JPH0211597A - Ｄｎａまたはｒｎａ配列を含有するルテニウム複合化合物 - Google Patents
Ｄｎａまたはｒｎａ配列を含有するルテニウム複合化合物Info
- Publication number
- JPH0211597A JPH0211597A JP10709689A JP10709689A JPH0211597A JP H0211597 A JPH0211597 A JP H0211597A JP 10709689 A JP10709689 A JP 10709689A JP 10709689 A JP10709689 A JP 10709689A JP H0211597 A JPH0211597 A JP H0211597A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- ruthenium
- compound according
- dna
- bathophenanthroline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H23/00—Compounds containing boron, silicon or a metal, e.g. chelates or vitamin B12
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は次式ｌで示されるルテニウム複合体に、好まし
くはスペーサー基を介して、共有結合されているＤＮＡ
配列またはＲＮＡ配列を含有するルテニウム複合化合物
に関し、この複合化合物において、ＲＮＡまたはＤＮＡ
配列はルテニウム複合体との反応によって、修飾されて
いる形で、または修飾されていない形で、直接にあるい
はスペーサー基を介して共有結合されている： Ｒｕ” ” ＬＩＬ２Ｌ３ １〔式中、Ｌ
ｌおよびＬ２は同一または異なり、電荷移動単位（Ｃｈ
ａｒｇｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉ乞）を表わし、そ
してＬ３はまた基Ａ−Ｘで置換されてｉる電荷移動単位
を表わし、Ａは所望により、−８０Ｈ２−ＮＨ−１−ｓ
−−ｏ−−ｃｏｏ−または−Ｃｏ−ＮＨ−で置換されて
いてもよいアルキレン基を表わし、そしてＸはアルデヒ
ド、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオシアネート
基、ハロゲンまたはホスファイトあるいはホスフェート
基、またはホスホネートあるいはチオホスフェート基の
ような修飾ホスフェート基、あるいは他の適当な官能性
基を表わす〕。
くはスペーサー基を介して、共有結合されているＤＮＡ
配列またはＲＮＡ配列を含有するルテニウム複合化合物
に関し、この複合化合物において、ＲＮＡまたはＤＮＡ
配列はルテニウム複合体との反応によって、修飾されて
いる形で、または修飾されていない形で、直接にあるい
はスペーサー基を介して共有結合されている： Ｒｕ” ” ＬＩＬ２Ｌ３ １〔式中、Ｌ
ｌおよびＬ２は同一または異なり、電荷移動単位（Ｃｈ
ａｒｇｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉ乞）を表わし、そ
してＬ３はまた基Ａ−Ｘで置換されてｉる電荷移動単位
を表わし、Ａは所望により、−８０Ｈ２−ＮＨ−１−ｓ
−−ｏ−−ｃｏｏ−または−Ｃｏ−ＮＨ−で置換されて
いてもよいアルキレン基を表わし、そしてＸはアルデヒ
ド、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオシアネート
基、ハロゲンまたはホスファイトあるいはホスフェート
基、またはホスホネートあるいはチオホスフェート基の
ような修飾ホスフェート基、あるいは他の適当な官能性
基を表わす〕。
電荷移動単位Ｌｌ ｓ Ｌ２およびり、は同一または異
なることができ、所望によジ置換されていてもよいビピ
リジル、バソフェナントロリン（ｂａｔｈｏｐｈｅ−ｎ
ａｎｔｈｒｏ１１Ωｅ）ま＆ｔｆベンズバソコエナント
ロリンを表わすことができる。
なることができ、所望によジ置換されていてもよいビピ
リジル、バソフェナントロリン（ｂａｔｈｏｐｈｅ−ｎ
ａｎｔｈｒｏ１１Ωｅ）ま＆ｔｆベンズバソコエナント
ロリンを表わすことができる。
電荷移動単位ＬｌおよびＬ２はスルホン酸基で置換され
ているのが望ましい。
ているのが望ましい。
アルキレン基Ａは好ましくは、最大で８個のＣ原子を有
する直鎖状または分枝鎖状のアルキレン基である。
する直鎖状または分枝鎖状のアルキレン基である。
特に好ましくは、Ａは−＜Ｃａ２）、−または−（ｃＨ
ｓ）ｔ−基である。
ｓ）ｔ−基である。
本発明に従い、適当に修飾されているＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列を使用することができ、アミノ修飾ＤＮＡまたは
ＲＮＡ配列は特に望ましい。
Ａ配列を使用することができ、アミノ修飾ＤＮＡまたは
ＲＮＡ配列は特に望ましい。
原則として、いずれか所望のＤＮＡまたはＲＮＡを式■
で示されるルテニウム複合体にカップリングさせること
ができるが、５′−末端におけるＤＮＡまたはＲＮＡの
共有結合が好ましい。
で示されるルテニウム複合体にカップリングさせること
ができるが、５′−末端におけるＤＮＡまたはＲＮＡの
共有結合が好ましい。
式Ｉで示されるルテニウム複合体はヨーロッパ特許出願
／１６８５．１１１３７７７．９ （公開鷹１７８４５
０）ｌＣ従い、あるいはその類似方法によυ製造するこ
とができる。
／１６８５．１１１３７７７．９ （公開鷹１７８４５
０）ｌＣ従い、あるいはその類似方法によυ製造するこ
とができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とのカップリングはそれ自体既
知の方法で行なう。修飾ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する
カップリング方法の一つは式Ｉで示されるルテニウム複
合体および修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を水溶性カルが
ジイミド誘導体で処理する、たと、ｔばＮ−シクロヘキ
シル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−力ルがジイミ
ド−メチル−１）−）ルエンスルホネートで処理するこ
とよ多なる。特に好適なカップリング剤は１，１，３．
３−テトラメチル−２−スクシンイミジルウロニウムテ
トラフルオロボラー）（１：１）であり、この化合物は
以下でｒ Ｔ８Ｕ Ｊと記する〔このｒ ’ｒｓＴＪ
Ｊは日本国特許出願公告／ｌ６１６６７５０／８６に記
載のとおシにして製造することができる〕。カップリン
グは好ましくは溶媒混合物、たとえばＤＭＩヘジオキサ
ンまたは水の混合物中で行なう。驚くべきことに、ＴＳ
Ｕによるカルボキシル官能基の活性化がまた、水の存在
の下で生じることが見い出された。
知の方法で行なう。修飾ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する
カップリング方法の一つは式Ｉで示されるルテニウム複
合体および修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を水溶性カルが
ジイミド誘導体で処理する、たと、ｔばＮ−シクロヘキ
シル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−力ルがジイミ
ド−メチル−１）−）ルエンスルホネートで処理するこ
とよ多なる。特に好適なカップリング剤は１，１，３．
３−テトラメチル−２−スクシンイミジルウロニウムテ
トラフルオロボラー）（１：１）であり、この化合物は
以下でｒ Ｔ８Ｕ Ｊと記する〔このｒ ’ｒｓＴＪ
Ｊは日本国特許出願公告／ｌ６１６６７５０／８６に記
載のとおシにして製造することができる〕。カップリン
グは好ましくは溶媒混合物、たとえばＤＭＩヘジオキサ
ンまたは水の混合物中で行なう。驚くべきことに、ＴＳ
Ｕによるカルボキシル官能基の活性化がまた、水の存在
の下で生じることが見い出された。
しかしながら、カップリングはまた、直接に、たとえば
ホスホジエステル結合を介して行なうことができ、この
結合はアセトニトリルまたは無水ピリジンなどの溶媒中
で生成される。直接カップリングさせるためには、ルテ
ニウム複合体をカップリングに適する形に、好ましくは
ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｏｒａｍｌｄｉｔｅ ）
または活性化さレタホスフエート官能体に変換する。
ホスホジエステル結合を介して行なうことができ、この
結合はアセトニトリルまたは無水ピリジンなどの溶媒中
で生成される。直接カップリングさせるためには、ルテ
ニウム複合体をカップリングに適する形に、好ましくは
ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｏｒａｍｌｄｉｔｅ ）
または活性化さレタホスフエート官能体に変換する。
本発明によるルテニウム複合化合物は相補的ＤＮＡまた
はＲＮＡ配列の検出に格別に適している。
はＲＮＡ配列の検出に格別に適している。
この検出は既知のハイブリッド形成技法に従い行なうこ
とができる。標識分子として働く、式Ｉで示されるルテ
ニウム複合体の検出は高感度の螢光技法に従い行なう、
たとえばＤＴＯ８２６２８１５８に記載されているよう
な時間分解螢光法（ｔｉｍｅ−ｒｅａｏｌｖｅｄ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）は特に
好適である。さらにまた、この時間分解螢光法の詳細は
前記のヨーロッパ特許出願４８５．１１１３７７７．９
（公告／ｌ６１７８４５０）に記載されている。
とができる。標識分子として働く、式Ｉで示されるルテ
ニウム複合体の検出は高感度の螢光技法に従い行なう、
たとえばＤＴＯ８２６２８１５８に記載されているよう
