＫ−１５株（Ａｕｒ
ｉｃｕＩａｒｉａｐＯｌｙｔｒｊｃｈａＫ−１５）、さ
るのこしかけ科（ＰＯｌｙｐＯｒａｃｅａｅ）あなたけ
属（ＰＯｒｉａ）に属する菌株、例えばきぞめたけＫ一
１６招株（ＰＯｒｉａｅｐｉｍｌｌｔｉｒｌａＫ−１６
４３）である。

上記担子菌の子実体および胞子の形態的特徴は以下のと
おりである。（ａ）しいたけＫ−３篤株： 傘は円形または腎蔵形で直径６〜１０ｃｍ１肉質は緻密
でやや強靭、縁部は内側に巻いており、表面は茶褐色で
濃色歯牙状の鱗被におおわれ、網状の亀裂を有する。

肉は白色で乾燥すれは強い香りを生ずる。ヒダはやや密
で茎に湾生し、白色である。茎は３〜４×１ａｎ１中心
性または偏心性で中実、強靭であり、表面のツバより下
部は淡褐色て繊維状、上部は白色で平滑またはヒダに連
続した条線がある。胞子は長だ円ないし円筒形、５〜７
×３．５ｐ１胞子紋は白色である。以上の特徴を今関六
也、本郷次雄共著、保育社発行１原色日本菌類図鑑ョの
記載と比較すると、本菌はしいたけであることが明瞭で
ある。

本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番
号微工研菌寄第５７７６号として寄託されている。（ｂ
）つえたけＫ−１４４？： 傘は丸山形で直径５〜９ｃｍ１中央部は山形にふくらみ
、表面は淡灰褐色で湿ると強い粘性を示し、無毛である
が顕著な皺を有する。

肉は薄く、灰白色である。ヒダは幅広くやや疎で茎にほ
とんど直生する。茎は中空て地上部５〜１２×０．４〜
０．９ｃｍ、傘と同色て粉状を呈し、繊維状の条線があ
り、基部は太まつた後再び細くなつて地中て長い（５〜
３０ｃＴｒＬ）根となつている。胞子はだ円形ないし球
形で平滑、１５〜２４×１４〜１８Ｐ１胞子紋は白色で
ある。担子柄は２または４ケ胞子を着け、４５〜５５×
１１〜１３ｐである。以上の特徴を今関六也、本郷次雄
共著、保育社発行０原色日本菌類図鑑ョの記載と比較す
ると、本菌はつえたけであることが明瞭である。本菌は
工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号微工
研菌寄第５７７７号として寄託されている。（Ｃ）ぬめ
りつばたけＫ−１９味１ 傘はまんじゆう形で直径３〜６ＣＷＩ１表面は中心部が
肌色、周辺部が白色で、湿ると強い粘性を示し、乾燥す
るとやや粉状にて光沢を生じ、縁部は多少条線を有する
。

肉はほぼ白色で柔軟な膠質である。ヒダは白色で幅広く
、やや疎に茎に直生する。茎は傘と同色で３〜６×０．
３〜０．７ｃｍ、丈夫な軟骨質をおび、上方で次第に細
まり、ツバを有し、基部は肥大する。胞子はだ５円形な
いし類球形で平滑、２０〜２３×１６〜１８ｐ１胞子紋
は白色てある。担子柄は４ケ胞子を着け７０〜１００×
２０〜３０ｐてある。以上の特徴を今関六也、本郷次雄
共著、保育社発行１原色日本菌類図鑑ョの記載と比較す
る１０と、本菌はぬめりつばたけてあることが明瞭てあ
る。

本菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託
番号微工研菌寄第５７７８号として寄託されている。（
ｄ）えのきたけＫ−１６３？： １．
−傘は初めまんじゆう形で後丸山形から扁平に開く、直
径２〜８ｄで表面は湿ると強い粘性を示し、黄褐色て周
辺は淡色てある。

