JPS6058074A - バチルス・ブレビスを形質転換する方法 - Google Patents
バチルス・ブレビスを形質転換する方法Info
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- JPS6058074A JPS6058074A JP58165066A JP16506683A JPS6058074A JP S6058074 A JPS6058074 A JP S6058074A JP 58165066 A JP58165066 A JP 58165066A JP 16506683 A JP16506683 A JP 16506683A JP S6058074 A JPS6058074 A JP S6058074A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドおよびそれを用いてバチルス・プレ
ビスを形質転換する方法に関する。
ビスを形質転換する方法に関する。
バチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｇ
）は表層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。
）は表層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。
な性質に着目し、本菌は組換えＤＮＡの受容菌として好
適なものであると考えた。
適なものであると考えた。
しかるに、これまでにバチルス・プレビスにおいてはコ
ピー数の多いプラスミドは見出されていない。このよう
な事情のため、バチルス・ブレｊビスのＤＮＡ受容菌と
し沓ぐれた性質は利用されていなかった〇 そこで、バチルス−プレビス細胞内でよく増殖できるプ
ラスミドベクターの開発が強く要望されている。
ピー数の多いプラスミドは見出されていない。このよう
な事情のため、バチルス・ブレｊビスのＤＮＡ受容菌と
し沓ぐれた性質は利用されていなかった〇 そこで、バチルス−プレビス細胞内でよく増殖できるプ
ラスミドベクターの開発が強く要望されている。
本発明者らは、スタフィロコッカス・アウレウス由来の
プラスミドであってバチルス・ズブチリスを宿主とする
ベクターとして広く使用されているｐＵＢ １１０ （
Ｇｒｙａｗａｎ、 Ｔ、 Ｊ、 、 ８．０ｏｎｔｅｎ
ｔｅ ｔｍｄＤ。
プラスミドであってバチルス・ズブチリスを宿主とする
ベクターとして広く使用されているｐＵＢ １１０ （
Ｇｒｙａｗａｎ、 Ｔ、 Ｊ、 、 ８．０ｏｎｔｅｎ
ｔｅ ｔｍｄＤ。
Ｄｕｂｎａｎ （１９ｙｓ） Ｊ、Ｅａｃｔｅｒｉｏｌ
、 １５４．３１８−５２９ ）に注目し、このプラス
ミドベクターｐＵＢ ｉ １０を用いてバチルス・プレ
ビスを形質転換したところ、ｐＵｌ １１０はバチルス
。プレビス細胞内で極めてよく増殖することならびに該
プラスミドｐＵＢ １１０バチルス・プレビスを形質転
換せしめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく発
現することを見出した。
、 １５４．３１８−５２９ ）に注目し、このプラス
ミドベクターｐＵＢ ｉ １０を用いてバチルス・プレ
ビスを形質転換したところ、ｐＵｌ １１０はバチルス
。プレビス細胞内で極めてよく増殖することならびに該
プラスミドｐＵＢ １１０バチルス・プレビスを形質転
換せしめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく発
現することを見出した。
本発明は第１にプラスミドｐＵＢ ｊ １０のドライブ
ユニット領域を少なくとも有するプラスミドであってバ
チルス・プレビスの細胞内に含まれているプラスミドを
提供するものであシ、第２にバチルス・プレビスの細胞
内にプラスミドｐＵＢ １１０のドライブユニット領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを特徴と
するバチルス・プレビスの形質転換方法を提供するもの
である。
ユニット領域を少なくとも有するプラスミドであってバ
チルス・プレビスの細胞内に含まれているプラスミドを
提供するものであシ、第２にバチルス・プレビスの細胞
内にプラスミドｐＵＢ １１０のドライブユニット領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを特徴と
するバチルス・プレビスの形質転換方法を提供するもの
である。
ここで、ドライブユニット領域とはｏｒｉ領域と同餞で