な時間分解螢光法（ｔｉｍｅ−ｒｅａｏｌｖｅｄ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）は特に
好適である。さらにまた、この時間分解螢光法の詳細は
前記のヨーロッパ特許出願４８５．１１１３７７７．９
（公告／ｌ６１７８４５０）に記載されている。
さらにまた、本発明によるルテニウム複合化合物はヌク
レオチドの配列決定に特に適している。
レオチドの配列決定に特に適している。
驚くべきことに、式Ｉで示されるルテニウム複合体は、
これらをＤＮＡまたはＲＮＡ配列にカップリングさせた
場合でさえも、その優れた崩壊時間が実質的に変えられ
ないことが見い出された。この優れた崩壊時間はハイブ
リッド形成技法においてばか９でなく、またヌクレオチ
ドの配列決定においても示される。さらにまた、この崩
壊時間は、該ルテニウム複合化合物を一本鎖のＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリッド形成させた場合にも、実質的
に変化しない。
これらをＤＮＡまたはＲＮＡ配列にカップリングさせた
場合でさえも、その優れた崩壊時間が実質的に変えられ
ないことが見い出された。この優れた崩壊時間はハイブ
リッド形成技法においてばか９でなく、またヌクレオチ
ドの配列決定においても示される。さらにまた、この崩
壊時間は、該ルテニウム複合化合物を一本鎖のＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリッド形成させた場合にも、実質的
に変化しない。
本発明のルテニウム複合化合物の螢光性はｏ２、−およ
び温度に対して感受性である。
び温度に対して感受性である。
たとえば、界面活性剤および酸化防止剤を使用すると、
ＮＨ，ＰＦ、またはＮＨ，ＢＦ’、のような塩を添加し
ても、螢光測定に好ましいことが見い出された。
ＮＨ，ＰＦ、またはＮＨ，ＢＦ’、のような塩を添加し
ても、螢光測定に好ましいことが見い出された。
モラーつの好ましい点はチオグリセロール−フタル酸溶
液の使用にある。これらの好ましい溶液を使用した場合
に、Ｈ２Ｏ中におけるよシも長い崩壊時間τがこの溶液
にＮ２またはＡｒを通気する必要なく、測定されうろこ
とがわかった。この崩壊時間τは良好に測定することが
でき、測定条件を特徴づけることができるパラメーター
である。種々の溶液の崩壊時間を次表に例として示す。
液の使用にある。これらの好ましい溶液を使用した場合
に、Ｈ２Ｏ中におけるよシも長い崩壊時間τがこの溶液
にＮ２またはＡｒを通気する必要なく、測定されうろこ
とがわかった。この崩壊時間τは良好に測定することが
でき、測定条件を特徴づけることができるパラメーター
である。種々の溶液の崩壊時間を次表に例として示す。
ＰＢＳ ＝ ！Ｊン酸塩緩衝塩類溶液（リン酸塩緩衝塩
化ナトリウム溶液） １２−ＤＡＰｓ＝ツメチルアメチニオプロパンスルホネ
ートｃＨＡＰｓ ＝ ３− （（５−クロラミドグロ
ビル）−ジメチル−アンモニオ） −１−フロパンスル
ホネート ＤＤＰＣ＝ドデシルホスホリコリン β−ＯＧ ＝オクチルーβ−Ｄ−グルコピラノシドＳＤ
Ｓ ＝ドデシル硫酸ナトリウムしかしながら、この
測定は溶液中でばか）でなく、また固体相においても行
なうことができることは明白である。
化ナトリウム溶液） １２−ＤＡＰｓ＝ツメチルアメチニオプロパンスルホネ
ートｃＨＡＰｓ ＝ ３− （（５−クロラミドグロ
ビル）−ジメチル−アンモニオ） −１−フロパンスル
ホネート ＤＤＰＣ＝ドデシルホスホリコリン β−ＯＧ ＝オクチルーβ−Ｄ−グルコピラノシドＳＤ
Ｓ ＝ドデシル硫酸ナトリウムしかしながら、この
測定は溶液中でばか）でなく、また固体相においても行
なうことができることは明白である。
次側は本発明を説明するものである。
例
５′−アミノ−５′−デソキシチミジンは公知方法、た
とえばＬ Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｍ、 ５ｅｋｉｎｅ、
Ｔ、 Ｈａｔａ 、 Ｊ。
とえばＬ Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｍ、 ５ｅｋｉｎｅ、
Ｔ、 Ｈａｔａ 、 Ｊ。
Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、 Ｐｅｒｋｌｎ １．１ （１９
８０年）、６０６頁またはり、Ｅ、 ＧｉｂＭ、 Ｌ、
Ｅ、 Ｏｒｇｅｌ 、Ｊ、 Ｃａｒｂｏｈｙ−ｄｒａ、
Ｆｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏ（１０）ｄｅａ、Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｌｄｅｓ、３ 、 ５ ＆ ６（１９７６年）、３１５
頁により、展進することができる。
８０年）、６０６頁またはり、Ｅ、 ＧｉｂＭ、 Ｌ、
Ｅ、 Ｏｒｇｅｌ 、Ｊ、 Ｃａｒｂｏｈｙ−ｄｒａ、
Ｆｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏ（１０）ｄｅａ、Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｌｄｅｓ、３ 、 ５ ＆ ６（１９７６年）、３１５
頁により、展進することができる。
例 １
５′−モノメトキシトリチルアミノ−５′−デツキ５′
−アミノ−５′−デソキシチミジン２５ ｍ ｍｏｌ＜
６．０３ ｆｉ ）を無水ピリジン中に取り入れた後
に、２回濃縮させた。次いで、無水ピリシン１５０ｄ中
に溶解し、４−ジメチルアミノ−ピリジン１６．７ ｍ
ｍｏｌ（２，（１４）１）、トリエチルアミン１５．
７ ｍ ｍｏｌ （２−３３１７： １．７０ 、ｌｉ
’ ）およびモノメトキシトリチルクロライド６０ ｍ
ｍｏｌで処理し、室温で攪拌した。２時間後に、メタ
ノール２０＋１１１を加え、さらに１５分後に、混合物
を飽和重炭酸ナトリウム溶液２５ ＯＴＲｔ中に注ぎ入
れ、各回２５０ゴのクロロホルムで４回抽出した。集め
た有機相をＮａ２８（１４）上で乾燥させ、乾燥剤から
濾別した後に、濃縮した。
−アミノ−５′−デソキシチミジン２５ ｍ ｍｏｌ＜
６．０３ ｆｉ ）を無水ピリジン中に取り入れた後
に、２回濃縮させた。次いで、無水ピリシン１５０ｄ中
に溶解し、４−ジメチルアミノ−ピリジン１６．７ ｍ
ｍｏｌ（２，（１４）１）、トリエチルアミン１５．
７ ｍ ｍｏｌ （２−３３１７： １．７０ 、ｌｉ
’ ）およびモノメトキシトリチルクロライド６０ ｍ
ｍｏｌで処理し、室温で攪拌した。２時間後に、メタ
ノール２０＋１１１を加え、さらに１５分後に、混合物
を飽和重炭酸ナトリウム溶液２５ ＯＴＲｔ中に注ぎ入
れ、各回２５０ゴのクロロホルムで４回抽出した。集め
た有機相をＮａ２８（１４）上で乾燥させ、乾燥剤から
濾別した後に、濃縮した。
残留物をシリカゾル２００ｇ上で短いカラムクロマトグ
ラフィによって分離した。純粋な生成物の留分を採取し
、濃縮した。クロロホルム２０ｍＡ！およびトリエチル
アミン６−に溶解した後に、残留物をｎ−ペンタン２ノ
中に滴下して導入することにより再沈殿させた。沈殿を
採取し、乾燥させ、純粋な生成物６．２ ｇ（４８，３
％）を得た。
ラフィによって分離した。純粋な生成物の留分を採取し
、濃縮した。クロロホルム２０ｍＡ！およびトリエチル
アミン６−に溶解した後に、残留物をｎ−ペンタン２ノ
中に滴下して導入することにより再沈殿させた。沈殿を
採取し、乾燥させ、純粋な生成物６．２ ｇ（４８，３
％）を得た。
列 ２
５′−モノメトキシトリチルアミノ−５′−デソキシチ
ミジン３’−０−（２−シアノエチルＮ、Ｎ−５′−モ
ノメトキシトリチルアミノ−５′−デンキシチミジン４
ｍｍｏｌ （２，０１９）およびぎス（ジインプロピ
ルアンモニウム）テトラゾリド５ ｍｍｏｌ（０，５５
、！ｉ’ ）を高減圧の下で一夜にわたシ乾燥させた。
ミジン３’−０−（２−シアノエチルＮ、Ｎ−５′−モ
ノメトキシトリチルアミノ−５′−デンキシチミジン４
ｍｍｏｌ （２，０１９）およびぎス（ジインプロピ
ルアンモニウム）テトラゾリド５ ｍｍｏｌ（０，５５
、！ｉ’ ）を高減圧の下で一夜にわたシ乾燥させた。
翌日に、４′−モノメトキシトリチルアミノ−５′−デ
ノキシチミジンを無水ＣＨ２Ｃｊ２ ＜５ Ｑ ｍｌ中
にとシ、上記テトラゾリドで、およびビス−（ジイソプ
ロピルアミノ）−シアノエトキシホスフィン７−９ ｍ
ｍｏｌ （２−６０、！ｉ’ ）で処理した。１時間後
に、混合物を抱卵重炭酸す） ＋）ラム溶液７０プ中に
注ぎ入れた。混合物をＣＨ２Ｃｊ２で抽出した。集めた
有機相を飽和Ｎａ（Ｊ纏液５０ｄで２回、抽出し、有機
相を濃縮させた。残留物をＣＦＩ２Ｃ１２２０−に溶解
し、次いでｎ−ペンタン７００ゴ中に滴下して加えるこ
とにより再沈殿させた。−夜にわた夛乾燥させた後に、
生成物２．８ｇが無色粉末の形態で得られた（９８％）
。
ノキシチミジンを無水ＣＨ２Ｃｊ２ ＜５ Ｑ ｍｌ中
にとシ、上記テトラゾリドで、およびビス−（ジイソプ
ロピルアミノ）−シアノエトキシホスフィン７−９ ｍ
ｍｏｌ （２−６０、！ｉ’ ）で処理した。１時間後
に、混合物を抱卵重炭酸す） ＋）ラム溶液７０プ中に
注ぎ入れた。混合物をＣＨ２Ｃｊ２で抽出した。集めた
有機相を飽和Ｎａ（Ｊ纏液５０ｄで２回、抽出し、有機
相を濃縮させた。残留物をＣＦＩ２Ｃ１２２０−に溶解
し、次いでｎ−ペンタン７００ゴ中に滴下して加えるこ
とにより再沈殿させた。−夜にわた夛乾燥させた後に、
生成物２．８ｇが無色粉末の形態で得られた（９８％）
。
例 ６
５′−アミノ−ｄＣＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
Ｇ〕（３ａ）の合成 この配列の最後のビルディングブロックまでの合成はす
でに公開されている方法［Ｗ、Ｂａｎｎｗａｒｔｈ。
Ｇ〕（３ａ）の合成 この配列の最後のビルディングブロックまでの合成はす
でに公開されている方法［Ｗ、Ｂａｎｎｗａｒｔｈ。
Ｐ、 ＩａｉｚａによるＤＮＡ５．５（１９８６年）、
４１６頁］に従い、固体キャリヤ物質（６ｍｍｏｌ ）
として一定線孔を有するガラス上で行なった。
４１６頁］に従い、固体キャリヤ物質（６ｍｍｏｌ ）