肉はほぼ白色で、中央は厚く、周辺は薄く柔軟である。
ヒダは白色ないし淡黄色で幅広く、かなり密に茎２′に
上生または湾生する。茎は強靭て３〜１０×０．２〜０
．８ｃｍ１上部は黄褐色下部は黒褐色の短密毛におおわ
れ、成熟すると中空となる。胞子はだ円形ないし円筒形
で平滑、５〜８×３〜４μ、胞子紋は白色てある。縁お
よび側ともにシ２スチジアを有し、３３〜６６×９〜２
？である。以上の特徴を今関六也、本郷次雄共著、保育
社発行０原色日本菌類図鑑ョの記載と比較すると、本菌
はえのきたけであることが明瞭てある。本菌は工業技術
院微生物工業技術研究所に３微生物受託番号微工研菌寄
第５７７鰻として寄託されている。（ｅ）からかさたけ
Ｋ−９的株：傘は初め卵形で後に扁平に開き直径２０ｃ
ｍ１こも達する、表皮は初め茶褐色てあるが、傘が開く
．に伴い多数の亀裂を生じ著しい鱗被となる、亀裂によ
つてあられれた肉肌は白色て海綿質てある。

ヒタは白色て茎に隔生する。茎は長太く、中空て基部は
著しく肥大する、表面は細かい褐色の鱗被でおおわれて
おり、上部に厚いツバを−有する。胞子はた円形、１７
〜１９×１１〜１４１Ｌ１胞子紋は白色である。以上の
特徴を今関六也、本郷次雄共著、保育社発行１原色日本
菌類図鑑ョの記載と比較すると、本菌はからかさたけで
あることが明瞭てある。

本菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託
番号微工研菌寄第５７８（ロ）ｔして寄託されている。
）ささくれひとよたけＫ−２９屹株： 傘ははじめほぼ円筒状で茎の半分以上にかふさつており
、後鐘形に展関する、直径３〜５０１高さ６〜１０ｃｍ
１表面は淡褐色のささくれ状鱗被でおおわれている。

肉は白色でもろい。ヒダは茎に離生し、初め白いが後に
淡紅色かな黒色に変わり、傘の周辺付近から黒インク状
に溶解する。茎は白色で１５〜２５×１〜１．５α、上
部、は中空で下部は中実、可動性の脱落しやすいツバを
有し、基部は紡鐘形にふくらむ。胞子はだ円形で平滑、
１１〜１４Ｘ６〜８ｐ１胞子紋は黒褐色である。以上の
特徴を今関六也、本郷次雄共著、保育社発行１原色日本
菌類図鑑ョの記載と比較すると、本菌はささくれひとよ
たけてあることが明瞭てある。

本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番
号微工研菌寄第５７８１号として寄託されている。（ｇ
） とふんたけＫ−１８Ｂ株： 傘はまんじゆう形で直径２〜３ｃｒｆＬ１表面は黄土褐
色で粘性はなく、条線はなく、表皮の上層はゼラチン化
しない、縁部は不整形てある。

肉はうすく、表面と同じく黄土褐色てある。ヒダは茎に
密に直生し、幅２〜３ＴＷｔ１初め淡色で後汚紫褐色と
なる。茎は中空て５〜７Ｘ０．３〜０．４０、表面は絹
糸状で白色ないし淡黄土色である。胞子はだ円形、６〜
７×３〜４μ、胞子紋は暗紫褐色である。縁シスチジア
は先がややとがつた紡鐘形で１７〜２０×５〜７μであ
る。以上の特徴を今関六也、本郷次雄共著、保育社発行
１続原色日本菌類図鑑ョの記載と比較すると本菌はとふ
んたけであることが明瞭である。本菌は工業技術院微生
物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第５７８
？として奇託されている。（ｈ） こがねねばりこうや
くたけＫ−１５３嘘１子実体は全背着性で傘をつくらす
樹皮面に広く（４〜８×２〜３ｃｒｎ）ひろがり、密着
してはがれない、表面は卵黄色て平滑または乳頭状のい
ぼが少しあり、乾燥すると亀裂が生じる。

肉は縁黄色で厚さ１２０〜３００μ、縁は薄く、革質で
ある。構成菌糸は直立し、幅約２μで多数の嚢状の大形
細胞を有している嚢状の大形細胞は１５〜２０Ｘ６〜９
μで水酸化カリウム溶液で桃色となる。胞子はだ円形で
平滑、無色、４〜５×２〜３μ、胞子紋は白色である。
以上の特徴を伊藤誠哉著、養賢堂発行（１９５５年）ｒ
日本菌類誌第２巻第４号ョの記載と比較すると、本菌は
こがねねばりこうやくたけであることが明瞭てある。

