JPS6070084A - 分散プロモ−タ− - Google Patents
分散プロモ−タ−Info
- Publication number
- JPS6070084A JPS6070084A JP59130207A JP13020784A JPS6070084A JP S6070084 A JPS6070084 A JP S6070084A JP 59130207 A JP59130207 A JP 59130207A JP 13020784 A JP13020784 A JP 13020784A JP S6070084 A JPS6070084 A JP S6070084A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- dna
- promoter
- fragment
- genes
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（発明の分野）
種々の宿主中で外来性遺伝子を発現するための大きな努
力がなされている。多くの努力は、多数の原核生物宿主
又は真核生物宿主中でのＤＮＡの複製を可能にする複製
系を得ることに向けられてきた。宿主にとって外来性の
遺伝子の複製を可能にするであろうベクターを得るため
の努力と共に、目的生成物の増強された生産をもたらす
ために外（２） 来性遺伝子の動電的な転写の制御を可能にＬ７、宿主に
より認識されるプロモーターを得る努力がなされてきた
。従って、特定のプロモーターを定義すること、及びそ
のようなプロモーターを分離してそれらが目的蛋白質生
成物の有効な制御のために使用され得るか否かを決定す
ることに向けられた広範な文献が存在する。
力がなされている。多くの努力は、多数の原核生物宿主
又は真核生物宿主中でのＤＮＡの複製を可能にする複製
系を得ることに向けられてきた。宿主にとって外来性の
遺伝子の複製を可能にするであろうベクターを得るため
の努力と共に、目的生成物の増強された生産をもたらす
ために外（２） 来性遺伝子の動電的な転写の制御を可能にＬ７、宿主に
より認識されるプロモーターを得る努力がなされてきた
。従って、特定のプロモーターを定義すること、及びそ
のようなプロモーターを分離してそれらが目的蛋白質生
成物の有効な制御のために使用され得るか否かを決定す
ることに向けられた広範な文献が存在する。
（従来技術）
Ｓｔ、Ｊｏｈｎ 及びＤａｖｌｇ、Ｃｅ１ｌ （１９７
９）ＤＮＡ配列を記載している。Ｓｔ、Ｊｏｈｎ 及び
のガラクトース遺伝子群の構成と転写について記載して
いる。Ｓｔ、Ｊｏｈｎ等、的掲 （１９８１）１５Ｔ
： ３７７−３３４ は、サツカロミセスＧＡＬ遺伝子
群の欠失分析、及び３つのプロモーターからの転写につ
いて記載している。
９）ＤＮＡ配列を記載している。Ｓｔ、Ｊｏｈｎ 及び
のガラクトース遺伝子群の構成と転写について記載して
いる。Ｓｔ、Ｊｏｈｎ等、的掲 （１９８１）１５Ｔ
： ３７７−３３４ は、サツカロミセスＧＡＬ遺伝子
群の欠失分析、及び３つのプロモーターからの転写につ
いて記載している。
発明の要約
宿主にとって外来性の遺伝子の転写のためのエピゾーム
要素中で使用するためのポータプルＤＮＡ断片として、
外的に誘導し得る分散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プロモー
ターが提供される。特に、小ＤＮＡ断片上のＧＡＬｌ−
１０プロモーター（複数〕が提供され、この小ＤＮＡ断
片は、宿主中で安定に維持され得るベクター上で逆向き
になっている同−又は異る遺伝子（複数）に連結され得
る。こうして得られた構成物は、注目する遺伝子（複数
）の誘導的同時的転写及び発現のために使用することが
できる。
要素中で使用するためのポータプルＤＮＡ断片として、
外的に誘導し得る分散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プロモー
ターが提供される。特に、小ＤＮＡ断片上のＧＡＬｌ−
１０プロモーター（複数〕が提供され、この小ＤＮＡ断
