JPS6049262A - アデニン自動分析装置 - Google Patents
アデニン自動分析装置Info
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- JPS6049262A JPS6049262A JP15725483A JP15725483A JPS6049262A JP S6049262 A JPS6049262 A JP S6049262A JP 15725483 A JP15725483 A JP 15725483A JP 15725483 A JP15725483 A JP 15725483A JP S6049262 A JPS6049262 A JP S6049262A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、動植物組織中又は生体体液中に見出されるア
デニン誘導体類を高速液体クロマトグラフで分離して分
析する方法に関し、特に螢光試薬としてブロモアセトア
ルデヒドを用いてアデニン類と螢光反応させ、高感度に
アデニン類をオンラインで自動分析する方法及び装置に
関するもので、動植物等の天然物、生体体液中に非常に
多種類にわたって見い出δれる微力1アデニン類の定量
、合成アデニン類の定量、更にその応用として魚、臓器
等の鮮度測定のだめの分析、又核酸の構造解析(DNA
のシーケンス分析)等に広く利用され得るものである。
デニン誘導体類を高速液体クロマトグラフで分離して分
析する方法に関し、特に螢光試薬としてブロモアセトア
ルデヒドを用いてアデニン類と螢光反応させ、高感度に
アデニン類をオンラインで自動分析する方法及び装置に
関するもので、動植物等の天然物、生体体液中に非常に
多種類にわたって見い出δれる微力1アデニン類の定量
、合成アデニン類の定量、更にその応用として魚、臓器
等の鮮度測定のだめの分析、又核酸の構造解析(DNA
のシーケンス分析)等に広く利用され得るものである。
従来技術
生体内、あるいは天然物中に見い出されている多種類の
アデニン誘導体tよ微量に存在するため、特異的な高感
度分析が必要とされている。
アデニン誘導体tよ微量に存在するため、特異的な高感
度分析が必要とされている。
従来より、アデニン類の紫外線吸収による分析法は多数
行なわれているが、紫外線を吸収する物質が多数存在す
るため特異的選択的でなく、又感度も吸光鹿で測定する
ため限度があシ充分でない。
行なわれているが、紫外線を吸収する物質が多数存在す
るため特異的選択的でなく、又感度も吸光鹿で測定する
ため限度があシ充分でない。
最近になってクロルアセトアルデヒドを用いて螢光反応
させ、高速液体クロマトグラフで分析する方法(J、
Chromatogr、 123.220,1976
)が提案されているが、これらの反応に使われているク
ロルアセトアルデヒドは反応性が悪く、特に反応に高温
と長時間を要し、しかも反応率が充分でないなど種々の
欠点を有していた。
させ、高速液体クロマトグラフで分析する方法(J、
Chromatogr、 123.220,1976
)が提案されているが、これらの反応に使われているク
ロルアセトアルデヒドは反応性が悪く、特に反応に高温
と長時間を要し、しかも反応率が充分でないなど種々の
欠点を有していた。
これら上述の欠点を克服して、螢光反応性が高く従って
高感度でかつすぐれた選択性を備えたアデニン類の発蛍
光分析法として、ブロモアセトアルデヒドをアデニン類
と反応させ、生成する螢光物質の螢光を検出する分析法
が特願昭53−22556号とし、て出願されている。
高感度でかつすぐれた選択性を備えたアデニン類の発蛍
光分析法として、ブロモアセトアルデヒドをアデニン類
と反応させ、生成する螢光物質の螢光を検出する分析法
が特願昭53−22556号とし、て出願されている。
しかし、この方法は感度の点では優れているものの操作
の上で種々問題があった。すなわち、高速液体クロマト
グラフでアデニン類を分離検出する前にブロモアセトア