本菌は、工業技術院微生物■業技術研究所に微生物受託
番号微工研菌寄第５７８３号として寄託されている。（
１） ねんどたけＫ−７関株： 子実体は茎がなく、傘は扁平な半円形て多数重なり合つ
て発生し、基部は垂生し上下連なる、径５〜８Ｃ７ｊで
基部の厚さ０．５〜１．０ｃｍ１表面は黄褐色て環紋は
不鮮明であり、短い剛直な束毛て密におおわれ、やや鮫
肌状の粗い手ざわりを示し、下面は黄褐色てある。

肉は黄褐色のコルク質てあり、殼皮は発達しない。管孔
は長さ３〜５ｒｆ０ｎ、孔口は小さい円形で１Ｗｕｒ１
の間に６〜７個存在する。胞子は類球形、４〜５×２〜
３μ、無色で平滑である。剛毛体は多数あり、厚膜て長
いくさひ形、２５〜３０×３〜６μである。以上の特徴
を今関六也、本郷次雄共著、保育社発行７続原色日本菌
類図鑑ョの記載と比較すると、本菌はねんどたけてある
ことが明瞭である。本菌は、工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号微工研菌寄第５７８４号として
寄Ｊモされている。（ｊ） あらげきくらげＫ−ｂ株： 子実体は背着性て、傘は半球状ないし耳朶状で高さ２〜
３ｃｍ１直径３〜６ｃｍ１厚さ約１ｃｍであり、中央付
近て短柄を有す。

傘の上面は茶褐色で短い密毛をおび、下面は淡紫黒色て
粗く畝５立ち、乾燥すると上面は赤褐色となり下面は紫
黒色にて粉状を呈し、やや光択を有するが、子実体は殆
んど収縮しない。肉は革状の膠質で、厚さ約１ｃｍ程度
てある。担子柄は円筒形、６０〜７０×４〜５μ、４室
よりなる。胞子は無色で８４〜１２Ｘ３〜５μ、円筒形
てやや屈曲する。以上の特徴を伊藤誠哉著、養賢堂発行
（１９５５年）ｒ日本菌類誌第２巻第４号ョの記載と比
較すると、本菌はあらげきくらげであることが明瞭であ
る。本菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物
受託番号微工研菌寄第５７８８号として寄託されている
。（ｋ） きぞめたけＫ−１６招株： ー 子実体は全背着性て傘をつくらす、樹上あるいは
材上に密着して薄く広く（径６〜８ｃＴｔ）ひろがり、
はがれ難く、着生材を濃橙黄色に着色させ、周辺は橙黄
色で最外部は紫褐色に縁取られる。

肉は木質を帯び橙黄色で、管孔部は灰色ク である。管
孔は長く、孔口は多角形で小さく、孔壁は薄い。胞子は
だ円形で平滑、無色、大きさ約３．５×２ｐである。シ
スチジアは存在しない。 以上の特徴を伊藤誠哉著、養
賢堂発行（１９５５７年）ｒ日本菌類誌第２巻、第４号
ョの記載と比較すると、本菌はきそめたけであることが
明瞭である。

本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番
号微工研菌寄第５８０４号として寄託されている。ｌ
担子菌は分類方法や記載法の違いによつて異なつた名称
で呼ばれることもあるが上記の文献に記載された分類に
よつて上記属のいずれかの属に分類される菌であればす
べて本発明に含まれる。

上記の菌はいずれも構成的にＣｈ．Ｏ．を生成する能力
を有し、コレステロールを含有する培地においてだけで
なく、コレステロールを含有しない培地においてもＣｈ
．Ｏ．を生産する。本発明方法においてＣｈ．Ｏ．生産
のために上記Ｃｈ．Ｏ．生産菌を担子菌の公知の培養法
を用いて栄養培地上て好気的に培養すれば良い。