として一定線孔を有するガラス上で行なった。
合成された１６量体からジメトキシ） ＩＪチル保護基
を脱離させた後の、５′−モノメトキシトリチルアミノ
−５′−デソキシチミジン３’−０−（２−シアノエチ
ルＮ、Ｎ−ゾイソプロビルホスホラミダイト）ｔ−慣用
の反応サイクルにおける最後の縮合の丸めのビルディン
グゾロツクとして使用した。保護基の脱離後に、粗製混
合物をポリアクリルアミドデル電気泳動によ）、および
逆相クロマトグラフィにより、検査した。この検査は粗
！Ａ混合物中に主生成物（〜６０％）として所望の５１
−アミノ−ｄ（ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＩ
が存在することを示した。粗製混合物（４９００Ｄ、２
（５０ｍｍ ） ｔ−２回透析しＣＫＣｌに対して）、
この形で相応する活性化Ｒｕ複合体４ａ〜４ｄとのカッ
プリング反応に使用した。
を脱離させた後の、５′−モノメトキシトリチルアミノ
−５′−デソキシチミジン３’−０−（２−シアノエチ
ルＮ、Ｎ−ゾイソプロビルホスホラミダイト）ｔ−慣用
の反応サイクルにおける最後の縮合の丸めのビルディン
グゾロツクとして使用した。保護基の脱離後に、粗製混
合物をポリアクリルアミドデル電気泳動によ）、および
逆相クロマトグラフィにより、検査した。この検査は粗
！Ａ混合物中に主生成物（〜６０％）として所望の５１
−アミノ−ｄ（ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＩ
が存在することを示した。粗製混合物（４９００Ｄ、２
（５０ｍｍ ） ｔ−２回透析しＣＫＣｌに対して）、
この形で相応する活性化Ｒｕ複合体４ａ〜４ｄとのカッ
プリング反応に使用した。
例 ４
５′−７ミノーｄ ［ＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣ（
）ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ”］この合成は３ａの場合と同
様に行なうが、この工程では官能性にされたキャリヤ物
質を使用した。
）ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ”］この合成は３ａの場合と同
様に行なうが、この工程では官能性にされたキャリヤ物
質を使用した。
保護基を脱離させ、ＫＣｌに対して透析した後に、粗製
５ ｂ ７１０ Ｄ （２６０ｎｍ ）が得られ、こ
の生成物はこの形でカップリング反応に使用した。
５ ｂ ７１０ Ｄ （２６０ｎｍ ）が得られ、こ
の生成物はこの形でカップリング反応に使用した。
例 ５
５′−アミノ−ｄ ［ＴＴＴＴＣＴ（）ＧＡＴＣＣＣＴ
（）ＡＧＣＣＴＧ’ｒＴＣ）（３Ｃ）の合成 この合成は例３と同様に行なうが、官能性にされたキャ
リヤ物質１０μｍｏｌを使用した。保護基の脱離および
ＫＣｊに対する透析の後に、粗製５Ｃ１７０００Ｄ （
２６０ｎｍ ） を得た。コノ生成物はこの形でカップ
リング反応に使用した。
（）ＡＧＣＣＴＧ’ｒＴＣ）（３Ｃ）の合成 この合成は例３と同様に行なうが、官能性にされたキャ
リヤ物質１０μｍｏｌを使用した。保護基の脱離および
ＫＣｊに対する透析の後に、粗製５Ｃ１７０００Ｄ （
２６０ｎｍ ） を得た。コノ生成物はこの形でカップ
リング反応に使用した。
例 ６
５′−アミノプロピル−修飾ＤＮＡ （３ｄ）の合成配
列ｄ（Ｔ’ｒＴＴＣＴ（）ＧＡＴＣＣＣＴ（）ＡＣ）Ｃ
ＣＴＧＴＴＣ） Ｃ）合成は、すでに公開されている方
法（Ｗ、 Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、 Ｐ。
列ｄ（Ｔ’ｒＴＴＣＴ（）ＧＡＴＣＣＣＴ（）ＡＣ）Ｃ
ＣＴＧＴＴＣ） Ｃ）合成は、すでに公開されている方
法（Ｗ、 Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、 Ｐ。
工ａｉｚａによるＤＮＡ５．５ （１９Ｂ６年）４１３
頁）に従い固体中ヤリャ物質として、一定の細孔を有す
るガラス上で行なった。
頁）に従い固体中ヤリャ物質として、一定の細孔を有す
るガラス上で行なった。
ジメトキシトリチル保護基の脱離後の（３−ｐ−メトキ
シトリチルアミノデロポキシ）（２−シアノエトキシ）
ジイソプロピルアミノホスフィンを慣用の反応サイクル
でビルディングブロックとして使用した（このビルディ
ングブロックはβアラニンベンジルエステルから三工程
合成により高収率で調製された）。
シトリチルアミノデロポキシ）（２−シアノエトキシ）
ジイソプロピルアミノホスフィンを慣用の反応サイクル
でビルディングブロックとして使用した（このビルディ
ングブロックはβアラニンベンジルエステルから三工程
合成により高収率で調製された）。
保護基の脱離後に、粗′Ｒ混合物をポリアクリルアミド
デル電気泳動により検査し、塩化カリウムに対して２回
透析し、この形で、複合体５ａとのカップリング反応に
使用した。
デル電気泳動により検査し、塩化カリウムに対して２回
透析し、この形で、複合体５ａとのカップリング反応に
使用した。
例 ７
Ｒｕ（ｂａｔ、ｈｏ〕２（ｂａｔｈｏ（ｃａ２） ５ｃ
ｏｏＨ）ａ１□（４ａ）（トリフェニルシリルクロライ
ド上で蒸留した）ＤＭＦ ２−中のＲｕ複合体４ａ ５
０ μｍｏｌ （６４，２ｖ９）を、Ｃａ（Ｊ管を備え
た１０プ丸底フラスコ中に入れた。活性化剤（ＴＡＵ）
５５ μｍｏｌ （１８−ＯＷ ）およびジインプロ
ピルエチルアミン（Ｈ’ｌｊｎｉｇ塩基）５５μｍｏｌ
（７，１３９ｓ ９．５４ ｐｇ ）を室温で加え、
混合物を２時間攪拌した。ＤＭＦを減圧の下で高められ
た温度で除去し、残留物をジエチルエーテル中に浸した
。小型フリットに通して濾過した後に、残留物ヲジエチ
ルエーテルで数回、すすぎ、次いで高減圧の下で乾燥さ
せ、これにより５ａ６３ｒＲ９を淡赤色粉末として得た
（ ｎｒ＝ｏ、５６ ；シリカゲルＨＰＴＬＣ板：溶出
：初めに、ジエチルエーテル、次いでクロロホルム／メ
タノール／水（６５／２５／４容量／容量）〕。５ａは
この形でカップリング反応に使用することができるが、
５ａはまた、シリカゲル上で、溶出液として増加する割
合のエタノールとＣＨ（’＃３とを使用する短いカラム
クロマトグラフィによってさらに精製することができる
ことが示された（ Ｂ、Ｊ、 Ｈｕｎｔ、 Ｗ、 Ｒｌ
ｇｂｙによるＣｈｅｍ、 工ｎｄ、 （１９６７年）、
１８６８頁〕。
ｏｏＨ）ａ１□（４ａ）（トリフェニルシリルクロライ
ド上で蒸留した）ＤＭＦ ２−中のＲｕ複合体４ａ ５
０ μｍｏｌ （６４，２ｖ９）を、Ｃａ（Ｊ管を備え
た１０プ丸底フラスコ中に入れた。活性化剤（ＴＡＵ）
５５ μｍｏｌ （１８−ＯＷ ）およびジインプロ
ピルエチルアミン（Ｈ’ｌｊｎｉｇ塩基）５５μｍｏｌ
（７，１３９ｓ ９．５４ ｐｇ ）を室温で加え、
混合物を２時間攪拌した。ＤＭＦを減圧の下で高められ
た温度で除去し、残留物をジエチルエーテル中に浸した
。小型フリットに通して濾過した後に、残留物ヲジエチ
ルエーテルで数回、すすぎ、次いで高減圧の下で乾燥さ
せ、これにより５ａ６３ｒＲ９を淡赤色粉末として得た
（ ｎｒ＝ｏ、５６ ；シリカゲルＨＰＴＬＣ板：溶出
：初めに、ジエチルエーテル、次いでクロロホルム／メ
タノール／水（６５／２５／４容量／容量）〕。５ａは
この形でカップリング反応に使用することができるが、
５ａはまた、シリカゲル上で、溶出液として増加する割
合のエタノールとＣＨ（’＃３とを使用する短いカラム
クロマトグラフィによってさらに精製することができる
ことが示された（ Ｂ、Ｊ、 Ｈｕｎｔ、 Ｗ、 Ｒｌ
ｇｂｙによるＣｈｅｍ、 工ｎｄ、 （１９６７年）、
１８６８頁〕。
確認＝ＩＨ−耶、ＩＲ。
例８
Ｒｕ［ｂａ ｔｈｏ］２（ｂａ ｔｈｏ （ＣＨ２）
４ＣＯＯＨ］Ｃ１２（４ｂ）５ｂの製造は５ａの場合と
同様に行なりが、この場合には、Ｈ’ｕｚｉｇ塩基１０
０ 、ｕｍｏｌを使用し、そして反応はＤＭＦ １．５
ｄ中で６時間行なった。仕上げ処理は例６と同様に行な
い、５ｔ１０５＊（７６，９％）を得た。
４ＣＯＯＨ］Ｃ１２（４ｂ）５ｂの製造は５ａの場合と
同様に行なりが、この場合には、Ｈ’ｕｚｉｇ塩基１０
０ 、ｕｍｏｌを使用し、そして反応はＤＭＦ １．５
ｄ中で６時間行なった。仕上げ処理は例６と同様に行な
い、５ｔ１０５＊（７６，９％）を得た。
この生成物のうちの少量をまた、シリカゲル上でＣＨＣ
ｊ ３中のエタノールの増加勾配を用いる短いカラムク
ロマトグラフィによりさらに精製した。
ｊ ３中のエタノールの増加勾配を用いる短いカラムク
ロマトグラフィによりさらに精製した。
同定：ＩＨ−虱但、ＩＲ。
例 ９
Ｒｕ（ｂａｂｈｏ）２［ｂｅｎｚｂａｔｈｏ（ＣＨ２）
４ＣＯＯＨ″］Ｃ１ｔ Ｃ４０）比から始めて、ｆＰＪ
８と同様に行なった。反応時間は２時間であった。仕上
げ処理は例７と同様に行なった。５Ｃの収量は定量的で
あった。少量の５Ｃをシリカゾル上で溶出液としてＣＨ
Ｃｈ中のエタノールの増加勾配を用いる短いカラムクロ
マトグラフィによりさらにｉｉｖ製した。
４ＣＯＯＨ″］Ｃ１ｔ Ｃ４０）比から始めて、ｆＰＪ
８と同様に行なった。反応時間は２時間であった。仕上
げ処理は例７と同様に行なった。５Ｃの収量は定量的で
あった。少量の５Ｃをシリカゾル上で溶出液としてＣＨ
Ｃｈ中のエタノールの増加勾配を用いる短いカラムクロ
マトグラフィによりさらにｉｉｖ製した。
分析：ＩＨ−跡、ＩＲ。
例１０
Ｒｕ（ｂａｔｈｏ ２８０３Ｎａ）ｓ（ｂａｔｈｏ（Ｃ
Ｈ２）３ＣＯＯＨ″１ｃ１４ （４ｄ）４ ｄ ３０
μｍｏｌ （５１ｒＩ＆９） ｔ−ＤＭＦ ２ ｔｎｌ
ｓｐよびＨ２Ｏ０，２−の混合物中で、Ｈｕｎ１ｇ塩
基７ｏμｍ０１（５，９１１ｆｌ）の存在の下に：、
ＴＳＵ ７０ μｎｏｎ （２５，０Ｗ９）と反応させ
た。１時間後に、薄層クロマトグラムは完全な反応を示
した。溶媒を回転蒸発器上で濃縮し、残留物をジエチル
エーテル中で温浸し、引続いて、吸引の下で濾別し、ジ
エチルエーテルで数回すすぎ、次いで乾燥させた。５ｄ
の収量は定量的であった。
Ｈ２）３ＣＯＯＨ″１ｃ１４ （４ｄ）４ ｄ ３０
μｍｏｌ （５１ｒＩ＆９） ｔ−ＤＭＦ ２ ｔｎｌ