あシ、宿主細胞内でプラスミドが増殖しつる機能を司る
ＤＮＡ領域を意味する。本発明のプラスミドｐＵＢ １
１０のドライブユニット領域を少なくとも有するプラス
ミドとしてドライブユニット領域のほかに薬剤耐性など
の宿主細胞内に導入されたときに、その宿主を形質転換
して当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出来
るよう圧するための、いわゆるマーカー遺伝子が含まれ
ているものを用いることが望ましい。さらに、プロモー
ター配列を入れておくこともでき、そのほか発現させる
べき蛋白質をコードする遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌
せしめるに必要なりＩＩＡなどが挿入されていてもよい
。すなわち、これらマーカー遺伝子、プロモーター配列
、外来遺伝子および／または蛋白質分泌のためのＤＮＡ
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明における
プラスミドに含まれるものである。
あシ、宿主細胞内でプラスミドが増殖しつる機能を司る
ＤＮＡ領域を意味する。本発明のプラスミドｐＵＢ １
１０のドライブユニット領域を少なくとも有するプラス
ミドとしてドライブユニット領域のほかに薬剤耐性など
の宿主細胞内に導入されたときに、その宿主を形質転換
して当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出来
るよう圧するための、いわゆるマーカー遺伝子が含まれ
ているものを用いることが望ましい。さらに、プロモー
ター配列を入れておくこともでき、そのほか発現させる
べき蛋白質をコードする遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌
せしめるに必要なりＩＩＡなどが挿入されていてもよい
。すなわち、これらマーカー遺伝子、プロモーター配列
、外来遺伝子および／または蛋白質分泌のためのＤＮＡ
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明における
プラスミドに含まれるものである。
本発明のｐＵＢ １１０由来の新しいプラスミドは具体
的には次のようなものがある。すなわち、第１図に制限
酵素切断地図を示しだプラスミドｐｌＢ−２はｐＵＢ
１１０とＴＩＢＢ！＋２２を結合したものでアシ、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ）とバチルス・ プレビス（Ｅａ
ａｉｌ１８ｂｒｅｖｉｓ ） におけるシャトルベクタ
ーであり、いずれの細菌においてもコピー数が多いとい
う特色がある。図中、Ａｍｐ’ はアンピシリン耐性、
Ｔａｒはテトラサイクリン耐性、 Ｎｍｒはネオマイシ
ン耐性を示す。第２図に、本発明の新しいプラスミドで
あるｐＫＢ−５およびｐＥＴ −１の制限酵素切断地図
およびその造成経過を示す。ｐＨＴ −１はｐＵＢｌｌ
ｏと同様にバチルス・プレビスでコピー数の多いプラス
ミドであシ、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｍｒ）のほか
にエリスロマイシン耐性遺伝子（ｍ−’ ）を含んでい
る。さらに、ｐＵＢ １１０ＤＮＡに存在した制限酵素
切断部位以外にＨ１ｎ４■によシ１個所切−断される部
位をもっている。また、ｐＵＢｌｌｏとα−アミラ）ゼ
な結合させて得たプラスミドｐＢＡＭ−１０２の制限酵
素切断地図を第３図に示す。
的には次のようなものがある。すなわち、第１図に制限
酵素切断地図を示しだプラスミドｐｌＢ−２はｐＵＢ
１１０とＴＩＢＢ！＋２２を結合したものでアシ、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ）とバチルス・ プレビス（Ｅａ
ａｉｌ１８ｂｒｅｖｉｓ ） におけるシャトルベクタ
ーであり、いずれの細菌においてもコピー数が多いとい
う特色がある。図中、Ａｍｐ’ はアンピシリン耐性、
Ｔａｒはテトラサイクリン耐性、 Ｎｍｒはネオマイシ
ン耐性を示す。第２図に、本発明の新しいプラスミドで
あるｐＫＢ−５およびｐＥＴ −１の制限酵素切断地図
およびその造成経過を示す。ｐＨＴ −１はｐＵＢｌｌ
ｏと同様にバチルス・プレビスでコピー数の多いプラス
ミドであシ、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｍｒ）のほか
