JPS6064997A - インシユリン誘導体の製法 - Google Patents
インシユリン誘導体の製法Info
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- JPS6064997A JPS6064997A JP59161643A JP16164384A JPS6064997A JP S6064997 A JPS6064997 A JP S6064997A JP 59161643 A JP59161643 A JP 59161643A JP 16164384 A JP16164384 A JP 16164384A JP S6064997 A JPS6064997 A JP S6064997A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/62—Insulins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
インシュリンは生体内でプレプロインシュリンと呼ばれ
る前駆物質の形態で合成される。その前駆配列は膜との
相互作用のための信号域を表わし、合成中または合成後
直ちに分解される。
る前駆物質の形態で合成される。その前駆配列は膜との
相互作用のための信号域を表わし、合成中または合成後
直ちに分解される。
これに対して、プロインシュリンは膵臓抽出物の中に少
量見い出されうる物質である。それのインシュリンへの
変換中に、Ｃ−ニブタイドは特定の酵素系によって分解
される。
量見い出されうる物質である。それのインシュリンへの
変換中に、Ｃ−ニブタイドは特定の酵素系によって分解
される。
該加工酵素に対する切断部位は１３５１およびＢ５２（
Ｂ３０はＢ鎖のＣ−末端の後である）位でのＡｒｇ−Ａ
ｒｇ配列および６２（またはＡｊ）および６６（または
ＡＯ） （それらは後のＡ鎖へのＮ−末端である）位で
のＬｙｓ−Ａｒｇ配列によって形成される。プロインシ
ュリンは、トリプシンおよびカルボキシはプチダーセＢ
作用（： Ｋｅｍｍｌｅｒ氏等ｒＪＢｃＪ第２４６巻第
６７８６−９１頁（１９７１））を有する酵素によって
試験管内で容易にインシュリンに変換され得る。これに
対してトリプシンまたはトリプシン様酵素のみによる蛋
白質分解はＢ鎖のＣ−末端における３１および３２位に
１つまたは両方のアルギニンをなお有する中間体を優先
的に与え、さらにＢ−末端で分解してリシン−（Ｂ２９
）−インシュリン〔デアラニンー（Ｂ５０） −フタイ
ンシュリン、デスレオニン−（Ｂ３０）−ヒトインシュ
リン〕を与えるかまたはアルギニン−（Ｂ２２）−イン
シュリン（デオクタペプタイドインシュリン）を与える
インシュリン分解生成物を与える（ Ｃｈａｎｃｅ氏Ｔ
Ｊ−Ｐｒｏｃ・〜ＶＣｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄ、 Ｊ
（１９７０）、Ｄ、Ｅ、５ｔｅｉｎｅｒ氏等ｒ Ｆｅｄ
、 Ｐｒｏｃ、 Ｊ ８ｒ’Ｃ３３巻第２１０５〜１５
（１９７４）、Ｊ、 Ｍａｒｋｕｅｏｅｎ、ＩＪｒＦｒ
ｏｃ、 Ｓｙｍｐ、ｏｎ Ｐｒｏｌ、ｎｅｕｌｉｎ、
Ｉｎ５ｕ］、ｉｎ％Ｃ−ＰＯ［＝ｔｉｄｅ、 Ｔｏｋｕ
ｓｈｉｍＪ（１９７８） ）。
Ｂ３０はＢ鎖のＣ−末端の後である）位でのＡｒｇ−Ａ
ｒｇ配列および６２（またはＡｊ）および６６（または
ＡＯ） （それらは後のＡ鎖へのＮ−末端である）位で
のＬｙｓ−Ａｒｇ配列によって形成される。プロインシ
ュリンは、トリプシンおよびカルボキシはプチダーセＢ
作用（： Ｋｅｍｍｌｅｒ氏等ｒＪＢｃＪ第２４６巻第
６７８６−９１頁（１９７１））を有する酵素によって
試験管内で容易にインシュリンに変換され得る。これに
対してトリプシンまたはトリプシン様酵素のみによる蛋
白質分解はＢ鎖のＣ−末端における３１および３２位に
１つまたは両方のアルギニンをなお有する中間体を優先
的に与え、さらにＢ−末端で分解してリシン−（Ｂ２９
）−インシュリン〔デアラニンー（Ｂ５０） −フタイ
ンシュリン、デスレオニン−（Ｂ３０）−ヒトインシュ
リン〕を与えるかまたはアルギニン−（Ｂ２２）−イン