固体培養法を用いることもできるが、工業規模ての生産
のためには液体培養法を用いるのが有利てある。培地に
加える栄養源は使用する菌株か利用し得るものであれば
よく、炭素源としては例えはデンプン、グルコース、シ
ユクロース、マルトース、ラクトース、デキストリン、
糖密、油脂類等が利用でき、窒素源としては酵母工キズ
、ペプトン、コーンステイーブリカー、デイステイラー
ズソルブルズ、脱脂大豆等が適当である。

その他に隣酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩等
の無機質および金属塩類を加えてもよく、更にはビタミ
ン類、生長促進因子を加えてもよい。担子菌を培養する
に当り、Ｃｈ．Ｏ．の生産量は培養条件により大きく変
動するか、一般に培養温度は２０〜３５゜Ｃ１培地のＰ
Ｈ４〜７が良く、２〜１０日の培養てＣｈ．Ｏ．の生産
は最高に達する。

培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、Ｃｈ．Ｏ
．の生産量が最大になるように設定するのは当然である
。液体培養を用いた場合、Ｃｈ．Ｏ．は培養液中に生！
成されているので、培養終了液はろ過あるいは遠心分離
などて菌体を除き培養沖液を得る。培養？液からＣｈ．
Ｏ．を採取するには、公知の酵素精製手段、例えば分別
沈澱、透析、吸着溶離、クロマトグラフィー等の手段を
組み合わせて用い１ることができる。

溶媒沈澱の場合は、例えば、アルコール、アセトン等を
５０〜８０Ｖ／ｖ％加えることにより、塩析の場合は、
例えば、硫安、塩化カルシウム等を２０〜８０ｗ／ｖ％
加えることにより沈澱として分離さ１れる。

得られた沈澱物より透析、セフアデツクス処理あるいは
限外沖過によつて脱塩し、粗酵素液を得る。得られた粗
酵素液を精製するには、例えはあらかじめ０．０１Ｍの
リン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）で緩衝化したＤＥＡＥセフ
アデツクス（Ａ−５０）の力２ラムに吸着させ、吸着物
を０．２Ｍのリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）て溶出し、活
性区分を集める。次にこの活性区分を０．０１Ｍ酢酸緩
衝液（ＰＨ４Ｏ）て充分に透析後、同緩衝液で緩衝化し
たＳｐ−セフアデツクス（ｃｍ５０）カラムに吸着させ
、吸着物を０．０１Ｍ冫酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ）で溶
出して活性区分を集める。この活性区分を０．０１Ｍの
リン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）に透析し、透析内液を濃縮
後凍結乾燥し、精製酵素粉末を得る。本発明で得られる
Ｃｈ．Ｏ．の特徴的性質は次のと．おりてある。

（１）酵素作用： 本発明の酵素は、３β位に水酸基を有するステロール類
に作用し、３β位の水酸基を脱水素して過酸化水素を発
生する。

例えは、コレステ．ロールを基質とした場合は、５−コ
レステンー３−オンと過酸化水素を生成する。生成した
５−コレステンー３−オンは反応液中で不安定であり、
非酵素的に徐々に４−コレステンー３−オンに変換する
。本発明のＣｈ．Ｏ．を後述の活性測定の方法でコレス
テロールに作用させる反応前および反応開始後１扮での
反応液をそれぞれクロロホルムで抽出し、約１＠に濃縮
した濃縮液を高速液体クロマトグラフィて展関したとき
の溶出パターンを第５〜ｂ図に示し、標準液（コレステ
ロール、４−コレステンー３−オンおよび５−コレステ
ンー３−オンの標準品を同一溶解）を高速液体クロマト
グラフィて展関したときの溶出パターンを第５−ａ図に
示した。第５−ａ図および第５−ｂ図より、本発明によ
るＣｈ．Ｏ．の反応生成物は５−コレステンー３ーオン
であることは明らかである。現在までに報告されている
ノカルジア属、ブレビバクテリウム属、ストレプトミセ
ス属およびスエヒロタケ属の菌が生産するＣｈ．Ｏ．に
ついては、いずれも酸化作用と異性化作用の両方を合わ
せ持つことが知られている。一方、本発明のＣｈ．Ｏ．
は異性化作用を持たす、酸化作用のみを有し、コレステ
ロールを酸化して５−コレステンー３−オンを生成する
。酸化作用のみを有するＣｈ．Ｏ．は知られておらす、
本発明により初めて製造が可能となつたものである。２
）基質特異性： 本発明のＣｈ．Ｏ．は３β位に水酸基を有するステロー
ル類のみに特異的に作用する。