にエリスロマイシン耐性遺伝子（ｍ−’ ）を含んでい
る。さらに、ｐＵＢ １１０ＤＮＡに存在した制限酵素
切断部位以外にＨ１ｎ４■によシ１個所切−断される部
位をもっている。また、ｐＵＢｌｌｏとα−アミラ）ゼ
な結合させて得たプラスミドｐＢＡＭ−１０２の制限酵
素切断地図を第３図に示す。
上記各プラスミドを導入した大腸菌およびノ（チルス・
プレビスはいずれも微工研に寄託されておシ、菌株名と
寄託番号は以下の通りである。
プレビスはいずれも微工研に寄託されておシ、菌株名と
寄託番号は以下の通りである。
１１！ｅｃｈｅｒｉａｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／
ｐＨ１Ｂ−２ＦＩＣＲＭＰ−７２２７ＨＢ １０１／醪
Ｂ−５ＦＩｌ＋ＲＭ Ｐ−７２２８Ｂ＆ｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ ４７／ｐＨＴ−１ア］ＩｉｎＭ Ｐ−７
２２６１４７／ｐＢＡＭ−１０２’Ｉ！ＨＲＭ Ｐ−７
’２２５どがある。また、プラスミドベクターの例とし
ては上記した４種類のプラスミドがある。
ｐＨ１Ｂ−２ＦＩＣＲＭＰ−７２２７ＨＢ １０１／醪
Ｂ−５ＦＩｌ＋ＲＭ Ｐ−７２２８Ｂ＆ｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ ４７／ｐＨＴ−１ア］ＩｉｎＭ Ｐ−７
２２６１４７／ｐＢＡＭ−１０２’Ｉ！ＨＲＭ Ｐ−７
’２２５どがある。また、プラスミドベクターの例とし
ては上記した４種類のプラスミドがある。
バチルス拳プレビスを形質転換する方法としては以下の
ような方法があるＯ 高滲透圧液（高張溶液とも云う。）に浮遊した細胞にリ
ゾチームを作用させて生じたプロトプラスト（細胞壁を
失なった裸の細胞）にポリエチレングリフールを用いて
プラスミドＤＮＡを導入する方法や後述するように、ア
ルカリ性トリス塩酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除
去した細胞（細胞壁の蛋白質のみを失なった細胞）にポ
リエチレングリコールを用いてプラスミドＤＮＡを導入
する方法がある。
ような方法があるＯ 高滲透圧液（高張溶液とも云う。）に浮遊した細胞にリ
ゾチームを作用させて生じたプロトプラスト（細胞壁を
失なった裸の細胞）にポリエチレングリフールを用いて
プラスミドＤＮＡを導入する方法や後述するように、ア
ルカリ性トリス塩酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除
去した細胞（細胞壁の蛋白質のみを失なった細胞）にポ
リエチレングリコールを用いてプラスミドＤＮＡを導入
する方法がある。
本発明のプラスミドを用いることによってノくチルス・
プレビスを容易に形質転換することができる。このバチ
ルス・プレビスは蛋白質を菌体外に多量に生産する能力
を有しておシ、しかもブｐテアーゼ活性がないので、生
成した蛋白質が分解されない。したがって、動物、植物
および微生物山水／７−１纏桜手か釦込んだ渦を、その
遺伝子の有する遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生
成した蛋白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、
本発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチルス・
プレビスの培養は通常のバチルス・プレビスの培養と同
じ方法で行なえばよい。
プレビスを容易に形質転換することができる。このバチ
ルス・プレビスは蛋白質を菌体外に多量に生産する能力
を有しておシ、しかもブｐテアーゼ活性がないので、生
成した蛋白質が分解されない。したがって、動物、植物
および微生物山水／７−１纏桜手か釦込んだ渦を、その
遺伝子の有する遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生
成した蛋白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、
本発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチルス・
プレビスの培養は通常のバチルス・プレビスの培養と同
じ方法で行なえばよい。
次に、本発明を実施例によシ説明する。
実施例１
第２図に示したように、プラスミドｐＨ０７９（Ｈｏｈ
ｎ、 Ｂ、ａｎｄ ０ｏｌｌｉｎｅ 、 ：ｆ、 （１
