JPS6062985A - 細菌生産物の外在化法 - Google Patents
細菌生産物の外在化法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の分野
本発明は遺伝子工学の分野、さらに詳しくは、遺伝子工
学的に操作された微生物によって産生される生産物の外
在化法に関する。 発明の背景 イー・コ＋） （Ｅ、ｃｏＪ ｉ） ′ｊ６よび他の原
核性徴生物を、所望の蛋白質の表現用宿主として使用す
る際に伴なう１つの問題として、しばしば、精製のため
に該宿主細胞から蛋白質を外在化させることが挙けられ
ている。この問題を解消するための試みには、均質化ま
たは超音波処理のような細胞もしくは菌体の物理的破壊
、洗浄剤またはリゾチームによる処理のような細胞もし
くは菌体の化学的破壊Ｂよびυｌ／１ｌｌ−シグナルペ
プチドをコードするＩ）ＮＡ配列を、所望の生産物をコ
ードする構造遺伝子へ副！合させることが包含される。 例えば、ヨーロッパ特ＷＩ出願第６１２５０号（Ｗｃｉ
ｓｓｍａｎ ｃｔ ａｌ、 ）はｆ１ｉｆ″仁細胞の溶
解剤または滲透剤による処理を開示しており、米１］特
π「第４３３６３３６号（ＳｉｌｈａｔＶｙＣｔ ａｌ
、 ）は、得られるハイブリッド蛋白が宿主細胞、−反
面近く、またはそれを越えて輸送される、ように細胞質
蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白用の遺伝子にＭＭＩＩ！
合させる方法を開示し、また、米国特許第４３３８３９
７号（Ｇ１１ｌ）ｃｒｔ ａｔ ａｌ、）はプレ蛋白質
用の構造遺伝−ｒ−を表現ベクターに挿入することから
なる成ツ（分泌１て白質の製法を開示している。 イー・コリは工木鎖１） Ｎ Ａウィルスである偏性寄
生体のラムダ・ファージによって感染される。 イー・コリ遺伝学同様、ラムダ遺伝学はよく研究されて
いる（例えば、”ｌｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
Ｌａｒ＋１ｘｌａ ”、 ｅｄｉｔ、Ａ、Ｄ、 ｌ１
ｅｒｓｈｅｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
ｌ ９７１ ’ＩＪ照）。 ラムダはテンペレート・ファージで、イー・コリ中で、
２相のうちの１つの相で増殖する。１つの相、溶菌相に
おいて、ファージＤＮＡは［目目的に復製し、キヤ・プ
レ蛋白質用形成、包′！Ａおよび宿主細胞の溶解を指令
する。溶菌４′ｒ１の間のラムダＤＮＡの表現は非常に
効率的である。’ｂｚ： ’７Ｊ、は両方のＤＮＡＮ玉
鎖上また、１本の鎖Ｊ二で右側方間へ向って、およびも
う１本の頂上て左側方向へ向って起る。誘発は３７′Ｃ
で５０分間に約１００個のファージ粒子の放出をもたら
すことができる（前記ｒｌｅｒｓ１１ｅｙｌ１ｒｓ ｈｅｙ参照；目、溶原（′目にＢいて、ラムダＩ） Ｎ
Ａは宿主細胞ゲノムに組−込まれ、宿主複製酵素によ
り、宿主染色体ＤＮＡと共に受動的に複製される。 溶原相におけるファージはプロファージとしで知られ、
宿主は溶原菌として知られ、免疫性であるといわれる。 免疫性は溶菌仕を誘発する種々の事象の発生により失な
われうる。ラムダ１ｎＬｆ６よびｘｉｓ遺伝子の生産物
はイー・コリゲノムからのラムダゲノム除去の触媒作用
をし、自律複製できる共有的に閉じた環を形成する。こ
れらの遺伝子および、直接的または間接的に、全ての他
のラムダ遺伝子の合成はラムダｃｌ 遺伝子の生産物に
より抑制される。 ある種の化学薬品または１） ＮΔ損傷剤に応答して、
細菌は細菌性ｒｃｃ Ａ遺伝子の生産物の合成を指令リ
ーる。該ｒｃｃ Ａ遺伝）生産物は蛋白加水分解的に（
Ｉ レプレッサ蛋白質を開裂し、溶菌４’ｌ遺伝子の友
現を”Ｊ能にさせる。ついて、ファージの増殖は、最終
的にラムダＪ、） Ｎ Ａの自律複製を開始させるいく
つかのラムダ調ｆｎｊ因子の（；目σ作用を必要とする
。 ラムダＰおよびＯ遺伝ｒ−の生産物がＤＮＡ１製に必要
とされる。Ｉ） Ｎ Ａ ｉＪＪ製についで、ファージ
はウィルス構造蛋白質、すなわち、頭部および尾部蛋白
質の合成および無垢な中空ウィルス粒子中でのそれらの
組立を指令しなければならない。これを完了するには少
なくとも１８個の遺伝子のｔｎ互作用を必要とする。最
後に、該ＤＮＡが中空ウィルス粒子中に包装されて感染
性無垢ウィルス粒子が形成され、菌体は、Ｑ遺伝子の生
産物によつ′Ｃ活性化されるラムダＳおよびＲ遺伝子に
よってコードされた細胞内溶解素によって破壊され、そ
れにより、ファージが放出する。Ｑ遺伝子はへ機能によ
って活性化される。Ｎ遺伝子は（１機能によって抑制さ
れる。 キャプシド組立に必要な該１８個の遺伝子はｊ貫伝地図
の右側転写鎖の約３位および３６位の間（遺伝地図上の
位置は総ラムダＤＮＡのパーセンディジで表わしている
）に存在する。左から右へ、第１の遺伝子はＡｌＷｇよ
びＢで、最後はＪである。正常な溶原菌では、Ｊ遺伝子
の右側に８個の細菌遺伝子がある。そのうちの５個、Ｉ
）ｉｏＡ、Ｉｓ。 Ｃ，Ｉ）［よびＦがビオチンの生合成に包含される。 第６番目のｕｖｒ Ｂは紫外線照射耐性をＪｊえる。最
後の２つ、ｃｈｌＡおよびＥは塩素酸塩にに４チる感受
性を与える［ Ｇｕｅｓｔ、 Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、Ｇｃ
’ｎｅｔ、１０５： ２８５〜２８−９ （１９６９）
蟇５ｔｅｖｅｎｓ ｅｔａｌ、。 ’ｉｌ＋ｃ１％；ｔｃｔｅｒｉｏｐｌ＋ａｇｃ Ｌａｍ
ｂｄａ ”、 ｃｄ＋ｌ１ｅｒｓｈｅｙ 。 前出１円）５１５〜５３４参照〕。 天然の宿主細胞溶解において機能する他のラムダ遺伝子
はｋｉｌ遺伝子である。ｋｉｌ遺伝頂の機能は余りよく
判明し−Ｃいない。ｋｉｌ遺伝子を表現する細胞は誘発
後、細胞増殖速度か減少する。ｋｉ１機能の喪失は細胞
の正常な速度での増殖、すなわち、誘発後、溶菌が起る
まで対数期増殖を可能とする。Ｓおよび１ζ」貫伝子と
同様、ｋｉｌ遺伝須はＣＩレプレッサーにより、Ｎｉ貫
云子を介し、間接的に制御されＴｌｚｌる（ Ｇｒｅｃ
ｒ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ６６ ： ５８９〜６０４
（１９７５）参照〕。 温度１９ビ受性溶原菌はよく研究されている〔例えば、
Ｃａｍｐｏｃｌｌ 、 Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ ｌ去」：
２２−３２（１９６１）参照〕。ｃ１８５７遺伝子は温
度感受性ＣＩ変異体で、３８”（Ｊ２１、下で機能する
（ ＳｕｓｓｍａｎｅＬａｌ、、 Ｃ、ＲｏＩＩ、 Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｐａｒｉｓ、２５４’ １５１７〜１
５１９（１９６２）参照〕。同様なファージ系が他の属
で起ることが仰られてし）る。 例えば、ロモフスカヤらｌ： Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ
ｃｔ ；１１．。 Ｊ、Ｖｉｔｏｌ、、９７２５８〜２６２（１９７２）３
はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
にＦ８染するテンペレート・ファージの温度感受性変異
株￥株を報告シテイル。７ ｏ ツ／７ ［Ｆｌｏｃｋ
、 Ｍｏｌ 、 Ｇｃｒ＋。 Ｇｃｎｅｔ、、１５５：２４１−２４７（１９７７））
はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に忌染するテンペ１／
−１−・ファージｐｈｉ −１０５の温度感受性変異株
を報ｌ１１−している。ホトスタインら（Ｂｏｔｓｔｅ
ｉｎ ｃｔ ａｌ、 。 Ｎａｔｕｒｅ、２５１ ： ５８４−５８８（１９７４
）３はサルモ不う（Ｓａｌｍｏｎｃｌｌａ ）に壓染す
る一アンペレート・ファージＩ゛２２の温度感染性変異
株を報／１４ｉしている。ジョストロームら［Ｊｏｓｔ
ｒｏｌｌｌｃｔ ａｌ、 。 Ｊ、 １ｓａｃｃｅｒｉｏｔ、、 １１９ ： １９〜
３２ （１９７４）〕およびトムプンン［１１１ｏｍｐ
ｓｏｎ、 Ｊ、Ｉｓ；ｔｃｔｃｒｉｏｌ 、。 １２９ニア７８〜７８８（１９７７）〕はスタフィロコ
ッカス（５ｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ） にｊす染
するテンペレート・ファージｐＨｉ −１１の温ｒｗ
Ｌ・ｇ受↑ｌに変異株を報告している。ミラーら［Ｍｉ
ｌｂ二１° ｃｔシｔ１．。 Ｖｉｒｏｌ、、５９： ５６６−５６９（１９７４））
ｉまシウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）の７７
ペレ・−）−７アージを報告している。 ボトスタインら［ｌ５ｏｔｓｔｃｉｎ ｃｔ ａｌ＋、
Ａｎｎ、 Ｒｅｖ。 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：６］−８３（１９８２））に
よる報告のようにラムダ細胞自溶Ｗ（素がファージを吸
収できる→）−ル七ネラ株を溶解することが判明してい
る。 ペリショータら（＋’ｃｒｒｉｃａｕｄｃｔ ｃｔ ａ
ｌ。ＦＥＩ３ＳＬｅｔｃ、、５６ ： ７〜１ ］、
（１９７５） ］は、ララムダ遺伝子ｘｉｓ、ｒｃｔｌ
、ｇａｌｌ−１（１１１およびＫｉｌ遺伝子を含むセグ
メントである遺伝地ＩＸ＋の５８位８よび７１位の間（
△５８〜７１）のラムダ遺伝子の欠失を記載している。 ヨーロッパｌ侍π１゛出願２０８４５８４号（ｌｌｃｒ
ｓｈ−１）ｅｒｇｃｒ ｃｔ ａｌ、 ）はプラスミド
の安定化および選択のため、宿１：、細胞として溶原閑
の使用を開示している。この発明者らは、例えは、欠損
ｃｌ遺伝子を汀する溶原菌の、機能（Ｉ遺伝子を有する
プラスミドによる形）Ｊｉｔ転換を開示している。１つ
の開示された具体例において、該機能ＣＩ遺伝子はｃＩ
８５７遺伝子である。 転置因子、すなわち、宿主の染色体組換機構とは独立し
て組換てきる遺伝子がマーカーとして宿主細胞に挿入で
きることが知られている。ロスら［Ｒｏｓｓ ＣＬ ａ
ｌ、、Ｃｅ１ｌ、 １５ ： ７２１〜７３１（１９７
９）］は、転置テトラサイクリン耐性囚因子！ｎ ｌ
Ｑによってプロモートされる欠失および逆位の物理的構
造を報告している。ディビスら［＋）＋ｉ ｖ ｉ ｓ
ｅｃ ａｌ。Ｊ３ａｃｃｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
” 、Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）市ｙ’１ｇＨａｒｂｏ：ｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８
０） ］は転置因子の使用を記載している。 ラブカンら［Ｒｕｖｋｕｎ ｅｃ ａｌ 、、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２８ｇ二８５〜８８（１９８１）］は、転置カ
ナマイシン耐性およびネオマイシン耐性因子Ｌ’１１５
を何するプラスミドの接合、ついて、相同組換による
ｔｎ５のリゾヒ゛ウム・メリロチ（Ｒｈ１ｚｏｂ璽ＬＩ
ＩＴＩｍｅｌｉｌｏｔｉ ） 染色体１）ＮＡへの組込
みを報＜！′ｌ’ Ｌ Ｔいる。相同フランキング配列
の存在に由来する組換による非対応遺伝子の組込もヨー
ロッパ特ｒ［出願第７４８０８号に開示されている。 発明の４１１ｊ戻 本発明はテンペレート・ファージからの細胞内溶解素コ
ードｆ＝Ｊけ遺伝子を用いる細菌内で生産物を産生ずる
方法を１）、′−供するものである。本発明の方法は％
１ｆｌｊｆ度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子お
よび機能性ファージ・リゾチーム・コード付は遺伝子を
ｆｒ Ｌ、π１容条件下で該リゾチーム・コード付り逍
１べ子が抑制され、制限条件下で表現される温度Ｉ［Ｆ
］受性細菌（９、を、直接または間接的に生産物を表現
するＩ） Ｎ Ａ分）で形質転換し、許容条件下で該形
質転換株を培養して該生産物を産生さぜ、温度を１＝Ｐ
Ｉさせて制限条件を生じさせ、所望により、培養培地ま
たはその濃縮物から該生産物を回１■することからなる
。 本発明の他の態様は、生産物を産生する細菌を、温度１
多受性フアージ・レプレッサー遺伝子２よひファージ・
リゾチーム・コード付は遺伝子を有し、７１″容条件下
で該リゾチーム・コード付は遺伝子が抑制され、制限条
件下で表現されるファージＤＮＡ配列で形質転換して細
菌を溶菌性にし、許容条件下で該形質転換細菌を培養し
て生産物を産生させ、温度を変化させて制限条件を生じ
させ、所望により、生産物を培養培地またはその濃縮物
から回収することからなる細菌生産物の産生法を提供す
るものである。 本発明のもう１つの態様は、温度ｊ［Ｆ］受性レプレッ
サー遺伝子および機能性リゾチーム・コードイ；」け遺
伝子を有し、該リゾチーム・コード付すＪ貫伝子が許容
条件下で抑制され、制限条件十で表現される欠損ファー
ジ配列、選択マーカーおよび、好ましくは、宿主細胞の
染色体に２ける隣接配列と相同のフランキンクＤＮＡ配
列からなる１） Ｎ Ａフラグメントを提供するもので
ある。 本発明のもう１つ別の態様は、細菌を本発明の１）ＮＡ
フラグメントで形質転換してなる溶菌性細菌の製法およ
び該１）ＮＡフラグメン１−からなる細菌を提供するも
のである。 さらに、本発明のもう１つの態様は、有効ｍｍの細菌生