即ち、コレステロール、β−コレスタノール、カンペス
テロール、β−シトステロール、ステイグマステロール
、５α−プレグナンー３β、２０β−ジオール、デハイ
ドロエピアンドロステン、プレグネノロンおよびエルゴ
ステロールなどに作用する。他の位置（３α位を含む）
に水酸基を有するステロール類には全く作用しない。３
）至適ＰＨおよびＰＨ安定性： 本発明酵素の至適ＰＨをそれぞれ第１−ａ図〜第１−ｋ
図に示した。

それぞれのＰＨにおける活性の測定は、後述の活性の測
定法に準じておこない、ＰＨ２およびＰＨ３は０．１Ｍ
グリシン・塩酸緩衝液中て、ＰＨ４およびＰＨ５は０．
１Ｍ酢酸緩衝液中て、ＰＨ６，ＰＨ７およびＰＨ８は０
．１Ｍ燐酸緩衝液中で、ＰＨ９およびＰＨｌＯは硼酸緩
衝液中て行なつた。本発明酵素はＰＨ５〜７付近に高い
活性を有している。また、本発明酵素を３ｒＣにおいて
それぞれのＰＨで６吟間処理したときのＰＨ安定性を第
３−ａ図〜第３−ｋ図に示した。本発明酵素は、ＰＨ４
〜８付近が安定である。（４）至適温度および熱安定性
： 本発明酵素の至適温度は第２−ａ図〜第２−Ｋ図の曲線
で表わされるごとく３５〜４５℃付近にある。

また、本発明酵素をＰＨ７．Ｏにおいてそれぞれの温度
で１紛間処理したときの熱安定性を第４−ａ図〜第４−
ｋ図に示した。本発明酵素は４０〜４５゜Ｃまて安定で
ある。（５）分子量： 本発明酵素の分子量はセフアデツクスＧ−１００による
ゲル沖過法て約５８０００である。

（６）等電点：本発明酵素の等電点はフアルマライト（
ＰＨ３〜１１、フアルマシア社製）を用いた焦点電気泳
動法で４．２±０．１である。

（７）活性の測定法： 活性の測定は、パーオキシダーゼと色原体の存在下、過
酸化水素の生成量（クリニカル・ケミストリー、第２０
巻、第４７０頁、１９７４）から、または、高速液体ク
ロマトグラフィを用いてコレステロールの減少量から求
めた。

即ち、前者においては４−アミノアンテイピリン２．４
６マイクロモル、フェノール４２マイクロモル、パーオ
キシダーゼ２偉位の存在下、エタノールに溶解したコレ
ステロール溶液（２０ミリモル）−０．１ｍ１に酵素液
を添加し、ＰＨ７．Ｏ、反応液量３．０ｍ１で３７℃、
１吟間反応後、生成した過酸化水素に基つく５００ｎｍ
の吸収増加を測定する。後者においてはエタノールに溶
解したコレステロール溶液、（２０ミリモル）０．１ｍ
１に酵素液を添加し、ＰＨ７．Ｏ反応液量３．０ｍ１で
３７゜Ｃ１扮間反応後、残存コレステロールをクロロホ
ルムで抽出して減少したコレステロール量を測定する。
Ｃｈ．Ｏ．ｌ単位は３７＊８℃で１分間に１マイクロモ
ルのコレステロールを酸化する酵素量または過酸化水素
を生成する酵素量で示す。以下に本発明によるＣｈ．Ｏ
．の製造方法を実施例をもつて示すが、本発明が以下の
実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース３％、エピオス０．５％および寒天１，５％
（エピオス培地）の組成の斜面培地に第１表にノ示した
本発明の担子菌を接種し、２５℃にて１週間静置培養し
て第１次種菌とした。

