JPS6067433A - マイトマイシン類，多糖類及び抗体の複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマイトマイシン類、多糖類及び抗体を結合させ
て得られる複合体に関する。さらに詳しくは本発明はマ
イトマイシン類と多糖類との結合体と、抗体とが■−一
般 式式％ （式中、ｎは３〜７の整数を、Ｒは低級アルキレン基を
表わす。又各左端の０は多糖類の水酸基のＯを、右端の
Ｎｌ（は抗体のアミノ基のＮＨを示す。）で表わされる
基、■一般式 ％式％ （式中、ｎ、Ｒ，左端の０、右端のＮＨは前記と同義で
ある）で表わされる基、又は■上記■。

■の一般式中の（ＣＨ２）ｎ　で表わされるメチレン鎖
のいずガかの水素が低級アルキル基で置換した７、Ｕに
より結合し、／こ、マイトマイシン類、多糖類及び抗体
の複合体に関する。

ただし、上記でマイトマイシン類と多糖類との結合体と
ｒ１マイトマイシン類と多糖類とが■′一般式 ％式％ （式中、ｎけ前記と同義であり、左端のＮはマイトマイ
シン類のイミノ基のＮを右端の０は多糖ガＩの水酸基の
０を示す）で表わされる基、■′−貞Ｉｐ　＋ ンＮ−ｃｏ−（ｃＨ２’）ｎ−ｏ− （式中、ｎ１左端のＮ１右端の０は前記と同義である）
で表わされる基、又は■′上記■′、■′の一般式中の
（ｃｕｔ）ｙ、で表わされるメチレン鎖のいずれかの水
素が低級アルキル基で置換した基により結合した結合体
をいうものとする。

本発明の複合体においてはマイトマイシン類と多糖類と
の結合体にさらに抗体が結合している点に特徴を有する
。抗体として例えば抗α−フェトプロティン抗体などの
抗腫瘍抗体を用いる場合、いわゆるミサイル療法を適用
できるメリットがある。

従来、多糖類の水酸基に結合させたスペーサーにマイト
マイシン類を結合させた結合体については本出願人によ
る出願がある（％開昭５４−９７６９１　）。該特開昭
ではスペーサー部は””、　Ｎ−Ｃ！０（ＯＨ２）ｎ−
Ｎｌ（−０−０−１ 等であると考えられる。また上記でスペーサー部が ＞Ｎ−ｃｏ−（ＣＨ２）ｎ−ｏ− である結合体については本出願と同日付の本田に；ｒｉ
人による出願がある（発明の名称：マイトマイシン類と
多糖類との結合体）。

次に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明で使用するマイトマイシン類としてはイミノ塙（
アジリジン環イミノ基）を有するものであればいずれで
もよく、マイトマイシンＡ１マイトマイシンＣ１これら
のアジリジンＨ以外の部位の誘導体が用いられる。

多糖類としてはデキストラン、セルロース、アガロース
、アルギン酸等が用いられる。

マイトマイシン類と多糖類との結合体の製造にｊ゛特開
昭５４−９７６９１、前記同日付則出願に記小Ｖされて
いる。

次に抗体としては生体内に相対する抗原が存在し、かつ
それ自身又は抗原との相互作用により重篤な症状をおこ
すもめでないならばいずれでもよいが、本発明の目的か
ら特に抗腫瘍抗体が好ましい。抗腫瘍抗体としては公知
の種々のもの、例えば抗α−フェトプロティン、０ＥＡ
（カルチノエンブリオテイツクアンチジエン）、ＨＯＧ
　（ヒユーマンコリオジェニックゴナドトロピン）など
が使用可能である。

本発明の複合体は次の方法によって得ることができる。

（１）　マイトマイシン類と多糖類との結合体に一８Ｈ
基の導入 （１）−１結合体にアミノ基の導入 結合体中にはマイトマイシン類との結合に使用されてい
ないスペーサ一部分、すなわち■−一般 式式％ （式中、ｎ１左端の０は前記と同義である）で表わされ
る俵、又は■−一般 式式％ （式中、ｎ１左端の０は前記と同義である）で表わされ
る基、又は■上記■、■の一般式中の（ＣＨ２）ｎ　で
表わされるメチレン鎖のいずれかの水素が低級アルギル
基で置換した基が存在する。した−かって、まずこの基
に低級アルキレンジアミンを作用させて上Ｎ１シ各式右
末端のカルボキシル基を −ｃｏ　ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２（式中、Ｒは前記と同義であ
る）にする。