産物を含有する量の温度感受性細菌を哺乳類に投与し、
これにより、細菌が哺乳類の体内て溶解し、該生産物を
放出することからなる哺乳類に細菌生産物を投与する方
法を提供するものである。 発明の訂′説 １１−１１４度感受性細１￥１は、ｌ都度感受性レプレ
ッサー遺伝子を含み、１つのｉ’ｌ’ｉｌ’Ｌ度範囲＜
＝＋容条件）にて培養した場合、レプレッサーが機能
するが、もう１つの温度範囲（制限条件）で培養した場
合、レプレッサーが機能ヒ゛ず、レプレッサーが表現さ
れず、または安定でないファージＩ） Ｎ Ａ配列を有
する細菌である。制ｔｉｌｌ ８件下、ファージ・リゾ
チーム・コード付は遺伝子を含め、ファージ遺伝子が表
現され、菌体の溶解をもたらず。かかる温度感受性細菌
が溶菌性細菌である。本明細書に記載のようないずれの
溶菌性細菌も本発明の方法に使用できる。 温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子は入手するこ
とができ、あるいは公知の方法でかかる遺伝子を変異さ
せることにより調製できる。例えば、キ’ｖ ７へｔｖ
［Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＶｉｒｏｌＯ，ｇＸ ｌ ４
：２２〜３２（１９６１）］は温度感受性ファージ変異
株の単離を記載している。一般に、この方法は、ファー
ジ感染細菌に、紫外線照射によるなどして変異誘発処理
を行ない、生存菌を高温でインキュベートして、いずれ
かの温度感受性レプレッサー変異株の誘導を生じさせる
ことからなる。ついで、溶解質を感受性細菌の感染に用
いる。この新たな溶原菌を加熱誘発に付し、加熱誘発後
に生じたファージを温度感受性細菌からの溶原菌調製に
用いる。このサイクル（溶原菌調製、誘発、再調製）は
ファージ・レプレッサー変異体の同定に通じる。典型的
には、３〜４回のかかるサイクルがかかる変異株を得る
のに充分である。 以下の記載は大部分、溶菌性イー・コリ、ことに、Ｃｌ
８５フイー・コリ溶原菌に関する。けれども、これに限
定するものではなく、ラムダまたは前記したテンペレー
ト・ファージのような他のテンペレート・ファージから
のレプレッサーおよび細菌内溶解素コード付は遺伝子を
用いて他の溶菌性イー・コリならびに他の溶菌性細菌に
ついても同様に行なうことができる。 （１８５７溶原菌は公知であり、一般的に入手でき、３
８°Ｃ以下で活性であるが、３８°Ｃを超えると不活性
なｃＩ レプレッサーを産生ずる。これらは、レプレッ
サーが３８ ”Ｃを超えると不活性になる変異に加えて
、ｃｌ ５ｓ７ｉｔｆｆ伝子が、ラムダｒｃｃ Ａ遺伝
子の生産物による蛋白加水分解的開裂に対して該ｃｌ
レプレッサー蛋白を不感性にする第２の変異を含有する
ので他の温度感受性イー・コリ溶原菌より好ましい。す
なわち、許容条件下で培養した場合、ｃｌ レプレッサ
ー蛋白は安定で、したがって、免疫性を卸持するのに効
率的である。 イー・コリＵＣ５８２２株はＣ１８５７変異を有する溶
原閑である。また、該株はｉｎｔ遺伝子（ｉｎＬ ５
ａｍ 、７７ハー変異）およびＰ遺伝子（Ｐ３ ａｍ
、アンバー変異）に点変異を有する（アンバー変異は翻
訳の終１にを合図する。）。一般に、ＵＣ５８２２株は
、欠損性、すなわち、一般に感染性ファージ粒子を生成
しないので、例えば、ＭＭ２９４（ｃｌ ８５７）株よ
りも好ましい。欠損性溶原菌は、ことに、ポリペプチド
を哺乳類に投与するのに用いる場合に好ましい。しかし
ながら、ＵＣ５８２２株は低レベルのリゾチームを産生
じ、これは、多分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝子の
より低い複写数、すなわち、ＭＭ２９４（Ｃ１８５７）
より低い複写数、すなわち、５０〜１００を有するため
であるにもかかからず、ＵＣ５８２２株は誘発後、容易
に溶解する。 本発明の方法における１つの態様において、温度感受性
細菌は、直接または間接的に所望の生成物をコードする
ＤＮＡ分子により形質転換される。 この形質転換は、ＤＮＡ分子が宿主細胞に入り、生産物
を表現することを可能にするいづ゛れの技術によっても
行なうことができる。これらの技術には、例えば、形質
転換、形質導入、接合および細胞融合が包含される。多
くの適当な表現ベクターがよく知られており、生産物用
の遺伝子クローニング君よぴ細胞のかかる分子による形
質転換のための技術と同様に広く利用されている。一般
に、生産物は非排泄性の非対応遺伝子生産物、すなわち
、天然には宿七によ、って生産されない、外在化されな
い物質である。直接表現される生産物にｃＪポリペプチ
ドが包含され、間接的に表現される生産物にはポリペプ
チド、糖蛋白質、抗生物質および、例えば、金属チオネ
イン産生細菌内に隔離することのできるような金属イオ
ンのごとき他の分子が包含される。 形質転換宿：１ＥＣＩ８５７溶原菌は、所望の生産物の
表現に至適なγ１゛容条件下（く３８℃、通常、３２〜
３６ ”Ｃ）、無際限に増殖できる。充分な増殖がぶ成
されたとき、すなわち、通常、対数増殖Ｉ！／Ｊ中期（
八〇、。−０，Ｊ ）にｙ予したとき、溶原菌を制限条
件下で培養してラムダ細胞内溶解素の合成を誘発させる
。これは、培養培地またはその濃縮物の温度を、Ｃｌ８
５７株の場合、３８”Ｃより高く、好ましくは、４２〜
４４”Ｃに約９０〜１２Ｑ分間」二！Ｉさぜることによ
り行なえる。別法として、培養培地寸たはその濃縮物の
ｉ’ｆｌｌｆ度を３８°Ｃより高く、好ましくは、４２
〜４４°′Ｃに短時間、すなわち、ファージＩ）ＮＡを
誘発するに充分な時間；好ましくは、少なくとも約５分
間上昇させ、ついで、温度を０〜３８℃、好ましくは、
２〜３６℃に低下させる。 溶菌がより効率的で、迅速であるので、制限条件を９０
〜１２０分間維持することが好ましい。 しかしながら、場合により、例えば、所望の蛋白質が熱
不安定性な場合または制限条件を維持する経費をさける
ような場合には後者の方法も好ましい。 宿主［１８５７株が機能ラムダＣｒＱ逍伝子を有する場
合、溶菌が起るまで、細胞は細胞が機能するいずれの温
度においてもリゾチームを合成しつつける。ラムダ細胞
内溶解素はＯ″Ｃのごとき低６１ｊλても活性であるが
、一般的に、蛋白合成１車度および触媒活性の低下ゆえ
に、溶菌に要する時間は低温ではより長くなる。 誘発の直前または誘発後、好ましくは、細胞を、ρ過、
遠心分離または他の手段により濃縮し、この濃縮物を溶
菌するまてインキュベ−１・する。かかる方法は所望の
生産物の収集Ｂよび精製を容易にする。誘発につづき、
細胞壁は実質的に分解する。プ「ｒドプラスト 合成しつつけ、生産物は細胞膜を通して多量に培地中に
放出される。培地中への完全な放出は溶菌によって達成
される。溶菌は培養培地またはその濃縮物の清澄化およ
び／または培養培地または濃縮物の粘度増加によって観
察できる。溶菌は、例えば、機械的攪拌または急激な培
養条件の変化、例えば、温度を２〜２５′ｃの間で急激
に変化させるか、培地または濃縮物の浸透圧強反を変化
させることにより増強することができる。好ましくは、
細胞を濃縮し、生産物含有上澄液をデカンテーションし
た後、誘発細胞を最少塩緩衝液または０．１Ｍ １．リ
ス緩衝液、５ Ｑ ｍＭ ＮａＣｌ ２ ヨ（ｊ １
ｍＭＩ！．ｌ） ’Ｆ Ａに懸濁させ、攪拌して溶菌を
行なう。 ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所昭の生産物を回収し、所望により、精製する。 別法として、溶菌４′Ｉ′ｌの訪発前に全細胞をａａし
、哺乳類に経１」投ｑする。ついて、体内で誘発が起り
、所望のポリペプチドの放出をもたらす。この方法はこ
とに、全細胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起さ
せるのに好適な場合に、動物に該抗原を投与するのに有
用である。例えば、１、゛１′−Ｂ抗原のような抗原を
コードする遺伝子を有する温度域受性溝原菌は直接ブタ
および／またはウシに摂取させることができる。各動物
に投−グする菌体の所は有効用阻を含有する菌体量であ
る。！１′１位屑の菌体によって産生される蛋白質搦は
公知の方法で訂算することができる。 本発明の１つの態様は本発明の方法に用いる溶菌性細菌
を調製するのに使用できるＩ） ＮΔフラグメントを提
供することである。かかるＩ）ＮＡフラグメントは温度
感受性レプレッサー遺伝子および機能性リソチーム・コ
ード付は遺伝子を有する欠損ファージ配列からなる。か
かる欠損ラムダ配列からなるＤＮＡフラグメントは細胞
内溶解素が制限条件下で表現されるような温度感受性ｃ
Ｉｔｋｌ伝子および機能性ラムダ細胞内溶解素コードｆ
・Ｊけ遺伝子（Ｎ，Ｑ，ＳおよびＲ）、選択マーカーＢ
よび、ＩＪｆましくけ、宿主細胞染色体における隣接１
）ＮＡとイｎ同のフランキングＤＮＡ配列を有する。 １つの具体例において、該１） Ｎ Ａフラグメントは
、遺伝地図（の５８位およ０，７１位間の遺伝子が欠失
しており、したがって、ｊｌｌＬ、ＸｊＳｊ６よびｋｉ
Ｊ遺伝子を欠き、温度ｊ’Ｚ染性Ｃ１遺伝子を有し、０
ぢよびＰ遺伝ｒに変異を有し、該（Ｉ遺伝子が（Ｉ８５
７変異体で、制限条件下で細胞内溶解素を産生するラム
ダＩ）ＮＡからなる。０およびＰ変異は欠失マたは点変
異とすることができる。０２９、Ｐ３およびＰ ８０変
異のような点変異は、それらが容易に利用できるので好
ましい。Ｐ３変異はＰ８０変異より好ましい。 他の具体例１トおいては、フラグメントは、遺伝地図の
３位および７１位の間の遺伝子に実質的な欠失があるラ
ムダＤＮＡからなる。かかるフラグメントはラムダ・キ
ャプシド組立に必須の実質的に全ての遺伝子ならびにｉ
ｎｔ、 ｘｉｓおよびｋ ｉ Ｉ ｉｌｌｌｌ伝火失し
ている。 所望の生産物を産生ずる、または、例えは、遺伝子工学
的技術により、予めもしくはその後に所望の生産物を産
生ずるようにした宿主細胞、イー・コリまたは他の細菌
は、公知の技術により、温度感受性ファージ・レプレッ
サー遺伝子およびファージ・リゾチーム・コード付は遺
伝子を有するファージＩ） Ｎ Ａ配列で形質転換され
る。これには、かかる温度感受性レプレッサー遺伝子を
有するテンペレート・ファージ、好ましくは、欠損ファ
ージでの細菌の感染が包含される。また、公知の方法、
例えば、形質転換、形質導入、接合おにひ融合により、
細菌を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換させるこ
とが包含される。一般に、形質転換にはファージまたは
プラスミドのようなベクターへのフラグメントの組込が
包含される。例えば、フラグメントは１）旧（３２２等
のようなプラスミド中てりｌ］−ンすることがてき、該
フラグメントに（ＩＩＩ ｊｊを接する配列に相同する
隣接配列を欠くか、組換事象を欠損している（ ｒｅｃ
）適当な宿主中、１ｎｖｉｖｏで生育できる。該プラ
スミドは回収し、所望の生産物産生１１１の適当な宿主
の形質転換に使用できる。かかる宿主の形質転換につい
で、宿主染色体における隣接１．） Ｎ Ａ配列と相同
のフランキングＩ）Ｎへ配列を有するフラグメントを相
同隣接配列のサイトで自然に組換えるこ、とにより組込
む。別法として一所望の生産物を産生ずる適当な宿主は
線型または原型の分離１） Ｎ Ａフラグメントて形質
転換てきる。 該１） Ｎ Ａフラグメントは選択マーカーを有し、形
質転換体の選択を容易にする。選択マーカーは、典型的
には、分析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主に原栄
養性を復元するか、致死もしくは抑制化合物、一般に、
抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。好ましく
は、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子で、こ
れらは、入手できないか、あるいは自然に原栄養性に復
帰する栄養要求性宿主の使用を要しない。テトラ−リイ
タリンは安価で、また、テトラサイクリン而１性は通常
、自然には獲得されないので、テトラサイクリン１ｌｉ
Ｉ性が好ましい。 形質転換体におけるマーカーの存在は宿主が該ＤＮＡフ
ラグメントからなっていることを示す。 該ＤＮＡフラグメントと宿主細胞Ｄ Ｎ Ａ （７）間
の相同はラムダＩ） Ｎ Ａと側面を接する領域およＯ
・マーカー中にのみ存在するので、該フラグメ７１−か
組込まれれば、全フラグメントが組込れる。 １） Ｎ Ａフラグメント中にマーカーがない場合、形
質導入または形質転換操作後、ラムダＩ） Ｎ Ａを有
する宿主細胞の選択は欠損ファージによる推定的形質導
入体の重複感染（非組込み）および免疫性生存細菌の選
択が必要とされる。 本発明のＤＮＡフラグメントの組込みにより溶菌性にし
たイー・コリ株には、例えば、ＭＧ株が包含される。こ
れらの株は、そのラムダＩ） Ｎ Ａか遺伝地図の５８
位および７１位の間の遺伝子を欠失し、したがって、ｉ
ｎ＋、ｘｉｓ 、 ｒｅｄｌｇａｍ 。 ｋｉｔおよびｅ ＩＩＩ 遺伝子を欠き、Ｃｌ８５７変
異を有し、０および
学的に操作された微生物によって産生される生産物の外
在化法に関する。 発明の背景 イー・コ＋） （Ｅ、ｃｏＪ ｉ） ′ｊ６よび他の原
核性徴生物を、所望の蛋白質の表現用宿主として使用す
る際に伴なう１つの問題として、しばしば、精製のため
に該宿主細胞から蛋白質を外在化させることが挙けられ
ている。この問題を解消するための試みには、均質化ま
たは超音波処理のような細胞もしくは菌体の物理的破壊