ルデヒド試薬とアデニン類及び緩衝液を反応させるプレ
ラベル法を行っているため、プレラベル化の面倒な操作
のためオンラインの自動化ができず、又ラベル化された
成分に経時変化があシ、検出誤差を生じ、ブjffモア
セトアルデヒド試薬は刺激性のある試薬のためプレラベ
ル処理に注意を要するなど種々の問題をかかえていた。
の上で種々問題があった。すなわち、高速液体クロマト
グラフでアデニン類を分離検出する前にブロモアセトア
ルデヒド試薬とアデニン類及び緩衝液を反応させるプレ
ラベル法を行っているため、プレラベル化の面倒な操作
のためオンラインの自動化ができず、又ラベル化された
成分に経時変化があシ、検出誤差を生じ、ブjffモア
セトアルデヒド試薬は刺激性のある試薬のためプレラベ
ル処理に注意を要するなど種々の問題をかかえていた。
目 的
本発明は、かかる現状に基いてなされたものでオシ、ブ
ロモアセトアルデヒドをアデニン類と反応させると高感
度螢光発色が得られ高感度検出が出来る利点を生かし、
液体りDマドグラフで分離分析する前に行なう煩雑な前
処理を不要とし、反応をオンラインで行なって自動分析
を可能とするアデニン類自動分析方法及び装置を提供す
ることにある。
ロモアセトアルデヒドをアデニン類と反応させると高感
度螢光発色が得られ高感度検出が出来る利点を生かし、
液体りDマドグラフで分離分析する前に行なう煩雑な前
処理を不要とし、反応をオンラインで行なって自動分析
を可能とするアデニン類自動分析方法及び装置を提供す
ることにある。
梠 成
本発明の目的を達成するだめ、本発明の方法においては
異なる二つの混入方法を採用することによシ螢光試薬ブ
ロモアセトアルデヒドるアデニン類の分析を行なうもの
である。
異なる二つの混入方法を採用することによシ螢光試薬ブ
ロモアセトアルデヒドるアデニン類の分析を行なうもの
である。
本発明の構成の一つは、アデニン類を高速液体クロマト
グラフのカラムで分離後、別の反応試薬送液ポンプによ
)螢光試薬ブロモアセトアルデヒドをカラム溶液中に混
入して送液し、該カラム溶出液全反応槽を通過させ生成
さhだ螢光物質を螢光検出器によシ検出して分析を行な
うものである。
グラフのカラムで分離後、別の反応試薬送液ポンプによ
)螢光試薬ブロモアセトアルデヒドをカラム溶液中に混
入して送液し、該カラム溶出液全反応槽を通過させ生成
さhだ螢光物質を螢光検出器によシ検出して分析を行な
うものである。
他の構成は、螢光試薬ブロモアセトアルデヒドを高速液
体クロマトグラフのカラムで分離する前の溶離液中に含
有させ、カラム溶出液を反応槽を通過させ生成された螢
光物質を螢光検出器によシ検出して分析を行なうもので
おる。
体クロマトグラフのカラムで分離する前の溶離液中に含
有させ、カラム溶出液を反応槽を通過させ生成された螢
光物質を螢光検出器によシ検出して分析を行なうもので
おる。
これら二つの構成は、どちらを用いても同じくアデニン
類の分析が可能でアリ、どちらを用いても良い。
類の分析が可能でアリ、どちらを用いても良い。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例
第1図,第2図に本発明の実施例をゾロツク図で示す。
し1中同じ番号は同じものを示す。打工1図は、カラム
で分離されたカラム溶出液中に螢光試薬ブロモアセトア
ルデヒド金試薬ポンプで送液混入する方法の実施例を示
す。1は溶離液送液用ポンプ、5は反応試薬送液用ポン
プ、2は溶媒、4はカラノ・、4′は恒温槽、3は試料
注入部、6は螢光試薬ブロモアセトアルデヒド溶液、7
は反応槽、7′は恒温槽、8は冷却・9イゾ、9は螢光
検出器、10は記録計、11に一排液。4′はカラムの
分81亡を最適温度条件に、7′は反応槽を最適温度条
件にするだめの恒温槽である。
で分離されたカラム溶出液中に螢光試薬ブロモアセトア
ルデヒド金試薬ポンプで送液混入する方法の実施例を示
す。1は溶離液送液用ポンプ、5は反応試薬送液用ポン
プ、2は溶媒、4はカラノ・、4′は恒温槽、3は試料
注入部、6は螢光試薬ブロモアセトアルデヒド溶液、7