マイトマイシン類と多糖類との結合体を■−Ｃ０２Ｈ（
ただしＣｏ２Ｈはスペーサー部末端のＣ０２Ｈを示す）
で表わすなら上記反応は次のごとく表わされる。

■−ｃｏ２ａ　＋　Ｒ（ＮＨｚ）ｚ→■−０ＯＮＨ−Ｒ
−ＮＨ２１１’ｒ、　Ｖ、Ｉｌ、　−ｙ　＋、　ｋ　＋
　−、＋　−Ｓ　”ｉｒ　５　、／　＋ｙ　−ｈ−１，
＋７Ｍ−ｆ’１４　’？　Ｎキレンとしては炭素数２〜
６の直鎖もしくは分枝状のものが好適に用いられる。例
えばエチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメ
チレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が用いられ
る。

上記反応は水系媒体中、適当な縮合剤の存在下に通常室
温、ｐＨ６〜８で５〜５０時間行う。

水系媒体とは水又は水とメタノール、エタノール等の低
級アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等との混
合溶媒、又緩衝溶液を意味する。縮合剤としては例えば
１−エチル−３−Ｃ５−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド等が用いられる。

上記反応は又結合体製造の中間体たる多糖類とスペーサ
ーとの結合したものにマイトマイシン類を結合させるに
際し、低級アルキレンジアミンを共存させることによシ
一段階で行ってもよい。この場合の反応条ａ：ｔｌ−ｉ
ｉ’　ふ　后１作〒　１−−反応終了後限外涙過で未反
応物を除去する。

（１）−２−５−ｓ−居の導入 アミン化結合体に３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸Ｎ−サクシミジル（以下８ＰＤｐという）を反応さ
せて結合体に−８−Ｂ−基を導入する。該反応は水系媒
体中、通常宰泥、ｐＨ６〜８で１０分〜５時間行う。水
系媒体としては前記のものが用いられる。

反応終了後透析等により生成物を精製する。

（１）−３−５−ｓ−→−８Ｒ −÷■−Ｃｏｔ（）（−Ｒ−ＮＨ−００−（、Ｈ２０Ｈ
２８Ｎ（ジスルフィド化結合体を還元してメルカプト結
合体とする。−５＝Ｓ−を−８Ｈとする公知の還元手法
を適用できるが、ジチオスレイト−ル（ｄｉｔｈｊ、ｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌ　）　による還元が特に好適である。

ジチオスレイトールを用いる場合、反応はジスルフィド
結合体とジチオヌレイトールとを水系媒体中、通常室温
下、ｐＨ６〜８で５分〜３時間反応させることにより行
う。

（１）−２で透析後の溶液にジチオスレイトール水溶液
を添加して反応を行ってもよい。

反応終了後透析等によりメルカプト結合体を精製する。

（２）　抗体に−５−ｓ−基の導入 （式中、■−ＮＨ２は抗体を示す） 抗体に５ＰＤＰを反応させて−５−Ｓ−基を導入する。

反応条件は前記（１）−２の場合と同様でよい。反応終
了後透析等により精製する。

（３）　メルカプト結合体と２スルフィド抗体との反応
（目的複合体の生成） ■−〇〇ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ！０−０１（２Ｃ！Ｈ２Ｓ
Ｈ＋■−ＣＯＮＨ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−ＯＨ２ＣＨ２−Ｅ
３−８−（３Ｈ２ＣＩ１２Ｃ，Ｎ’Ｈ−（９反応Ｃ：水
系謀体中、通常室温下ｐＨ６〜８で１〜２０時間行う。

水系媒体としては前記と同様のものが使用できるが、特
に緩衝溶液が好ましい。透析終了後のメルカプト結合体
溶液及びジスルフィド抗体溶液を混合して反反応終了後
、ゲル濾過等によりｔｉＩｌ製する。

本発明のマイトマイシン類、多糖類及び抗体の複合体の
薬剤的、薬理的性質をスペーサーとして６−アミノヘキ
サン酸を用いて得られるデキストラン・マイトマイシン
Ｃ結合体と抗体としての抗ヒト赤血球Ｉｆｆ　（フルオ
レラセンイソチオシアネートでラベル）とから得られる
複合体（実施例１のもの）の場合について以下に示す。

（１）放出速度 ６７℃、ｐＨ７，４１ＪンＬ賀緩衝液中での複合体から
のマイトマイシンＣの放出は一次速度式に従って放出さ
れ（つまり直線関係）、半減期は約２４時間である。こ
れは抗体結合のない場合とほぼ同様である。

（２）抗腫瘍活性 マψス　Ｌ１２１０　ｌｅｕｋｅｍｉａ　を用いた１ｎ
Ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性を調べた結果は次の通シ己 であり、マイトマイシンと同等である。

△ 祭物濃度　生長阻害 μ９肩、マイトマイ （、、、、、７１０）　（％） ０、　５　８　５．　１ ０、　５　７　５．　７ （３）抗体活性 抗原としてヒト赤血球、補体としてモルモット補体を用
いて、溶血反応を指標に抗体価の検定を行った。５０％
溶血を起こす濃度で比較すると、複合体はもとの抗体の
８５．６％の活性を保っており、合成後も補体系関与の
活性がほぼ維持されていることが明らかとなった。