９８０） Ｇｏｎｏ １１．２９１−２９８）とプラス
ミドｐＵＢ １１０ （Ｇｒｙｃｚａｎ 、 Ｔ、 Ｊ
、。
ｎ、 Ｂ、ａｎｄ ０ｏｌｌｉｎｅ 、 ：ｆ、 （１
９８０） Ｇｏｎｏ １１．２９１−２９８）とプラス
ミドｐＵＢ １１０ （Ｇｒｙｃｚａｎ 、 Ｔ、 Ｊ
、。
Ｓ、 ０ｏｎｔｅｎｔｅ ａｎｄ Ｄ、 Ｄｕｂｎａｎ
（１９７Ｂ ） Ｊ、 Ｂａａｔｅｒｉｏｌ。
（１９７Ｂ ） Ｊ、 Ｂａａｔｅｒｉｏｌ。
Ｖ己、 ３１Ｂ−１２９）とをＩＩ！ｃｏＰＩ部位で結
合したものをｎｔｎ（Ｉ ＩＩＩ 、 Ｏｌａ Ｈで切
断し、これにＨｌｎｄｌｌｌ。
合したものをｎｔｎ（Ｉ ＩＩＩ 、 Ｏｌａ Ｈで切
断し、これにＨｌｎｄｌｌｌ。
ＣＩＩＬＩで切断して得たプラスミドｐＨＷ １ （Ｈ
ｏｒｉｎｏｕＱｈｉ 。
ｏｒｉｎｏｕＱｈｉ 。
Ｓ ａｎｄ Ｂ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ （１９８２）
、Ｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５０．８０４−８１４
）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入することに
よってシャトルベクターｐＫＥ ５を得た。
、Ｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５０．８０４−８１４
）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入することに
よってシャトルベクターｐＫＥ ５を得た。
次いで、このプラスミドｐＨＢ ５から０．９ＫｂのＢ
ａｍＨｉ断片を除去することによりプラスミドｐＨＴ−
１を得た。
ａｍＨｉ断片を除去することによりプラスミドｐＨＴ−
１を得た。
実施例２
プラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＵＢ１１０を用
い、実施例１と同様にしてこれらをＫｃｏＢ １部位で
結合することにより、第１図に示したプラスミドｐＦｉ
Ｂ ２を得た。
い、実施例１と同様にしてこれらをＫｃｏＢ １部位で
結合することにより、第１図に示したプラスミドｐＦｉ
Ｂ ２を得た。
実施例５
（１１好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離バチルス・ス
テアロザーモフィラス（Ｂ、 ５ｔｅａｒｏ −ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） ＤＹ −５の好熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＨ工５０１よシα−ア
ミラーゼ遺伝子を以下のようにして調製した。
テアロザーモフィラス（Ｂ、 ５ｔｅａｒｏ −ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） ＤＹ −５の好熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＨ工５０１よシα−ア
ミラーゼ遺伝子を以下のようにして調製した。
プラスミドｐＨ工５ｏ１（％ＦＭ昭５８−５０１４８号
明細書参照）を制限酵素］ｊｊａｏＢ Ｉで部分的に加
水分解後、再びＢａｒｎ Ｈｌで部分的に加水分解し、
種々の長さのＤＮＡを調製し、これをα−アミラーゼ遺
伝子として用いた。
明細書参照）を制限酵素］ｊｊａｏＢ Ｉで部分的に加
水分解後、再びＢａｒｎ Ｈｌで部分的に加水分解し、
種々の長さのＤＮＡを調製し、これをα−アミラーゼ遺
伝子として用いた。
（２） バチルス・ズプヂリスとバチルス・プレビス４
７への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクローニング ベクター・プラスミドとしてｐＵ１３１１０を用いた。
７への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクローニング ベクター・プラスミドとしてｐＵ１３１１０を用いた。
まず、プラスミドｐＵＢ １００を制限酵素’ＥａｏＢ
ＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５′末端のリン酸基をバ
クチリアル・アルカリ・ホスファターゼ処理により除去
し、線状プラスミドｐＵＢ １１ Ｇを調製した。
ＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５′末端のリン酸基をバ