は反応槽、7′は恒温槽、8は冷却・9イゾ、9は螢光
検出器、10は記録計、11に一排液。4′はカラムの
分81亡を最適温度条件に、7′は反応槽を最適温度条
件にするだめの恒温槽である。
第2図はブロモアセトアルデヒドを溶離液と共に送液す
る実施例を示す。螢光試薬ブロモアセトアルデヒドを、
カラムを通過さゼ゛る前の溶媒2に入れて試料を試料注
入口:3よシ注入して分析する。カラム4,恒温槽4′
,反応4曹7,恒温槽7′,冷却パイグ8,検出器9,
記録1110は第1図と同様である。アデニン類は螢光
試薬ブロモアセトアルデヒド( BrCIL2CILO
)と反応してケイ光物質のI N’−エテノ誘勇.体
を生成し、240〜320■の光を照射して:380〜
500叫の螢ブtk検出することによシ分析8 i’L
る。
る実施例を示す。螢光試薬ブロモアセトアルデヒドを、
カラムを通過さゼ゛る前の溶媒2に入れて試料を試料注
入口:3よシ注入して分析する。カラム4,恒温槽4′
,反応4曹7,恒温槽7′,冷却パイグ8,検出器9,
記録1110は第1図と同様である。アデニン類は螢光
試薬ブロモアセトアルデヒド( BrCIL2CILO
)と反応してケイ光物質のI N’−エテノ誘勇.体
を生成し、240〜320■の光を照射して:380〜
500叫の螢ブtk検出することによシ分析8 i’L
る。
本発明を第2図の構成によって分離分析した測定結果を
第3図以下に示す。
第3図以下に示す。
測ン屁条件は以下の通9である。
溶 媒: 0.025 M クエン酸−0,05Mリン
酸水素ナトリウム−0,3M食塩バッファー溶液(PH
5,0) ニ ア −ヒ ト ニ ト リ ル (4:IV/V)0.
1Mグロモアセトアルデヒド 流 速:0.1mも2分 カラム:日立ダル30/2 N (4,6mIDX 3
5m+L)温度45C 反応コイル: 0.1m IDX 30 mL 温度1
00C検 出:日本分光FP−110 励起 253.7]m エミッション 400 nm F3図に、溶離液中のアセトニトリル濃度のキャパシテ
ィーファクターに対する効果を示す。
酸水素ナトリウム−0,3M食塩バッファー溶液(PH
5,0) ニ ア −ヒ ト ニ ト リ ル (4:IV/V)0.
1Mグロモアセトアルデヒド 流 速:0.1mも2分 カラム:日立ダル30/2 N (4,6mIDX 3
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00C検 出:日本分光FP−110 励起 253.7]m エミッション 400 nm F3図に、溶離液中のアセトニトリル濃度のキャパシテ
ィーファクターに対する効果を示す。
横軸はアセトニトリルの濃度、縦軸はキャ/やシティ−
ファクターに′の対数togK’、ここでに′ハに’
−(tr to ) / to と定義される。ここで
t。
ファクターに′の対数togK’、ここでに′ハに’
−(tr to ) / to と定義される。ここで
t。
はアデノシンの保持時間、trは他の成分の保持時間で
ある。一般にtoはサンプル溶媒等の成分の保持時間で
カラムに保持されずに溶出する。
ある。一般にtoはサンプル溶媒等の成分の保持時間で
カラムに保持されずに溶出する。
図中口はAMP (アデニンモノホスフェイト)X ハ
cAMP (サイクリック アデニンモノホスフェイト
)○はADP (アデニンディホスフェイト)OはAT
P (アデニントリホスフェイト)を示す。アデニ/は
保持されずに溶出すると考えられる。第3図より、アセ
トニトリル選んで分離すれば、保持時間が別々となり分
離されることが判る。
cAMP (サイクリック アデニンモノホスフェイト
)○はADP (アデニンディホスフェイト)OはAT
P (アデニントリホスフェイト)を示す。アデニ/は
保持されずに溶出すると考えられる。第3図より、アセ
トニトリル選んで分離すれば、保持時間が別々となり分
離されることが判る。
第4図はアデニンとブロモアセトアルデヒドのゾレカラ