シュリン（デオクタペプタイドインシュリン）を与える
インシュリン分解生成物を与える（ Ｃｈａｎｃｅ氏Ｔ
Ｊ−Ｐｒｏｃ・〜ＶＣｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄ、 Ｊ
（１９７０）、Ｄ、Ｅ、５ｔｅｉｎｅｒ氏等ｒ Ｆｅｄ
、 Ｐｒｏｃ、 Ｊ ８ｒ’Ｃ３３巻第２１０５〜１５
（１９７４）、Ｊ、 Ｍａｒｋｕｅｏｅｎ、ＩＪｒＦｒ
ｏｃ、 Ｓｙｍｐ、ｏｎ Ｐｒｏｌ、ｎｅｕｌｉｎ、
Ｉｎ５ｕ］、ｉｎ％Ｃ−ＰＯ［＝ｔｉｄｅ、 Ｔｏｋｕ
ｓｈｉｍＪ（１９７８） ）。
プレプロインシュリンは現在；！’Ｃ伝子丁子工学的方
法って原始植生物（ｐｒｏｌｃａｒｙｏｔｅｓ ） ４
′ｉに太）ＩＩ５ＣＢ （Ｅ、ｃｏｌｉ）から入手され
る。ヒトインシュリン配列を有するプロインシュリンを
含有するこれらの菌株はここでは特に興味深い。さらに
プラスミドの修飾により新しい配列部分を制６１１ｊさ
れた手段、殊に酵素的または化学的解裂部位がインシュ
リンまたはインシュリン誘導体の放出のために保持され
るような手段によるプロインシュリン配列の５１〜３３
位および６１〜６３位における変換によって榴成するこ
とが可能である。
法って原始植生物（ｐｒｏｌｃａｒｙｏｔｅｓ ） ４
′ｉに太）ＩＩ５ＣＢ （Ｅ、ｃｏｌｉ）から入手され
る。ヒトインシュリン配列を有するプロインシュリンを
含有するこれらの菌株はここでは特に興味深い。さらに
プラスミドの修飾により新しい配列部分を制６１１ｊさ
れた手段、殊に酵素的または化学的解裂部位がインシュ
リンまたはインシュリン誘導体の放出のために保持され
るような手段によるプロインシュリン配列の５１〜３３
位および６１〜６３位における変換によって榴成するこ
とが可能である。
これらは例えば３１および３２位の一方または両方のア
ルギニンの代りに別の塩基性アミノ酸すなわちリジンま
たはヒスチジンを含み、そのためトリプシンの特性を有
する酵素が解裂のために使用されるような誘導体である
。しかしながら、他の既知の蛋白質分解酵素の基質であ
る配列または化学的方法による解裂が可能である配列を
導入することもできる。本発明のための前提条件はもっ
ばら次のことである。すなわちＡ鎖のＮ−末端の前に追
加のアミノ酸を含まず、Ｂ鎖（３１〜３３位）のＣ−末
端に３個までの追加のアミノ酸のなかで少なくとも１つ
の塩基性アミノ酸を有しているインシュリン誘導体が形
成、されることである。
ルギニンの代りに別の塩基性アミノ酸すなわちリジンま
たはヒスチジンを含み、そのためトリプシンの特性を有
する酵素が解裂のために使用されるような誘導体である
。しかしながら、他の既知の蛋白質分解酵素の基質であ
る配列または化学的方法による解裂が可能である配列を
導入することもできる。本発明のための前提条件はもっ
ばら次のことである。すなわちＡ鎖のＮ−末端の前に追
加のアミノ酸を含まず、Ｂ鎖（３１〜３３位）のＣ−末
端に３個までの追加のアミノ酸のなかで少なくとも１つ
の塩基性アミノ酸を有しているインシュリン誘導体が形
成、されることである。
Ｂ鎖のＣ−末端にさらに陽電荷を有するインシュリン誘
導体、それらの製造方法、それらを含む剤ならびにそれ
らの用途は西ドイツ／ｌ’＞ ＃’Ｆ出１、項第Ｐ ３
３２６４７２．４号および同第Ｐ ３３’２６４７３．
２号の主題である。それらの結晶化法は西ドイツ特許出
Ｆ？３第Ｐ ３３２７７０９．５−弓の主Ｉ；［である
。
導体、それらの製造方法、それらを含む剤ならびにそれ
らの用途は西ドイツ／ｌ’＞ ＃’Ｆ出１、項第Ｐ ３
３２６４７２．４号および同第Ｐ ３３’２６４７３．
２号の主題である。それらの結晶化法は西ドイツ特許出
Ｆ？３第Ｐ ３３２７７０９．５−弓の主Ｉ；［である
。
これらのインシュリンＭ％ ４体は、フェノールまたは
同様の芳香族体の存在下で所望の誘導体の等′１「点付
近で蛋白質分解による消化または化学的分解を行うこと
によって相当する中間体、プロインシュリン、フレゾロ
インシュリンマタは相当する同族体から格別に賓易に＄
１４造されうろことが発児された。この方法によれば最
イタ生成物が反応溶液から沈殿し、反応平衡から実り″