ｓｐよびＨ２Ｏ０，２−の混合物中で、Ｈｕｎ１ｇ塩
基７ｏμｍ０１（５，９１１ｆｌ）の存在の下に：、
ＴＳＵ ７０ μｎｏｎ （２５，０Ｗ９）と反応させ
た。１時間後に、薄層クロマトグラムは完全な反応を示
した。溶媒を回転蒸発器上で濃縮し、残留物をジエチル
エーテル中で温浸し、引続いて、吸引の下で濾別し、ジ
エチルエーテルで数回すすぎ、次いで乾燥させた。５ｄ
の収量は定量的であった。
同定：ＩＲ。
この生成物はこの形で、カップリング反応に使用した。
例１１
セトニトリル溶出勾配を用いるＨＰＬＣにょシ精製し、
このＨＰＬＣにおいて、ポリアクリルアミドデル電気泳
動によ）また純粋である形で６ａを得た。
このＨＰＬＣにおいて、ポリアクリルアミドデル電気泳
動によ）また純粋である形で６ａを得た。
例１２
（６ａ）
ＫＣｊに対して透析した、粗製５′−アミノーＤＮＡ断
片３ａ４００Ｄ単位（２６０ｎｍ ）をＤＭＥＦ２００
μｊ１ジオキサン２００μｌおよびＨ，０２００μｌｏ
ａ合物中に取）入れ、ここに５ａ６．［ｌ■（４，６９
μｍｏｌ ）およびジイソプロピルアミン２０μｍｏｌ
（５−４μｊ）を加え、混合物を暗所で、室温におい
て、２４時間ゆつくプ振盪した。溶媒をスビーｒバック
コンセントレータ−（８ｐｅｅｄＭａｃ Ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｏｒ ）で除去した。残留物を少量の水中に取
シ入れ、過剰の複合体５ ａ ｔＣＨＣｚ３によりそこ
から抽出した。水性相を逆相シリカゾルカラムで、溶出
液として０．１ Ｍ ）リエチルアンモニウムアセテー
）（ｐＨ７，０）中の５〜９０％ア２７０ Ｄ Ｃ２６
０ｎｍ ）を、５ ｂ ２−５４ μｍｏｌ（３，２！
ｌｌ５Ｆ）（これは短いカラムクロマトグラフィにより
ｎ製した）およびＨ’：ｎ４ｇ塩基１０ μｍｏｌ（１
，７ｐｇ ） （！：、ＤＭＦ １００ ｐｇ、 ９オ
キｔｙ １００μ！およびＨ２Ｏ１００μＩの混合物中
で反応させた。混合物は暗所において、室温で１４２時
間ゆつくＩＨまぜた。６ｂの単離はｃ−１８逆相カラム
上において、溶出液として０．１ Ｍ ）リエチルアン
モニウムアセテート（ｐｉ（７，０”）中の５〜９゜チ
アセトニトリル勾配を用いるＨＰＬＣ分離によって、直
接に行なった。生成物はゲルクロマトグラフィにより均
質であった。
片３ａ４００Ｄ単位（２６０ｎｍ ）をＤＭＥＦ２００
μｊ１ジオキサン２００μｌおよびＨ，０２００μｌｏ
ａ合物中に取）入れ、ここに５ａ６．［ｌ■（４，６９
μｍｏｌ ）およびジイソプロピルアミン２０μｍｏｌ
（５−４μｊ）を加え、混合物を暗所で、室温におい
て、２４時間ゆつくプ振盪した。溶媒をスビーｒバック
コンセントレータ−（８ｐｅｅｄＭａｃ Ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｏｒ ）で除去した。残留物を少量の水中に取
シ入れ、過剰の複合体５ ａ ｔＣＨＣｚ３によりそこ
から抽出した。水性相を逆相シリカゾルカラムで、溶出
液として０．１ Ｍ ）リエチルアンモニウムアセテー
）（ｐＨ７，０）中の５〜９０％ア２７０ Ｄ Ｃ２６
０ｎｍ ）を、５ ｂ ２−５４ μｍｏｌ（３，２！
ｌｌ５Ｆ）（これは短いカラムクロマトグラフィにより
ｎ製した）およびＨ’：ｎ４ｇ塩基１０ μｍｏｌ（１
，７ｐｇ ） （！：、ＤＭＦ １００ ｐｇ、 ９オ
キｔｙ １００μ！およびＨ２Ｏ１００μＩの混合物中
で反応させた。混合物は暗所において、室温で１４２時
間ゆつくＩＨまぜた。６ｂの単離はｃ−１８逆相カラム
上において、溶出液として０．１ Ｍ ）リエチルアン
モニウムアセテート（ｐｉ（７，０”）中の５〜９゜チ
アセトニトリル勾配を用いるＨＰＬＣ分離によって、直
接に行なった。生成物はゲルクロマトグラフィにより均
質であった。
この反応は例１２と同様にして、同一反応剤およびそれ
ぞれ同一の溶媒量を使用して行なった。
ぞれ同一の溶媒量を使用して行なった。
６ＣＯ仕上げ処理はまた、同様に行なうが、０．１Ｍト
リエチルアンモニウムアセテート（Ｐ）１７）中の６０
〜９０％アセトニトリル勾配を使用した。
リエチルアンモニウムアセテート（Ｐ）１７）中の６０
〜９０％アセトニトリル勾配を使用した。
生成物はデルクロマトグラフィにより均質であった。
例１４
３ａ ５５０ＤをＤＭＦ ２００μ！、ジオキサン２
００μ！およびＨ２Ｏ２００μｔの混合物中で、Ｈｕｎ
ｉ ｇ塩基２０ μｍｏｌ （３，４μｇ ）の存在
の下に、前記例に記載のように、５ｄ ５μｍｏｌ
（８，９４１！９）と反応させた。９６時間の反応時間
の後に、６ｄを前記したＨＰＬＣにより単離した。この
生成物はゲルクロマトグラフィにより均質であった。
００μ！およびＨ２Ｏ２００μｔの混合物中で、Ｈｕｎ
ｉ ｇ塩基２０ μｍｏｌ （３，４μｇ ）の存在
の下に、前記例に記載のように、５ｄ ５μｍｏｌ
（８，９４１！９）と反応させた。９６時間の反応時間
の後に、６ｄを前記したＨＰＬＣにより単離した。この
生成物はゲルクロマトグラフィにより均質であった。
例１５
３ｂ ２０ ０ＤをＤＭＦ １００μｊ１ジオキサン
１００μｌおよびＨ２Ｏ１００μｊの混合物中でＨｉｉ
ｎｉｇ塩基１ ［１μｔ （１，７ｔｘｔ）の存在の下
に、前記例に記載のように、活性化Ｒｕ複合体５ ａ
２．３２μｍｏｌ （３−２”？ ）と反応させた。２
４時間の反応時間の後に、生成物６ｅを逆相ＨＰＬＣに
より単離した。
１００μｌおよびＨ２Ｏ１００μｊの混合物中でＨｉｉ
ｎｉｇ塩基１ ［１μｔ （１，７ｔｘｔ）の存在の下
に、前記例に記載のように、活性化Ｒｕ複合体５ ａ
２．３２μｍｏｌ （３−２”？ ）と反応させた。２
４時間の反応時間の後に、生成物６ｅを逆相ＨＰＬＣに
より単離した。
例１６
３ｃ４ＱＯＤを前記したように、ＤＭＦ ２００μｌジ
オキサン２００μｌおよびＨ２Ｏ２００μｌよシなる混
合物中で、Ｈ’ｕｎｌ ｇ塩基２０μｍｏｌ （３，４
μりの存在の下に、光を排除して、活性化Ｒｕ複合体５
ａ６．４η（４，６５μｍｏｌ ）と２４時間、反応さ
せた。生成物６ｆの単離は前記したように、逆転相ＨＰ
ＬＣによって行なった。
オキサン２００μｌおよびＨ２Ｏ２００μｌよシなる混
合物中で、Ｈ’ｕｎｌ ｇ塩基２０μｍｏｌ （３，４
μりの存在の下に、光を排除して、活性化Ｒｕ複合体５
ａ６．４η（４，６５μｍｏｌ ）と２４時間、反応さ
せた。生成物６ｆの単離は前記したように、逆転相ＨＰ
ＬＣによって行なった。
例１７
５ａと３ｄとのカップリング
５ａ ＋ ３ｄ→６ｇ
塩化カリウムに対して透析した、粗製の６ｄ１００Ｄを
、ＤＭＦ ５０μｊ１ジオキサン５０μ！およびＨ２Ｏ
５０μｌよシなる混合物中で、Ｈｕｎｉｇ塩基０．８５
μｔｃ５μｍ０１）の存在の下で、暗所において、５
ａ １．６Ｔｎ９（１，１７μｍｏｌ ） （これは短
いカラムクロマトグラフィによって精製した）と１６８
時間反応させた。粗混合物を引続いてスピードバックコ
ンセントレータ−で濃縮した。残留物を各回２００μｊ
のメチレンクロライド中に２回温浸し、各回毎に、残留
物を遠心分離した。残留物をＤＭＦ １００μ！および
水１００μ！中に取り入れる七、完全な溶液が得られた
。これから、Ｃ−１８逆相カラム上において、溶出液と
して０．１Ｍ ） ＩＪエチルアンモニウムアセテ−）
（−７）中のアセトニトリル勾配を使用するＨＰＬＣに
より、所望のカップリング生成物が純粋な形で得られた
。
、ＤＭＦ ５０μｊ１ジオキサン５０μ！およびＨ２Ｏ
５０μｌよシなる混合物中で、Ｈｕｎｉｇ塩基０．８５
μｔｃ５μｍ０１）の存在の下で、暗所において、５
ａ １．６Ｔｎ９（１，１７μｍｏｌ ） （これは短
いカラムクロマトグラフィによって精製した）と１６８
時間反応させた。粗混合物を引続いてスピードバックコ
ンセントレータ−で濃縮した。残留物を各回２００μｊ
のメチレンクロライド中に２回温浸し、各回毎に、残留
物を遠心分離した。残留物をＤＭＦ １００μ！および
水１００μ！中に取り入れる七、完全な溶液が得られた
。これから、Ｃ−１８逆相カラム上において、溶出液と
して０．１Ｍ ） ＩＪエチルアンモニウムアセテ−）
（−７）中のアセトニトリル勾配を使用するＨＰＬＣに
より、所望のカップリング生成物が純粋な形で得られた
。
例１８
その場における５ａの活性化およびΣ」工とのカップリ
ングによる６ａの生成 ５ ａ ５ μｍｏｌ （６−４”？ ）をＤＭＦ
２００ μｍ％ジオキサン２００μ！およびＨ，０１０
０μｌの混合物中に取シ入れた。ＴＡＵ １０ μｍｏ
ｌ （３，６”９ ）およびＨ’ｕｎｉｇ塩基２０ μ
ｍｏｌ （３，４μりを添加した後に、反応混合物を１
時間、僅かに振夛まぜ、次いで粗製の透析した３ａ
３２０Ｄに加え、光を排除し１、僅かに振）まぜながら
、２２時間反応させた。引続く精製および単離は例１０
と同様に行なつた。
ングによる６ａの生成 ５ ａ ５ μｍｏｌ （６−４”？ ）をＤＭＦ
２００ μｍ％ジオキサン２００μ！およびＨ，０１０
０μｌの混合物中に取シ入れた。ＴＡＵ １０ μｍｏ
ｌ （３，６”９ ）およびＨ’ｕｎｉｇ塩基２０ μ
ｍｏｌ （３，４μりを添加した後に、反応混合物を１
時間、僅かに振夛まぜ、次いで粗製の透析した３ａ
３２０Ｄに加え、光を排除し１、僅かに振）まぜながら
、２２時間反応させた。引続く精製および単離は例１０
と同様に行なつた。
例１９
Ｒｕ複合体のホスホジエステル結合を介しての結合
ａ）キャリヤ物質２００ｒｎ９（７，３μｍ０１）から
出発して、次の配列ｄ （” ＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡ
ＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣ：５）を常法により合成し
、キャリヤ物質５■を次いでここからとシ出した。５′
−末端のＤＭＴ保護基をジクロロ酢酸（３１によ）分離
した後に、アセトニトリルで除去した。これと平行して
、Ｒｕ複合体のホスホラミダイトを次のとおシにしてそ
の場で製造した： Ｒｕ（ｂａｔ＝ｈ０）２（ｂａｔｈ
ｏ（ＣＨ２）５０Ｈ’１Ｃｊ２２５つた。この溶液をジ
イソプロピルアンモニウムテトラゾリド５．１■（３０