片は、宿主中で安定に維持され得るベクター上で逆向き
になっている同−又は異る遺伝子（複数）に連結され得
る。こうして得られた構成物は、注目する遺伝子（複数
）の誘導的同時的転写及び発現のために使用することが
できる。
特定の具体例の記載
この発明に従えば、同時的に外的制御を受ける分散二方
向プロモーター（複数） （ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｂｉｄ
ｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ） を有
するＤＮＡ断片が提供される。２個のプロモーターの下
流に同−又は異る複数のポリペプチドを発現する複数の
遺伝子を配置することにより、複数の蛋白質の同時的転
写及び発現を行うことができ、その結果一種類の目的生
成物がより字素に得られ、又は２種類の異る生成物が同
時に得られ、この場合複数の生成物は、同じ蛋白質の複
数のサブユニットであることにより関連付けられ、又は
多数の他の制御系の調和した制御をも走らすことにより
関連付ケラれる。コーレブレッサー、インデー−サーの
使用のごとき外的効果により、抑制（Ｒｅｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ）、抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｉｓ １ｏｎ） 又
は活性化（ａｃｔｉ−ｖａｔｉｏｎ） が達成されよう
。
向プロモーター（複数） （ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｂｉｄ
ｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ） を有
するＤＮＡ断片が提供される。２個のプロモーターの下
流に同−又は異る複数のポリペプチドを発現する複数の
遺伝子を配置することにより、複数の蛋白質の同時的転
写及び発現を行うことができ、その結果一種類の目的生
成物がより字素に得られ、又は２種類の異る生成物が同
時に得られ、この場合複数の生成物は、同じ蛋白質の複
数のサブユニットであることにより関連付けられ、又は
多数の他の制御系の調和した制御をも走らすことにより
関連付ケラれる。コーレブレッサー、インデー−サーの
使用のごとき外的効果により、抑制（Ｒｅｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ）、抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｉｓ １ｏｎ） 又
は活性化（ａｃｔｉ−ｖａｔｉｏｎ） が達成されよう
。
分散プロモーターを含有するＤＮＡ断片は一般に２ｋｄ
以下、通常１．５ ｋｄ以下であり、そして１ ｋｄ
又はそれより小さいであろう。一般に、この複数のプロ
モーターは少なくとも約１００ｂｐ。
以下、通常１．５ ｋｄ以下であり、そして１ ｋｄ
又はそれより小さいであろう。一般に、この複数のプロ
モーターは少なくとも約１００ｂｐ。
さらに通常は少なくとも２００ｂｐ、そして一般に約５
００〜８００ ｂｐ により分離されているであろう。
００〜８００ ｂｐ により分離されているであろう。
便利なことには、介在する塩基は、分散プロモーターに
より開始される転写を制御するために機能する制御蛋白
質の結合部位として機能することができよう。すなわち
この断片は、種々のＤＮＡ配列、多くの場合構造遺伝子
、の転写及び発現をもたらす他の配列に連結され、制御
可能な（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）分散プロモーターと
して機能するであろう。この断片は、転写及び翻訳に関
連する種々のシグナルを提供するように様々に変形する
ことができる。
より開始される転写を制御するために機能する制御蛋白
質の結合部位として機能することができよう。すなわち
この断片は、種々のＤＮＡ配列、多くの場合構造遺伝子
、の転写及び発現をもたらす他の配列に連結され、制御
