JPH02145189A - チロシナーゼ阻害物３４２２の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発問は、皮膚の美白、又はシミもしくはソバカスの除
去などに有効なチロシナーゼ阻害物の製造方法及びその
阻害物を産生ずる新規菌株に関する。

〔従来の技術〕

皮膚の着色の原因となるメラニン色素は、表皮と真皮と
の間にあるメラニン細胞（メラノサイト）内のメラニン
生成顆粒（メラノサイト）において生産され、生成した
メラニンは、浸透作用により隣接細胞へ拡散する。この
メラノサイト内における生化学的反応は、現在のところ
次のようなものと推定されている。必須アミノ酸である
チロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノン
となり、これが酵素的又は非酵素的酸化作用により赤色
色素及び無色色素を経て黒色のメラニンへ変化する過程
がメラニン色素の生成過程である。

従って、反応の第一段階であるチロシナーゼの作用を抑
制すること、或いは中間段階のキノン類を還元すること
によってメラニンの生成を抑制し得るものと考えられる
。既に、その抑制手段として、チロシナーゼの活性中心
である銅と結合する物質（例えばチオ尿素、システィン
、コウジ酸）、チロシナーゼの基質であるチロシンと競
合基質となり得る物質（例えばＮ−アセチルチロシシ、
γ−ピロン、ヒノキチオール）、チロシナーゼと基質と
の酵素反応の誘導期を延長する物質（例えばツイーン２
０）、ドーパ等のＯ−ジヒドロキシ基と選択的に結合す
る物質（例えばモリブデンイオン）、Ｏ−キノン類と結
合する物質（例えばアニリン）、Ｏ−キノン類に対する
還元剤（例えばアスコルビン酸、ヒドロキノン及びその
誘導体）などが提案されている。しかし、ヒトに対する
毒性、安定性、官能的影響等を考慮すれば、満足できる
ものはない。例えばシスティンはドーパ色素の生成を抑
制するが、硫黄臭があるので化粧品として利用するには
問題がある。またアスコルビン酸は酸化され易く、配合
物を褐変させるため、これも実用上に問題がある。

〔発明が解決しようとする課題〕 本発明者らは、人体に好ましくない副作用を有せず、か
つ優れた美白効果を示す美白剤を見出すべく永年にわた
って研究を重ねてきたところ、トリコデルマ属に属する
菌株を培養して得られる発酵液がアスコルビン酸よりも
優れた顕著なチロシナーゼ阻害効果を示すことを見出し
た。しかも、この培養液より得られた粗精製物は、ｐＨ
１熱などに対する安定性が非常に良好であるうえ、無色
、無臭であるので多くの用途に利用することができるこ
とを見出し、本発明を完成するに到った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、トリコデルマ属（Ｔｒ　ｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ）に属するチロシナーゼ阻害物生産菌を好ま
しくは好気的に培養し、その培養物からチロシナーゼ阻
害物を採取することを特徴とするチロシナーゼ阻害物３
４２２の製造方法である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明方法においては、トリコデルマ属に属する任意の
チロシナーゼ阻害物生産菌を用いることができる。本発
明方法で用いることのできる微生物は、例えば、トリコ
デルマ・ハルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａ
ｒｉｚｉａｎｕｍ　）　ＩＦＤ−３０７１７、）リコデ
ルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ
）　ＩＦＤ−３１１３７、及び本発明者が見出した新規
の微生物である。その新規の微生物は、１９８７年９月
８日に兵庫県加東郡東条町の畑土から分離、採取された
ものである。

この微生物の菌学的性質は後述するが、その性質と、リ
ファイ　（Ｒｉｆａｉ）のア・リビイジョン・オブ・す
・ジー＋ス・）　！Ｊ　コｆ’ルマ（Ａ　ＲＥＶＩＳＩ
口Ｎ　ＯＦ　ＴＨＥＧＥＮＩＪＳ　ＴＲＩＣｌｌ０ＤＥ
ＲＩ、ＩＡ）、　１９６９などに記載されている事項と
を照合すると、本発明の微生物はトリコブル’？　−ハ
ルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎ
ｕｍ）あるいはトリコデルマ・ハルチアヌム類縁の菌と
判断されるので、ここではトリコデルマ・ハルチアヌム
（Ｔｒ＋ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）　　
３４２２　と命名した。また、この微生物は工業技術院
微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されている（微
工研菌寄第１０３４５号）。