μｍｏｌ ）で、およびビス−（ジイソプロピルアミノ
）−β−シアノエトキシ−ホスフィン６ ”？ （２０
μｍｏｌ ）含有１ｆｒ液０．１−で処理した。３時間
の反応時間の後に１この混合物を、保護された形の５′
−ヒドロキシル官能基までの上記配列を有する乾燥キャ
リヤ物質に加えた。０．４８ Ｍテトラゾールアセトニ
トリル溶液０．７ｄを加えた後に、混合物を１０分間反
応させた。引続いて、キャリヤ物質を反応混合物から分
離し、次いでＴＨＦ ／ルチジン／水（８Ｃ１Ｏ／２０
０／２０：容量／容量）混合物中の０．２Ｍヨウ素溶液
と反応させて、酸化した。この溶液を分離した後に１キ
ヤリヤ物質をアセトニトリルで、およびエーテルで洗浄
し、次いで乾燥させた。
出発して、次の配列ｄ （” ＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡ
ＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣ：５）を常法により合成し
、キャリヤ物質５■を次いでここからとシ出した。５′
−末端のＤＭＴ保護基をジクロロ酢酸（３１によ）分離
した後に、アセトニトリルで除去した。これと平行して
、Ｒｕ複合体のホスホラミダイトを次のとおシにしてそ
の場で製造した： Ｒｕ（ｂａｔ＝ｈ０）２（ｂａｔｈ
ｏ（ＣＨ２）５０Ｈ’１Ｃｊ２２５つた。この溶液をジ
イソプロピルアンモニウムテトラゾリド５．１■（３０
μｍｏｌ ）で、およびビス−（ジイソプロピルアミノ
）−β−シアノエトキシ−ホスフィン６ ”？ （２０
μｍｏｌ ）含有１ｆｒ液０．１−で処理した。３時間
の反応時間の後に１この混合物を、保護された形の５′
−ヒドロキシル官能基までの上記配列を有する乾燥キャ
リヤ物質に加えた。０．４８ Ｍテトラゾールアセトニ
トリル溶液０．７ｄを加えた後に、混合物を１０分間反
応させた。引続いて、キャリヤ物質を反応混合物から分
離し、次いでＴＨＦ ／ルチジン／水（８Ｃ１Ｏ／２０
０／２０：容量／容量）混合物中の０．２Ｍヨウ素溶液
と反応させて、酸化した。この溶液を分離した後に１キ
ヤリヤ物質をアセトニトリルで、およびエーテルで洗浄
し、次いで乾燥させた。
保護基を開裂させ、キャリヤ物質から分離するために、
この物質５■を濃アンモニア５００ゴ中に取シ入れ、し
つかり閉鎖したエツペンドルフ試験管中で９０分間、６
６℃に保持した。冷却後に、溶液をキャリヤ物質から分
離し、次いで濃縮した。
この物質５■を濃アンモニア５００ゴ中に取シ入れ、し
つかり閉鎖したエツペンドルフ試験管中で９０分間、６
６℃に保持した。冷却後に、溶液をキャリヤ物質から分
離し、次いで濃縮した。
得られたペレット状物を水１００ｄおよびジオキサン２
００−中にとシ、温浸し、次いで遠心分離後に、ＴＨＦ
６００ｍｌにより沈殿させた。遠心処理後に、ペレット
状物を水中に取９人れ、逆相カラムクロマトグラフィに
よって分離した後に、所望の化合物が単離した。別法と
して、この化合物はまた、ポリアクリルアミドデル電気
泳動、引続く電気溶出によって得ることができた。
００−中にとシ、温浸し、次いで遠心分離後に、ＴＨＦ
６００ｍｌにより沈殿させた。遠心処理後に、ペレット
状物を水中に取９人れ、逆相カラムクロマトグラフィに
よって分離した後に、所望の化合物が単離した。別法と
して、この化合物はまた、ポリアクリルアミドデル電気
泳動、引続く電気溶出によって得ることができた。
ｂ）例ａ）と同様にして、ＤＮＡ配列をキャリヤ物質上
に合成し、Ｒｕ複合体とカップリングさせる。
に合成し、Ｒｕ複合体とカップリングさせる。
これと平行して、Ｒｕ複合体２５ Ｔｎ９（２０μｍｏ
ｌ ）をａ）に記載の方法と同様にして、相当するホス
ホラミダイトに変換した。３時間の反応時間の後に、混
合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液５０ｄ中に注ぎ入れた。Ｃ
Ｈ２ＣＪ２で３回抽出し、集めた有機相をＮａ２ＳＯ４
上で乾燥させ、次いで濃縮した。この濃縮は無水アセト
ニトリルの添加後に６回繰返し、残留物を次いで無水ア
セトニトリル０．３−中にとった、この溶液を次いでａ
）の場合と同様のキャリヤ物質および無水アセトニトリ
ル中の０．４８ Ｍ（３５３μｍｏｌ ）テトラゾール
溶液０，７ｄに加えた。１０分の反応時間の後に、混合
物をａ）に記載のようにさらに処理した。
ｌ ）をａ）に記載の方法と同様にして、相当するホス
ホラミダイトに変換した。３時間の反応時間の後に、混
合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液５０ｄ中に注ぎ入れた。Ｃ
Ｈ２ＣＪ２で３回抽出し、集めた有機相をＮａ２ＳＯ４
上で乾燥させ、次いで濃縮した。この濃縮は無水アセト
ニトリルの添加後に６回繰返し、残留物を次いで無水ア
セトニトリル０．３−中にとった、この溶液を次いでａ
）の場合と同様のキャリヤ物質および無水アセトニトリ
ル中の０．４８ Ｍ（３５３μｍｏｌ ）テトラゾール
溶液０，７ｄに加えた。１０分の反応時間の後に、混合
物をａ）に記載のようにさらに処理した。
例２０
ｉ） ｄ（ＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴＧ）２）５′−アミノｄ（ＴＧＡＣＧＴＴＧＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ）（６ｂ）Ｂ ａｎ
ｇｅ ｒによってＦｉ４発されたジデソキシ法、すなわ
ちチェインデグラデーション法〔Ｆ、 Ｓａｎｇｅｔ等
によるＰＮＡＳ ７４ （１９８０年）６４６３頁以降
〕に従ってＤＮＡ配列を決定するためには、配列決定し
ようとする鋳型に対する配列決定用プライマーの特異的
ハイブリッド形成を行なうことは基本的な必要条件であ
る。
ＣＡＧＴＧ）２）５′−アミノｄ（ＴＧＡＣＧＴＴＧＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ）（６ｂ）Ｂ ａｎ
ｇｅ ｒによってＦｉ４発されたジデソキシ法、すなわ
ちチェインデグラデーション法〔Ｆ、 Ｓａｎｇｅｔ等
によるＰＮＡＳ ７４ （１９８０年）６４６３頁以降
〕に従ってＤＮＡ配列を決定するためには、配列決定し
ようとする鋳型に対する配列決定用プライマーの特異的
ハイブリッド形成を行なうことは基本的な必要条件であ
る。
Ｒｕ複合体で標識した配列決定用プライマーは相当する
標識されていないプライマーと同一の配列決定パターン
を導くことを示すことができた。
標識されていないプライマーと同一の配列決定パターン
を導くことを示すことができた。
これによりＲｕ複合体標識！ライマーが特異的にハイブ
リッド形成することを示し、同時に、配列決定に対する
その適合性が証明された。配列決定はＴＪｎｉｔｅｄ
５ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ（１０） Ｃｏｒｐ
からの配列決定キット（Ｔｙｐｅｉ７０７００ ）を使
用し、このキットに指示されている方法に従い行なった
。
リッド形成することを示し、同時に、配列決定に対する
その適合性が証明された。配列決定はＴＪｎｉｔｅｄ
５ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ（１０） Ｃｏｒｐ
からの配列決定キット（Ｔｙｐｅｉ７０７００ ）を使
用し、このキットに指示されている方法に従い行なった
。
下記の配列決定プライマーを使用した：ＧＴＭＡＡＣＧ
ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ） （６ｅ
）＝５ｂ 配列決定バッチの放射能標識はα−’２Ｐ−ｄＡＴＰを
挿入することによって付与する。上記プライマーを使用
して、別々に配列決定反応を平行して行なった後に、ゲ
ル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより、３つ
の配列決定反応の全部について、類似の配列決定パター
ンが現われた。
ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ） （６ｅ
）＝５ｂ 配列決定バッチの放射能標識はα−’２Ｐ−ｄＡＴＰを
挿入することによって付与する。上記プライマーを使用
して、別々に配列決定反応を平行して行なった後に、ゲ
ル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより、３つ
の配列決定反応の全部について、類似の配列決定パター
ンが現われた。
特定の場合について説明すると、この配列決定反応は次
のとおりにして行なった。
のとおりにして行なった。
初めに、下記の混合物を調製する。
ＥＤＴＡ中の１本鎖鋳型Ｍ １５ ｍｐｌ ８ １
μｔ（０，２μｇ）水
５μ！５ｘ配列決定緩衝液＝
２μ！０．２ Ｍ Ｔｒｔｓ ／ ＨＣＬ
、 ｐＨ７，５０，１Ｍ塩化マグネシウム ０．２５Ｍ塩化ナトリウム 各プライマー溶液 ２μｔ（６ｘｌ
Ｏ−’ＯＤ）総容饋は１０μｌである。
μｔ（０，２μｇ）水
５μ！５ｘ配列決定緩衝液＝
２μ！０．２ Ｍ Ｔｒｔｓ ／ ＨＣＬ
、 ｐＨ７，５０，１Ｍ塩化マグネシウム ０．２５Ｍ塩化ナトリウム 各プライマー溶液 ２μｔ（６ｘｌ
Ｏ−’ＯＤ）総容饋は１０μｌである。
これらのノ・イブリッド形成混合物はそれぞれ、６５°
Ｃに２分間加熱し、次いで３０分の間に室温まで冷却さ
せる。この冷却時間中に次の溶液を調製する： 指定プライマーの一つとの各配列決定のために、４本の
エツペンドルフ試験管にＡ、Ｔ、ＧおよびＣの記号を付
け、引続いて各試験管を相応する停止用混合物２．５μ
！で処理し、氷上に貯蔵し、次いで使用の少し前に６７
℃に加温する。
Ｃに２分間加熱し、次いで３０分の間に室温まで冷却さ
せる。この冷却時間中に次の溶液を調製する： 指定プライマーの一つとの各配列決定のために、４本の
エツペンドルフ試験管にＡ、Ｔ、ＧおよびＣの記号を付
け、引続いて各試験管を相応する停止用混合物２．５μ
！で処理し、氷上に貯蔵し、次いで使用の少し前に６７
℃に加温する。
ｄｄ Ａ−停止用混合物： ８０μＭ ｄＧＴＰ：
８０μＭ ｄＡＴＰ：８０μＭ ｄｃＴＰ： ８０μＭ