、洗浄剤またはリゾチームによる処理のような細胞もし
くは菌体の化学的破壊Ｂよびυｌ／１ｌｌ−シグナルペ
プチドをコードするＩ）ＮＡ配列を、所望の生産物をコ
ードする構造遺伝子へ副！合させることが包含される。 例えば、ヨーロッパ特ＷＩ出願第６１２５０号（Ｗｃｉ
ｓｓｍａｎ ｃｔ ａｌ、 ）はｆ１ｉｆ″仁細胞の溶
解剤または滲透剤による処理を開示しており、米１］特
π「第４３３６３３６号（ＳｉｌｈａｔＶｙＣｔ ａｌ
、 ）は、得られるハイブリッド蛋白が宿主細胞、−反
面近く、またはそれを越えて輸送される、ように細胞質
蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白用の遺伝子にＭＭＩＩ！
合させる方法を開示し、また、米国特許第４３３８３９
７号（Ｇ１１ｌ）ｃｒｔ ａｔ ａｌ、）はプレ蛋白質
用の構造遺伝−ｒ−を表現ベクターに挿入することから
なる成ツ（分泌１て白質の製法を開示している。 イー・コリは工木鎖１） Ｎ Ａウィルスである偏性寄
生体のラムダ・ファージによって感染される。 イー・コリ遺伝学同様、ラムダ遺伝学はよく研究されて
いる（例えば、”ｌｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
Ｌａｒ＋１ｘｌａ ”、 ｅｄｉｔ、Ａ、Ｄ、 ｌ１
ｅｒｓｈｅｙ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
ｌ ９７１ ’ＩＪ照）。 ラムダはテンペレート・ファージで、イー・コリ中で、
２相のうちの１つの相で増殖する。１つの相、溶菌相に
おいて、ファージＤＮＡは［目目的に復製し、キヤ・プ
レ蛋白質用形成、包′！Ａおよび宿主細胞の溶解を指令
する。溶菌４′ｒ１の間のラムダＤＮＡの表現は非常に
効率的である。’ｂｚ： ’７Ｊ、は両方のＤＮＡＮ玉
鎖上また、１本の鎖Ｊ二で右側方間へ向って、およびも
う１本の頂上て左側方向へ向って起る。誘発は３７′Ｃ
で５０分間に約１００個のファージ粒子の放出をもたら
すことができる（前記ｒｌｅｒｓ１１ｅｙｌ１ｒｓ ｈｅｙ参照；目、溶原（′目にＢいて、ラムダＩ） Ｎ
Ａは宿主細胞ゲノムに組−込まれ、宿主複製酵素によ
り、宿主染色体ＤＮＡと共に受動的に複製される。 溶原相におけるファージはプロファージとしで知られ、
宿主は溶原菌として知られ、免疫性であるといわれる。 免疫性は溶菌仕を誘発する種々の事象の発生により失な
われうる。ラムダ１ｎＬｆ６よびｘｉｓ遺伝子の生産物
はイー・コリゲノムからのラムダゲノム除去の触媒作用
をし、自律複製できる共有的に閉じた環を形成する。こ
れらの遺伝子および、直接的または間接的に、全ての他
のラムダ遺伝子の合成はラムダｃｌ 遺伝子の生産物に
より抑制される。 ある種の化学薬品または１） ＮΔ損傷剤に応答して、
細菌は細菌性ｒｃｃ Ａ遺伝子の生産物の合成を指令リ
ーる。該ｒｃｃ Ａ遺伝）生産物は蛋白加水分解的に（
Ｉ レプレッサ蛋白質を開裂し、溶菌４’ｌ遺伝子の友
現を”Ｊ能にさせる。ついて、ファージの増殖は、最終
的にラムダＪ、） Ｎ Ａの自律複製を開始させるいく
つかのラムダ調ｆｎｊ因子の（；目σ作用を必要とする
。 ラムダＰおよびＯ遺伝ｒ−の生産物がＤＮＡ１製に必要
とされる。Ｉ） Ｎ Ａ ｉＪＪ製についで、ファージ
はウィルス構造蛋白質、すなわち、頭部および尾部蛋白
質の合成および無垢な中空ウィルス粒子中でのそれらの
組立を指令しなければならない。これを完了するには少
なくとも１８個の遺伝子のｔｎ互作用を必要とする。最
後に、該ＤＮＡが中空ウィルス粒子中に包装されて感染
性無垢ウィルス粒子が形成され、菌体は、Ｑ遺伝子の生
産物によつ′Ｃ活性化されるラムダＳおよびＲ遺伝子に
よってコードされた細胞内溶解素によって破壊され、そ
れにより、ファージが放出する。Ｑ遺伝子はへ機能によ
って活性化される。Ｎ遺伝子は（１機能によって抑制さ
れる。 キャプシド組立に必要な該１８個の遺伝子はｊ貫伝地図
の右側転写鎖の約３位および３６位の間（遺伝地図上の
位置は総ラムダＤＮＡのパーセンディジで表わしている
）に存在する。左から右へ、第１の遺伝子はＡｌＷｇよ
びＢで、最後はＪである。正常な溶原菌では、Ｊ遺伝子
の右側に８個の細菌遺伝子がある。そのうちの５個、Ｉ
）ｉｏＡ、Ｉｓ。 Ｃ，Ｉ）［よびＦがビオチンの生合成に包含される。 第６番目のｕｖｒ Ｂは紫外線照射耐性をＪｊえる。最
後の２つ、ｃｈｌＡおよびＥは塩素酸塩にに４チる感受
性を与える［ Ｇｕｅｓｔ、 Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、Ｇｃ
’ｎｅｔ、１０５： ２８５〜２８−９ （１９６９）
蟇５ｔｅｖｅｎｓ ｅｔａｌ、。 ’ｉｌ＋ｃ１％；ｔｃｔｅｒｉｏｐｌ＋ａｇｃ Ｌａｍ
ｂｄａ ”、 ｃｄ＋ｌ１ｅｒｓｈｅｙ 。 前出１円）５１５〜５３４参照〕。 天然の宿主細胞溶解において機能する他のラムダ遺伝子
はｋｉｌ遺伝子である。ｋｉｌ遺伝頂の機能は余りよく
判明し−Ｃいない。ｋｉｌ遺伝子を表現する細胞は誘発
後、細胞増殖速度か減少する。ｋｉ１機能の喪失は細胞
の正常な速度での増殖、すなわち、誘発後、溶菌が起る
まで対数期増殖を可能とする。Ｓおよび１ζ」貫伝子と
同様、ｋｉｌ遺伝須はＣＩレプレッサーにより、Ｎｉ貫
云子を介し、間接的に制御されＴｌｚｌる（ Ｇｒｅｃ
ｒ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ６６ ： ５８９〜６０４
（１９７５）参照〕。 温度１９ビ受性溶原菌はよく研究されている〔例えば、
Ｃａｍｐｏｃｌｌ 、 Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ ｌ去」：
２２−３２（１９６１）参照〕。ｃ１８５７遺伝子は温
度感受性ＣＩ変異体で、３８”（Ｊ２１、下で機能する
（ ＳｕｓｓｍａｎｅＬａｌ、、 Ｃ、ＲｏＩＩ、 Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｐａｒｉｓ、２５４’ １５１７〜１
５１９（１９６２）参照〕。同様なファージ系が他の属
で起ることが仰られてし）る。 例えば、ロモフスカヤらｌ： Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ
ｃｔ ；１１．。 Ｊ、Ｖｉｔｏｌ、、９７２５８〜２６２（１９７２）３
はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
にＦ８染するテンペレート・ファージの温度感受性変異
株￥株を報告シテイル。７ ｏ ツ／７ ［Ｆｌｏｃｋ
、 Ｍｏｌ 、 Ｇｃｒ＋。 Ｇｃｎｅｔ、、１５５：２４１−２４７（１９７７））
はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に忌染するテンペ１／
−１−・ファージｐｈｉ −１０５の温度感受性変異株
を報ｌ１１−している。ホトスタインら（Ｂｏｔｓｔｅ
ｉｎ ｃｔ ａｌ、 。 Ｎａｔｕｒｅ、２５１ ： ５８４−５８８（１９７４
）３はサルモ不う（Ｓａｌｍｏｎｃｌｌａ ）に壓染す
る一アンペレート・ファージＩ゛２２の温度感染性変異
株を報／１４ｉしている。ジョストロームら［Ｊｏｓｔ
ｒｏｌｌｌｃｔ ａｌ、 。 Ｊ、 １ｓａｃｃｅｒｉｏｔ、、 １１９ ： １９〜
３２ （１９７４）〕およびトムプンン［１１１ｏｍｐ
ｓｏｎ、 Ｊ、Ｉｓ；ｔｃｔｃｒｉｏｌ 、。 １２９ニア７８〜７８８（１９７７）〕はスタフィロコ
ッカス（５ｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ） にｊす染
するテンペレート・ファージｐＨｉ −１１の温ｒｗ
Ｌ・ｇ受↑ｌに変異株を報告している。ミラーら［Ｍｉ
ｌｂ二１° ｃｔシｔ１．。 Ｖｉｒｏｌ、、５９： ５６６−５６９（１９７４））
ｉまシウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）の７７
ペレ・−）−７アージを報告している。 ボトスタインら［ｌ５ｏｔｓｔｃｉｎ ｃｔ ａｌ＋、
Ａｎｎ、 Ｒｅｖ。 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：６］−８３（１９８２））に
よる報告のようにラムダ細胞自溶Ｗ（素がファージを吸
収できる→）−ル七ネラ株を溶解することが判明してい
る。 ペリショータら（＋’ｃｒｒｉｃａｕｄｃｔ ｃｔ ａ
ｌ。ＦＥＩ３ＳＬｅｔｃ、、５６ ： ７〜１ ］、
（１９７５） ］は、ララムダ遺伝子ｘｉｓ、ｒｃｔｌ
、ｇａｌｌ−１（１１１およびＫｉｌ遺伝子を含むセグ
メントである遺伝地ＩＸ＋の５８位８よび７１位の間（
△５８〜７１）のラムダ遺伝子の欠失を記載している。 ヨーロッパｌ侍π１゛出願２０８４５８４号（ｌｌｃｒ
ｓｈ−１）ｅｒｇｃｒ ｃｔ ａｌ、 ）はプラスミド
の安定化および選択のため、宿１：、細胞として溶原閑
の使用を開示している。この発明者らは、例えは、欠損
ｃｌ遺伝子を汀する溶原菌の、機能（Ｉ遺伝子を有する
プラスミドによる形）Ｊｉｔ転換を開示している。１つ
の開示された具体例において、該機能ＣＩ遺伝子はｃＩ
８５７遺伝子である。 転置因子、すなわち、宿主の染色体組換機構とは独立し
て組換てきる遺伝子がマーカーとして宿主細胞に挿入で
きることが知られている。ロスら［Ｒｏｓｓ ＣＬ ａ
ｌ、、Ｃｅ１ｌ、 １５ ： ７２１〜７３１（１９７
９）］は、転置テトラサイクリン耐性囚因子！ｎ ｌ
Ｑによってプロモートされる欠失および逆位の物理的構
造を報告している。ディビスら［＋）＋ｉ ｖ ｉ ｓ
ｅｃ ａｌ。Ｊ３ａｃｃｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
” 、Ｃｏ１ｄ Ｓｌ）市ｙ’１ｇＨａｒｂｏ：ｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８
０） ］は転置因子の使用を記載している。 ラブカンら［Ｒｕｖｋｕｎ ｅｃ ａｌ 、、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２８ｇ二８５〜８８（１９８１）］は、転置カ
ナマイシン耐性およびネオマイシン耐性因子Ｌ’１１５
を何するプラスミドの接合、ついて、相同組換による
ｔｎ５のリゾヒ゛ウム・メリロチ（Ｒｈ１ｚｏｂ璽ＬＩ
ＩＴＩｍｅｌｉｌｏｔｉ ） 染色体１）ＮＡへの組込
みを報＜！′ｌ’ Ｌ Ｔいる。相同フランキング配列
の存在に由来する組換による非対応遺伝子の組込もヨー
ロッパ特ｒ［出願第７４８０８号に開示されている。 発明の４１１ｊ戻 本発明はテンペレート・ファージからの細胞内溶解素コ
ードｆ＝Ｊけ遺伝子を用いる細菌内で生産物を産生ずる
方法を１）、′−供するものである。本発明の方法は％
１ｆｌｊｆ度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子お
よび機能性ファージ・リゾチーム・コード付は遺伝子を
ｆｒ Ｌ、π１容条件下で該リゾチーム・コード付り逍
１べ子が抑制され、制限条件下で表現される温度Ｉ［Ｆ
］受性細菌（９、を、直接または間接的に生産物を表現
するＩ） Ｎ Ａ分）で形質転換し、許容条件下で該形
質転換株を培養して該生産物を産生さぜ、温度を１＝Ｐ
Ｉさせて制限条件を生じさせ、所望により、培養培地ま
たはその濃縮物から該生産物を回１■することからなる
。 本発明の他の態様は、生産物を産生する細菌を、温度１
多受性フアージ・レプレッサー遺伝子２よひファージ・
リゾチーム・コード付は遺伝子を有し、７１″容条件下
で該リゾチーム・コード付は遺伝子が抑制され、制限条
件下で表現されるファージＤＮＡ配列で形質転換して細
菌を溶菌性にし、許容条件下で該形質転換細菌を培養し
て生産物を産生させ、温度を変化させて制限条件を生じ
させ、所望により、生産物を培養培地またはその濃縮物
から回収することからなる細菌生産物の産生法を提供す
るものである。 本発明のもう１つの態様は、温度ｊ［Ｆ］受性レプレッ
サー遺伝子および機能性リゾチーム・コードイ；」け遺
伝子を有し、該リゾチーム・コード付すＪ貫伝子が許容
条件下で抑制され、制限条件十で表現される欠損ファー
ジ配列、選択マーカーおよび、好ましくは、宿主細胞の
染色体に２ける隣接配列と相同のフランキンクＤＮＡ配
列からなる１） Ｎ Ａフラグメントを提供するもので
ある。 本発明のもう１つ別の態様は、細菌を本発明の１）ＮＡ
フラグメントで形質転換してなる溶菌性細菌の製法およ
び該１）ＮＡフラグメン１−からなる細菌を提供するも
のである。 さらに、本発明のもう１つの態様は、有効ｍｍの細菌生
産物を含有する量の温度感受性細菌を哺乳類に投与し、
これにより、細菌が哺乳類の体内て溶解し、該生産物を
放出することからなる哺乳類に細菌生産物を投与する方
法を提供するものである。 発明の訂′説 １１−１１４度感受性細１￥１は、ｌ都度感受性レプレ
ッサー遺伝子を含み、１つのｉ’ｌ’ｉｌ’Ｌ度範囲＜
＝＋容条件）にて培養した場合、レプレッサーが機能
するが、もう１つの温度範囲（制限条件）で培養した場
合、レプレッサーが機能ヒ゛ず、レプレッサーが表現さ
れず、または安定でないファージＩ） Ｎ Ａ配列を有
する細菌である。制ｔｉｌｌ ８件下、ファージ・リゾ
チーム・コード付は遺伝子を含め、ファージ遺伝子が表
現され、菌体の溶解をもたらず。かかる温度感受性細菌
が溶菌性細菌である。本明細書に記載のようないずれの