グルコース２％、酵母工キズ０．３％、ポリペプトン０
．３％、ＫＨ２ＰＯ４（０．１％およびＭｇＳＯ４）・
７Ｈ２００．０５％の組成の培地１００ｍ１を５００ｍ
１容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２紛間殺菌し
た後、冷却し、これに上記の種菌をかきとり接種して、
２ｒＣで、毎分１００回転で振盪培養して第２次種菌と
した。培養日数は第１表に示した。炭素源として可溶性
デンプンまたはグリコース２％、酵母工キズ０．３％、
ポリペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４Ｏ．３％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００．１％および大豆油０．５％の組成の培地
１５ｅを３０１容のジヤーフアーメンターに入れ、１２
０地Ｃて２吟間殺菌した。冷却後、上記の第２次種菌を
１００ＴｔＬ１接種し、２ＴＣて毎分１０′の通気速度
と毎分２００回転の攪拌速度の条件下て培養した。培養
日数は第１表に示したとおりである。培養終了後、培養
液を？過して菌体を除き、培養沖液１３ｆを得た。培養
？液のＣｈ．Ｏ．活性（過酸化水素生成量より測定した
）は第１表に示したとおりてあつた。実施例２実施例１
て得た培養戸液１３１に硫酸アンモニウム７２９０ｇ加
え（約８０％飽和）て溶解し、一昼夜放置後、生成した
沈澱をろ過して集め、これを大量の０．０ＩＭ燐酸緩衝
液（ＰＨ７．Ｏ）で透析後、同緩衝液で緩衝化したＤＥ
ＡＥセフアデツクス（Ａ−５０），１ホのカラム（５．
０×４０ｃｍ）に吸着させ、吸着物を０．２Ｍ燐酸緩衝
液（ＰＨ７．Ｏ）で溶出した。

活性画分を０．００ＩＭ燐酸緩衝液て透析後、凍結乾燥
して精製酵素粉末を得た。精製酵素粉末の収量および活
性を第２表に示した。前述した如く特開昭５１−７９７
８１号にはスエヒロタケＩＦＯ４９２８由来のＣｈ．Ｏ
．が記載されているが、このＣｈ．Ｏ．と上述した本発
明によるＣｈ，Ｏ．を用いて人血清中の遊離コレステロ
ールおよび総コレステロールを測定した楊合の例を下記
実験例にて示す。

実施例 １ 遊離コレステロールの測定 人血清中の総コレステロールの測定には、次の反応組成
て行なつた。

即ち、人血清０．１ｍＬぃ４−アミノアンチピリン２．
４６マイクロモル、フェノール４２マイクロモル、パー
オキシダーゼ２禅位、トリトンＸ一１００濃度０．３３
％、リン酸緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）３００マイクロモル及
び、それぞれ本発明または特開昭５１−７９７８１号に
よるコレステロール・オキシダーゼ３単位総液量３．０
ｍＬで３７゜Ｃで反応を行ない、試薬ブランク（人血清
の代わりに精製水を添加したもの）を対照として、その
反応の経時的変化を、波長５００ｒｗＬにおける吸光度
の変化より追跡した。

その結果を第６図に示す。第６図に見られる如く、本発
明のコレステロール・オキシダーゼ３単位を用いた場合
（４）、反応は３分間で完了するのに対し、特開昭５１
−７９７８１号のスエヒロタケＩＦＯ４９２８起源のコ
レステロールａオキシダーゼ３単位を用いた場合（Ｂ）
、反応を３０分間行なつても、血清中のコレステロール
が全て酸化されなく、吸光度の変化として測定すること
ができない。２総コレステロールの測定 人血清中の総コレステロールの測定には、次の反応組成
を用いた。

即ち、人血清０．１ｍ１、４−アミノアンチピリン２．
４６マイクロモル、フェノール４２マイクロモル、パー
オキシダーゼ２弾位、トリトンＸ一１０α農度０．３３
％、リン酸緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）３００マイクロモル、
コレステロール●エステラーゼ５単位およびそれぞれ本
発明によるコレステロール・オキシダーゼ３単位または
特開昭５１一７９７８１号のスエヒロタケ由来のコレス
テロール・オキシダーゼ３単位あるいは１弾位、総液量
３．０ｍ１で３７゜Ｃで反応を行ない、試薬ブランク（
人血清の代わりに精製水を添加したもの）を対照として
その反応の経時的変化を波長５００ｒ１ｍにおける吸光
度の変化より追跡した。