ｄ’ｌ’ＴＰ：８ ＡＭ ｄｄＡＴＰ： ５０ ｍＭ
ＮａＣ１ｄｄ Ｃ−停止用混合物：８０μＭ ｄＧＴ
Ｐ： ８０μＭ ｄＡＴＰ：８０μＭ ｄｃ’Ｉ’Ｐ：
８０μＭ ｄＴ’ｒＰ：８μＭ ｄｄｃＴＰ： ５
０ ｄｄ Ｇ−停止用混合物：８０μＭ ｄＧＴＰ： ８０
８０ μｍ ｄＧＴＰ二 ８０ ８μＭ ａａＧｒｐ： ５０ ｄｄ Ｔ−停止用混合物＝８０μＭ ａＧＴｐ： ８０
８０μＭ ａｃＴｐ： ８０ ８μＭ ｄｄＴＴＰ： ５０ ｍＭ ＮａＣ１ ＡＭ ｄＡ’Ｉ’Ｐ： ＡＭ ｄＴＴＰ： ｍＭ ＮａＣ１ μＭｄＡＴＰ： ＡＭ ａ’ｒ’ｒｐ： ｍＭ ＮａＣ１ ｂ）標識混合物 １．５μＭ ｄＧＴＰ； １．５μＭＣＴＰ：１．５μ
Ｍ ’ｒＴＰ 。
８０μＭ ｄＡＴＰ：８０μＭ ｄｃＴＰ： ８０μＭ
ｄ’ｌ’ＴＰ：８ ＡＭ ｄｄＡＴＰ： ５０ ｍＭ
ＮａＣ１ｄｄ Ｃ−停止用混合物：８０μＭ ｄＧＴ
Ｐ： ８０μＭ ｄＡＴＰ：８０μＭ ｄｃ’Ｉ’Ｐ：
８０μＭ ｄＴ’ｒＰ：８μＭ ｄｄｃＴＰ： ５
０ ｄｄ Ｇ−停止用混合物：８０μＭ ｄＧＴＰ： ８０
８０ μｍ ｄＧＴＰ二 ８０ ８μＭ ａａＧｒｐ： ５０ ｄｄ Ｔ−停止用混合物＝８０μＭ ａＧＴｐ： ８０
８０μＭ ａｃＴｐ： ８０ ８μＭ ｄｄＴＴＰ： ５０ ｍＭ ＮａＣ１ ＡＭ ｄＡ’Ｉ’Ｐ： ＡＭ ｄＴＴＰ： ｍＭ ＮａＣ１ μＭｄＡＴＰ： ＡＭ ａ’ｒ’ｒｐ： ｍＭ ＮａＣ１ ｂ）標識混合物 １．５μＭ ｄＧＴＰ； １．５μＭＣＴＰ：１．５μ
Ｍ ’ｒＴＰ 。
Ｃ）酵素溶液
シェークエナーゼ（ＳｅｑｕｅｎａａｅｌｒＭ） （修
飾ＤＮＡポリメラーゼ）１μｚ；１２．５ｖ／μＩを含
有する原液を水７μｌで稀釈した。
飾ＤＮＡポリメラーゼ）１μｚ；１２．５ｖ／μＩを含
有する原液を水７μｌで稀釈した。
２ 標識反応液
下記の溶液を各ノ・イブリド形成混合物にそれぞれ加え
る。
る。
（ハイブリッド形成用混合物１０μり
Ｑ、１ＭＤＴＴ １μｊ標識標
識物 ２μｊα−”ｐ−ａＡＴｐ
； １ ０ ｍｃｌ ／ ｍｌ ； ６０００ Ｃ１／ｍ
ｍｏｌｃｏｄｅ： Ｐ１３１（１４）７４）酵素溶液
（３，Ｉ Ｕ ） ２ μ！総容量は
１６．５μ！である。
識物 ２μｊα−”ｐ−ａＡＴｐ
； １ ０ ｍｃｌ ／ ｍｌ ； ６０００ Ｃ１／ｍ
ｍｏｌｃｏｄｅ： Ｐ１３１（１４）７４）酵素溶液
（３，Ｉ Ｕ ） ２ μ！総容量は
１６．５μ！である。
相互混合した後に、溶液を室温で５分間、インキュベー
トする。
トする。
標識混合物６．５μｌを４つの異なるチェインデグラデ
ーション混合物を含有する試験管にそれぞれ、加え、次
いでインキュベーションを３７℃で５分間行なう。プラ
イマ−１およびプライマー２との反応はそれぞれ、染料
溶液４μｊを加え、９５°Ｃに２分間加熱し、次いで水
浴中で冷却することによって止める。これらは次いで、
ポリアクリルアミドデルに装荷することができる。プラ
イマー３との反応は９５℃に２分間加熱する。次いで、
水４３μ１１グリコーゲン溶液（２０ダ／ｄ）１μＩお
よびイソゾロパノール１００μｊで処理する。−８０℃
で３０分後に、０℃において１２，０００ＲＰＭで１５
分間、遠心処理する。上澄液を除去し、ペレット状物を
染料溶液５μ！中に取り入れる。
ーション混合物を含有する試験管にそれぞれ、加え、次
いでインキュベーションを３７℃で５分間行なう。プラ
イマ−１およびプライマー２との反応はそれぞれ、染料
溶液４μｊを加え、９５°Ｃに２分間加熱し、次いで水
浴中で冷却することによって止める。これらは次いで、
ポリアクリルアミドデルに装荷することができる。プラ
イマー３との反応は９５℃に２分間加熱する。次いで、
水４３μ１１グリコーゲン溶液（２０ダ／ｄ）１μＩお
よびイソゾロパノール１００μｊで処理する。−８０℃
で３０分後に、０℃において１２，０００ＲＰＭで１５
分間、遠心処理する。上澄液を除去し、ペレット状物を
染料溶液５μ！中に取り入れる。
９５℃に加熱しく２分間）、次いで氷上で冷却させた後
に、ポリアクリルアミドデルに適用する。
に、ポリアクリルアミドデルに適用する。
６％変性ポリアクリルアミドデル（２０Ｘ４０Ｘ ０．
（１４） ｃｍ ）を１．５時間、予備電気泳動処理し
く ２，０００ボルトａ １３ ｍＡ ）、次いで各配
列決定反応液２μｓｆ各スロツト毎に適用する。
（１４） ｃｍ ）を１．５時間、予備電気泳動処理し
く ２，０００ボルトａ １３ ｍＡ ）、次いで各配
列決定反応液２μｓｆ各スロツト毎に適用する。
電気泳動：９０分（２，５００ボルト／ １４ ｍＡ）
。引続いて、Ｘ線フィルムに露光し、これによって、同
一の特定の配列決定パターンが３つのプライマーの全部
の場合に得られた（この点については第１図を参照する
ことができる）。
。引続いて、Ｘ線フィルムに露光し、これによって、同
一の特定の配列決定パターンが３つのプライマーの全部
の場合に得られた（この点については第１図を参照する
ことができる）。
例２１
サデーンハイデリド形成法による特異的ノ・イゾリツド
形成およびその検出 Ｒｕ ？！合体標識ＤＮＡ断片の特異性を決定するため
に、Ｍ １３ ｍｐ １８ ｔ−制限酵素８ａｐＩを使
用して消化させ、引続いて生成した断片ｔ−ゲル電気泳
動により分離した。引続いて、これらの断片をハイブリ
ッド形成に適する膜に移した。１５５４ ｂｐを有する
断片の一部分に対して相補的である１７個の塩基よシな
る合成オリゴヌクレオチドを、Ｒｕ複合体で前記の方法
（例１６）により標識した。
形成およびその検出 Ｒｕ ？！合体標識ＤＮＡ断片の特異性を決定するため
に、Ｍ １３ ｍｐ １８ ｔ−制限酵素８ａｐＩを使
用して消化させ、引続いて生成した断片ｔ−ゲル電気泳
動により分離した。引続いて、これらの断片をハイブリ
ッド形成に適する膜に移した。１５５４ ｂｐを有する
断片の一部分に対して相補的である１７個の塩基よシな
る合成オリゴヌクレオチドを、Ｒｕ複合体で前記の方法
（例１６）により標識した。
このＲｕ複合体−標識オリゴヌクレオチドの中の少部分
をその６′−末端で放射能でさらに標識した。
をその６′−末端で放射能でさらに標識した。
引続いて、Ｒｕ複合体と放射能との両方の標識を有する
試料のみならずＲｕ複合体のみによる標識を有する試料
もまた相応する制限断片（１５５４ｂｐ ）と特異的に
ハイブリッド形成することを示すことができた。これは
、Ｘ線フィルムを適用して位置をきめ、次いで試料を分
離し、放射能を測定することによって、およびまた、特
異的ハイブリッド形成後に分離されたＲｕ複合体−標識
試料の時間分解螢光法による測定によって、行なった。
試料のみならずＲｕ複合体のみによる標識を有する試料
もまた相応する制限断片（１５５４ｂｐ ）と特異的に
ハイブリッド形成することを示すことができた。これは
、Ｘ線フィルムを適用して位置をきめ、次いで試料を分
離し、放射能を測定することによって、およびまた、特
異的ハイブリッド形成後に分離されたＲｕ複合体−標識
試料の時間分解螢光法による測定によって、行なった。
特定の場合についてハイブリッド形成は次のとおシにし
て行なった。
て行なった。
Ｍ １３ ｍｐ １８ Ｒｆ −ＤＮＡ ５ ｔｔｇを
３３ ｍＭ Ｔｒｉｓ／アセテ−） （ｐＨ７，９）、
６６ｍｕＫｏＡｃ、１０ｍＭＭｇ（ＯＡＣ）Ｚおよび０
．５ ｍＭ Ｉ）Ｉ）’ｒよシなる混合物中において、
制限酵素Ｓａｐ Ｉ ３０単位を用い、６７°Ｃで２時
間、切断した。この消化から得られた断片を引続いて、
エチジウムブロマイド３００ｒｎ９／Ｉｄを含有する０
、７％アガロースデルを用いる電気泳動によって分離し
た。１５５４ ｂｐ断片を約８．５ｍ移動させた後［（
第２メ図賃ゲルを０．５ ＭＮａＯＨ中で１５分間、次
いでＩ Ｍ ＮａＯＨ中に、最後に０．５ ＭＴｒｌｓ
／ＨＣＩ （ｐｌ（８−９） ： ３ Ｍ ＮａＣ＃
中に２回、浸した。引続いて２０ ｘ ｓｓｃ （３Ｍ
ＮａＣ１：０．２８ Ｍ クエン酸Ｎａ）で、セルロ
ース膜への移し変えを一夜にわたり行なった。この膜を
乾燥させ、Ｍ１３ｍｐ１８のＳ８ｐ工消化物のパンｐに
相当する１ｃｆｎ巾のストリップに切断した。このよう
なストリップの２枚（１μｇ消化物に相当する）を、ウ
シ胸腺ＤＮＡで予備ハイブリッド形成した後に、３７℃
で６時間、プローゾロｄとおよびまたα−３２Ｐ ｄａ
ＡＴＰおよびターミネーターヌクレオチジルトランスフ
エラーゼを用いて、放射能標識した６ｄとハイブリッド
形成させた。
３３ ｍＭ Ｔｒｉｓ／アセテ−） （ｐＨ７，９）、
６６ｍｕＫｏＡｃ、１０ｍＭＭｇ（ＯＡＣ）Ｚおよび０
．５ ｍＭ Ｉ）Ｉ）’ｒよシなる混合物中において、
制限酵素Ｓａｐ Ｉ ３０単位を用い、６７°Ｃで２時
間、切断した。この消化から得られた断片を引続いて、
エチジウムブロマイド３００ｒｎ９／Ｉｄを含有する０
、７％アガロースデルを用いる電気泳動によって分離し
た。１５５４ ｂｐ断片を約８．５ｍ移動させた後［（
第２メ図賃ゲルを０．５ ＭＮａＯＨ中で１５分間、次
いでＩ Ｍ ＮａＯＨ中に、最後に０．５ ＭＴｒｌｓ
／ＨＣＩ （ｐｌ（８−９） ： ３ Ｍ ＮａＣ＃
中に２回、浸した。引続いて２０ ｘ ｓｓｃ （３Ｍ
ＮａＣ１：０．２８ Ｍ クエン酸Ｎａ）で、セルロ
ース膜への移し変えを一夜にわたり行なった。この膜を
乾燥させ、Ｍ１３ｍｐ１８のＳ８ｐ工消化物のパンｐに
相当する１ｃｆｎ巾のストリップに切断した。このよう
なストリップの２枚（１μｇ消化物に相当する）を、ウ
シ胸腺ＤＮＡで予備ハイブリッド形成した後に、３７℃
で６時間、プローゾロｄとおよびまたα−３２Ｐ ｄａ
ＡＴＰおよびターミネーターヌクレオチジルトランスフ
エラーゼを用いて、放射能標識した６ｄとハイブリッド
形成させた。
非結合ＤＮＡを２×ＳＳＣにより洗浄した。引続くオー
トラジオグラムは放射能標識を有するゾロ−ゾロｄが６
ｄに対して相補的なりＮＡ配列を有する１５５４ｂｐ＠
片と特異的にバイブリド形成したことを示した（第２＄
図冑この６ｄとの・・イブリッド形成ストリップを四角
形に切断し、各四角形体をそれぞれ、６５°Ｃで１０〜
２０分間、０．１Ｘ５５Ｃ６００μＬで６回、洗浄した
。洗浄液をそれぞれ濃縮し、次いでそれぞれ、水７５μ
ｌ中にとり、そこで螢光を四角形体９で検出した。