溶菌性細菌も本発明の方法に使用できる。 温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子は入手するこ
とができ、あるいは公知の方法でかかる遺伝子を変異さ
せることにより調製できる。例えば、キ’ｖ ７へｔｖ
［Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＶｉｒｏｌＯ，ｇＸ ｌ ４
：２２〜３２（１９６１）］は温度感受性ファージ変異
株の単離を記載している。一般に、この方法は、ファー
ジ感染細菌に、紫外線照射によるなどして変異誘発処理
を行ない、生存菌を高温でインキュベートして、いずれ
かの温度感受性レプレッサー変異株の誘導を生じさせる
ことからなる。ついで、溶解質を感受性細菌の感染に用
いる。この新たな溶原菌を加熱誘発に付し、加熱誘発後
に生じたファージを温度感受性細菌からの溶原菌調製に
用いる。このサイクル（溶原菌調製、誘発、再調製）は
ファージ・レプレッサー変異体の同定に通じる。典型的
には、３〜４回のかかるサイクルがかかる変異株を得る
のに充分である。 以下の記載は大部分、溶菌性イー・コリ、ことに、Ｃｌ
８５フイー・コリ溶原菌に関する。けれども、これに限
定するものではなく、ラムダまたは前記したテンペレー
ト・ファージのような他のテンペレート・ファージから
のレプレッサーおよび細菌内溶解素コード付は遺伝子を
用いて他の溶菌性イー・コリならびに他の溶菌性細菌に
ついても同様に行なうことができる。 （１８５７溶原菌は公知であり、一般的に入手でき、３
８°Ｃ以下で活性であるが、３８°Ｃを超えると不活性
なｃＩ レプレッサーを産生ずる。これらは、レプレッ
サーが３８ ”Ｃを超えると不活性になる変異に加えて
、ｃｌ ５ｓ７ｉｔｆｆ伝子が、ラムダｒｃｃ Ａ遺伝
子の生産物による蛋白加水分解的開裂に対して該ｃｌ
レプレッサー蛋白を不感性にする第２の変異を含有する
ので他の温度感受性イー・コリ溶原菌より好ましい。す
なわち、許容条件下で培養した場合、ｃｌ レプレッサ
ー蛋白は安定で、したがって、免疫性を卸持するのに効
率的である。 イー・コリＵＣ５８２２株はＣ１８５７変異を有する溶
原閑である。また、該株はｉｎｔ遺伝子（ｉｎＬ ５
ａｍ 、７７ハー変異）およびＰ遺伝子（Ｐ３ ａｍ
、アンバー変異）に点変異を有する（アンバー変異は翻
訳の終１にを合図する。）。一般に、ＵＣ５８２２株は
、欠損性、すなわち、一般に感染性ファージ粒子を生成
しないので、例えば、ＭＭ２９４（ｃｌ ８５７）株よ
りも好ましい。欠損性溶原菌は、ことに、ポリペプチド
を哺乳類に投与するのに用いる場合に好ましい。しかし
ながら、ＵＣ５８２２株は低レベルのリゾチームを産生
じ、これは、多分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝子の
より低い複写数、すなわち、ＭＭ２９４（Ｃ１８５７）
より低い複写数、すなわち、５０〜１００を有するため
であるにもかかからず、ＵＣ５８２２株は誘発後、容易
に溶解する。 本発明の方法における１つの態様において、温度感受性
細菌は、直接または間接的に所望の生成物をコードする
ＤＮＡ分子により形質転換される。 この形質転換は、ＤＮＡ分子が宿主細胞に入り、生産物
を表現することを可能にするいづ゛れの技術によっても
行なうことができる。これらの技術には、例えば、形質
転換、形質導入、接合および細胞融合が包含される。多
くの適当な表現ベクターがよく知られており、生産物用
の遺伝子クローニング君よぴ細胞のかかる分子による形
質転換のための技術と同様に広く利用されている。一般
に、生産物は非排泄性の非対応遺伝子生産物、すなわち
、天然には宿七によ、って生産されない、外在化されな
い物質である。直接表現される生産物にｃＪポリペプチ
ドが包含され、間接的に表現される生産物にはポリペプ
チド、糖蛋白質、抗生物質および、例えば、金属チオネ
イン産生細菌内に隔離することのできるような金属イオ
ンのごとき他の分子が包含される。 形質転換宿：１ＥＣＩ８５７溶原菌は、所望の生産物の
表現に至適なγ１゛容条件下（く３８℃、通常、３２〜
３６ ”Ｃ）、無際限に増殖できる。充分な増殖がぶ成
されたとき、すなわち、通常、対数増殖Ｉ！／Ｊ中期（
八〇、。−０，Ｊ ）にｙ予したとき、溶原菌を制限条
件下で培養してラムダ細胞内溶解素の合成を誘発させる
。これは、培養培地またはその濃縮物の温度を、Ｃｌ８
５７株の場合、３８”Ｃより高く、好ましくは、４２〜
４４”Ｃに約９０〜１２Ｑ分間」二！Ｉさぜることによ
り行なえる。別法として、培養培地寸たはその濃縮物の
ｉ’ｆｌｌｆ度を３８°Ｃより高く、好ましくは、４２
〜４４°′Ｃに短時間、すなわち、ファージＩ）ＮＡを
誘発するに充分な時間；好ましくは、少なくとも約５分
間上昇させ、ついで、温度を０〜３８℃、好ましくは、
２〜３６℃に低下させる。 溶菌がより効率的で、迅速であるので、制限条件を９０
〜１２０分間維持することが好ましい。 しかしながら、場合により、例えば、所望の蛋白質が熱
不安定性な場合または制限条件を維持する経費をさける
ような場合には後者の方法も好ましい。 宿主［１８５７株が機能ラムダＣｒＱ逍伝子を有する場
合、溶菌が起るまで、細胞は細胞が機能するいずれの温
度においてもリゾチームを合成しつつける。ラムダ細胞
内溶解素はＯ″Ｃのごとき低６１ｊλても活性であるが
、一般的に、蛋白合成１車度および触媒活性の低下ゆえ
に、溶菌に要する時間は低温ではより長くなる。 誘発の直前または誘発後、好ましくは、細胞を、ρ過、
遠心分離または他の手段により濃縮し、この濃縮物を溶
菌するまてインキュベ−１・する。かかる方法は所望の
生産物の収集Ｂよび精製を容易にする。誘発につづき、
細胞壁は実質的に分解する。プ「ｒドプラスト 合成しつつけ、生産物は細胞膜を通して多量に培地中に
放出される。培地中への完全な放出は溶菌によって達成
される。溶菌は培養培地またはその濃縮物の清澄化およ
び／または培養培地または濃縮物の粘度増加によって観
察できる。溶菌は、例えば、機械的攪拌または急激な培
養条件の変化、例えば、温度を２〜２５′ｃの間で急激
に変化させるか、培地または濃縮物の浸透圧強反を変化
させることにより増強することができる。好ましくは、
細胞を濃縮し、生産物含有上澄液をデカンテーションし
た後、誘発細胞を最少塩緩衝液または０．１Ｍ １．リ
ス緩衝液、５ Ｑ ｍＭ ＮａＣｌ ２ ヨ（ｊ １
ｍＭＩ！．ｌ） ’Ｆ Ａに懸濁させ、攪拌して溶菌を
行なう。 ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所昭の生産物を回収し、所望により、精製する。 別法として、溶菌４′Ｉ′ｌの訪発前に全細胞をａａし
、哺乳類に経１」投ｑする。ついて、体内で誘発が起り
、所望のポリペプチドの放出をもたらす。この方法はこ
とに、全細胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起さ
せるのに好適な場合に、動物に該抗原を投与するのに有
用である。例えば、１、゛１′−Ｂ抗原のような抗原を
コードする遺伝子を有する温度域受性溝原菌は直接ブタ
および／またはウシに摂取させることができる。各動物
に投−グする菌体の所は有効用阻を含有する菌体量であ
る。！１′１位屑の菌体によって産生される蛋白質搦は
公知の方法で訂算することができる。 本発明の１つの態様は本発明の方法に用いる溶菌性細菌
を調製するのに使用できるＩ） ＮΔフラグメントを提
供することである。かかるＩ）ＮＡフラグメントは温度
感受性レプレッサー遺伝子および機能性リソチーム・コ
ード付は遺伝子を有する欠損ファージ配列からなる。か
かる欠損ラムダ配列からなるＤＮＡフラグメントは細胞
内溶解素が制限条件下で表現されるような温度感受性ｃ
Ｉｔｋｌ伝子および機能性ラムダ細胞内溶解素コードｆ
・Ｊけ遺伝子（Ｎ，Ｑ，ＳおよびＲ）、選択マーカーＢ
よび、ＩＪｆましくけ、宿主細胞染色体における隣接１
）ＮＡとイｎ同のフランキングＤＮＡ配列を有する。 １つの具体例において、該１） Ｎ Ａフラグメントは
、遺伝地図（の５８位およ０，７１位間の遺伝子が欠失
しており、したがって、ｊｌｌＬ、ＸｊＳｊ６よびｋｉ
Ｊ遺伝子を欠き、温度ｊ’Ｚ染性Ｃ１遺伝子を有し、０
ぢよびＰ遺伝ｒに変異を有し、該（Ｉ遺伝子が（Ｉ８５
７変異体で、制限条件下で細胞内溶解素を産生するラム
ダＩ）ＮＡからなる。０およびＰ変異は欠失マたは点変
異とすることができる。０２９、Ｐ３およびＰ ８０変
異のような点変異は、それらが容易に利用できるので好
ましい。Ｐ３変異はＰ８０変異より好ましい。 他の具体例１トおいては、フラグメントは、遺伝地図の
３位および７１位の間の遺伝子に実質的な欠失があるラ
ムダＤＮＡからなる。かかるフラグメントはラムダ・キ
ャプシド組立に必須の実質的に全ての遺伝子ならびにｉ
ｎｔ、 ｘｉｓおよびｋ ｉ Ｉ ｉｌｌｌｌ伝火失し
ている。 所望の生産物を産生ずる、または、例えは、遺伝子工学
的技術により、予めもしくはその後に所望の生産物を産
生ずるようにした宿主細胞、イー・コリまたは他の細菌
は、公知の技術により、温度感受性ファージ・レプレッ
サー遺伝子およびファージ・リゾチーム・コード付は遺
伝子を有するファージＩ） Ｎ Ａ配列で形質転換され
る。これには、かかる温度感受性レプレッサー遺伝子を
有するテンペレート・ファージ、好ましくは、欠損ファ
ージでの細菌の感染が包含される。また、公知の方法、
例えば、形質転換、形質導入、接合おにひ融合により、
細菌を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換させるこ
とが包含される。一般に、形質転換にはファージまたは
プラスミドのようなベクターへのフラグメントの組込が
包含される。例えば、フラグメントは１）旧（３２２等
のようなプラスミド中てりｌ］−ンすることがてき、該
フラグメントに（ＩＩＩ ｊｊを接する配列に相同する
隣接配列を欠くか、組換事象を欠損している（ ｒｅｃ
）適当な宿主中、１ｎｖｉｖｏで生育できる。該プラ
スミドは回収し、所望の生産物産生１１１の適当な宿主
の形質転換に使用できる。かかる宿主の形質転換につい
で、宿主染色体における隣接１．） Ｎ Ａ配列と相同
のフランキングＩ）Ｎへ配列を有するフラグメントを相
同隣接配列のサイトで自然に組換えるこ、とにより組込
む。別法として一所望の生産物を産生ずる適当な宿主は
線型または原型の分離１） Ｎ Ａフラグメントて形質
転換てきる。 該１） Ｎ Ａフラグメントは選択マーカーを有し、形
質転換体の選択を容易にする。選択マーカーは、典型的
には、分析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主に原栄
養性を復元するか、致死もしくは抑制化合物、一般に、
抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。好ましく
は、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子で、こ
れらは、入手できないか、あるいは自然に原栄養性に復
帰する栄養要求性宿主の使用を要しない。テトラ−リイ
タリンは安価で、また、テトラサイクリン而１性は通常
、自然には獲得されないので、テトラサイクリン１ｌｉ
Ｉ性が好ましい。 形質転換体におけるマーカーの存在は宿主が該ＤＮＡフ
ラグメントからなっていることを示す。 該ＤＮＡフラグメントと宿主細胞Ｄ Ｎ Ａ （７）間
の相同はラムダＩ） Ｎ Ａと側面を接する領域およＯ
・マーカー中にのみ存在するので、該フラグメ７１−か
組込まれれば、全フラグメントが組込れる。 １） Ｎ Ａフラグメント中にマーカーがない場合、形
質導入または形質転換操作後、ラムダＩ） Ｎ Ａを有
する宿主細胞の選択は欠損ファージによる推定的形質導
入体の重複感染（非組込み）および免疫性生存細菌の選
択が必要とされる。 本発明のＤＮＡフラグメントの組込みにより溶菌性にし
たイー・コリ株には、例えば、ＭＧ株が包含される。こ
れらの株は、そのラムダＩ） Ｎ Ａか遺伝地図の５８
位および７１位の間の遺伝子を欠失し、したがって、ｉ
ｎ＋、ｘｉｓ 、 ｒｅｄｌｇａｍ 。 ｋｉｔおよびｅ ＩＩＩ 遺伝子を欠き、Ｃｌ８５７変
異を有し、０および
【′遺伝子に遺伝子を有し、制限条
件下で細胞内溶解素が表現されるように機能性Ｎ、Ｑ、
ＳおよびＩ（遺伝子を有する溶原菌である。 １つの具体例において、アンバー・サプレッサー、ずな
わち、ＵＡＧ翻訳終止コードンの翻訳サプレッサーの宿
主細１１；す）ＮＡによる産生のため、点（アンバー）
変異株であるＭＣ１株［Ｃ６００（λ△５８〜７１．Ｃ
１８５７，？’３，０２９）。 ５ｕｅＪ十、 ｇａｌ Ｋ、 ＩａｃＺ、 ｔｈｉ 、
ｇａｌ：： ｔｎｌＱＬｅｔＲ〕が解読され、０およ
びＰ遺伝子が表現される。 本発明の方法で用いるさらに好ましい宿主細胞は表現型
的に〇−およびＰ−のものである。１つの具体例におい
て、ＭＣ３株（Ｎ９９（λ△５８〜７１．ｃｌ ８５７
．Ｐ３，０２９）、ｇａｌＫ。 １ａｃＺ 、 ｔｌｌｉ 、 ｇａｌ ：： １１１１
Ｑ Ｌｅｔ ）はＭＣ１株と同様なラムダＤＮＡを有
する。しかし、この株は表現型的に〇−およびＰ−で、
ｔｅｔ 、△ｋｉｌ。 △ｉｎｔおよび△ｘｉｓである。 もつとも好ましい溶菌性イー・コリはＭＣ４株である。 これは実質的に全てのラムダ横置蛋白質、組立遺伝子お
よび正常な右側プロファージ−細菌接合点、すなわち、
右側結合サイト（ａｌｔ）を欠失する株である。ことに
、これらは遺伝地図の３位および７１位間のラムダ遺伝