クチリアル・アルカリ・ホスファターゼ処理により除去
し、線状プラスミドｐＵＢ １１ Ｇを調製した。
前記好熱性アミラーゼＤＮＡと線状プラスミドｐＵＢ
１１０を混合し、Ｔ４ＤＩＩＡリガーゼで両ＤＮＡを連
結した。
１１０を混合し、Ｔ４ＤＩＩＡリガーゼで両ＤＮＡを連
結した。
連結したＤＮＡを枯草菌（Ｅ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）
Ｉ Ａ ２８９（α−アミラーゼ陰性株）にＯｈ＝ｇ
、 Ｓ、 ａｎｄ ０ｏｈｅｎ 。
Ｉ Ａ ２８９（α−アミラーゼ陰性株）にＯｈ＝ｇ
、 Ｓ、 ａｎｄ ０ｏｈｅｎ 。
Ｓ、 ）Ｉ、のプロトプラスト法（Ｍｏ１ｅａ、 Ｑｅ
ｎ、 Ｇｏｎｏ七、１６８゜１１１−１１５ （１９７
９）） で形質転換し、カナマイシン耐性によシ多数の
形質転換株を得た。これらの形質転換株を１％可溶性デ
ンプンと１０μν盲カナマイシンを含むＤｉｆｃｏ Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３プレート上にレ
プリカし、１夜培養後、ヨードデンプン反応によりコロ
ニーの周辺が無色になっているものを検索することによ
ってα−アミラーゼ生産株を選択した。第３図はα−ア
ミラーゼ遺伝子の入ったプラスミドｐＢＡＭ −１０２
の制限酵素切断地図である。
ｎ、 Ｇｏｎｏ七、１６８゜１１１−１１５ （１９７
９）） で形質転換し、カナマイシン耐性によシ多数の
形質転換株を得た。これらの形質転換株を１％可溶性デ
ンプンと１０μν盲カナマイシンを含むＤｉｆｃｏ Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３プレート上にレ
プリカし、１夜培養後、ヨードデンプン反応によりコロ
ニーの周辺が無色になっているものを検索することによ
ってα−アミラーゼ生産株を選択した。第３図はα−ア
ミラーゼ遺伝子の入ったプラスミドｐＢＡＭ −１０２
の制限酵素切断地図である。
上記α−アミラーゼ遺伝子の入ったプラスミドを有する
枯草菌よりプラスミドをＢｉｒｎｂｏｉｍ 、 Ｈ。
枯草菌よりプラスミドをＢｉｒｎｂｏｉｍ 、 Ｈ。
０、 ａｎｄ Ｄｏｌｙ 、 Ｊ、の方法（Ｎｕｃｌｓ
ｉａ Ａｃ１ｄｓ Ｅｅｓ、、７ 。
ｉａ Ａｃ１ｄｓ Ｅｅｓ、、７ 。
１５１！ｌ−１５２５（１９７９））により抽出し、セ
シウムク四ライドーエチジウムブロマイド超遠心分離法
でさらにプラスミドＤＮＡを精製したのちバチルス・プ
レビス４７菌の形質転換に使用した。
シウムク四ライドーエチジウムブロマイド超遠心分離法
でさらにプラスミドＤＮＡを精製したのちバチルス・プ
レビス４７菌の形質転換に使用した。
まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩割液による処理に
よってバチルス・プレビスの表層蛋白質を除去し、残さ
れたペプチドグリカン層と細胞質膜によってのみ囲まれ
た細胞にポリエチレングリコールを用いてプラスミドＤ
ＮＡを導入した。ずなわち、Ｔ、培地に前培養したバチ
ルス・プレビスの菌液を新しいＴ、培地５−に１００分
の１希釈し、３７℃で振とう培養を行ない、対数増殖後
期（０，Ｄ、 ６６０ ｎｍ ＝１．９）に達したとき
、菌体を遠心（５０００ｆ、５分、室温）によって集め
、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ５ｍ７
によシ洗浄した後、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐｉ
ｅ、５ ）にＶ濁し、５７°Ｃで振とうした。６０分
後、菌体を遠心（５０００Ｇ、ｓ分、室温）によって集
め、０．５ｍ／のＴＰ培地（０，９５５％ＫＨ，ＰＯ，
、０，４２６％Ｎａ２ＨＰＯ４，０，５％肉エキス、１
％ポリペプトソ、０．２％Ｆ？母エキス、１％グルコー
ス）Ｋ懸濁した。これにプラスミドＤＮＡ溶液（１０ｍ
Ｍ）リス塩酸綬衝液、 ｐＨ７，５、１ｍＭ ＩｅＤＴ
Ａ）とＴＰ培地の１：１混合液１００μｔを加えて混合
した。次いで、直ちに４０％ポリエチレングリコール溶
液（０，９５３％ＫＨ，ＰＯ，、０，４２６％Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４、４０％（ｗ／ｖ ）ポリエチレングリコールｐ
ｘａ６ｏｏｏ）１．５ｍを加えて攪拌し、３７℃で１０
分分間上うし、た。しかる後、遠心（５０００ｊｉ’、
