JPS6062998A - Ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コノ発［Ｊ］ｉｊ：Ｌ　−７スパルチルーし一フェニル
アラニンメチルエステル（以下、ＡＰＭト略す。）の製
造法に関する。

ＡＰＭは、甘味剤として近年注目さノ１−ている被ブチ
ドである。

ＡＰＭの製造法とし“ては、化学合成法と酵素的合成法
が知られている。

化学的合成法としては、Ｎ−保護のＬ−アスｉ４ラギン
酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下
、ＰＭと略す。）を縮合させてＮ−保護のＡＰＭとし、
その後保護基を除去する方法があシ、酵素合成法として
は、Ｎ−保護のＬ−アスパラギン酸とＰＭに蛋白分解酵
素ｒ作用させてＮ−保護のＡＰＭあるいはＮ−保護のＡ
ＰＭのＰＭ伺加物とし、その後、保護基を除去してＡＰ
Ｍにする方法が知られているが、両方法とも保護基の導
入、脱離が必要で工程が複雑となる。

また保護基を使用しないＡＰＭの製造方法（４！ｉ＋開
昭５８−４３７９３、昭和５８年日本農芸化学大会要旨
集Ｐ４２）も知られておシ、シェードモナス属、アルカ
リ土類金属、トルロプシス属、ロドトルラ属、スポロポ
ロミス属のいずれかを用いる微生物的合成法であるが収
率が非常に低く工業的なＡＰＭの生産には必ずしも適し
ていない。

本発明者らは、このような従来のＡＰＭの製造法に対し
、よシ効率の良い方法を見い出すべく研究した結果、微
生物を用いる事によってＬ−アスパラギン酸とＰＭから
ＡＰＭが直接、効率よく生成する事を見い出した（特願
昭５８−７５５５９）。

史によシ効率の良いＡＰＭの製造法を見い出すべく鋭意
研究を重ねた結果、Ｌ−アスパラギン酸とＰＭを縮合し
てＡＰＭを生成する能力を有する微生物の作用によシ少
なくともカチオン濃度が２００−以上を含む水性媒体中
にてＬ−アメ／４’ラギン酸とＰＭを作用せしめてＡＰ
Ｍを生成させる事によシＡＰＭの生成が飛躍的に向上す
ることを見い出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明はアルカリ土類金属、アクロモバクタ−属
、コリネバクテリウム属、キャンディダム、クリプトコ
ツカス属、エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、ジ
オトリクム属、ミクロコツカス属、ハキシレン属、ザル
チナ楓、スポロボロミセス属、サツカロミセス属、トリ
コスポロン属、トルロプシス属、ロドトルラ属、キサン
トモナス属、シュードモナス属、クルイヘロミセス繻及
びエンドミセス属に属し、Ｌ−アスパラギン酸とＰＭを
縮合してＡＰＭを生成する能力を有する微生物を少なく
ともカチオン濃度が２００ｍＭ以上含む水性媒体中にて
Ｌ−アメ／４’ラギン酸とＰＭに作用せしめてＡＰＭを
生成する事を特徴とするＡＰＭの製造方法である。

Ｌ　−７スノ＋　ラギン酸とＰＭを縮合してＡＰＭヲ生
成する能力を有する微生物の作用にょシ、カチオン濃度
が２００ｍＭ以上含む水性媒体中にてＬ−アスパラギン
酸とＰＭを縮合してＡＰＭに変換せしめる方法はカチオ
ン濃度が２００品り以上含む水溶性媒体中にてＬ−アス
パラギン酸とＰＭと上記微生物の菌体、培養液あるいは
菌体処理物とを接触せしめれば良い。