次に本発明のマイトマイシン類、多糖類及び抗体の複合
体の製造を実施例によシ説明する。

実施例１ ｌ−（１）　スペーサーを６−アミンへキサン酸とする
マイトマイシンＣ１デキスト ラン結合体にメルカプト基の導入 デキストランと６−アミンへキサン酸との反応中間体（
特開昭５４−９７６９１に製造例がある）１００■、マ
イトマイシンＧ１０１’ｌｉ７％エチレンジアミン０．
４５■、１−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩！＋００■をｐＨ７，５のリ
ン酸緩衝液１０ｗ１に溶解し、室温で２４時間反応後、
ｐＨ９の炭酸ナトリウム水溶液で２万カツトの限外沢過
膜を用いて限外沖過して未反応物を除去する。

次ＶＣ０，３ｍｌ　ｘ　タ／　−ル中（７）　５ＰＤｊ
　４．４６　Ｔｎｇを加え２５℃で５０分反応させる。

反応終了後、０．１Ｍｌ・リス塩酸緩衝液０．５　ｍｌ
を加え、０．１　Ｍ　ｐＨ７，５リン酸緩衝液で透析す
る。

次に４０　ｍＭ　ジチオスレイトールを添加し２３℃で
２０分反応させ、ｐＨ４，５のアセトン緩衝液で透析す
る。

１−（２１抗体に−５−ｓ−基導入 抗体としてＦＩＴＣでラベルした抗ヒト赤血球工７グを
用いる。抗体１５０ｍｇをリン酸緩衝液１０７ｇに溶解
し、エタノール中の５ＰＤＰ　１．９５■を加え、２３
℃で３０分反応させる。ついで０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液０．５　ｍｌを加え、０．１ＭｐＨ１５のリン酸緩衝
液で透析する。

１−（３）複合体の生成 １−（ｉ）　＋　１１２１の生成物をｐＨ７，５のリン
酸緩衝液中室温で約１０時間反応させる。

１−（４）精製（ゲル沖過） 反応終了液をセファデックスＧ−２００で分画し、未反
応抗体を分離し、複合体分画をｖｏｉｄｙ□］、ｕｍｅ
　分画として得る（第１図）。さらにセファデックス４
Ｂでｅ）分画し、３つのピークを１’ｒ’ｒる（第２図
）第１のピーク（ｖｏｉｄ　ｖｃｉ’ｌｕｍｅ　）はマ
イトマ・ｆシンＣとデキストランとの結合体と、抗体と
の重合体でおる。第２のピークは目的とする複合体であ
る。第３のピークは未反応のマイトマイシンＣとデキス
トランとの結合体である。なお、上記でマイトマイシン
Ｃとデキストランとの結合体は０）６．で、抗体は０〜
０で測定する。

複合体の結合比率をゲル濾過チャートの吸光度よシマイ
トマイシン・デキストラン結合体を定量し、ＬＯＷｒ７
法によりタンパク量を定量することによシ調べたところ
、結合体：抗体＝１：２の比で結合していることが明ら
かとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は複合体生成反応終了液のセファデックスＧ−２
００分画に際しての時間と吸光度との関係を示す。 第２図は複合体生成反応終了液のセフ了デツクス４Ｂ分
画に際しての時間と吸光度との関係を示す。 特許出願人（１０２’）協和醗酵工業株式会社代表者　
本　下　祝　部

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　マイトマイシン類と多糖類との結合体と、抗体
   とが■一般式 ％式％ キレン基を表わす。又各左端の０は多糖類の水酸基の０
   を、右端のＮＨは抗体のアミノ基のＮＨを示す。）で表
   わされる基、■一般式％式％ （式中、ｎ、Ｒ，、左端の０、右端のＮＨは前記と同義
   である）で表わされる基、又は■上記■、■の一般式中
   の（ＣＨ２）ｎ　で表わされるメチレン鎖のいずれかの
   水素が低級アルキル基で置換した基により結合した、マ
   イトマイシン類、多糖類及び抗体の複合体。 ただし、上記でマイトマイクン類と多糖類との結合体と
   はマイトマイシン類と多糖類とが■′一般式 ％式％ ンＮ−ｃｏ−（ｃｕ２）！１−ＮＨ冑Ｃく。−（式中、
   ｎは前記と同義であり、左端のＮはマイトマイシン類の
   イミノ基のＮを、右端の０は多糖類の水酸基の０を示す
   ）で表わされる基、■′一般式 ％式％） （式中、ｎ１左端のＮ１右端の０は前記と同義でおる）
   で表わされる俵、又は■′上記■′。 ■′の一般式中の（ＯＨｇ）ｎ　で表わされるメチレン
   鎖のいずれかの水素が低級アルキル基で置換した基によ
   り結合した結合体をいうものとする。
2. （２）　多糖類がデキストラン、アガロース、セルロー
   ス又はアルギンＣソである特許請求の範囲第１項記載の
   複合体。