５分、室温）によシ菌体を集め、２０ ｍＭＭｇｏ４を
添加したＴ、培地に懸濁した。３７°Ｃで１５０分間振
聞損した後、形質転換体選択用の寒天培地（６０μＦ！
−／Ｉのネオマイシンを含むＴ、培地プレート（ポリペ
プトン１％、肉エキス０．５％、 、 酵母エキス０．
２％、グルコース１％、ウラシル０．０１％＋ ｐＨ７
） ）に０．１ｍ／ずつ散布した。３７℃で３０時間培
養してネオマイシン耐性株を得た。これらの形質転換株
を１％可溶性デンプンと６０ ｐｆ／−／ｍｅｍｌネオ
マイシンむＴ、培地プレート上にレプリカし、１夜培養
後、ヨードデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
ったものを検索することによってα−アミラーゼ生産株
（バチルス・プレビス４７／ｐＢＡＭ−１０２（７１２
１１Ｍ Ｐ−７２２５） ）を選択した。
よってバチルス・プレビスの表層蛋白質を除去し、残さ
れたペプチドグリカン層と細胞質膜によってのみ囲まれ
た細胞にポリエチレングリコールを用いてプラスミドＤ
ＮＡを導入した。ずなわち、Ｔ、培地に前培養したバチ
ルス・プレビスの菌液を新しいＴ、培地５−に１００分
の１希釈し、３７℃で振とう培養を行ない、対数増殖後
期（０，Ｄ、 ６６０ ｎｍ ＝１．９）に達したとき
、菌体を遠心（５０００ｆ、５分、室温）によって集め
、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ５ｍ７
によシ洗浄した後、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐｉ
ｅ、５ ）にＶ濁し、５７°Ｃで振とうした。６０分
後、菌体を遠心（５０００Ｇ、ｓ分、室温）によって集
め、０．５ｍ／のＴＰ培地（０，９５５％ＫＨ，ＰＯ，
、０，４２６％Ｎａ２ＨＰＯ４，０，５％肉エキス、１
％ポリペプトソ、０．２％Ｆ？母エキス、１％グルコー
ス）Ｋ懸濁した。これにプラスミドＤＮＡ溶液（１０ｍ
Ｍ）リス塩酸綬衝液、 ｐＨ７，５、１ｍＭ ＩｅＤＴ
Ａ）とＴＰ培地の１：１混合液１００μｔを加えて混合
した。次いで、直ちに４０％ポリエチレングリコール溶
液（０，９５３％ＫＨ，ＰＯ，、０，４２６％Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４、４０％（ｗ／ｖ ）ポリエチレングリコールｐ
ｘａ６ｏｏｏ）１．５ｍを加えて攪拌し、３７℃で１０
分分間上うし、た。しかる後、遠心（５０００ｊｉ’、
５分、室温）によシ菌体を集め、２０ ｍＭＭｇｏ４を
添加したＴ、培地に懸濁した。３７°Ｃで１５０分間振
聞損した後、形質転換体選択用の寒天培地（６０μＦ！
−／Ｉのネオマイシンを含むＴ、培地プレート（ポリペ
プトン１％、肉エキス０．５％、 、 酵母エキス０．
２％、グルコース１％、ウラシル０．０１％＋ ｐＨ７
） ）に０．１ｍ／ずつ散布した。３７℃で３０時間培
養してネオマイシン耐性株を得た。これらの形質転換株
を１％可溶性デンプンと６０ ｐｆ／−／ｍｅｍｌネオ
マイシンむＴ、培地プレート上にレプリカし、１夜培養
後、ヨードデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
ったものを検索することによってα−アミラーゼ生産株
（バチルス・プレビス４７／ｐＢＡＭ−１０２（７１２
１１Ｍ Ｐ−７２２５） ）を選択した。
（３） α−アミラーゼの生産・圧
第３図に示すプラスミドを有する枯草菌々らびにバチル
ス・プレビス４７菌を６０μ￥／ ｍｌネオマイシンま
たは１０μｆＩ／ ｖ＋ｌカナマイシンを含むＴ２液体
培地に接種し、３７°Ｃで２２時間培着［７、遠心分離
により培養濾液を調製して培養濾液中のα−アミラーゼ
活性を不破の方法（Ｊ、 Ｅｉｏｃｈθｍ、旦。
ス・プレビス４７菌を６０μ￥／ ｍｌネオマイシンま
たは１０μｆＩ／ ｖ＋ｌカナマイシンを含むＴ２液体
培地に接種し、３７°Ｃで２２時間培着［７、遠心分離
により培養濾液を調製して培養濾液中のα−アミラーゼ
活性を不破の方法（Ｊ、 Ｅｉｏｃｈθｍ、旦。
５Ｂ！Ｓ−６０５（１９５４））により４０°Ｃで測定
した。
した。
結果を第１表に示す。
第１表
ノサ欣・フ１／白４７菌 ５５０ ５６００枯草菌およ
びバチルス・プレビス４７菌で作られるα−アミラーゼ
はすべて菌体外に分泌され、耐熱性を示した。第１表に
示したように、α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラス
ミドの存在によってバチルス・プレビス４７菌を宿主と