を的に除かれるだけでなく、上記条件下では鋭いふちを
有するプリズム状の結晶が’ｔ１体中に直接形成され、
該結晶は小さい表面積のために例えば無晶形の沈殿物よ
りもさらなる反応を受けにくい。かくして例えば結晶状
態における誘導体たるインシュリン−ＡｒｇＢ’ １−
ＯＨがさらなるトリプシン分解に対して特別に安定で
あることは驚ろくべきことである。
同様の芳香族体の存在下で所望の誘導体の等′１「点付
近で蛋白質分解による消化または化学的分解を行うこと
によって相当する中間体、プロインシュリン、フレゾロ
インシュリンマタは相当する同族体から格別に賓易に＄
１４造されうろことが発児された。この方法によれば最
イタ生成物が反応溶液から沈殿し、反応平衡から実り″
を的に除かれるだけでなく、上記条件下では鋭いふちを
有するプリズム状の結晶が’ｔ１体中に直接形成され、
該結晶は小さい表面積のために例えば無晶形の沈殿物よ
りもさらなる反応を受けにくい。かくして例えば結晶状
態における誘導体たるインシュリン−ＡｒｇＢ’ １−
ＯＨがさらなるトリプシン分解に対して特別に安定で
あることは驚ろくべきことである。
本発明は、中間体、プロインシュリン、プレプロインシ
ュリンまたはそれらの同族体を分解することにより式Ｉ （上記式中、Ｒ５０は遺伝学的に符号化されうる中性Ｌ
−アミノ酸の基を示し、Ｘは遺伝学的に符号化されうる
Ｌ−アミノ酸の同一または異ブよった基であって少なく
ともそれらの１つは塩基性アミノ酸でありその際Ｃ−末
噛員がホモセリン−ラクトン基でありうる基をボし、Ｙ
はＰｈｅまたはＨであり、そしてｎは１．２またはろで
ある）を有するインシュリン誘巧１体をｐｖ造するにあ
たり、芳香族ヒドロキシ化合物の存在下で前記式ｌのイ
ンシュリン誘導体の等電点付近で分解を行うことを特徴
とする、インシュリン詰２す′体の９４造方法に関する
ものである。
ュリンまたはそれらの同族体を分解することにより式Ｉ （上記式中、Ｒ５０は遺伝学的に符号化されうる中性Ｌ
−アミノ酸の基を示し、Ｘは遺伝学的に符号化されうる
Ｌ−アミノ酸の同一または異ブよった基であって少なく
ともそれらの１つは塩基性アミノ酸でありその際Ｃ−末
噛員がホモセリン−ラクトン基でありうる基をボし、Ｙ
はＰｈｅまたはＨであり、そしてｎは１．２またはろで
ある）を有するインシュリン誘巧１体をｐｖ造するにあ
たり、芳香族ヒドロキシ化合物の存在下で前記式ｌのイ
ンシュリン誘導体の等電点付近で分解を行うことを特徴
とする、インシュリン詰２す′体の９４造方法に関する
ものである。
Ｙは好適にはＰｈｅである。
下記のＬ−アミノ酸は遺伝学的にね一号化さねうる。
μワ・浮立・引■・ υ＝・とり・里、 Ｈｉｐ、 Ａ
ｎ■）、下線が付されている）中性アミノ酸は７１８通
りのものとして理解さオｔ゛、特に、Ｇｌｙ、 ＡＬａ
、 Ｓｅ’ｒ％Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、工１ｅ、
Ａｅｎ、 （）Ｉｎ％’ Ｍｅｔ、 ＰｈｅまたはＰｒ
ｏである。塩基性アミ、ノ酸は字義通りのものとし′〔
理解され、を臣にＡｒｇ、 Ｌｙｓまたは巳８である。
ｎ■）、下線が付されている）中性アミノ酸は７１８通
りのものとして理解さオｔ゛、特に、Ｇｌｙ、 ＡＬａ
、 Ｓｅ’ｒ％Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、工１ｅ、
Ａｅｎ、 （）Ｉｎ％’ Ｍｅｔ、 ＰｈｅまたはＰｒ
ｏである。塩基性アミ、ノ酸は字義通りのものとし′〔
理解され、を臣にＡｒｇ、 Ｌｙｓまたは巳８である。
例えば、下記のインシュリン誘導体が不発明の方法によ
って製造されるが不発明はこれ１ｃ限定されるものでは
ない。
って製造されるが不発明はこれ１ｃ限定されるものでは
ない。
ヒトインシュリン−ＡｒｇＢ３１− ＯＨブタインシュ
リン−ＡｒｇＢ５１− ＯＨウシインシュリン−Ａｒｇ
Ｂ５１− ＯＨヒトインシュリン−ＡｒｇＢ ５１−
Ａｒｇ Ｂ５２− ＯＨブタインシュリン−ＡｒｇＢｌ
ｌ −Ａｒｇ”２ ＝ ＯＨウシインシュリン−Ａｒｇ
Ｂ３１−Ａ？、、Ｂ３２− ＯＨヒトインシュリン−Ｌ