トラジオグラムは放射能標識を有するゾロ−ゾロｄが６
ｄに対して相補的なりＮＡ配列を有する１５５４ｂｐ＠
片と特異的にバイブリド形成したことを示した（第２＄
図冑この６ｄとの・・イブリッド形成ストリップを四角
形に切断し、各四角形体をそれぞれ、６５°Ｃで１０〜
２０分間、０．１Ｘ５５Ｃ６００μＬで６回、洗浄した
。洗浄液をそれぞれ濃縮し、次いでそれぞれ、水７５μ
ｌ中にとり、そこで螢光を四角形体９で検出した。
第１図は粒子構造を示す写真であって、６種のプライマ
ーを用いた例２０において得られた配列決定パターンを
示す。第２図は粒子構造を示す写真であって、例２１で
得られた結果を示すオートラジオグラムである。 ａ： ５ｓｐＩ 嫡化物っ分萬蔽
ーを用いた例２０において得られた配列決定パターンを
示す。第２図は粒子構造を示す写真であって、例２１で
得られた結果を示すオートラジオグラムである。 ａ： ５ｓｐＩ 嫡化物っ分萬蔽
Claims (26)
- （１）一般式 I Ｒｕ＾２＾＋Ｌ＿１Ｌ＿２Ｌ＿３ 〔式中、Ｌ＿１およびＬ＿２は同一または異なり、電荷
移動単位を表わし、そしてＬ＿３は基Ａ−Ｘで置換され
ている電荷移動単位を表わし、Ａは所望により−ＳＯＨ
＿２−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＯ−または−Ｃ
Ｏ−ＮＨで置換されていてもよいアルキレン基を表わし
、そしてＸはアルデヒド、カルボキシ、ヒドロキシ、ア
ミノ、チオシアネート基、ハロゲンまたはホスファイト
あるいはホスフェート基、または修飾されたホスフェー
ト基、たとえばホスホネートまたはチオホスフェート基
あるいは他の官能性基を表わす〕 で示されるルテニウム複合体に、好ましくはスペーサー
基を介して、共有結合しているＤＮＡまたはＲＮＡ配列
を含有し、このＲＮＡまたはＤＮＡ配列は修飾形態で、
または非修飾形態で、直接に、あるいはスペーサー基を
介して、上記ルテニウム複合体との反応によつて、共有
結合されている、ルテニウム複合化合物。 - （２）電荷移動単位Ｌ＿１、Ｌ＿２およびＬ＿３は同一
または異なり、所望により置換されていてもよいビピリ
ジル、バソフェナントロリンまたはベンズバソフェナン
トロリン基を表わすことを特徴とする請求項１に記載の
ルテニウム複合化合物。 - （３）電荷移動単位Ｌ＿１およびＬ＿２がスルホン酸基
で置換されていることを特徴とする請求項１に記載のル
テニウム複合化合物。 - （４）上記式 I において、Ａが最大で８個のＣ原子を
有する直鎖状または分枝鎖状のアルキレン基を表わすこ
とを特徴とする請求項１〜３のいづれか一項に記載のル
テニウム複合化合物。 - （５）上記式 I において、Ａが−（ＣＨ＿２）＿４−
であり、そしてＸがＣＯＯＨを表わすことを特徴とする
請求項４に記載のルテニウム複合化合物。 - （６）上記式 I において、Ａが基−（ＣＨ＿２）＿５
−であり、そしてＸが基ＣＯＯＨまたはホスホラミダイ
ト基あるいは活性化ホスフェート基を表わすことを特徴
とする請求項４に記載のルテニウム複合化合物。 - （７）非修飾の、またはアミノ修飾されたＤＮＡまたは
ＲＮＡ配列が式 I で示されるルテニウム複合体に結合
していることを特徴とする請求項１〜６のいづれか一項
に記載のルテニウム複合化合物。 - （８）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が５′−末端で、式 I
で示されるルテニウム複合体に結合していることを特徴
とする請求項１〜７のいづれか一項に記載のルテニウム
複合化合物。 - （９）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がカップリング剤によつ
て、式 I で示されるルテニウム複合体に共有結合して
いることを特徴とする請求項１〜８のいづれか一項に記
載のルテニウム複合化合物。 - （１０）上記カップリング剤がカルボジイミド誘導体で
あることを特徴とする請求項９に記載のルテニウム複合
化合物。 - （１１）上記カルボジイミド誘導体がＮ−シクロヘキシ
ル−Ｎ−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド−
メチル−ｐ−トルエンスルホネートであることを特徴と
する請求項１０に記載のルテニウム複合化合物。 - （１２）上記カップリング剤が１，１，３，３−テトラ
メチル−２−スクシンイミジルウロニウムテトラフルオ
ロボレート（１：１）であることを特徴とする請求項９
に記載のルテニウム複合化合物。 - （１３）上記ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が非修飾形態で、
式 I で示されるルテニウム複合体に結合していること
を特徴とする請求項８に記載のルテニウム複合化合物。 - （１４）上記ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がホスホジエステ
ル基を介して、式 I で示されるルテニウム複合体に結
合していることを特徴とする請求項１３に記載のルテニ
ウム複合化合物。 - （１５）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がバ
ソフェナントロリン基を表わし、そしてＬ＿３がバソフ
ェナントロリン基を表わし、Ａが−（ＣＨ＿２）＿５−
基を表わし、そしてＸがＣＯＯＨを表わし、そして５′
−アミノ−ＤＮＡ配列が【遺伝子配列があります】であ
ることを特徴とする請求項１に記載のルテニウム複合化
合物。 - （１６）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がバ
ソフェナントロリン基を表わし、そしてＬ＿３がバソフ
ェナントロリン基を表わし、Ａが基−（ＣＨ＿２）＿４
−を表わし、そしてＸがＣＯＯＨ基であり、そして５′
−アミノ−ＤＮＡ配列が【遺伝子配列があります】であ
ることを特徴とする請求項１に記載のルテニウム複合化
合物。 - （１７）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がバ
ソフェナントロリン基を表わし、そしてＬ＿３がベンズ
バソフェナントロリン基を表わし、Ａが基−（ＣＨ＿２
）＿４−を表わし、そしてＸがＣＯＯＨ基であり、そし
て５′−アミノ−ＤＮＡ配列が、【遺伝子配列がありま
す】であることを特徴とする請求項１に記載のルテニウ
ム複合化合物。 - （１８）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がス
ルホン酸基で置換されているバソフェナントロリン基を
表わし、そしてＬ＿３がバソフェナントロリン基を表わ
し、Ａが−（ＣＨ＿２）＿５−基を表わし、そしてＸが
−ＣＯＯＨ基を表わし、そして５′−アミノ−ＤＮＡ配
列が【遺伝子配列があります】であることを特徴とする
請求項１に記載のルテニウム複合化合物。 - （１９）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がス
ルホン酸基で置換されているバソフェナントロリン基を
表わし、そしてＬ＿３がバソフェナントロリン基を表わ
し、Ａが基−（ＣＨ＿２）＿５−を表わし、そしてＸが
−ＣＯＯＨ基であり、そして５′−アミノ−ＤＮＡ配列
が【遺伝子配列があります】であることを特徴とする請
求項１に記載のルテニウム複合化合物。 - （２０）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がバ
ソフェナントロリン基を表わし、そしてＬ＿３がバソフ
ェナントロリン基を表わし、Ａが基−（ＣＨ＿２）＿５
−を表わし、そしてＸが−ＣＯＯＨ基を表わし、そして
５′−アミノ−ＤＮＡ配列が【遺伝子配列があります】
であることを特徴とする請求項１に記載のルテニウム複
合化合物。 - （２１）上記式 I において、Ｌ＿１およびＬ＿２がバ
ソフェナントロリン基を表わし、そしてＬ＿３がバソフ
ェナントロリン基を表わし、Ａが基−（ＣＨ＿２）＿５
−を表わし、Ｘがホスホジエステル官能性基を表わし、
そしてＤＮＡ配列が【遺伝子配列があります】であるこ
とを特徴とする請求項１に記載のルテニウム複合化合物
。 - （２２）請求項１〜２１のいづれか一項に記載のルテニ
ウム複合化合物の、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出する
ための使用。 - （２３）上記検出に、ハイブリッド形成技法を使用する
ことを特徴とする請求項２２に記載の使用。 - （２４）時間分解螢光技法を使用することを特徴とする
請求項２２または２３のどちらか一項に記載の使用。 - （２５）請求項１〜２１のいづれか一項に記載のルテニ
ウム複合化合物のヌクレオチドの配列決定における使用
。 - （２６）時間分解螢光技法を使用することを特徴とする
請求項２５に記載の使用。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH166288 | 1988-05-04 | ||
| CH01662/88-2 | 1988-05-04 | ||
| CH317188 | 1988-08-26 | ||
| CH03171/88-4 | 1988-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0211597A true JPH0211597A (ja) | 1990-01-16 |
Family
ID=25688308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10709689A Pending JPH0211597A (ja) | 1988-05-04 | 1989-04-26 | Ｄｎａまたはｒｎａ配列を含有するルテニウム複合化合物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0340605A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0211597A (ja) |