次に、本発明で利用するトリコデルマ・ハルチアヌム３
４２２　（微工研菌寄第１０３４５号）の菌学的性質を
示す。

１、形態的性質 （１）　　ポテトデキストロース寒天培地ポテトデキス
トロース寒天培地（極東製薬工業株式会社）上での発育
は速い。

コロニーは急速に成長し、はじめ表面は白色を呈し、ま
ばらな菌糸のマットを形成する。すぐに羊毛状菌糸が伸
長しコロニー表面を覆い中心部に近づくに従ってもり上
がる。コロニー中心部から分生子群が形成し、始めは薄
縁色となる。その後明るい緑色となり、最後には暗緑色
となる。分生子柄は気菌糸から分岐し、さらに多数の側
分岐を産生じ、樹木状を呈する。従って、コロニーは車
輪状の幾分疎な芝生様コロニーにみえる。分生子は球形
または順法形、淡緑色でその径は４．０〜５．　Ｏｐ−
ｘ　４．５〜５．３廁であり、分生子壁面は滑らかであ
る。

コロニーの裏面は白色で色素の産生はない。

（２）　　麦芽エキス寒天培地 麦芽エキス寒天培地上での発育は速い。

気菌糸は長＜８ｎ＋ｍ位伸び、培地前面を疎に覆い、白
色綿毛状コロニーを呈する。気菌糸から分生子柄を生じ
、胞子柄は車輪状に分岐する。その先端に短い梗子を生
じ、各梗子の先端から分生胞子を塊状に生じ樹木状を呈
する。分生胞子は球形またよ叩球形、緑色でその径は３
．５〜４．５１ＭＸ　４．５〜５．５−であり、分生子
壁面は滑らかである。

従って、分生胞子の着生が進むとコロニー中心部にリン
グ状に緑色の分生胞子群が帯状に生ずる。

コロニー裏面は白色で色素の産生はない。

２、生育条件 ｐＨ：ｐＨ２〜ｐＨ９の広い範囲でよく生育する。

特にｐＨ３〜ｐＨ６では非常によく生育し、酸性側を好
む。

温度：２０℃〜３０℃でよく発育する。１５℃での発育
は幾分良く、１０℃での発育は微弱である。

一方、３７℃でも発育は幾分良いが、４５℃では全（発
育しない。

３、炭素源の利用性 キシロース　　　　　　　什 アラビノース　　　　　　＋ グルコース　　　　　　　÷ マンノース　　　　　　　　÷ フルクトース　　　　　　← ガラクトース　　　　　　拝 スクロース　　　　　　　　梓 セロビオース　　　　　　→ トレハロース　　　　　　　← マルトース　　　　　　　＋ ラクトース　　　　　　　→ ラフィノース　　　　　　± スターチ　　　　　　　　＋ セルロース　　　　　　　± 橙　非常によく利用出来る。

什　よく利用出来る。

＋　利用出来る。

±　はとんど利用出来ない。

４、　フェノールオキシダーゼ反応：陽性本発明方法に
おいては、上記微生物を利用してチロシナーゼ阻害物３
４２２を生産する。このチロシナーゼ阻害物３４２２を
生産するために用いる、前記微生物の培地組成としては
、通常キシロース、アラビノース、グルコース、マンノ
ース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、セロ
ビオース、トレハロース、マルトース、ラクトース又は
スターチなどの炭素源約２〜１０％（重量％、以下同様
）、硫酸アンモニウム、ポリペプトン、硝酸ナトリウム
、パン酵母抽出物、ビール酵母抽出物又はポテト抽出物
などのチッ素源約０．１〜１％、硫酸マグネンウムなど
のマグネシウム源約０．０１〜０．０５％、リン酸１水
素カリウム、リン酸２水素カリウムなどのリンおよびカ
リウム源０．０１〜０．１％、その他硫酸第二鉄、塩化
第二鉄、塩化ナトリウムなどの無機塩約０．００１〜０
．００５％を含有する培地を使用することができる。

本発明においては、使用菌を培地に接種し、空気のよう
な酸素含有ガスを通気などの手段により導入した好気的
条件下で行うのが好ましい。また、培養は１０℃乃至４
０℃、好ましくは２０℃乃至３５℃の温度で２日乃至７
日間行うのが適当である。培養後、菌体を除去し、培養
液を濾過して発酵液を得た。得られた発酵液を１００倍
に稀釈しても強いチロシナーゼ阻害効果を示した。この
発酵液から酸性アルミナでタンパク質、色素などの不純
物を除去後、活性物質を活性炭に吸着させる。