ｙｓｒ３３１−ＯＨピトインシュリ７− ＡＬａＢ５Ｌ
−Ｌｙｓ”５２−ＯＨヒトインシュリン−ｙａＩＢ５１
．−Ａｒｇ１３３２−ＯＨヒトインシュリン−Ｌｅｕ”
＋−ＡｒｇＢ５２−ＡｒｇＢ５５−＜４Ｈブタインシュ
リン−ＶａｌＢ３１−Ｈｌｓ”２−ＡｒｇＢ”−、ＯＨ
ブタインシュリン−Ｌｅｕ”１−Ｖ、ａｌＢ’２−Ａｒ
ｇ””−ＯＨヒトインシュリン−ＡｒｇＢ５１−Ｐｈｅ
Ｂ３２−ＯＨそれ以上のフェノールの混合物の存在下で
、等電点より１ ｐＨ単位以下ないし等電点より１ ｐ
Ｈ単位以上のｐＨ範囲で好適に実施される。
リン−ＡｒｇＢ５１− ＯＨウシインシュリン−Ａｒｇ
Ｂ５１− ＯＨヒトインシュリン−ＡｒｇＢ ５１−
Ａｒｇ Ｂ５２− ＯＨブタインシュリン−ＡｒｇＢｌ
ｌ −Ａｒｇ”２ ＝ ＯＨウシインシュリン−Ａｒｇ
Ｂ３１−Ａ？、、Ｂ３２− ＯＨヒトインシュリン−Ｌ
ｙｓｒ３３１−ＯＨピトインシュリ７− ＡＬａＢ５Ｌ
−Ｌｙｓ”５２−ＯＨヒトインシュリン−ｙａＩＢ５１
．−Ａｒｇ１３３２−ＯＨヒトインシュリン−Ｌｅｕ”
＋−ＡｒｇＢ５２−ＡｒｇＢ５５−＜４Ｈブタインシュ
リン−ＶａｌＢ３１−Ｈｌｓ”２−ＡｒｇＢ”−、ＯＨ
ブタインシュリン−Ｌｅｕ”１−Ｖ、ａｌＢ’２−Ａｒ
ｇ””−ＯＨヒトインシュリン−ＡｒｇＢ５１−Ｐｈｅ
Ｂ３２−ＯＨそれ以上のフェノールの混合物の存在下で
、等電点より１ ｐＨ単位以下ないし等電点より１ ｐ
Ｈ単位以上のｐＨ範囲で好適に実施される。
上記１１）Ｈは適当な緩酋液（例えば酢酸塩、クエン酸
塩またはリン酸塩）によって設定されている。
塩またはリン酸塩）によって設定されている。
本発明の方法において、出発物質の濃度は０．５〜３０
り／ ｍｅ、好適には１〜１０ ｍ？／ｌｙｌ、反応の
速度は結晶の形成速度よりやや犬きめかまたは笠しい速
度で反応を実施するのが好ましい。このことは多くの結
晶の種が形成され、結晶の大きさは平均３０μｍを越え
贋いことを意味する。所望の方法で反応の速度を非常に
正確に制御することは殊に酵素触媒の場合には可能であ
る。
り／ ｍｅ、好適には１〜１０ ｍ？／ｌｙｌ、反応の
速度は結晶の形成速度よりやや犬きめかまたは笠しい速
度で反応を実施するのが好ましい。このことは多くの結
晶の種が形成され、結晶の大きさは平均３０μｍを越え
贋いことを意味する。所望の方法で反応の速度を非常に
正確に制御することは殊に酵素触媒の場合には可能であ
る。
上記方法を用いることによって所望の生成物の方向に反
応をより良く進行させ、それによって収率における重要
な改良が可能である。生成物は、単に洗浄するだけでさ
らなる処理が容易であり、かつ過剰の分解剤、例えばプ
ロテアーゼから実質的に解放されうる形態で待られる。
応をより良く進行させ、それによって収率における重要
な改良が可能である。生成物は、単に洗浄するだけでさ
らなる処理が容易であり、かつ過剰の分解剤、例えばプ
ロテアーゼから実質的に解放されうる形態で待られる。
選択された分解剤は、例えば、所望の基Ｘｎが保持され
、一方分解が行なわれた後にＡ鎖が遊離のＮ−末端Ｈ−
ｏｌｙを有しているような特性を有するプロテアーゼで
ある。プロインシュリン配列における相当する部位でメ
チオニンが心入される場合には、分解は臭化シアンによ
って実施されることがでと、その場合にはＣ−末端にホ
モセリン−ラクトン基が保持される。
、一方分解が行なわれた後にＡ鎖が遊離のＮ−末端Ｈ−
ｏｌｙを有しているような特性を有するプロテアーゼで
ある。プロインシュリン配列における相当する部位でメ
チオニンが心入される場合には、分解は臭化シアンによ
って実施されることがでと、その場合にはＣ−末端にホ
モセリン−ラクトン基が保持される。
式Ｉのインシュリン誘導体およびそれを含有する医薬は
完全に新規で遅効性の成分であり、その作用は亜鉛また
は硫酸プロタミンのような貯蔵物質の補助なしに生じる
。貯蔵物Ｊりの作用は、蛋白質化学に由来する固有の物
理的原理、すなわち、等電点でのインシュリン誘導体の
低い溶解性に帰因する。
完全に新規で遅効性の成分であり、その作用は亜鉛また
は硫酸プロタミンのような貯蔵物質の補助なしに生じる