子の実質的に全てを欠失し、０およびＰ遺伝子に点変異
を有し、制限条件下で細胞内溶解素が表現されるように
ｄ］＾度感受性ｃＩ遺伝子、機能性Ｎ、Ｑ、Ｓおよび１
（遺伝子を有し、選択マーカー、すなわち、１１１゜テ
トラサイタリン耐性転置因子を有する溶原閑である。か
かる欠損溶原菌はウィルス増殖に対する４つの独立した
遮断を有している。すなわち、ｔｉ）ＯおよびＰ複製機
能の喪失、（１１）プロファージの重複感染ファージか
らのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子による相補をできなくさ
せるａｔｔ の壱失、（ｌｉｔ）ラノ、ダ構造遺伝子の
コード不能および（ＩＶ）ラムダ１）ＮＡの大きさが包
装に必要な最小の大きさよりはるかに小さいことである
。これらは、最初に、ＭＧ株のようなＣｌ８５７．０−
１Ｐ−溶度菌株に塩素酸塩ストレスを加えて塩素酸塩耐
性株を産生じ、Δおよび１３機能欠損の重複感染異種免
疫もしくはビルレント・ラムダまたはラムドイド・ファ
ージの増殖を相補できない変異株を選択することにより
調製できる。該マーカー、ラムダｌ） Ｎ Ａおよび該
イー・コリ染色体からのフランキング配列からなるｌ）
Ｎ Ａフラグメン１−は、例えば、制限エンドヌモレ
アーゼによる処理またはＰ１形質導入によってＭＣ４株
から単離できる。 ＭＧ４は、ウィルス構造成分をコードするノくクテリオ
ファージ遺伝子の全部または大部分を欠失させることに
よりＭＧ３から誘導できる。これらの遺伝子の喪失を保
証するためには、ＭＧ４中のウィルス・ゲノムが、それ
自体これらの遺伝子を欠損している重複感染ファージを
相補および増殖させることができないことを証明すれば
充分である。λシャｏ７３Ａ（λＡ 、ＩＳ−ｉｍｍ
８Ｑ ）がこの重複感染に使用できるファージの例であ
る。 別法として、異種免疫またはビルレント・ファージ（λ
ｖｉｒ ）の存在下、ＡまたはＢにアン／く一変異を有
するか、他のウィルス構造シストｌ−Ｊンを有するいず
れかのファージを感受性イー・・コリ上て平板培養する
ことができる。該２つのファージ間で組換が起り、組換
体、例えば、ｖｉｒΔ−の形成をもたらす。組換体の頻
度は実験条件に依存して、１〜５０９６の間である。組
換体は、それらか→Ｊ−プレッサー含含有層原菌 Ｙｍ
ｅｌ （λ）〕上で羽根培養できることおよび、それら
がＮ９９のような非抑圧１．λ、感受性株」二でプラー
クを形成しないことにより認識できる。この交差で得ら
れるプラークをＹｍｅｌ （λ）またはＮ９９を入れた
ベトす器上で平板培養し、組換体を精製する。Ａおよび
／またはＢ遺伝子機能を欠損するラムダ・ファージは、
それらのラムダ・ゲノム上の位置ゆえに、これらの機能
を相補できないＭＧ、４株が他のラムダ構造遺伝子の全
てを欠失することになるので好ましい。 欠損ファージおよび宿主をこのように使用することは「
マーカー救済」と称され、広〈実施されている（例えば
、” Ｔ１１ｃ ｌ５ａｃｔｅｒｉｏｐｌ＋ａｇｅ Ｌ
ａｍｂｄａ ”ｅｄ、 Ａ、Ｉ）、ｌ１ｅｒｓｌｌｃｙ
、 Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、１９７１ ．５Ｌｅｖｃｎｓ ｃｔ ａ
ｌ＋、ｐｐ５１５〜５３３参照）。 本発明はいずれの細菌生産物の製造にも使用できる。そ
の例は非常に多く、とりわけ、インシュリン、狂犬病糖
蛋白質、Ｋ９９および９８７Ｐ抗原、抗生物質、生長ホ
ルモン、金属チオネイン、σ−１−抗トリプシン、イン
フルエンザ抗原、リンフ才力インおよびインターフェロ
ンが包含される。加えて、本発明は、従来必要とされて
いる溶菌工程を回避して、操作を非常に簡単に、かつ、
操作時間を短縮できるので、コロニー・スクリーニング
、ＲＮＡ単離およびプラスミド調製にも用いることがで
きる。 つぎに実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。 実施例中、全ての出発月料は容易に入手できるか、公知
の技術によって容易に調製できる。形質導入ハ実質的に
エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイツ
クス［ｌｌＥｘｐｅｒｉｍ’ｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ” 、ｅｄ 、 Ｊ 、
Ｈ、八（ｉｌｌｅｒ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｎｅｗ”ｒｋ（１９７２）、ＰＰ、２０１〜
２０５Ｊ（７）記載に従って行なった。 実施例Ｉ ＭＧＯの調製 Ｃ６０，０株（イー・コリ５ｕｌＩ＋、 Ｋ １２ 、
ｇａｌＫ 、 ｌａｃ Ｚ、 ５ｕＩｌ 、 ｔｈｉ
）をλｃＩ ８５７ Ｐ ３０２９（つ不スコンシン
大学、Ｗ、５ｙｚｂａ Ｉ ｓｋ ｉ氏提供）の存在下
でインキュベーションした。３２℃で一夜増殖させ、生
存細菌を分離、精製した。 これらの細菌の８０％が重複感染に対して免疫性であり
、４４℃で増殖できず、４４℃にさらした後、λｃＩ８
５７ Ｐ３ ０２９と区別できないラムダ・ファージ〔
該ファージがＣ６００株ヒてはプラークを生じるが、Ｎ
９９株（イー・コリＫ １２ 。 ｇａｌ Ｋ 、 ｌａｃ Ｚ 、 ｓｕＯ、ｔｈｉ ）
上では生じないことで判定〕を産生ずることが判明した
。これらの生存細菌群の１つを精製し、ＭＧＯ（（’ｌ
： ６００（λ ｃＩ ８５７ １’３０２９ ） ）
と命名した。 実施例２ ＭＧＯ−ＡＲ６の調製 Ｎ５１５１株（イー・コリに１２，５Ａ５００゜ｇａｌ
Ｋ、 ｌ；ｔｃ７． 、 ｐｒｏ 、 ｔｈｒ 、
１１ｉｓ、 ｇａｌ ８（λｃＩ ８５７ Δ５８〜７
１ △ｌ１ｌ））を、予めΔに４株（イー・コリに１２
、ｇａｊ：： ｔｎｌＱ（Ｐｌｃｍ １００ ） ）
Ｊ−で増殖させたＰｌｍ １００フアージの存在下でイ
ンキュベーションした。Ｎ５１５１およびＡ Ｉｔ ４
ｌ−で増殖させたＩ）１ｍｌＱＱの交差はテトラサイ
クリン耐性、Ｕ■感受性、温度感受性溶原閑を生じさせ
た。これらの単離物の１つを精製し、ＭＧＯ−ＡＲ６（
イー・コリに１２、ｇａｌ ｐ、 、 （ｐｉｌ ：
： ｔｏ ｌ Ｑ λ△５８〜７１ Ｃ１８５７△ＩＩ
ｌ （＋）ｉｏ ｕｖｒｌｌ ） ）と命名した。 実施例３ ＭＣｌの調製 ＭＧｏ −ＡＲ６４；ｌ、Ｐｌｃｍ １００の存在下に
インキュベーションしたＡＲ６の生存菌を単離スること
によりＨ’ｎｎ ］ ００溶原閑になった。ＭＧＯ−Ａ
Ｒ５のＰ１ｃｍ１００溶原菌をＭＧＯ−ＡＲＩ Ｂと命
名した。 ＭＧＯ株を、ＭＧＯ−ＡＲＩＢ上で増殖させたＰｌｃｍ
ｌＯＯによりＰ１形質導入して交差さ−げだ。 ファージを吸収させた後、菌体を４ Ｊ ／ ｕｔのＵ
Ｖ照射（ｕｖ線量計で測定した場合、２ Ｊ ／ ｕ
ｅ ／ ｓの割合の２５４’１ｍの光の照射）に付し、
テトラ勺−イタリンの存在下でインキュベーションした
。テトラサイクリン耐性コロニーの１１９６カ＜ｕＶ）
Ｙｊこ耐性を示し、それらが１１１欠失を有せず、した
力ｊって、それらがｃｌからファージの右側端まてのラ
ムダ遺伝子を有していることを示した。ことに、このこ
とはこれらのコロニーがＰ３および０２９変異と、無垢
のＳおよびに遺伝子を有してＧ）ることを意味している
。Ｕｖ耐性、テトラ４３−イタ１ノン耐性菌の１／３は
ファージを産生じな力）つた。したがつ−（、これらは
ラムダの５８〜７１欠失を１色得し、それ故、ｉｎｔ
、 ｘｉｓおよびｋｉｌ 遺伝子を欠失したと判断され
た。この群を精製し、ＭＣＩ（（Ｃ６００）（λ△５８
〜７１ 、ｃｌ ８５７Ｐ ３ ０２９ ） 、５ｕｌ
ｌ 、 ｇａｌ Ｋ、 ］ａｃＺｔｈｉ 、 ｇａｌ
： ： 目ｒ ｌＱ Ｌｅｔ ）と命名した。 実施例４ ＭＣｌを１″Ｉｃｍ １００の存在下でインキュベーシ
ョンし、生存菌を精製した。これらの生存菌のうち、非
常に高い割合でＰｌｃＩ＋１１．００溶原菌となったＭ
ＣＩ菌体が同定された。〜（Ｇ１のＰ１ｃｍ１００溶原
菌を精製し、Ｍに２命名した。 Ｎ９９株を、ＮイＧ ２−１テ増殖さぜた！’ｔｃｍｌ
ｏＯでＰｌｃ＋ｎ１００ 影付導入により交差させた。 テトラサイクリン１Ｉｌｉ、Ｉ性の形質導入体を選択し
た。これらの全てはラムダに苅して免疫性で、したがっ
て、ラムダ溶原菌と判断された。これらの溶原閑の１つ
を精製し、Ｍに３（Ｎ９９（λ△５８〜７１ｃ１８５７
Ｐ３ ０２９））と命名した。 Ｍｏ３を４４℃に９０〜１２０分間さらして溶菌を測定
した。該温度にさらす前および後、菌体培養中には全く
ファージは見出されながった（３゜３×１０ 細胞／ｎ
、／＋の培３％ ０．１ ｍｌ当り〈１）。ファージの
存在はＣ６００閑体」二で検定した。非欠損ラムダ・プ
ロファージを有するイー・コリ株の対照培養は３．３ｘ
ｌＯ”細胞／ηＪの培＄Ｉｍ＋！当り、１０５〜１０９
個のファージを含有していた。 実施例５ Ｍｏ３の調製 実質的に前記実施例と同様イこ、ただし、Ｎ９り株をλ
Ｃｌ８５７ Ｐ３ ０２９で直接溶原菌化してＭｏ３株
を調製した。得られた溶原菌をＭ ＧＯ−ＡＲ１８株で
Ｐ１形質導入することにより交差させ、温度誘発により
溶菌するが、ファージを産生じないテトラサイクリン耐
性溝原菌を選択した。 実施例６ ＵＣ５８２２の調製 Ｎ９９株をλｉｎｔ ６ ｒｅｄ ３ ｃＩＢ５７ ｐ
Ｂ□およびλ ｈｙ ５ ｃｌ ｉｍｍ ２１ Δ１）
２で感染させてＵＣ５８２２株を調製した。λ１１ｙ
５ ｃｌ ｉ＋ｎ＋ｎ２１ △ｂ２はファージλおよ
びファージ２１のハイブリッドである。この調製におけ
るλｈｙ５ｃｉ ｉｍｍ ２１ △ｂ ２の目的は、λ
ｉｎＬ （ｉ ｌ’ｅ（１３Ｃ１８５７Ｐ２Ｏがこの
株を溶原閑化するために必要なトランス状態で１１１１
機能を付与することにある。△Ｌ） ２変！７’＋３．
は△ｈ ｙ ５ ｃ Ｉｉ ｒｎｍ ２１△ｂ２フアー
ジのそれ自体の該株への組込の指令をできなくする。ラ
ムダの重複感染に免疫性であるが、ファージ２１に対し
て感受性を示すこの交差の生存菌を精製し、Ｕ Ｃ５８
２２と命名した。 この株は４４℃にさらすと生存しなかった。４４℃にお
けるインキュベーションの前後で、ＵＣ５８２２の陪従
中にファー ジは全く検出できなかつ１、：。 実施例７ Ｍｏ４の調製 Ｍｏ３の培養菌をルリア（Ｌｕｒｉａ ）ブロスまたは
他の完全培地中、Ａ６．。−０，５となるまで３２℃で
増殖させた。培養物は約５×１０８ 細胞／ ｍｌを含
有していた。ついで、培養物を、０．２９６グルコース
および０．２９６ＫＣ１０３を補足した栄養寒天平板■
；で毛板培養した。平板を嫌気性条件下、３２℃でコロ
ニーが形成されるまで（３〜５日間）インキュベーショ
ンした。かかる条件下、この培地上での増殖により、ｃ
ｈＩ！Ａ 、 Ｂ、 Ｃまたは１）遺伝子に変異を有す
るイー・コリを選択した（”Ｅｘｐｔｓ、 ｉｎ Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃ；ｅｎｅｔｉｃｓ”、、 Ｊ。 Ｍｉｌｌｅｒ、 ＰＰ、２２６〜２２７参照）。 ｃＪＢ、Ｃまたは１）における変異はＭｏ４の中限には
つながらない。変異のうち、ｃｌｌｌＡの表現に影響す
るのはｃｈｌ Ａにおける点変異およびｃｈｌＡ の左
側または右側に伸びる欠失である。 ｃｈｌＡ の左側に伸びる欠失は１９Ｆ接するｔ＋ｖｒ
ｌｓ遺伝子の破壊をきたし得、それ故、生物にＵＶ感受
性表現型を与える。同じ理由で、ｃｈｌｌ）から右側へ
伸びる欠失も生物にＵＶ感受性表現型を与え得る。嫌気
性インキュベーションで得られた塩素酸塩耐性コロニー
がＵＶ感受性であるか否かを決定するためにテストする
。これは、塩素酸塩耐性コロニーをペトリ皿上で画線し
、ペトリ皿のＩｉ２をカバーし、他の半分を２５４ ａ
【ｒＩａｌ Ｖ光の１０Ｊ ／ ｕｆ照射に付すことに
より、都合よく行なえる。 この線量はＵＶ感受性菌体を殺すが、ＵＶ耐性変異型は
殺さないために充分な量である。ＵＶ感受性変異株（ｃ
ｌ＋ＩＡまたはｃｈｌ、Ｈにおける変異からなる）の欠
損ラムダ・ファージの存在をテストする。これは、同種
免疫ファージの画線を介して菌体を交差画線することに
より行なえる。ラムダ感受性細菌は交差画線のところで
ファージによって殺され、ラムダ溶原菌は重複感染に対
して免疫性であり、殺されない。（ｂｌＡおよびｃｈｌ
ｌ）遺伝子、ラムダ・ゲノムおよび１ｉｖｒｌｌ 遺伝
子の所在の結果、全てのｊＪ ■感受性ｃｂｌＡ変異株
はラムダ溶原菌となりうる。したがって、ＵＶ感受性、
ラムダ溶原蘭は左側にｕｖｒｌｓ中へ伸ひる（旧Δの欠
失を含む。該欠失がｕｖｒ１３ を通過して伸ひる場合
、ビオチン・Ａべｒ１ン中、また、多分、構造ラムダ遺
伝−Ｆ中へ伸びることができる。この方法により、構造
ラムダ遺伝子の欠失が得られている（ Ｇｒｉｃｒ、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、 ６６ ： ５８９〜６０４（１９７
５））。全てのｕｖ感受性、ｃｈｌＡ−、ラムダ溶原菌
をλｖｉｒＡ−て感染さぜる。２．５時間後、λｖｉｒ
Δ−ファージおよびλｖｉｒＡ十組換体の増殖および／
またはλｖ＋ｒＡ ファージの産生のあったＭＧ４Ｇ４
候補型てる。λｖｉｒＡ−の相補マタはｖｉｒＡ″−の
産生をしない株はｃｈｌＡ がらラムダのＡ遺伝子まで
伸びる欠失を有している。 ｃｈｌ ＡからラムダのＡ遺伝子までの欠失を有するＭ
Ｇ４Ｇ４候補型菌細菌特性（〉３８℃の増殖の際の溶菌
）についてテストする。欠失を有し、溶菌細菌特性を保
持している株をＭＧ４として精製する。 実施例８ ＭＭ２９４（ＣＩ８５７）およびＵＣ５８２２における
クローニング イー・コリＭＭ２９４株をλＣ１８５７の存在下でイン