この活性炭を水洗後、含水メタノールで活性物質を抽出
する。この抽出物を乾燥させることによりチロシナーゼ
阻害物３４２２の粗精製物を得る。

〔実施例〕

次に実施例によって本発明を具体的に説胡する。

チロシナーゼ活性阻害作用試験法 チロシナーゼ阻害活性は以下の方法で評価した。

（１）　　反応系試薬 反応系試薬として使用したものは以下のとおりである。

Ｌ−ドーパ（和光純薬）の０．０５％水溶液１／１５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，８）阻害剤（試料溶液） チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製マツシュルームチロシナ
ーゼ）　２０００単位／ｍｇ、　０．７　ｍｇ／ｍｎ（
２）　　チロシナーゼ活性の測定 試料溶液及び測定試薬は測定まで氷で冷やして置く。

反応液の調整 チロシナーゼ活性の測定に際して、次の表１に示した割
合で混合したＣ１．Ｃ２，ＴＩ及びＴ２の４つの反応液
をそれぞれ試験管に３本ずつ用意し、室温に１０分以上
放置して室温に戻す。

測定 Ｃ１，Ｃ２，Ｔ１．Ｔ２　について測定しようとする反
応液を分光光度計用セル（３ｍｊりに移しかえる。

移しかえた溶液に、チロシナーゼ溶液０．０５ｍ！！、
を添加し、添加時より９０秒後に吸光度４７５ｎｍ　（
ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ；以下０．Ｄ、と略）を
分光光度計で測定する。

（３）　　チロシナーゼ活性阻害効果の求めかたチロシ
ナーゼ活性阻害率の計算 Ｃ＋、　Ｃ２，Ｔ　＋、　Ｔ　２について３つずつデー
タが得られるので、それぞれについて平均値を求め、そ
れぞれ′Ｃ１，で２．ゴＩ＋７２　とし、次式に従って
チロシナーゼ活性阻害率を求める。

測定 反応液Ｔ１及びＴ２における試料溶液の濃度を３点以上
において変え、チロシナーゼ活性阻害率を求め、片対数
グラフを用いて縦軸に阻害率、横軸に試料濃度（対数）
をとってグラフを作成し、５０％阻害率を示す試料濃度
を求め、ＩＤｓ。とする。

Ｉ　Ｄｓｏを示す濃度が小さいほど、チロシナーゼ活性
阻害効果が高いことを示す。

実施例１ 培地どして、スクロース３％、リン酸２水素カリウム０
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム
０５０５％、硫酸第二鉄０．００１％及び酵母エキス０
．５％を含有する水溶液を調製し、ｐＨ７に調整した後
、これを三角フラスコに１１５容積分まで充填し、オー
トクレーブで２Ｄ分間高圧滅菌した。この培地にトリコ
デルマ・ハルチアタム３４２２株（微工研菌寄第１０３
４５号）を接種し、２５℃で３日間振とう培養を行った
。培養後、菌体を除去し、培養液を濾過して発酵液を得
た。この発酵液の一部を凍結乾燥することによって凍結
乾燥物を得た。発酵液１βに酸性アルミナ５０ｇを添加
し、約１時間撹拌した後、濾過した。濾液に活性炭５ｍ
ｇ／ｍを添加し、約０．５時間撹拌することによって、
発酵液中のチロシナーゼ活性阻害物を活性炭に吸着させ
た。この活性炭を蒸留水で５回水洗した後、８０％メタ
ノールで活性炭からチロシナーゼ活性阻害物３４２２を
抽出した。この抽出液からエバポレーターでメタノール
を除去した後、凍結乾燥することによってチロシナーゼ
阻害物３４２２の粗精製物的０．５８ｇ／βを得ること
が出来た。

次に、この粗精製物のチロシナーゼ活性５０％阻害率度
を、既知のチロシナーゼ阻害剤であるビタミンＣととも
に測定した。結果を表２に示す。

以上の結果により、チロシナーゼ阻害物３４２２の粗精
製物は強いチロシナーゼ阻害効果を示すことが明らかで
ある。

このチロシナーゼ阻害物３４２２の粗精製物は白色、綿
状の固体で、その水溶液は無色、透明でかつ無臭である
ので、化粧品に使用されるチロシナーゼ阻害物として好
適である。