。貯蔵物Ｊりの作用は、蛋白質化学に由来する固有の物
理的原理、すなわち、等電点でのインシュリン誘導体の
低い溶解性に帰因する。
生３１１！学的争件下での上記物質の再溶解は付加的塩
基性基を分１町（ホさせることによって達成され、それ
はｈＳ導体により、トリプシンまたはトリプシン一様Ｋ
Ｍ＜および／またはカルボキシはブチダーゼＢまたは
カルボキシズプチダーゼＩｌ −（：；Ｆ酵素および／
またはニステラー七の作用によって起こる。
基性基を分１町（ホさせることによって達成され、それ
はｈＳ導体により、トリプシンまたはトリプシン一様Ｋ
Ｍ＜および／またはカルボキシはブチダーゼＢまたは
カルボキシズプチダーゼＩｌ −（：；Ｆ酵素および／
またはニステラー七の作用によって起こる。
実施例 １
フェノールの不存在または存在下におけるブタからのデ
ノナはブタイド−プロインシュリンのトリプシン消化 デノナベプタイドーブタプロインシュリン３５０確を酸
性条件下で溶解し、該溶液をトリプシン（ウシ）２００
μ２を含む０．１Ｍ）リスバッファ（ｐＨ＝’７．５
） ２１５−に加えた。数分内に濁りが生じた。反応終
了（約１時間〕後、トリプシン阻害剤１００μ？を加え
、該混合物を遠心分前し、白色沈殿を０．１％の適当な
洗剤を含有する０、０５Ｍ酢酸アンモニウムバッファ（
Ｔ）Ｈ＝４．０） ２０ ｒｒｒｔに溶解し、０〜Ｉ
Ｍ食塩勾配を有する陽イオン交換体上で留製した。次の
ものが単一、ａｊｐされた。純粋な状態でのインシュリ
ン−ＡｒｇＢ３１−Ａｒｇ”２−ＯＨ９６！Ｉ！ｒ（３
６，６％）およびインシュリン−ＡｒｇＢ３１−Ａｒｇ
Ｂ５２−ＯＨとインシュリン−ＡｒｇＢ５１− ＯＲと
の混合物７２Ｔｙｉ（２７，４％）およびさらに少なく
とも２秤類の不純物（等電点焦点および高圧液体クロマ
トグラフ イー （ＨＰＬＣ；）、１４．９％（７）出
発物質、ａ７％のジーおよびモノアルギニン誘４ 体、
４ ｑ、 ５％のデーアラニン（Ｂ２Ｏ）−インシュリ
ンおよび１２．２％のデオクタはブタイド−・インシュ
リンを含ムｍ 合物５６ ｍｇ（約２１係）が少景の未
確定のピーク（ＨＰＬＣ）のものとともに反応の上澄液
から単離された。
ノナはブタイド−プロインシュリンのトリプシン消化 デノナベプタイドーブタプロインシュリン３５０確を酸
性条件下で溶解し、該溶液をトリプシン（ウシ）２００
μ２を含む０．１Ｍ）リスバッファ（ｐＨ＝’７．５
） ２１５−に加えた。数分内に濁りが生じた。反応終
了（約１時間〕後、トリプシン阻害剤１００μ？を加え
、該混合物を遠心分前し、白色沈殿を０．１％の適当な
洗剤を含有する０、０５Ｍ酢酸アンモニウムバッファ（
Ｔ）Ｈ＝４．０） ２０ ｒｒｒｔに溶解し、０〜Ｉ
Ｍ食塩勾配を有する陽イオン交換体上で留製した。次の
ものが単一、ａｊｐされた。純粋な状態でのインシュリ
ン−ＡｒｇＢ３１−Ａｒｇ”２−ＯＨ９６！Ｉ！ｒ（３
６，６％）およびインシュリン−ＡｒｇＢ３１−Ａｒｇ
Ｂ５２−ＯＨとインシュリン−ＡｒｇＢ５１− ＯＲと
の混合物７２Ｔｙｉ（２７，４％）およびさらに少なく
とも２秤類の不純物（等電点焦点および高圧液体クロマ
トグラフ イー （ＨＰＬＣ；）、１４．９％（７）出
発物質、ａ７％のジーおよびモノアルギニン誘４ 体、
４ ｑ、 ５％のデーアラニン（Ｂ２Ｏ）−インシュリ
ンおよび１２．２％のデオクタはブタイド−・インシュ
リンを含ムｍ 合物５６ ｍｇ（約２１係）が少景の未
確定のピーク（ＨＰＬＣ）のものとともに反応の上澄液
から単離された。
別のバッチにおいて、デノナはプクィトーフタプロイン
シュリン１Ｑ［ｌ＊２を酸件栄件下で溶解し、該溶液を
ｍ−クレゾール２−５”ｊｉ’／ｍ／およびトリプシン
（ウシ）５０μ７を含む０．１ Ｍ ）リスバッファー
、（ｐＨ＝ ７．５） ５０ ｍｌに加えた。約１５分
後、約５〜１５ ｐｍの大きさのシャープな縁のプリズ
ム状の結晶沈殿が生成した。反応は３時間後に上記のよ
うにして中断された。操作は上記のようにして遂行され
た。
シュリン１Ｑ［ｌ＊２を酸件栄件下で溶解し、該溶液を
ｍ−クレゾール２−５”ｊｉ’／ｍ／およびトリプシン
（ウシ）５０μ７を含む０．１ Ｍ ）リスバッファー