キュベートした。３２℃で一夜増殖後、生存細菌を単離
し、精製した。重複感染に免疫で、４４℃で増殖できず
、ファージを産生できないクローンを分離した。得られ
たＣｌ８５７溶原株、ＭＭ２９４（λＣＩ ８５７ ）
およびイー・７９００５８２２株をＣａ Ｃｌ！２処理
によってコンピテント閑とし、イー・コリｒ−’ｉ”
−ｎ抗原ならびにアンピシリンおよびテトラザイクリン
面ｊ竹冒こつぃての遺伝子を有するプラスミド、Ｉ）Ｉ
）Ｎ５で形質転換した。 両方の溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリ
ン耐性形質転換体は標糸栄養ブロス中、３０〜３２℃で
よく増殖し、Ｌ ｉ’ −Ｉｓ抗原を表現した。細菌を
遠心分離によりペレット化し、４２℃の標塾栄養ブロス
に移す。約９０〜１２０分以内に、細胞溶解が明白にな
り、実質的に完了した。 Ｌ Ｔ −Ｉｓ抗原がブロス中に放出された。４Ｘ１０
７細胞／ ｍｌからなるＭＭ２９４（Ｃｉ８５７）形質
転換体の試料において、１ ｍｌ当り、約２ Ｘ １０
”個のラムダ・ファージを収集した。ＵＣ５’８２２形
質転換体の同イ■乏な試料中では、全くファージは収集
されなかった（く２ｏ個／ ｍｌ ）。 実施例９ Ｕ Ｃ５Ｂ ２２におけるクローニングイー・コリＩ・
Ｔ−１３抗原の遺伝子を有するプラスミドＰＩ！、５５
．２ を含有するイー・コリＵＯ３８２２の種培養をア
ンピシリン含有Ｌブロスの５ ｍｌ試験管中でインキュ
ベートした。６時間後、試験管内容物をアンピシリンを
含有する培地５００ Ｔｎ／’に移し、３２℃で一夜振
とうしながらインキュベートシた。該−夜培養物４００
ｄを、バーチイス（Ｖｉｒｔｉｓ ）・ベンチ・トップ
醗酵型中、アンピシリン含有培地１０１！に移した。培
養物を３２℃に保持し、各時間ごとに試料１ ’００
ｍｌについてＡ４２ｏ における増殖をモニターした。 ４時間目に、培養物に５０％デキストロース２０ ｏ
ｍＡ’および消泡剤０．ｌ−を加えた。８時間目、培養
物は４゜８Ａ 単位となり、４３℃に変化さぜた。】０
２０ 時間目、培養物に再ひ５０％デキストロース２００ｄを
加え、１４時時間区培養を停止した。４時間目、６時間
目、８時間目、９時間目、１０時間１］、１０．６時間
目および１４時時間区細胞濃縮物（ペレット）および細
胞上澄液の試料のｔ”ｒＩうについて、既知濃度のしＴ
Ｂを標準とするエライザ（ＥＬＩＳＡ）テストを用いて
テストした。 結果を第１表に示す。最初の４〜８時間、Ｌ Ｔ−１３
の９０９６以Ｊ：、がｆ（ＩＩ胞内に存在していたが、
温度変化後２時間（接種後１０時間）、Ｌ Ｔ−Ｂの９
０９６が上澄液中に存在した。温度変化後６時間開、Ｌ
Ｔ−Ｈの９５％が上澄液中にあり、ＬＴ、−Ｂは総蛋
白質の８ｉ５９ｔ＋に相当した。Ｔ−ｒ −Ｂの収率は
ｐＥ５５２ で形質転換したイ〜・コ＋ＪＭＭ２９４か
らの収率よりもはるかに大きがった。 温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇およびｏ
Ｊ視細胞片によって溶菌が明らかとなった。 温度変化後４〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養
物は容易にポンプで限外ρ過装置に通して全細胞片およ
び残った未溶解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子
ｉｆ Ｉ） Ｎ ＡおよびＲＮ Ａの培地への放出を反
映し、内因性ヌクレアーゼの作用が究極的に著しい粘度
の減少をもたらす。 実施例１０ 溶菌性サルモネラの調製 接合またはｌ） Ｎ Ａ形質転換により、サルモネラお
よびｌ１ｉｌ Ｇ ３の間で種間交差を行なう。サルモ
ネラ株は正常にはテトう→ノイクリン感受性であり、Ｍ
ｏ３はテトラザイクリン１１１１１性である。テトラサ
イクリン耐性となった→Ｊ“ルモネラ組換体の４２℃に
おける増殖能力をテストする。この温度で溶解するザル
そネラは組換を通じてＭｏ３の溶菌性細菌機能を獲得す
る。この実験は、（１）ラムダ溶菌性機能か→ノ“ルモ
ネラで表現されること、および（２）サルモネラとイー
・コリ（Ｍｏ３）の間に該遺伝子と側面を接するイー・
コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にする充分な相
同性が存在することにより可能である。 実施例１１ 溶菌性バチルスの調製 第１法 宿主の溶解を指令するに充分な遺伝因子にはλｃｌ ８
５７、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲＪ′１１伝子およびＰ、プロ
モータが包含される。これらの遺伝子の制限地図は公知
である（ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌｌＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＩＩ；ｔｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ、Ｙ、
） 。コれらの遺伝子はラムダからプラスミド（例え
ば、ｐｎＲ３２２）ｌ−に→ノーブクローンされる。バ
チルスからのＩ） Ｎ Ａのフラグメントをプラスミド
中、非必須部分のサイトに挿入する。宿主株Ｄ Ｎ Ａ
の性質または機能あるいはそのプラスミド中における方
向つけに）ｌ−、＋７性を１７゜える必要はない。つい
て、バチルスを精製プラスミドＩ） Ｎ Ａと共にイン
キュベーションし、抗生物質耐性形質転換体を選択する
。これらの形質転換体をテストし、高温にさらした後、
溶菌するか否かを測定する。これらの形質転換体におい
て、ラムダ遺伝子を含有するプラスミドは自律的複製単
位として存在するか、プラスミドおよび染色体１−の相
同バチルスＩ） Ｎ Ａ間の組換事象を介して宿主染色
体中に組込まれる。バチルス染色体中に復製できないプ
ラスミドによって担持されるＩ） Ｎ Ａの組込みは公
知である（ Ｈａｌｄｅｎｗａｙ ｅｔ ａ／ 。 Ｊ、Ｂａｃｔ、 １４２ ： ９０〜９８ 、 ］−９
８’０ ）。この方法は受容宿主株中でのラムダ溶菌遺
伝子の表現を必要とするが、ＭＧ３のイー・コリ配列と
受容細菌株との間の相同性は要求しない。 第２ｚｊ之 ファージｐｈｉ −１０’、）はバチルスに感染し、テ
ンペレー １・・ファｌ−ジで、変異できるＣＩ様レし
レッザーを有している。このレプレッサーに影響を及ば
ずｆａｉｌ Ｉｕ感受性変異を有するＩ）ｈｉ −１０
５の誘導体を調製することができる。除去もしくは複製
機能を欠くファージ誘導体は変異誘発処理または欠損株
の中熱によって分離できる（ Ｆｌｏｃｋ 。 Ｍｏｌ 、（ンｃｎ、 Ｇｅｎｃｔ 、 、 １５５
： ２ ４ １ 〜２４７ １１９７７）。熱不安定性
レプレッサーを有するファージ誘導体を得る。この変異
体の溶原閑は、感受性細胞を３０℃にて該ファージ感染
し、生存細胞を分離し、これらの細胞の重複感染ファー
ジに対する免疫および４０℃において増殖不能なことを
テストすることにより調製される。かかる生物はファー
ジ産生溶菌性′＠滑細菌である。欠損溶菌性細菌を分離
するため、細菌を変異誘発処理し、生存コロニーを、ｐ
ｈｉ−１０５感受性バチルスの未発達ローン上でレプリ
カ平板培養を行なう。高温にさら（、た後、ローン上で
ほとんど、または全くファージを産生じない温度感受性
コロニーはファージ増殖に影響を及ぼす変異を有してい
る。変異誘発処理のくり返しにより、より多くのストリ
ンジェント変異株を得ることができる。この構造を可動
体し、この構造の移動を容易に選択するために、ｐｈｉ
−ＩＱ５ゲノムに結合した抗生物質面ｊ性マーカーを有
する誘導体を分離することが好ましい。これは、バチル
ス染色体のランダム・フラグメントを、ｐＢＲ３２２の
ような、抗生物質耐性決定子を有する、バチルス中で複
製できないプラスミドにクローニングすることにより行
なえる。 形質転換した、薬剤耐性細胞が単離され、これは組込み
プラスミドを有している。これらの細胞のいくつかにお
いて、プラスミドはｐｈｉ−１０５のサイトの近くに組
込まれている。薬剤１岨性コロニーの非分割プールを普
遍バチルス導入ファージ、ｐ１％Ｓ１ て感染させる。 Ｉ） Ｉｓ Ｓ １ のストックは、イー・コリにおけ
るＩ’１ｃｍ １００が機能すると正確に同じ方法でバ
チルス中で機能し、ノ（チルレス細胞を薬剤耐性に形質
導入するために用いられる。 これらの薬剤耐性形質導入体をテストし、それらが温度
感受性で、清閑性細菌であるか否かを測定する。形質導
入体の約１９６が溶菌性細菌特性を獲得している。 以」二説明した本発明の方法および組成物は細菌生産物
の産生および外在化に有用である。以上は本発明の好ま
しい具体例についての記載であるが、本発明の精神を逸
脱することなく、種々の変形を加えることができ、それ
らも本発明範囲のものである。 特ｒＴｌ’出Ｍ１人 スミスクワイン・ベックマン・二
ｌ−ボレイション
件下で細胞内溶解素が表現されるように機能性Ｎ、Ｑ、
ＳおよびＩ（遺伝子を有する溶原菌である。 １つの具体例において、アンバー・サプレッサー、ずな
わち、ＵＡＧ翻訳終止コードンの翻訳サプレッサーの宿
主細１１；す）ＮＡによる産生のため、点（アンバー）
変異株であるＭＣ１株［Ｃ６００（λ△５８〜７１．Ｃ
１８５７，？’３，０２９）。 ５ｕｅＪ十、 ｇａｌ Ｋ、 ＩａｃＺ、 ｔｈｉ 、
ｇａｌ：： ｔｎｌＱＬｅｔＲ〕が解読され、０およ
びＰ遺伝子が表現される。 本発明の方法で用いるさらに好ましい宿主細胞は表現型
的に〇−およびＰ−のものである。１つの具体例におい
て、ＭＣ３株（Ｎ９９（λ△５８〜７１．ｃｌ ８５７
．Ｐ３，０２９）、ｇａｌＫ。 １ａｃＺ 、 ｔｌｌｉ 、 ｇａｌ ：： １１１１
Ｑ Ｌｅｔ ）はＭＣ１株と同様なラムダＤＮＡを有
する。しかし、この株は表現型的に〇−およびＰ−で、
ｔｅｔ 、△ｋｉｌ。 △ｉｎｔおよび△ｘｉｓである。 もつとも好ましい溶菌性イー・コリはＭＣ４株である。 これは実質的に全てのラムダ横置蛋白質、組立遺伝子お
よび正常な右側プロファージ−細菌接合点、すなわち、
右側結合サイト（ａｌｔ）を欠失する株である。ことに
、これらは遺伝地図の３位および７１位間のラムダ遺伝
子の実質的に全てを欠失し、０およびＰ遺伝子に点変異
を有し、制限条件下で細胞内溶解素が表現されるように
ｄ］＾度感受性ｃＩ遺伝子、機能性Ｎ、Ｑ、Ｓおよび１
（遺伝子を有し、選択マーカー、すなわち、１１１゜テ
トラサイタリン耐性転置因子を有する溶原閑である。か
かる欠損溶原菌はウィルス増殖に対する４つの独立した
遮断を有している。すなわち、ｔｉ）ＯおよびＰ複製機
能の喪失、（１１）プロファージの重複感染ファージか
らのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子による相補をできなくさ
せるａｔｔ の壱失、（ｌｉｔ）ラノ、ダ構造遺伝子の
コード不能および（ＩＶ）ラムダ１）ＮＡの大きさが包
装に必要な最小の大きさよりはるかに小さいことである
。これらは、最初に、ＭＧ株のようなＣｌ８５７．０−
１Ｐ−溶度菌株に塩素酸塩ストレスを加えて塩素酸塩耐
性株を産生じ、Δおよび１３機能欠損の重複感染異種免
疫もしくはビルレント・ラムダまたはラムドイド・ファ
ージの増殖を相補できない変異株を選択することにより
調製できる。該マーカー、ラムダｌ） Ｎ Ａおよび該
イー・コリ染色体からのフランキング配列からなるｌ）
Ｎ Ａフラグメン１−は、例えば、制限エンドヌモレ
アーゼによる処理またはＰ１形質導入によってＭＣ４株
から単離できる。 ＭＧ４は、ウィルス構造成分をコードするノくクテリオ
ファージ遺伝子の全部または大部分を欠失させることに
よりＭＧ３から誘導できる。これらの遺伝子の喪失を保
証するためには、ＭＧ４中のウィルス・ゲノムが、それ
自体これらの遺伝子を欠損している重複感染ファージを
相補および増殖させることができないことを証明すれば
充分である。λシャｏ７３Ａ（λＡ 、ＩＳ−ｉｍｍ
８Ｑ ）がこの重複感染に使用できるファージの例であ
る。 別法として、異種免疫またはビルレント・ファージ（λ
ｖｉｒ ）の存在下、ＡまたはＢにアン／く一変異を有
するか、他のウィルス構造シストｌ−Ｊンを有するいず
れかのファージを感受性イー・・コリ上て平板培養する
ことができる。該２つのファージ間で組換が起り、組換
体、例えば、ｖｉｒΔ−の形成をもたらす。組換体の頻
度は実験条件に依存して、１〜５０９６の間である。組
換体は、それらか→Ｊ−プレッサー含含有層原菌 Ｙｍ
ｅｌ （λ）〕上で羽根培養できることおよび、それら
がＮ９９のような非抑圧１．λ、感受性株」二でプラー
クを形成しないことにより認識できる。この交差で得ら
れるプラークをＹｍｅｌ （λ）またはＮ９９を入れた
ベトす器上で平板培養し、組換体を精製する。Ａおよび
／またはＢ遺伝子機能を欠損するラムダ・ファージは、
それらのラムダ・ゲノム上の位置ゆえに、これらの機能
を相補できないＭＧ、４株が他のラムダ構造遺伝子の全
てを欠失することになるので好ましい。 欠損ファージおよび宿主をこのように使用することは「
マーカー救済」と称され、広〈実施されている（例えば
、” Ｔ１１ｃ ｌ５ａｃｔｅｒｉｏｐｌ＋ａｇｅ Ｌ
ａｍｂｄａ ”ｅｄ、 Ａ、Ｉ）、ｌ１ｅｒｓｌｌｃｙ
、 Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、１９７１ ．５Ｌｅｖｃｎｓ ｃｔ ａ