ム反応(カラムで分離前に反応)とポストカラム反応(
カラムで分離後の反応)によるクロマトグラムを示す。
ム反応(カラムで分離前に反応)とポストカラム反応(
カラムで分離後の反応)によるクロマトグラムを示す。
A:アデニン類I P +r+ot,ノI/カラム反応
によシラベル化した成分のブロモアセトアルデヒドを溶
離液と共に反LiSコイル100C’.r通した時の分
離分析例 B;アデニン類IPmoAeゾレカラム反応によシラベ
ル化した成分をブロモアセトアルデヒドなしで100C
反応コイルを通した分析例 Cニルカラム反応を行なっていないアデニン類I P
motを100Cの反応コイルを通してブロモアセトア
ルデヒドを溶離液と共に送液し分離分析した例 り、Cと同様であるが反応コイル’5r,20Cに恒温
化した時の分析例 第5図には反応コイルの温度効果を示す。図中の曲線は
それぞれ3 P motのアデニンをブロモアセトアル
デヒドを加えた溶離液で分離し種種の温度の反応コイル
を通した時の反応収率であシ、1],×80,・の成分
は第3図と同様である。
によシラベル化した成分のブロモアセトアルデヒドを溶
離液と共に反LiSコイル100C’.r通した時の分
離分析例 B;アデニン類IPmoAeゾレカラム反応によシラベ
ル化した成分をブロモアセトアルデヒドなしで100C
反応コイルを通した分析例 Cニルカラム反応を行なっていないアデニン類I P
motを100Cの反応コイルを通してブロモアセトア
ルデヒドを溶離液と共に送液し分離分析した例 り、Cと同様であるが反応コイル’5r,20Cに恒温
化した時の分析例 第5図には反応コイルの温度効果を示す。図中の曲線は
それぞれ3 P motのアデニンをブロモアセトアル
デヒドを加えた溶離液で分離し種種の温度の反応コイル
を通した時の反応収率であシ、1],×80,・の成分
は第3図と同様である。
高温にする程ピーク値は高くなっている。
紀6図にアデニン類の検量線を示す。横軸は注入量で縦
軸はピーク値である,口,×,○,・の成分は第3図と
同様である。
軸はピーク値である,口,×,○,・の成分は第3図と
同様である。
第7図は、ATPのクロマトグラムを示すもので、5
P matのATPを分析した例である。 ・第8図は
脳抽出液のクロマトグラムを示すもので、ラット( m
ale Wlster 2 1 0 S’型重量の新鮮
な脳を3mtの0.4MHCω4中でホモジナイズし遠
心分離した上澄の1部を溶離液で50倍に希釈、希釈し
た溶液1μtf:注入し分離分析したクロマトグラムで
ある。
P matのATPを分析した例である。 ・第8図は
脳抽出液のクロマトグラムを示すもので、ラット( m
ale Wlster 2 1 0 S’型重量の新鮮
な脳を3mtの0.4MHCω4中でホモジナイズし遠
心分離した上澄の1部を溶離液で50倍に希釈、希釈し
た溶液1μtf:注入し分離分析したクロマトグラムで
ある。
J」し」Ll
ブロモアセトアルデヒドをアデニン類と反応させると高
感度螢光発色が得られ茜感度検出が出来ることが実施例
による測定結果より明らかである。更に、ブロモアセト
アルデヒド試薬とアデニン類及び緩衝液全反応させるフ
0レラベルの面倒な操作を省略した栴成によって分析を
行っているだめオンラインの自動分析が可能となった。
感度螢光発色が得られ茜感度検出が出来ることが実施例
による測定結果より明らかである。更に、ブロモアセト
アルデヒド試薬とアデニン類及び緩衝液全反応させるフ
0レラベルの面倒な操作を省略した栴成によって分析を
行っているだめオンラインの自動分析が可能となった。
本発明による高感度自動分析によるアデニンの分離分析
装置は、動植物の生体体液のアラ′二ン類の定量、核酸
の構造解析等多方面の利用が可能であシ産業の貢献多大
である。
装置は、動植物の生体体液のアラ′二ン類の定量、核酸
の構造解析等多方面の利用が可能であシ産業の貢献多大
である。
第1図,第2図は本発明のアデニン自動分析装置のブロ
ックダイアダラムを示す。 第1図は、ブロモアセトアルデヒドを試=1g 、1?