した場合には、枯草菌におけるよシも約１０倍に及ぶ多
量のα−アミラーゼが生産された。
びバチルス・プレビス４７菌で作られるα−アミラーゼ
はすべて菌体外に分泌され、耐熱性を示した。第１表に
示したように、α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラス
ミドの存在によってバチルス・プレビス４７菌を宿主と
した場合には、枯草菌におけるよシも約１０倍に及ぶ多
量のα−アミラーゼが生産された。
第１図は本発明のプラスミドｐｌＢ−２の制限酵素切断
地図、第２図は本発明のプラスミドｐＫ１３−３および
ｐＨＴ −１の制限酵素切断地図およびこれらプラスミ
ドの造成経過を示すものである。第６図は本発明のプラ
スミドｐＢＡＭ−１０２の制限酵素切断地図である。 特許出願人 鵜 高 重 三 第１図 手続補正書（自発） 昭和５８年１０月６ 日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、 事件の表示 特願昭５８−１６５０６６ ２ 発明の名称 プラスミドおよびそれを用いてバチルス・プレビスを形
質転換する方法 五 補正をする者 事件との関係 特許出願人 鵜高重三 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１番１０号 ５、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面＆ 補正の内
容 （１）明細書第２頁下から６行目の（’ Ｄｕｂｎａｎ
Ｊ を「Ｄｕｂ部Ｕ」に訂正する。 （２） 同第７頁１１行目の［Ｄ、 Ｄｕｂｎａｎ Ｊ
を［Ｄ。 Ｄｕｂｎａｕ Ｊに訂正する◎ （３） 同第７頁下から２行目のｒ ０．９ Ｋ？）
」 を［６，９Ｗｂ Ｊ に訂正する。 （４） 第１図〜第５図を別紙の通りに訂ｊＥするＯ（
以上） 第１図
地図、第２図は本発明のプラスミドｐＫ１３−３および
ｐＨＴ −１の制限酵素切断地図およびこれらプラスミ
ドの造成経過を示すものである。第６図は本発明のプラ
スミドｐＢＡＭ−１０２の制限酵素切断地図である。 特許出願人 鵜 高 重 三 第１図 手続補正書（自発） 昭和５８年１０月６ 日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、 事件の表示 特願昭５８−１６５０６６ ２ 発明の名称 プラスミドおよびそれを用いてバチルス・プレビスを形
質転換する方法 五 補正をする者 事件との関係 特許出願人 鵜高重三 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１番１０号 ５、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面＆ 補正の内
容 （１）明細書第２頁下から６行目の（’ Ｄｕｂｎａｎ
Ｊ を「Ｄｕｂ部Ｕ」に訂正する。 （２） 同第７頁１１行目の［Ｄ、 Ｄｕｂｎａｎ Ｊ
を［Ｄ。 Ｄｕｂｎａｕ Ｊに訂正する◎ （３） 同第７頁下から２行目のｒ ０．９ Ｋ？）
」 を［６，９Ｗｂ Ｊ に訂正する。 （４） 第１図〜第５図を別紙の通りに訂ｊＥするＯ（
以上） 第１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 プラスミドｐＵＢ １１０のドライブユニット９
Ａ域を少なくとも有し、バチルス・プレビスの細胞内に
含まれているプラスミド。 ２ バチルス・プレビスの細胞内にプラスミドｐＵＢ
１１０のドライブユニット領域を少なくとも有するプラ
スミドを導入することを特徴とするバチルス０プレビス
の形質転換方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165066A JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6058074A true JPS6058074A (ja) | 1985-04-04 |
| JPH0156756B2 JPH0156756B2 (ja) | 1989-12-01 |
Family
ID=15805214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58165066A Granted JPS6058074A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6058074A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2589880A1 (fr) * | 1985-11-07 | 1987-05-15 | Shigezo Udaka | Procede pour l'expression de genes par bacillus brevis |