次に、この阻害物３４２２の粗１！！物の熱安定性につ
いて検討した。阻害物３４２２の粗精製物を２５℃５０
℃、６０℃、８０℃、９０℃の各温度に放置し、一定時
間ごとにチロシナーゼ阻害効果を測定した。その結果を
第１図に示す。

第１図に示すように、阻害物３４２２の粗精製物を６０
℃で９０分間加熱しても、チロシナーゼ阻害活性はほと
んど減少しなかった。さらに、９０℃で９０分間加熱し
てもそのチロシナーゼ阻害活性は約６０％残存しており
、きわめて熱安定性のよいものといえる。

トリコブル？　＠　（Ｔｒ　ｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属
するカビが生産する生理活性物質としては、トリコピリ
ゾイン（Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｉｄｉｎ）、ピリデイン（
Ｖｉｒｉｄｉｎ）、グリオトキシン（Ｇｌｉｏｔｏｘｉ
ｎ）、トリコデルマン（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、
スズカシリ：／　（Ｓｕｚｕｋａｃ　ｉ　１１　ｉｎ）
などが報告されている。しかし、これらはいずれも抗生
物質であり抗菌力をもっている。これに対し、本物質（
チロシナーゼ阻害物３４２２粗精製物）の抗菌力をペー
パーディスク法で検討したところ、本物質２％濃度でも
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ、
１ｉｓ）　　Ｉ　ＡＭ１２１３、スタフィロコックス・
アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅ
ｕｓ）　２０９Ｐ、シュードモナス争エアルギノザア（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｇｉｎｏｓａ）　ＡＴＣ
Ｃ１５４４２、カンジイダア・アルビカンス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）などに対して
全く抗菌力を示さなかった。従って本物質はすでに報告
されている前記生理活性物質とは明らかに異なる新規な
チロシナーゼ阻害物であることがわかった。

実施例２ 培地として、スクロース３％、リン酸２水素カリウム０
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム
０．０５％、硫酸第２鉄０．００１％及び酵母エキス０
．５％を含有する水溶液を調製し、Ｉ］Ｈ７に調整した
後、三角フラスコに１１５容積分まで充填し、オートク
レーブで２０分間高圧滅菌した。この培地に、発酵研究
所（ＩＦＯ）より分譲を受けたトリコデルマ・ハルチア
ヌム（Ｔｒ　ｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）
　ＩＦＯ−３０７１７を接種し、２５℃で３日間振とう
培養を行った。培養後、菌体を除去し、培養液を濾過し
て発酵液を得た。この発酵液を凍結乾燥することによっ
て凍結乾燥物を得た。

実施例３ 培地として、スクロース３％、リン酸２水素カリウム０
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム
０．０５％、硫酸第２鉄０．００１％及び酵母エキス０
．５％を含有する水溶液を調製し、ｐＨ７に調整した後
、三角フラスコに１１５容積分まで充填し、オートクレ
ーブで２０分間高圧滅菌した。この培地に、発酵研究所
より分譲を受けたトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）　ＩＦＤ−３１１３７を接
種し２５℃で３日間振とう培養を行った。培養後、菌体
を除去し、培養液を濾過して発酵液を得た。この発酵液
を凍°結乾燥することによって凍結乾燥物を得た。

次に、実施例１〜実施例３で得られた凍結乾燥物のチロ
シナーゼ活性５０％阻害部度を測定した。

結果を表３に示す。

第１図は、チロシナーゼ阻害物３４２２粗精製物の熱安
定性を示すグラフである。

手 続 補 正 書（自発） 平成１年１月

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トリコデルマ属に属するチロシナーゼ阻害物生産菌
   を培養し、その培養物からチロシナーゼ阻害物を採取す
   ることを特徴とする、チロシナーゼ阻害物３４２２の製
   造方法。 ２、トリコデルマ属に属するチロシナーゼ阻害物生産菌
   がトリコデルマ・ハルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
   ａｈａｒｚｉａｎｕｍ）３４２２（微工研菌寄第１０３
   ４５号）である、請求項１記載の製造方法。 ３、トリコデルマ・ハルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
   ｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）（ＩＦＯ−３０７１７）より
   も高活性のチロシナーゼ阻害物を生産する、トリコデル
   マ・ハルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚ
   ｉａｎｕｍ）３４２２（微工研菌寄第１０３４５号）。