ｌ＋、ｐｐ５１５〜５３３参照）。 本発明はいずれの細菌生産物の製造にも使用できる。そ
の例は非常に多く、とりわけ、インシュリン、狂犬病糖
蛋白質、Ｋ９９および９８７Ｐ抗原、抗生物質、生長ホ
ルモン、金属チオネイン、σ−１−抗トリプシン、イン
フルエンザ抗原、リンフ才力インおよびインターフェロ
ンが包含される。加えて、本発明は、従来必要とされて
いる溶菌工程を回避して、操作を非常に簡単に、かつ、
操作時間を短縮できるので、コロニー・スクリーニング
、ＲＮＡ単離およびプラスミド調製にも用いることがで
きる。 つぎに実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。 実施例中、全ての出発月料は容易に入手できるか、公知
の技術によって容易に調製できる。形質導入ハ実質的に
エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイツ
クス［ｌｌＥｘｐｅｒｉｍ’ｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ” 、ｅｄ 、 Ｊ 、
Ｈ、八（ｉｌｌｅｒ。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｎｅｗ”ｒｋ（１９７２）、ＰＰ、２０１〜
２０５Ｊ（７）記載に従って行なった。 実施例Ｉ ＭＧＯの調製 Ｃ６０，０株（イー・コリ５ｕｌＩ＋、 Ｋ １２ 、
ｇａｌＫ 、 ｌａｃ Ｚ、 ５ｕＩｌ 、 ｔｈｉ
）をλｃＩ ８５７ Ｐ ３０２９（つ不スコンシン
大学、Ｗ、５ｙｚｂａ Ｉ ｓｋ ｉ氏提供）の存在下
でインキュベーションした。３２℃で一夜増殖させ、生
存細菌を分離、精製した。 これらの細菌の８０％が重複感染に対して免疫性であり
、４４℃で増殖できず、４４℃にさらした後、λｃＩ８
５７ Ｐ３ ０２９と区別できないラムダ・ファージ〔
該ファージがＣ６００株ヒてはプラークを生じるが、Ｎ
９９株（イー・コリＫ １２ 。 ｇａｌ Ｋ 、 ｌａｃ Ｚ 、 ｓｕＯ、ｔｈｉ ）
上では生じないことで判定〕を産生ずることが判明した
。これらの生存細菌群の１つを精製し、ＭＧＯ（（’ｌ
： ６００（λ ｃＩ ８５７ １’３０２９ ） ）
と命名した。 実施例２ ＭＧＯ−ＡＲ６の調製 Ｎ５１５１株（イー・コリに１２，５Ａ５００゜ｇａｌ
Ｋ、 ｌ；ｔｃ７． 、 ｐｒｏ 、 ｔｈｒ 、
１１ｉｓ、 ｇａｌ ８（λｃＩ ８５７ Δ５８〜７
１ △ｌ１ｌ））を、予めΔに４株（イー・コリに１２
、ｇａｊ：： ｔｎｌＱ（Ｐｌｃｍ １００ ） ）
Ｊ−で増殖させたＰｌｍ １００フアージの存在下でイ
ンキュベーションした。Ｎ５１５１およびＡ Ｉｔ ４
ｌ−で増殖させたＩ）１ｍｌＱＱの交差はテトラサイ
クリン耐性、Ｕ■感受性、温度感受性溶原閑を生じさせ
た。これらの単離物の１つを精製し、ＭＧＯ−ＡＲ６（
イー・コリに１２、ｇａｌ ｐ、 、 （ｐｉｌ ：
： ｔｏ ｌ Ｑ λ△５８〜７１ Ｃ１８５７△ＩＩ
ｌ （＋）ｉｏ ｕｖｒｌｌ ） ）と命名した。 実施例３ ＭＣｌの調製 ＭＧｏ −ＡＲ６４；ｌ、Ｐｌｃｍ １００の存在下に
インキュベーションしたＡＲ６の生存菌を単離スること
によりＨ’ｎｎ ］ ００溶原閑になった。ＭＧＯ−Ａ
Ｒ５のＰ１ｃｍ１００溶原菌をＭＧＯ−ＡＲＩ Ｂと命
名した。 ＭＧＯ株を、ＭＧＯ−ＡＲＩＢ上で増殖させたＰｌｃｍ
ｌＯＯによりＰ１形質導入して交差さ−げだ。 ファージを吸収させた後、菌体を４ Ｊ ／ ｕｔのＵ
Ｖ照射（ｕｖ線量計で測定した場合、２ Ｊ ／ ｕ
ｅ ／ ｓの割合の２５４’１ｍの光の照射）に付し、
テトラ勺−イタリンの存在下でインキュベーションした
。テトラサイクリン耐性コロニーの１１９６カ＜ｕＶ）
Ｙｊこ耐性を示し、それらが１１１欠失を有せず、した
力ｊって、それらがｃｌからファージの右側端まてのラ
ムダ遺伝子を有していることを示した。ことに、このこ
とはこれらのコロニーがＰ３および０２９変異と、無垢
のＳおよびに遺伝子を有してＧ）ることを意味している
。Ｕｖ耐性、テトラ４３−イタ１ノン耐性菌の１／３は
ファージを産生じな力）つた。したがつ−（、これらは
ラムダの５８〜７１欠失を１色得し、それ故、ｉｎｔ
、 ｘｉｓおよびｋｉｌ 遺伝子を欠失したと判断され
た。この群を精製し、ＭＣＩ（（Ｃ６００）（λ△５８
〜７１ 、ｃｌ ８５７Ｐ ３ ０２９ ） 、５ｕｌ
ｌ 、 ｇａｌ Ｋ、 ］ａｃＺｔｈｉ 、 ｇａｌ
： ： 目ｒ ｌＱ Ｌｅｔ ）と命名した。 実施例４ ＭＣｌを１″Ｉｃｍ １００の存在下でインキュベーシ
ョンし、生存菌を精製した。これらの生存菌のうち、非
常に高い割合でＰｌｃＩ＋１１．００溶原菌となったＭ
ＣＩ菌体が同定された。〜（Ｇ１のＰ１ｃｍ１００溶原
菌を精製し、Ｍに２命名した。 Ｎ９９株を、ＮイＧ ２−１テ増殖さぜた！’ｔｃｍｌ
ｏＯでＰｌｃ＋ｎ１００ 影付導入により交差させた。 テトラサイクリン１Ｉｌｉ、Ｉ性の形質導入体を選択し
た。これらの全てはラムダに苅して免疫性で、したがっ
て、ラムダ溶原菌と判断された。これらの溶原閑の１つ
を精製し、Ｍに３（Ｎ９９（λ△５８〜７１ｃ１８５７
Ｐ３ ０２９））と命名した。 Ｍｏ３を４４℃に９０〜１２０分間さらして溶菌を測定
した。該温度にさらす前および後、菌体培養中には全く
ファージは見出されながった（３゜３×１０ 細胞／ｎ
、／＋の培３％ ０．１ ｍｌ当り〈１）。ファージの
存在はＣ６００閑体」二で検定した。非欠損ラムダ・プ
ロファージを有するイー・コリ株の対照培養は３．３ｘ
ｌＯ”細胞／ηＪの培＄Ｉｍ＋！当り、１０５〜１０９
個のファージを含有していた。 実施例５ Ｍｏ３の調製 実質的に前記実施例と同様イこ、ただし、Ｎ９り株をλ
Ｃｌ８５７ Ｐ３ ０２９で直接溶原菌化してＭｏ３株
を調製した。得られた溶原菌をＭ ＧＯ−ＡＲ１８株で
Ｐ１形質導入することにより交差させ、温度誘発により
溶菌するが、ファージを産生じないテトラサイクリン耐
性溝原菌を選択した。 実施例６ ＵＣ５８２２の調製 Ｎ９９株をλｉｎｔ ６ ｒｅｄ ３ ｃＩＢ５７ ｐ
Ｂ□およびλ ｈｙ ５ ｃｌ ｉｍｍ ２１ Δ１）
２で感染させてＵＣ５８２２株を調製した。λ１１ｙ
５ ｃｌ ｉ＋ｎ＋ｎ２１ △ｂ２はファージλおよ
びファージ２１のハイブリッドである。この調製におけ
るλｈｙ５ｃｉ ｉｍｍ ２１ △ｂ ２の目的は、λ
ｉｎＬ （ｉ ｌ’ｅ（１３Ｃ１８５７Ｐ２Ｏがこの
株を溶原閑化するために必要なトランス状態で１１１１
機能を付与することにある。△Ｌ） ２変！７’＋３．
は△ｈ ｙ ５ ｃ Ｉｉ ｒｎｍ ２１△ｂ２フアー
ジのそれ自体の該株への組込の指令をできなくする。ラ
ムダの重複感染に免疫性であるが、ファージ２１に対し
て感受性を示すこの交差の生存菌を精製し、Ｕ Ｃ５８
２２と命名した。 この株は４４℃にさらすと生存しなかった。４４℃にお
けるインキュベーションの前後で、ＵＣ５８２２の陪従
中にファー ジは全く検出できなかつ１、：。 実施例７ Ｍｏ４の調製 Ｍｏ３の培養菌をルリア（Ｌｕｒｉａ ）ブロスまたは
他の完全培地中、Ａ６．。−０，５となるまで３２℃で
増殖させた。培養物は約５×１０８ 細胞／ ｍｌを含
有していた。ついで、培養物を、０．２９６グルコース
および０．２９６ＫＣ１０３を補足した栄養寒天平板■
；で毛板培養した。平板を嫌気性条件下、３２℃でコロ
ニーが形成されるまで（３〜５日間）インキュベーショ
ンした。かかる条件下、この培地上での増殖により、ｃ
ｈＩ！Ａ 、 Ｂ、 Ｃまたは１）遺伝子に変異を有す
るイー・コリを選択した（”Ｅｘｐｔｓ、 ｉｎ Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃ；ｅｎｅｔｉｃｓ”、、 Ｊ。 Ｍｉｌｌｅｒ、 ＰＰ、２２６〜２２７参照）。 ｃＪＢ、Ｃまたは１）における変異はＭｏ４の中限には
つながらない。変異のうち、ｃｌｌｌＡの表現に影響す
るのはｃｈｌ Ａにおける点変異およびｃｈｌＡ の左
側または右側に伸びる欠失である。 ｃｈｌＡ の左側に伸びる欠失は１９Ｆ接するｔ＋ｖｒ
ｌｓ遺伝子の破壊をきたし得、それ故、生物にＵＶ感受
性表現型を与える。同じ理由で、ｃｈｌｌ）から右側へ
伸びる欠失も生物にＵＶ感受性表現型を与え得る。嫌気
性インキュベーションで得られた塩素酸塩耐性コロニー
がＵＶ感受性であるか否かを決定するためにテストする
。これは、塩素酸塩耐性コロニーをペトリ皿上で画線し
、ペトリ皿のＩｉ２をカバーし、他の半分を２５４ ａ
【ｒＩａｌ Ｖ光の１０Ｊ ／ ｕｆ照射に付すことに
より、都合よく行なえる。 この線量はＵＶ感受性菌体を殺すが、ＵＶ耐性変異型は
殺さないために充分な量である。ＵＶ感受性変異株（ｃ
ｌ＋ＩＡまたはｃｈｌ、Ｈにおける変異からなる）の欠
損ラムダ・ファージの存在をテストする。これは、同種
免疫ファージの画線を介して菌体を交差画線することに
より行なえる。ラムダ感受性細菌は交差画線のところで
ファージによって殺され、ラムダ溶原菌は重複感染に対
して免疫性であり、殺されない。（ｂｌＡおよびｃｈｌ
ｌ）遺伝子、ラムダ・ゲノムおよび１ｉｖｒｌｌ 遺伝
子の所在の結果、全てのｊＪ ■感受性ｃｂｌＡ変異株
はラムダ溶原菌となりうる。したがって、ＵＶ感受性、
ラムダ溶原蘭は左側にｕｖｒｌｓ中へ伸ひる（旧Δの欠
失を含む。該欠失がｕｖｒ１３ を通過して伸ひる場合
、ビオチン・Ａべｒ１ン中、また、多分、構造ラムダ遺
伝−Ｆ中へ伸びることができる。この方法により、構造
ラムダ遺伝子の欠失が得られている（ Ｇｒｉｃｒ、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、 ６６ ： ５８９〜６０４（１９７
５））。全てのｕｖ感受性、ｃｈｌＡ−、ラムダ溶原菌
をλｖｉｒＡ−て感染さぜる。２．５時間後、λｖｉｒ
Δ−ファージおよびλｖｉｒＡ十組換体の増殖および／
またはλｖ＋ｒＡ ファージの産生のあったＭＧ４Ｇ４
候補型てる。λｖｉｒＡ−の相補マタはｖｉｒＡ″−の
産生をしない株はｃｈｌＡ がらラムダのＡ遺伝子まで
伸びる欠失を有している。 ｃｈｌ ＡからラムダのＡ遺伝子までの欠失を有するＭ
Ｇ４Ｇ４候補型菌細菌特性（〉３８℃の増殖の際の溶菌
）についてテストする。欠失を有し、溶菌細菌特性を保
持している株をＭＧ４として精製する。 実施例８ ＭＭ２９４（ＣＩ８５７）およびＵＣ５８２２における
クローニング イー・コリＭＭ２９４株をλＣ１８５７の存在下でイン
キュベートした。３２℃で一夜増殖後、生存細菌を単離
し、精製した。重複感染に免疫で、４４℃で増殖できず
、ファージを産生できないクローンを分離した。得られ
たＣｌ８５７溶原株、ＭＭ２９４（λＣＩ ８５７ ）
およびイー・７９００５８２２株をＣａ Ｃｌ！２処理
によってコンピテント閑とし、イー・コリｒ−’ｉ”
−ｎ抗原ならびにアンピシリンおよびテトラザイクリン
面ｊ竹冒こつぃての遺伝子を有するプラスミド、Ｉ）Ｉ
）Ｎ５で形質転換した。 両方の溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリ
ン耐性形質転換体は標糸栄養ブロス中、３０〜３２℃で
よく増殖し、Ｌ ｉ’ −Ｉｓ抗原を表現した。細菌を
遠心分離によりペレット化し、４２℃の標塾栄養ブロス
に移す。約９０〜１２０分以内に、細胞溶解が明白にな
り、実質的に完了した。 Ｌ Ｔ −Ｉｓ抗原がブロス中に放出された。４Ｘ１０
７細胞／ ｍｌからなるＭＭ２９４（Ｃｉ８５７）形質
転換体の試料において、１ ｍｌ当り、約２ Ｘ １０
”個のラムダ・ファージを収集した。ＵＣ５’８２２形
質転換体の同イ■乏な試料中では、全くファージは収集
されなかった（く２ｏ個／ ｍｌ ）。 実施例９ Ｕ Ｃ５Ｂ ２２におけるクローニングイー・コリＩ・
Ｔ−１３抗原の遺伝子を有するプラスミドＰＩ！、５５
．２ を含有するイー・コリＵＯ３８２２の種培養をア
ンピシリン含有Ｌブロスの５ ｍｌ試験管中でインキュ
ベートした。６時間後、試験管内容物をアンピシリンを
含有する培地５００ Ｔｎ／’に移し、３２℃で一夜振
とうしながらインキュベートシた。該−夜培養物４００
ｄを、バーチイス（Ｖｉｒｔｉｓ ）・ベンチ・トップ
醗酵型中、アンピシリン含有培地１０１！に移した。培
養物を３２℃に保持し、各時間ごとに試料１ ’００
ｍｌについてＡ４２ｏ における増殖をモニターした。 ４時間目に、培養物に５０％デキストロース２０ ｏ
ｍＡ’および消泡剤０．ｌ−を加えた。８時間目、培養
物は４゜８Ａ 単位となり、４３℃に変化さぜた。】０
２０ 時間目、培養物に再ひ５０％デキストロース２００ｄを
加え、１４時時間区培養を停止した。４時間目、６時間
目、８時間目、９時間目、１０時間１］、１０．６時間
目および１４時時間区細胞濃縮物（ペレット）および細
胞上澄液の試料のｔ”ｒＩうについて、既知濃度のしＴ
Ｂを標準とするエライザ（ＥＬＩＳＡ）テストを用いて
テストした。 結果を第１表に示す。最初の４〜８時間、Ｌ Ｔ−１３
の９０９６以Ｊ：、がｆ（ＩＩ胞内に存在していたが、
温度変化後２時間（接種後１０時間）、Ｌ Ｔ−Ｂの９
０９６が上澄液中に存在した。温度変化後６時間開、Ｌ
Ｔ−Ｈの９５％が上澄液中にあり、ＬＴ、−Ｂは総蛋
白質の８ｉ５９ｔ＋に相当した。Ｔ−ｒ −Ｂの収率は
ｐＥ５５２ で形質転換したイ〜・コ＋ＪＭＭ２９４か
らの収率よりもはるかに大きがった。 温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇およびｏ
Ｊ視細胞片によって溶菌が明らかとなった。 温度変化後４〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養