、（ｐＨ＝ ７．５） ５０ ｍｌに加えた。約１５分
後、約５〜１５ ｐｍの大きさのシャープな縁のプリズ
ム状の結晶沈殿が生成した。反応は３時間後に上記のよ
うにして中断された。操作は上記のようにして遂行され
た。
インシュリン−Ａ１−ｇＢ５１−Ａｒｇ”２−０’ｆＪ
の収量５６■（７４，７％）、ジ−アルギニンおよびモ
ノ−アルギニン誘導体の混合物１’ｌＷ（１４，７係）
。痕跡量のインシュリン様物質のみが上澄液に残った。
の収量５６■（７４，７％）、ジ−アルギニンおよびモ
ノ−アルギニン誘導体の混合物１’ｌＷ（１４，７係）
。痕跡量のインシュリン様物質のみが上澄液に残った。
実施例 ２
大腸菌において表現されたサルプレゾロインシュリンか
らのトリプシン消化によるヒトインシュリン−ＡｒｇＢ
５１− ＯＲの製造 サルプレプロインシュリン１０ｍ１７を酸性条件下で溶
解し、該溶液を、フェノールｉ、 ５ ｒｒｒｇ ／ｒ
ｎｅ１ｍ−クレゾール０．７ ｑ／ｍｅおよびトリプシ
ン（ウシ）２５μ２を含み、０．５１４食塩（ＤＨ＝
６．８ ）を含有するり、 Ｉ Ｍリン酸バッファ５
ｍｅに加える。所望の生成物は約５〜２０μｍの太きさ
め鋭いふちを有するプリズム状で反応液中に沈殿する。
らのトリプシン消化によるヒトインシュリン−ＡｒｇＢ
５１− ＯＲの製造 サルプレプロインシュリン１０ｍ１７を酸性条件下で溶
解し、該溶液を、フェノールｉ、 ５ ｒｒｒｇ ／ｒ
ｎｅ１ｍ−クレゾール０．７ ｑ／ｍｅおよびトリプシ
ン（ウシ）２５μ２を含み、０．５１４食塩（ＤＨ＝
６．８ ）を含有するり、 Ｉ Ｍリン酸バッファ５
ｍｅに加える。所望の生成物は約５〜２０μｍの太きさ
め鋭いふちを有するプリズム状で反応液中に沈殿する。
結晶は９２チのインシュリンおよびインシュリン誘導体
を含む。）（ＰＬＯによれば生成物の７８％はヒトイン
シュリン−Ａｒｇ”−ＯＨであり、そして１４係はヒト
インシュリン−ＡｒｇＢ５１−Ａｒ ｇＢ ” −ＯＨ
である。５係以下のインシュリン様蛋白のみが反応液の
土ｉテＦ液に見出される。結晶の懸１ｙ）液をトリプシ
ンの存在下に室温でさらに２日間放置すると、理論量の
８７％のインシュリンお２Ｌびインシュリン誘導体力り
占品状態でなお残り、生成物の７９％はヒトインシュリ
ン−ＡｒｇＢ５＋ −ＯＨでありそして１１％＋−ｒヒ
トインシュリンＡ ｒＦＴ１５１− Ａ ｒ ＋１７１
１５２− （）Ｈである。
を含む。）（ＰＬＯによれば生成物の７８％はヒトイン
シュリン−Ａｒｇ”−ＯＨであり、そして１４係はヒト
インシュリン−ＡｒｇＢ５１−Ａｒ ｇＢ ” −ＯＨ
である。５係以下のインシュリン様蛋白のみが反応液の
土ｉテＦ液に見出される。結晶の懸１ｙ）液をトリプシ
ンの存在下に室温でさらに２日間放置すると、理論量の
８７％のインシュリンお２Ｌびインシュリン誘導体力り
占品状態でなお残り、生成物の７９％はヒトインシュリ
ン−ＡｒｇＢ５＋ −ＯＨでありそして１１％＋−ｒヒ
トインシュリンＡ ｒＦＴ１５１− Ａ ｒ ＋１７１
１５２− （）Ｈである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）中間体、プロインシュリン、プレプロインシュリン
またはそれらの同族体を分解することにより式ｌ Ｂ ｓ （上記式中Ｒ３Ｄは遺伝学的に符号化されうる中性Ｌ−
アミノ酸の基を示し、Ｘは遺伝学的に符号化されうるＬ
−アミノ酸の同一または異なった基であって少なくとも
それらの１つは塩基性アミノ酸であり、その際Ｃ−末端
員がホモセリン−ラクトンでありうる基を示し、ＹはＰ
ｈｅまたはＨであり、そしてｎは１．２または３である
）を有するインシュリン言）１体を製造するにあたり、
芳香族゛ヒドロキシ化合物の存在下で前記式ｌのインシ
ュリン誘導体の等電点付近で分解を行うことを特（ｉｔ
’＜とする、インシュリン誘導体の製造方法。 ２ン 式ＩにおいてＰ３（〕がＡＬａ 、 Ｔｈｒまた
はＨｅｒを示す特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３）式ＩにおいてＹがＰｈｅを示す特許請求の範囲第１
項または第２項に記１．（）の製造方法。 ４）式１の・インシュリン誘導体がヒトインシュリン、