| EP0916733A1 (de) * | 1997-11-17 | 1999-05-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten |
| EP0919623A3 (en) * | 1997-11-17 | 1999-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Procedure and kit for cloning of DNA fragments |
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58165066A patent/JPS6058074A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5615300A (en) * | 1979-05-11 | 1981-02-14 | Gist Brocades Nv | Plasmid and its use |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2589880A1 (fr) * | 1985-11-07 | 1987-05-15 | Shigezo Udaka | Procede pour l'expression de genes par bacillus brevis |
| US4994380A (en) * | 1985-11-07 | 1991-02-19 | Shigezo Udaka | Process for expressing genes by Bacillus brevis |
| EP0916733A1 (de) * | 1997-11-17 | 1999-05-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten |
| EP0919623A3 (en) * | 1997-11-17 | 1999-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Procedure and kit for cloning of DNA fragments |
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| US7655452B1 (en) | 2003-11-11 | 2010-02-02 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Brevibacillus choshinensis and process for prodcuing protein wtih use of the microbe as host |
| JPWO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2008-04-24 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| JP2010246569A (ja) * | 2004-07-06 | 2010-11-04 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| EP2251425A1 (en) | 2004-07-06 | 2010-11-17 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JP2014064589A (ja) * | 2004-07-06 | 2014-04-17 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| JP2016063844A (ja) * | 2004-07-06 | 2016-04-28 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0156756B2 (ja) | 1989-12-01 |
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