可能な（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）分散プロモーターと
して機能するであろう。この断片は、転写及び翻訳に関
連する種々のシグナルを提供するように様々に変形する
ことができる。
プロモーターから下流の延長部分は、種々の機能を提供
する広範囲の種々のフランク配列であってよい。この断
片に接着末端又は平滑末端を設けて他のＤＮＡ配列との
連結を可能にすることができる。種々の部位において切
断を行うことにより、特定の状況に応じて、種々のシグ
ナル又はコード配列を弗留せしめることができる。通常
、ＧＡＬ１遺伝子及びＧＡＬ１Ｑ遺伝子の最終塩基対か
ら上流で切断されよう。プロモーターからすぐ下流を切
断することができ、得られた分散プロモーター機能ＤＮ
Ａを、必要な転写及び翻訳シグナルを有する他の配列に
連結することができる。
する広範囲の種々のフランク配列であってよい。この断
片に接着末端又は平滑末端を設けて他のＤＮＡ配列との
連結を可能にすることができる。種々の部位において切
断を行うことにより、特定の状況に応じて、種々のシグ
ナル又はコード配列を弗留せしめることができる。通常
、ＧＡＬ１遺伝子及びＧＡＬ１Ｑ遺伝子の最終塩基対か
ら上流で切断されよう。プロモーターからすぐ下流を切
断することができ、得られた分散プロモーター機能ＤＮ
Ａを、必要な転写及び翻訳シグナルを有する他の配列に
連結することができる。
場合によっては、プロモーターから下流のＧＡＬ転写及
び別状制御シグナルのすべてが除去されるようなプロモ
ーターから下流の部位に末端を得ることができる。他方
、プロモーターから下流のＧＡＬ転写及び翻訳制御配列
のすべてを残して、開始コドン及び場合によっては該開
始コドンから上流の幾つかの塩基、一般に約２０塩基以
下、便利には１０塩基以下を除去することができる。
び別状制御シグナルのすべてが除去されるようなプロモ
ーターから下流の部位に末端を得ることができる。他方
、プロモーターから下流のＧＡＬ転写及び翻訳制御配列
のすべてを残して、開始コドン及び場合によっては該開
始コドンから上流の幾つかの塩基、一般に約２０塩基以
下、便利には１０塩基以下を除去することができる。
開始コドンと整合するようにＤＮＡ配列を連結すること
ができる部位を切断することができる。この場合には融
合蛋白質が得られ、このものは多くの状況において、特
にＮ末端にＧＡＬ １ 又はＧＡＬｌｏ のアミノ酸配
列を有することが有利である場合に、利点を有するであ
ろう。
ができる部位を切断することができる。この場合には融
合蛋白質が得られ、このものは多くの状況において、特
にＮ末端にＧＡＬ １ 又はＧＡＬｌｏ のアミノ酸配
列を有することが有利である場合に、利点を有するであ
ろう。
プロモーターと開始コドンとの間に存在するＧＡＬｉ
及びＧＡＬｌｏの転写及び翻訳制御配列を保持しており
、そして分散プロモーター機能断片の２末端への異るＤ
ＮＡ配列の連結を簡単にするＧＤＮＡ断片が特に有利で
ある。
及びＧＡＬｌｏの転写及び翻訳制御配列を保持しており
、そして分散プロモーター機能断片の２末端への異るＤ
ＮＡ配列の連結を簡単にするＧＤＮＡ断片が特に有利で
ある。
従って、ＧＡＬ １−１０遺伝子及び介在する制御配列
を適切に操作して、ＧＡＬ １遺伝子及びＧＡＬ １０
遺伝子の開始コドン間に介在するＤＮＡ配列の大部分
をなす、プロモーターから下流に延びる断片を得ること
により、外来性遺伝子の制御された転写をもたらすＤＮ
Ａ断片が得られ、この転写制御は酵母宿主にとって本来
的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）である。すなわち、断片の
末端は開始コドンから上流にあるが、転写リーダー配列
に伸びている。
を適切に操作して、ＧＡＬ １遺伝子及びＧＡＬ １０
遺伝子の開始コドン間に介在するＤＮＡ配列の大部分
をなす、プロモーターから下流に延びる断片を得ること
により、外来性遺伝子の制御された転写をもたらすＤＮ
Ａ断片が得られ、この転写制御は酵母宿主にとって本来