ブタインシュリンまたはウシインシュリンの配列を有す
る特許請求の範囲第１拍ないし第３項のいずれかの項に
記載の製造方法。 ５）式ｌにおいてＸが中性および／または塩ノＳ性アミ
ノ酸基である特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかの項に記載の製造方法。 ６）分解反応がフェノールまたは数種のフェノールの混
合物の存在下で実施される特許請求の範囲第１項ないし
第５項のいずれかの項に記載の製造方法。 ７）反応の速度が反応生成物が３０μｍまでの大きさの
結晶の状態で優先的に得られるように選択されている特
許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかの項に記載
の製造方法。 ８）中間体、プロインシュリン、プレプロインシュリン
またはそれらの同族体が反応開始時に０．５〜３ｏｍｙ
／ｌｒｉの０度で反応媒体中に存在する特許請求の範囲
第１項ないし第７項のいずれかの項に記載の製造方法。 ９）反応媒体が適当な手段で緩衝化された水性媒体であ
る特許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかの項に
記載の製造方法。 １０）分解剤がプロテアーゼであり、それのｔ１￥性は
所望の基Ｘｎを保持させ、一方分解を遂行した後でＡ鎖
が遊離Ｎ−末端を有するようなものである特許請求の範
囲第１項ないし第９項のいずれかの項に記載の製造方法
。 １リ 分解剤は臭化シアンであり、ホモセリン−ラクト
ン基はＢ ａのＣ−末端に保持されており、一方Ａ鎖の
中性Ｎ−末端はＭθｔ −ＡＯでの分解で形成される特
許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかの項に記載
の製造方法。
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|---|---|---|---|
| DE19833327928 DE3327928A1 (de) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten |
| DE3327928.4 | 1983-08-03 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6064997A true JPS6064997A (ja) | 1985-04-13 |
| JPH0696597B2 JPH0696597B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP59161643A Expired - Lifetime JPH0696597B2 (ja) | 1983-08-03 | 1984-08-02 | インシユリン誘導体の製法 |
Country Status (20)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0135720B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0696597B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1229588A (ja) |
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| DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
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| JP3764174B2 (ja) * | 1997-03-20 | 2006-04-05 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 肺用組成物において使用するための亜鉛非含有のインスリン結晶 |