その結果を第７図に示す。第７図に見られる如く、本発
明のコレステロール◆オキシダーゼ３単位を用いた場合
Ａ１反応は３分間で完了するのに対し、特開昭５１−７
９７８１号のスエヒロタケＩＦＯ４９２８起源のコレス
テロール●オキシダーゼ３単位を用いた場合Ｂ、反応終
了まで６紛間も要した。また、１弾位を用いた場合Ｃで
も、２０，分間を要した。以上の結果より、人血清中の
遊離および総コレステロールの測定する場合、スエヒロ
タケＩＦＯ４９２８起源のコレステロール●オキシダー
ゼを用いるよりも、本発明の酵素を用いた場合、経済二
的かつ敏速に定量することが可能になつた。

【図面の簡単な説明】

第１−ａ図〜第１−ｋ図は、本発明により得られるＣｈ
．Ｏ．のＰＨと活性の関係を表わし、第２−ａ図〜第２
−ｋ図は温度と活性の関係を表わす。 第３−ａ図〜第３−ｋ図は本発明により得られるＣｈ．
Ｏ．をそれぞれのＰＨで６０分間処理した後のＰＨと活
性の関係を表わし、第４−ａ図〜第４−ｋ図はＰＨ７，
Ｏにおいてそれぞれの温度で１吟間処理した後の温度と
活性の関係を表わす。第５−ｂ図は、本発明により得ら
れるＣｈ．Ｏ。をコレステロールに作用させる反応前お
よび反応後１紛での反応ｊ液の高速液体クロマトグラフ
ィによる溶出パターンであり、第５−ａ図は標準液を高
速クロマトグラフィによる溶出パターンである。第６図
は人血清中の遊離コレステロールの測定における反応速
度を表わす図てあり、図中Ａは本発明Ｃｈ．Ｏ．を、Ｂ
はスエヒロタケＣｈ．Ｏ．を示す。第７図は人血清総コ
レステロールの測定における反応速度を表わす図であり
、図中Ａは本発明Ｃｈ．Ｏ．を、ＢおよびＣはスエヒロ
タケＣｈ．Ｏ．を示す。なお、各図において、ａはしい
たけＫ−３３９株の、ｂはつえたけＫ−１４４？の、ｃ
はぬめりつはたけＫ−１９７株の、ｄはえのきたけＫ−
１６３８株の、ｅはからかさたけＫ−９９？の、ｆはさ
さくれひとよたけＫ−２９屹株の、ｇはとふんたけＫ−
１８Ｂ株の、ｈはこがねねばりこうやくたけＫ一１５３
ＶＦ．の、ｉはねんどたけＫ−７５９株の、ｊはあらげ
きくらげＫ−１５株の、ｋはきぞめたけＫ−１６お株の
Ｃｈ．Ｏ．であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的諸性質を有することを特徴とするコ
   レステロール酸化酵素。 （ａ）作用 コレステロール＋Ｏ＿２→５−コレステン−３−オン＋
   Ｈ＿２Ｏ＿２（ｂ）基質特異性 ３−β位に水酸基を有するスチロール類のみに作用する
   。 他の位置（３−α位を含む）に水酸基を有するスチロー
   ル類には全く作用しない。（ｃ）至適ｐＨ１５〜７ （ｄ）安定ｐＨ：４〜８ （ｅ）至適温度：３５〜４５℃ （ｆ）熱安定性：４０〜４５゜Ｃまで安定（ｇ）分子量
   ：約５８０００（セフアデツクスＧ−１００によるゲル
   濾過法（ｈ）等電点：４．２±０．１〔フアルマライト
   （ｐＨ３〜１０、フアルマシア社製）を用いた焦点電気
   泳動法〕２ まつおおじ風、つえたけ属、えのきたけ属
   、きつねのからかさ属、ひとよたけ属、しびれたけ属、
   ねばりこうやくたけ属、きこぶたけ属、きくらげ属およ
   びあなたけ属に属するコレステロール酸化酵素生産能を
   有する微生物を培養し、得られた培養物からコレステロ
   ール酸化酵素を採取することを特徴とするコレステロー
   ル酸化酵素の製造法。