木を明において用いるＬ−アスノやラギン酸とＰＭを縮
合してＡＰＭに変換せしめる能力を有する微生物として
は、例えば、 アルカＩＩダネス　フェカリス　ＡＴＣＣ８７５０アク
ロモバクタ−ブチリ　ＡＪ　２４３ＢＦＥＲＭ−Ｐ　７
０５１ コリネバクテリウム　エスピー　ＡＴＣＣ２１２５１コ
リネバクテリウム　キセ四シス　ＡＴＣＣ３７３クリプ
トコツカス　ネオフォルマンス　ＩＦ０４２８９ニジエ
リア　コリ　ＡＪ　２６０６ ＦＥＲＭ−Ｐ　７０５５ フラｇ　バクテリウム　セワネンス　ＡＪ　２４７６Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ　７０５２ ジオトリタム　キャンディダム　ＩＦＯ４５９９ミクロ
コツカス　ルテウス　ＡＴＣＣ４６９８ノぐキシレン　
タンノフィラス　ＩＦＯ−１００７スボロボロミセス　
オドシス　ＩＦＯ１５９６トリゴスポロン　カビタータ
ム　ＩＦＯ１１９７トルロプシス　インコンスヒフ７　
ＩＰ”００６２１０ドトルラ　ラクトーサ　ＩＦＯ１４
２４シユードモナス　エルギノーザ　ＡＴＣＣ１４２１
０クルイヘロミセス　サーモトレランス　ＩＦＯ０６ｆ
ｉ２エンドミセス　オペテンシス　１１１’０１２（１
１サツカロミセス　セレビシェ　ＩＦＯ２０（１３等が
ある。

これらの微生物の菌体を得るには、辿常の培地を用いｌ
れは良い。又、培養の始めから、あるいは培養の途中で
Ｌ−アメ／４’ラギン酸とＰＭを添加して倍養しても良
い。

炭素源としては、グルコース、シークロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。蟹素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。更
にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると
望ましい結果が得らノ１．る場合が多い。

培養は好気的条件下に、ＰＨ４ないし８、温度２５ない
し４０℃の適当な範囲に制御しっつ１ないし１０日培養
を行えば望ましい結果が得られる。

菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液よ
シ分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用可
能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌体
、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌体、
機械的に摩砕した菌体等のはか、これら菌体処理物から
得られたＬ−アスパラギン酸とＰＭをＡＰＭに変換せし
める酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、これらの
菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、その他いずれ
も使用できる。

水溶性媒体としては、カチオン酸度２００　ｍＭ以機溶
媒を含むものが使用できる。更に必要に応じて、微生物
の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素
、ヒドロキシルアミンおよび金属イオン等を水性媒体に
添加することもできる。

上記微生物の菌体をカチオン濃度２０　（ｌ　ｍＭ以上
を含む水溶性媒体中で培養しながら、菌体とＬ−アスパ
ラギン酸とＰＭを接触せしめて作用ぜしめる場合には、
Ｌ−アスパラギン酸とＰＭを含み、かつ微生物の生育に
必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む
カチオン一度２００　ｍＭを含む水性媒体が用いられる
。更にビタミン、アミン酸等の有機微量栄養素を添加す
ると望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としては、グルコース、シークロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。屋素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウムｌ温、ソの他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。

培養は好気的条件下に、Ｐｌ（４ないし８、温度２５な
いし４０℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結
果が得られる。

かくして１ないし１０日間も培養を行えば、Ｌ−アスパ
ラギン酸とＰＭはＡＰＭに効率よく変換される。

これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体
あるいは菌体処理物をＬ−アスパラギン酸およびＰＭと
接触せしめて作用せしめる場合には、Ｌ−アスパラギン
酸とＰＭと培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を溶解
または懸濁したカチオン濃度が２００ｍＭ以上含む水性
媒体を１０℃ないし７０℃の過烏な温度に調節し声を４
ないし８に保ちつつ、暫時静買または俸拌すればよい。