| US6310038B1 (en) * | 1997-03-20 | 2001-10-30 | Novo Nordisk A/S | Pulmonary insulin crystals |
| US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
| KR100520616B1 (ko) * | 2002-12-05 | 2005-10-10 | 태양금속공업주식회사 | 보울트 머리 성형용 트리밍 다이스 |
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| US7714025B2 (en) * | 2006-05-10 | 2010-05-11 | Arizona Biomedical Research Commission | Modified chalcone compounds as antimitotic agents |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4913193A (ja) * | 1972-03-24 | 1974-02-05 | ||
| JPS5123290A (en) * | 1974-06-12 | 1976-02-24 | Hoechst Ag | Inshurin narabini sonoruientai oyobi judotainoseiho |
| JPS5777655A (en) * | 1980-09-03 | 1982-05-15 | Hoechst Ag | Novel insulin analogue |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1072410A (fr) * | 1951-11-15 | 1954-09-13 | Novo Terapeutisk Labor As | Perfectionnements apportés au procédé de préparation d'insuline sous une forme cristallisée |
| DK78069C (da) * | 1952-06-23 | 1954-09-06 | Novo Terapeutisk Labor As | Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk insulin. |
| DE952208C (de) * | 1953-11-13 | 1956-11-15 | Novo Terapeutisk Labor As | Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin |
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| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
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-
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-
1984
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- 1984-08-01 FI FI843045A patent/FI79853C/fi not_active IP Right Cessation
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- 1984-08-01 US US06/636,672 patent/US4639332A/en not_active Expired - Lifetime
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Patent Citations (3)
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