| AU (1) | AU622899B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6173363B1 (en) * | 1997-09-12 | 2001-01-09 | Teac Corporation | Data transmission device for reading data from a memory medium and transmitting the data to a magnetic reproducing apparatus with a reduced noise |
| US7238794B2 (en) | 2001-12-25 | 2007-07-03 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Organic conductor |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5635347A (en) * | 1986-04-30 | 1997-06-03 | Igen, Inc. | Rapid assays for amplification products |
| US4997928A (en) * | 1988-09-15 | 1991-03-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| US5262536A (en) * | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| ZA929351B (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-04 | Igen Inc | Electrochemiluminescent label for DNA assays. |
| DE4210970C2 (de) * | 1992-04-02 | 1996-10-17 | Markus Dipl Chem Sauer | Verfahren zur simultanen optischen qualitativen und quantitativen Erfassung von verschiedenen mit Fluorochromen oder Fluorogenen markierten Molekülen eines Gemisches mittels Laserspektroskopie |
| DE4344742A1 (de) * | 1993-06-09 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren |
| US6432637B1 (en) * | 1997-12-15 | 2002-08-13 | Joseph R. Lakowicz | Method for determining a base sequence of a nucleotide strand |
| US6306661B1 (en) * | 1998-02-05 | 2001-10-23 | Joseph R. Lakowicz | Water soluble luminescence oxygen sensor and method |
| US6664111B2 (en) | 2001-08-22 | 2003-12-16 | 3M Innovative Properties Company | Fluorescence based oxygen sensor systems |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4341957A (en) * | 1975-11-26 | 1982-07-27 | Analytical Radiation Corporation | Fluorescent antibody composition for immunofluorometric assay |
| US4547569A (en) * | 1982-11-24 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Intercalating agents specifying nucleotides |
| DK365785A (da) * | 1984-09-17 | 1986-03-18 | Hoffmann La Roche | Metalcomplexer |
-
1989
- 1989-04-24 AU AU33343/89A patent/AU622899B2/en not_active Ceased
- 1989-04-25 EP EP19890107439 patent/EP0340605A3/de not_active Withdrawn
- 1989-04-26 JP JP10709689A patent/JPH0211597A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6173363B1 (en) * | 1997-09-12 | 2001-01-09 | Teac Corporation | Data transmission device for reading data from a memory medium and transmitting the data to a magnetic reproducing apparatus with a reduced noise |
| US7238794B2 (en) | 2001-12-25 | 2007-07-03 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Organic conductor |
| US7419818B2 (en) | 2001-12-25 | 2008-09-02 | Fuji Xerox Co., Ltd | Organic conductor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0340605A2 (de) | 1989-11-08 |
| AU622899B2 (en) | 1992-04-30 |
| AU3334389A (en) | 1989-11-09 |
| EP0340605A3 (de) | 1991-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3379064B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの合成用担体 | |
| JP2509574B2 (ja) | 標識付けした核酸 | |
| JP2533100B2 (ja) | ポリヌクレオドの誘導方法 | |
| JPH06339378A (ja) | 液相核酸アッセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプローブ | |
| JP2022516244A (ja) | ３’保護ヌクレオチド | |
| JPS638396A (ja) | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 | |
| EP0438203A2 (fr) | Dérivés de nucléosides et leur utilisation pour la synthèse d'oligonucléotides | |
| JPH01500461A (ja) | 核酸プローブアッセイ法および組成物 | |
| JP2002513795A (ja) | モノマー、オリゴマーおよびポリマーのクネベナーゲル縮合生成物 | |
| JPH0359914B2 (ja) | ||
| CA2303299A1 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| JPH05507074A (ja) | ホスホラミダイト誘導体、それらの合成方法、および合成オリゴヌクレオチド上にリポーター基を取り込む際のそれらの用途 | |
| JPH0386897A (ja) | 検出可能な１本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成に有用な化合物 | |
| JPH03500773A (ja) | オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート | |
| JPH0211597A (ja) | Ｄｎａまたはｒｎａ配列を含有するルテニウム複合化合物 | |
| JPH04503059A (ja) | ５′―ビオチン化オリゴヌクレオチド製造用の試剤 | |
| JPH01502187A (ja) | α―オリゴヌクレオチド | |
| JP2835630B2 (ja) | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 | |
| US6022714A (en) | Methods for attachment of a polynucleotide to a preselected material | |
| JPS59148798A (ja) | ビオチンヌクレオチド誘導体 | |
| JPH05202090A (ja) | 全体にわたりアミドリン酸塩のヌクレオチド間架橋を有する新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド類 | |
| JPH0435480B2 (ja) | ||
| JPH0499793A (ja) | フェニトイン誘導体 | |
| JPS5993099A (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法 | |
| JPS5993100A (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体 |