ンノで送液する実施例、第2図はブロモアセトアルデヒ
ドを溶61#液と共に送液する実施例、第3図は溶離液
中のアセトニトリル濃度のキャノ9シティーファクター
に対する効果を示す測定例、第4図はアデニンとブロモ
アセトアルデヒドのノ0レカラム反応とポストカラム反
応によるクロマトグラム、第5図は、分離ピーク値に対
する反応コイルの温度効果、第6図はアデニン類の検f
fl[、第7図はATPのクロマトグラム、第8図は脳
油出液のクロマトグラム。 1・・・ポンプ、2・・・溶離液、3・・・試料注入口
、4・・カラム、5・・・試薬7j?ンプ、6・・反応
液、7・・・反応コイル、8・・・冷却・ぐイゾ、9・
・・螢光検出器、10・・・記録、11・・・排液。 特許出願人 日本分光工業株式会社 代理人 丸 山幸雄 第 3 図 10 30 50V/VO/。 ACetO=tti’le 第 4 図 J) lpl ゲ・1 6 図 ンIJ ユへ甑 第 7 図 竺8図 ′/11 0―
ックダイアダラムを示す。 第1図は、ブロモアセトアルデヒドを試=1g 、1?
ンノで送液する実施例、第2図はブロモアセトアルデヒ
ドを溶61#液と共に送液する実施例、第3図は溶離液
中のアセトニトリル濃度のキャノ9シティーファクター
に対する効果を示す測定例、第4図はアデニンとブロモ
アセトアルデヒドのノ0レカラム反応とポストカラム反
応によるクロマトグラム、第5図は、分離ピーク値に対
する反応コイルの温度効果、第6図はアデニン類の検f
fl[、第7図はATPのクロマトグラム、第8図は脳
油出液のクロマトグラム。 1・・・ポンプ、2・・・溶離液、3・・・試料注入口
、4・・カラム、5・・・試薬7j?ンプ、6・・反応
液、7・・・反応コイル、8・・・冷却・ぐイゾ、9・
・・螢光検出器、10・・・記録、11・・・排液。 特許出願人 日本分光工業株式会社 代理人 丸 山幸雄 第 3 図 10 30 50V/VO/。 ACetO=tti’le 第 4 図 J) lpl ゲ・1 6 図 ンIJ ユへ甑 第 7 図 竺8図 ′/11 0―
Claims (2)
- (1)アデニン類を高速液体クロマトグラフで分離分析
する装置において、カラムで分離されたカラム溶出液中
に新たな反応試薬送液、I?ンデによシ螢光試薬ブロモ
アセトアルデヒドを混入して送液し、該混合したカラム
溶出液を反応槽を通過させ生成された螢光生成物を螢光
検出器によシ検出分析することを特徴とするアデニン類
自動分析装置。 - (2)核酸成分を高速液体クロマトグラフで分離分析す
る装置において、螢光試薬ブロモアセトアルデヒドを溶
離液中に含有させ、カラム溶出液を反応槽を通過さぜ生
成された螢光生成物を螢光検出器により検出分析するこ
と全特徴とするアデニン類自動分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15725483A JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15725483A JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6049262A true JPS6049262A (ja) | 1985-03-18 |
| JPH0544623B2 JPH0544623B2 (ja) | 1993-07-06 |
Family
ID=15645626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15725483A Granted JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6049262A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61254852A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Shimadzu Corp | ヒスタミンの分析方法及び装置 |
| JPS6438636A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-08 | Ajinomoto Kk | Fluorescent analyzer |
| JPH03175356A (ja) * | 1989-12-04 | 1991-07-30 | Res Dev Corp Of Japan | 核酸構成成分過酸化物による核酸損傷程度測定方法および測定装置 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5529791A (en) * | 1978-06-14 | 1980-03-03 | Bifok Ab | Method of continuous measuring |
-
1983
- 1983-08-30 JP JP15725483A patent/JPS6049262A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5529791A (en) * | 1978-06-14 | 1980-03-03 | Bifok Ab | Method of continuous measuring |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61254852A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Shimadzu Corp | ヒスタミンの分析方法及び装置 |
| JPS6438636A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-08 | Ajinomoto Kk | Fluorescent analyzer |
| JPH03175356A (ja) * | 1989-12-04 | 1991-07-30 | Res Dev Corp Of Japan | 核酸構成成分過酸化物による核酸損傷程度測定方法および測定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0544623B2 (ja) | 1993-07-06 |
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