物は容易にポンプで限外ρ過装置に通して全細胞片およ
び残った未溶解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子
ｉｆ Ｉ） Ｎ ＡおよびＲＮ Ａの培地への放出を反
映し、内因性ヌクレアーゼの作用が究極的に著しい粘度
の減少をもたらす。 実施例１０ 溶菌性サルモネラの調製 接合またはｌ） Ｎ Ａ形質転換により、サルモネラお
よびｌ１ｉｌ Ｇ ３の間で種間交差を行なう。サルモ
ネラ株は正常にはテトう→ノイクリン感受性であり、Ｍ
ｏ３はテトラザイクリン１１１１１性である。テトラサ
イクリン耐性となった→Ｊ“ルモネラ組換体の４２℃に
おける増殖能力をテストする。この温度で溶解するザル
そネラは組換を通じてＭｏ３の溶菌性細菌機能を獲得す
る。この実験は、（１）ラムダ溶菌性機能か→ノ“ルモ
ネラで表現されること、および（２）サルモネラとイー
・コリ（Ｍｏ３）の間に該遺伝子と側面を接するイー・
コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にする充分な相
同性が存在することにより可能である。 実施例１１ 溶菌性バチルスの調製 第１法 宿主の溶解を指令するに充分な遺伝因子にはλｃｌ ８
５７、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲＪ′１１伝子およびＰ、プロ
モータが包含される。これらの遺伝子の制限地図は公知
である（ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌｌＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＩＩ；ｔｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ、Ｙ、
） 。コれらの遺伝子はラムダからプラスミド（例え
ば、ｐｎＲ３２２）ｌ−に→ノーブクローンされる。バ
チルスからのＩ） Ｎ Ａのフラグメントをプラスミド
中、非必須部分のサイトに挿入する。宿主株Ｄ Ｎ Ａ
の性質または機能あるいはそのプラスミド中における方
向つけに）ｌ−、＋７性を１７゜える必要はない。つい
て、バチルスを精製プラスミドＩ） Ｎ Ａと共にイン
キュベーションし、抗生物質耐性形質転換体を選択する
。これらの形質転換体をテストし、高温にさらした後、
溶菌するか否かを測定する。これらの形質転換体におい
て、ラムダ遺伝子を含有するプラスミドは自律的複製単
位として存在するか、プラスミドおよび染色体１−の相
同バチルスＩ） Ｎ Ａ間の組換事象を介して宿主染色
体中に組込まれる。バチルス染色体中に復製できないプ
ラスミドによって担持されるＩ） Ｎ Ａの組込みは公
知である（ Ｈａｌｄｅｎｗａｙ ｅｔ ａ／ 。 Ｊ、Ｂａｃｔ、 １４２ ： ９０〜９８ 、 ］−９
８’０ ）。この方法は受容宿主株中でのラムダ溶菌遺
伝子の表現を必要とするが、ＭＧ３のイー・コリ配列と
受容細菌株との間の相同性は要求しない。 第２ｚｊ之 ファージｐｈｉ −１０’、）はバチルスに感染し、テ
ンペレー １・・ファｌ−ジで、変異できるＣＩ様レし
レッザーを有している。このレプレッサーに影響を及ば
ずｆａｉｌ Ｉｕ感受性変異を有するＩ）ｈｉ −１０
５の誘導体を調製することができる。除去もしくは複製
機能を欠くファージ誘導体は変異誘発処理または欠損株
の中熱によって分離できる（ Ｆｌｏｃｋ 。 Ｍｏｌ 、（ンｃｎ、 Ｇｅｎｃｔ 、 、 １５５
： ２ ４ １ 〜２４７ １１９７７）。熱不安定性
レプレッサーを有するファージ誘導体を得る。この変異
体の溶原閑は、感受性細胞を３０℃にて該ファージ感染
し、生存細胞を分離し、これらの細胞の重複感染ファー
ジに対する免疫および４０℃において増殖不能なことを
テストすることにより調製される。かかる生物はファー
ジ産生溶菌性′＠滑細菌である。欠損溶菌性細菌を分離
するため、細菌を変異誘発処理し、生存コロニーを、ｐ
ｈｉ−１０５感受性バチルスの未発達ローン上でレプリ
カ平板培養を行なう。高温にさら（、た後、ローン上で
ほとんど、または全くファージを産生じない温度感受性
コロニーはファージ増殖に影響を及ぼす変異を有してい
る。変異誘発処理のくり返しにより、より多くのストリ
ンジェント変異株を得ることができる。この構造を可動
体し、この構造の移動を容易に選択するために、ｐｈｉ
−ＩＱ５ゲノムに結合した抗生物質面ｊ性マーカーを有
する誘導体を分離することが好ましい。これは、バチル
ス染色体のランダム・フラグメントを、ｐＢＲ３２２の
ような、抗生物質耐性決定子を有する、バチルス中で複
製できないプラスミドにクローニングすることにより行
なえる。 形質転換した、薬剤耐性細胞が単離され、これは組込み
プラスミドを有している。これらの細胞のいくつかにお
いて、プラスミドはｐｈｉ−１０５のサイトの近くに組
込まれている。薬剤１岨性コロニーの非分割プールを普
遍バチルス導入ファージ、ｐ１％Ｓ１ て感染させる。 Ｉ） Ｉｓ Ｓ １ のストックは、イー・コリにおけ
るＩ’１ｃｍ １００が機能すると正確に同じ方法でバ
チルス中で機能し、ノ（チルレス細胞を薬剤耐性に形質
導入するために用いられる。 これらの薬剤耐性形質導入体をテストし、それらが温度
感受性で、清閑性細菌であるか否かを測定する。形質導
入体の約１９６が溶菌性細菌特性を獲得している。 以」二説明した本発明の方法および組成物は細菌生産物
の産生および外在化に有用である。以上は本発明の好ま
しい具体例についての記載であるが、本発明の精神を逸
脱することなく、種々の変形を加えることができ、それ
らも本発明範囲のものである。 特ｒＴｌ’出Ｍ１人 スミスクワイン・ベックマン・二
ｌ−ボレイション
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子および
機能性ファージ・リゾチーム・コードイ」け遺伝子を有
し、該フｙ′−ジ・リソチーム・コード付は遺伝子が許
容系外１；で抑制され、？ｂｌ限条件下で表現さり、る
ｉ’Ｗｆ度感受性感受性細菌株ｉｌ接または間接的に生
産物を表現するＩ） Ｎ Ａ分子−で形質転換し１、Ｔ
Ｉ容条件下で該形質転換体を培前して該生産物を産生さ
せ、温度を一１＝ｆｉさせて制限条件を生じさせ、所゛
イ４により、培淳培ｔｌｌ−ｆたはその濃縮物から該生
° 産物を回収することを特徴とする細菌における生産
物の産生法。 （２）該細菌株がファージ生産に必要な他のファージ遺
１尺子に欠損を有している前記第（月頃の産生法。 （３１ファージ１．） Ｎ Ａが選択マーカーと側面を
接している前記第（２］項のｐｒ生法。 （４）温度感受性細１″ｔ４１’、ｌ、が温度１・δ受
性ラムダ（■遺伝子を有する前記第（月頃の産生法。 （５１ｃＩ遺伝子がｃＪ ８５７変異体である前記第（
４）項の産生法。 ｆ６］細菌株がファージの生産に必要な他のラムダ遺伝
子に欠損を有している前記第（５１項の産生法。 （７）ファージＩ）ＮΔが選択マーカーと側＋Ｔ＋」ｒ
ｃ接している前記第（６１項の産生法。 （８）細菌株がイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ） である
前記第（６）項の産生法。 （９）細菌株がイー・コリＵＣ５８２２株である前ｉｊ
ｅ第（６１項の産生法。 （１０〕細菌株が、遺伝地図の５８位および７１位の間
の遺伝子か欠失し、０およびｐａ伝子が変異しているラ
ムダＩ） Ｎ Ａゲノムを有する前記第（６）項の産生
法。 （Ｕ）ラムダＩ） Ｎ Ａゲノムが選択マーカーと側面
を接し、０およびＰ変異が点変異である前記第（１０）
項の産生法。 （功うムダＤＮＡゲノムが上流端で【ｎ １０転置テト
ラサイクリン耐性因子と側面を接し、０およびＰ遺伝子
−が０２９およびＰ３遺伝子である前記第（１１）項の
産生θモ。 （１３）細菌株がイー・コリである前記第（１幻項の産
生法。 （１４）細菌株がイー・コＩＪ Ｍ Ｇ株である前記第
（１２）項の産生法。 （（５）細菌味が、遺伝地図の３位および７１位の間の
ｉ責伝Ｐに欠失を有し、０およびＰ遺伝子に変異を有す
るラムダＩ） Ｎ Ａゲノムを有する前記第（６１項の
産生法。 （１６）ラムダｌ） Ｎ Ａゲノムが選択マーカーと側
面を接し、０およびＰ変異が点変異である前記第（靭項
の産生法。 （１７）ラムダＩ） Ｎ Ａゲノムが」二流端でｔｎｌ
Ｑ転置テトラサイクリン耐性因子と側面を接し、０およ
びＰ遺伝子が０２９およびＰ３遺伝子である前記第（１
６）項の産生法。 （列線菌株がイー・コリである前記第（１７）項の産生
法。 （ｐ）細菌株がイー・コ！ＪＭＧ４株である前記第（辺
項の産生法。 （■温度感受性レプレッサー遺伝子および機能性リゾチ
ーム・コード付は遺伝子を有し、該リソ゛チーム・コ・
−ド付は遺伝子が許容条件下で抑制され、制限条件下で
表現される欠損ファージ配列および選択マーカーからな
るＤＮＡフラグメント。 （２１）宿主細胞の染色体にＢける隣接配列に相同する
フランキングＤＮＡ配列を有する前記第（２０）項のＤ
ＮＡフラグメント。 （２２）ファージＤＮＡ配列が温度感受１ｄＨｃｌ 遺
伝子を有するラムダＤＮＡ配列である前記第（２ｏ）項
のＤＮＡフラグメント。 （２３）宿主細胞の染色体における隣接配列に４−目間
するフランキングＤＮＡ配列を有する前ｍＱ ’（Ｓ
（２２）項のＤＮＡフラグメント。 （カラムダＤＮＡ配列がｃＩ １３５７遺伝子および機
能性Ｎ、Ｑ、Ｓおよびに遺伝子からなり、遺イム地図の
５８位および７１位間の遺伝子が実質０りをこ欠失し、
０およびＰ遺伝子に変異を有する前Ｊ己第（２３）項の
ＤＮＡフラグメント。 （２５）選択マーカーが【ｎ １０転置テトラサイクリ
ン耐性因子であり、０およびＰ遺伝子が点変異である前
記第（２４）項のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （２６）０１よびＰ遺伝Ｐが０２９およびＰ３遺伝子で
ある前記第（２５）項のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （２７）ラムダＩ） Ｎ Ａ配列がｃＩ８５７遺伝−ｒ
−８よひ機能性Ｎ、Ｑ１ＳＰ６よびＩ（遺伝子からなり
、遺伝地間の３位および７１位間の遺伝子が実質的に欠
失し、０および１″遺伝子に変異を有する前記第（２３
）項のＩ） ＮΔフラグメント。 （２Ｂ）ｉＵ 択マーカーがＬｎ ｌ Ｑ 転置テトラ
サイクリン耐性因Ｐで、０および１ゝ変異が点変異であ
る前記第（２７）項のＩ）ＮＡフラグメント。 （２９）０ぢよひ１゛逍沃Ｊ−が０２９およびｌ”３遺
伝子である前記第（２８）項の１）ＮＡフラグメント。 （３０刀り記第（２０）項〜第（２９）項いずれか１つ
の１）ＮＡフラグメントからなる細菌。 （３１）イー・コリである前記第（３０）項の細菌。 （３２）細菌を前記第（２の項〜第（２９）項いずれか
１つのＤＮＡフラグメントて形質転換させる溶菌性細菌
の製法。 （３３）細菌がイー・コリである前記第（３２）項の製
法。 （３滲細菌を前記第（２０項〜第（２９）項いずハ、か
１つのＤＮＡフラグメントて形質転換し、該形質転換細
菌を許容条件下で培養して生産物を産生させ、温度を変
化させて制限条件を生じさせ、所望により、培養培地ま
たはその濃縮物から生産物を回１１Ｍすることを特徴と
する生産物を産生ずる、または産生させるようにした細
菌における生産物の産生法。 （３５）前記第（２０）項〜第（２９）項いずれか１つ
のＤＮＡフラグメントを細菌染色体に組込み、得られた
形質転換細菌を許容条件下で培養してポリペプチドを表
現させ、温度を変化させて制限条件を生じさせ、所望に
より、培養培地またはその濃１１ｉ：物からポリペプチ
ドを回収することを特徴とする生産物を産生ずる、また
は産生させるようにした細菌における生産物の産生法。 （３６）有効用量の生産物を含有する量の温度感受性細
菌を哺乳類に投与し、それにより、細菌が哺乳類の体内
で溶菌し、該生産物を放出することを特徴とする咄乳類
に生産物を投りする方法。 （３７）細菌を、温度感受性ファージ・レプレッサー遺
伝子Ｂよびファージ・リゾチーム・コード付は遺伝子を
Ｔａｒ Ｌ、該リゾチーム・コードイ旧す遺伝子がｒ「
容条件下で抑制され、制限条件下で表現されるファージ
］）ＮＡ配列で形算転換し、得られた形質転換細菌を許
容条件下で培、νｔして生産物を産生さぜ、温度を変化
さけ−Ｃ制限条件を生じさせ、所望により、培・１τＣ
培地またはその濃縮物から生産物を回収することを特徴
とする生産物を産生ずる細菌におりる生産物の産生法。 （３８）生産物を産生する細菌をテンペレート・ファー
ジで感染させる前記第（３７）項の産生法。 （３９）テンペレート・ファージが欠損ファージである
１）す記第（３８）項の産生法。 （４０）テンペレート・ファージかラムダ・ファージで
ある前記第（３８）項の産生法。 （４１）テンペレート・ファージが、Ｃｌ８５７遺伝ト
を有スるラムダ・ファージである前記第（４の項の産生
法。 （４２）テンペレート・ファージが欠損ファージである
前記第（４１）項の産生法。 （招）ファージＤＮＡが欠損である前記第（３７）項の
産生法。 （材）ファージＤＮＡが選択マーカーと側面を接してい
る前記第（４３）項の産生法。 （４５）ファージＩ） Ｎ Ａがラムダ・ファージから
誘導される前記第（４３）項の産生法。 （４６）ファージＤＮＡが選択マーカーと側面を接して
いる前記第（４５）項の産生法。
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