かくして５ないし１００時間も経過すれば水性媒体中に
多１のＡＰＭが生成蓄積される。

生成したＡＰＭは、公知の分離方法によシ分離精製する
事ができる。生成したＡＰＭはアミノ酸アナライザーを
用いて測定した。

実施例１ ｙｈ−ｚ−ス２．Ｏｇ／ｌｉｅ　、（Ｎｒｈ”）ｘｓＯ
４０，５ｇｅｅ　。

１＜Ｈｚ’ＰＯ＋　０．１１１Ａｌｌ　、　ｋｚｆ−１
’ＰＯ４０，１ｊ！／ｄｉ　、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，０５に伽、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０１ｒＶ／ｄｅ　、
　ＭｎＳＯ４’４ｆ１２０１ψｊ１酵母エキス１．　Ｏ
Ｖｄｌ　、マルツエキス０．５ｇＡＩｇ　、炭素カルシ
ウム４．　ＯＶｄｅ　Ｃ別殺菌）をよむ培地（ｒＪ（７
，０）を５００　ｍｌ容フラスコに５　ｇ　ｍｔ入れ１
２０℃で１５分間殺菌したＯ これにブイヨン寒天培地で３０℃にて、２４［ｒｋ間培
養したフラ？バクテリウム　セワネンスＡＪ２４７６、
ＦＥＰＭ−Ｐ　７０５２を１白金耳接Ｊｊｌｉ　Ｌ、３
０℃で２０時間培養した。この培養液より菌体を遠心分
離によシ採取し、培養液と向弁の生理食塩水で１回洗浄
し、菌１体を集めた。

これらの菌体を表１に示す反応液Ａ（但し、表−２に示
した塩類の１種類を各々含む）　５１１Ａｌｌにナルヨ
うに添加しく終末ｐＨ５，４，５ｍ）、３０℃に１６時
間保持反応した。

この時に生成したＡＰＭをアミノ酸アナライザーで測定
し、その結果を表２に示した。

表　１ ※０．０１Ｍリン酸バッファー中に上記基質を含む（Ｍ
終Ｐ１−＋　ｓ、　４　） 表−２ 実施例２ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラゼバクテリウム
　セワネンス　ＡＪ　２４７６　、　ＦＥＲＭ　−Ｐ４
Ｏ１０を表−３に示す塩類を含む反応液Ａに５　ｇｏａ
ｌになる様に投入し、３０℃、２４時間反応した。

この時のＡＰＭの生成量を表−３に示した。

表−３ 実施例３ 実施例１と同様に培養し洗浄した表−４に示す微生物を
表−４に示す地を含む反応液Ａに５　＆／ｄｉになるよ
うに投入し３０℃で２４時間反応した。

この時のＡＰＭの生成量を表−４に示した。

実施例４ 実施例１と同様の培地を用いて３０℃で１２時間培養し
たフー′７ゼバクテリウム　セワネンスＡＪ−２４７６
ＦＥＲＭ−Ｐ　７０５２の培養液中に培地中のＬ−アス
／４’　９ギン酸５１１とＰＭＩＯＩＩと硫酸ナトリウ
ム４００ｍＭを含む水溶液１０ｍ１（ｐＨ５，４に調製
）を無菌的に投入し、無菌的に培養液の−１を５．４に
調製後、更に１０時間培養を行った。培養中は２　ＩＩ
；！ｉ＝間おきに−を５．４になるように無菌的に調製
した。

この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザーで測定
した結果、ＡＰＭが３１５　ｍ９７ｄｅ生成していた。

尚、硫酸す）　ＩＪウム無添加の場合のＡＰＭ牛或は１
８０　ｍ？／ｄｉであった。

特許出願人味の素株式会社 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号（０１２
Ｐ　２１／（３２ Ｃ１２Ｒ１：６４５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 アルカリ土類金属、アクロモバクタ−属、コリネバクテ
   リウム属、キャンディダ属、クリプトコツカス属、エシ
   ェリヒア属、フラ？バクテリウム属、ジオトリクム属、
   ミクロコツカス属、パキシレン属、ザルチナ属、スポロ
   ボロミセス属、サツカロミセスＭ、トリコスアＩ？ロン
   属、トルロプシス属、ロドトルラ楓、キ′サントモナス
   属、シュードモナス属、クルイヘロミセス属及Ｕエンド
   ミセス属に属し、 Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンを縮合せし
   めてＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
   ステルを生成する能力を有する微生物を少なくともカチ
   オン濃度が２００ｍＭ以上含む水性媒体中にてＬ−アス
   パラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルに作
   用せしめて、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
   メチルエステルを生成する事を特徴とするＬ−アス・！
   ルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方
   法。