的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）である。すなわち、断片の
末端は開始コドンから上流にあるが、転写リーダー配列
に伸びている。
酵母中で使用するために、無傷の複製系を備えた多くの
ベクターが用いられる。多くのベクターは、２μプラス
ミドそれ自体、又はａｒｓｌ と組合わされた２μプラ
スミドの複製系に基礎を置いている。多数のベクターの
例がＢｏｔｇｔｅｆｎ 等、Ｇｅｎｅ （１９７９）
８ ： １７−１４ に記載されている。これらのベク
ターは、酵母複製系のほかにしばしば原核生物複製系を
有し、これはエピゾーム要素又はファージから誘導され
る。このようにして、操作され又は変形されたベクター
は各操作の後原核生物宿主中でクローニングすることが
゛でき、そして目的構成物を比較的大量に純粋に分離す
ることができる。
ベクターが用いられる。多くのベクターは、２μプラス
ミドそれ自体、又はａｒｓｌ と組合わされた２μプラ
スミドの複製系に基礎を置いている。多数のベクターの
例がＢｏｔｇｔｅｆｎ 等、Ｇｅｎｅ （１９７９）
８ ： １７−１４ に記載されている。これらのベク
ターは、酵母複製系のほかにしばしば原核生物複製系を
有し、これはエピゾーム要素又はファージから誘導され
る。このようにして、操作され又は変形されたベクター
は各操作の後原核生物宿主中でクローニングすることが
゛でき、そして目的構成物を比較的大量に純粋に分離す
ることができる。
所望の形質を得るために構成物に多くの能力を導入する
ことができる。好ましくは、構成物が導入される各宿主
のための複数のマーカーが設けられ、このマーカーは同
じであり又は異る。マーカーは一般に選択圧を提供し、
宿主が構成物を保持し、そして復元しないことを保証す
る。マーカーには、殺生物耐性、例えば抗生物質耐性、
コリシン耐性、重金属耐性等、栄養要求性の補完、免疫
性等が含まれよう。異る選択圧を有する必要性又は望ま
しさに依存して１個又は複数のマーカーを用いるのが望
ましいであろう。
ことができる。好ましくは、構成物が導入される各宿主
のための複数のマーカーが設けられ、このマーカーは同
じであり又は異る。マーカーは一般に選択圧を提供し、
宿主が構成物を保持し、そして復元しないことを保証す
る。マーカーには、殺生物耐性、例えば抗生物質耐性、
コリシン耐性、重金属耐性等、栄養要求性の補完、免疫
性等が含まれよう。異る選択圧を有する必要性又は望ま
しさに依存して１個又は複数のマーカーを用いるのが望
ましいであろう。
広範囲の異る生成物を製造するために多数の外来性すな
わち異種性の遺伝子を用いることができる。異種性遺伝
子は原核性分離源及び真核性分離源のいずれからも誘導
することができる。霊長類及び家畜からの種々の哺乳動
物遺伝子が特に有利である。知られており、そして微生
物宿主中で発現されている代表的な遺伝子には、α−１
β及びｒ−インターフエラン、プロインシュリン及びプ
レプロインシュリン、ヒト成長ホルモン、ソマトスタチ
ンの遺伝子等がある。有利な他の遺伝子は、病原体、例
えばウィルス及び微生物からの遺伝子であり、この発現
生成物は、ワクチンのため、受動免疫において使用する
ための抗体の産生を誘導するため、等に使用することが
できる。
わち異種性の遺伝子を用いることができる。異種性遺伝
子は原核性分離源及び真核性分離源のいずれからも誘導
することができる。霊長類及び家畜からの種々の哺乳動
物遺伝子が特に有利である。知られており、そして微生
物宿主中で発現されている代表的な遺伝子には、α−１
β及びｒ−インターフエラン、プロインシュリン及びプ
レプロインシュリン、ヒト成長ホルモン、ソマトスタチ
ンの遺伝子等がある。有利な他の遺伝子は、病原体、例
えばウィルス及び微生物からの遺伝子であり、この発現
生成物は、ワクチンのため、受動免疫において使用する
ための抗体の産生を誘導するため、等に使用することが
できる。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
実験
１５２ ： ２８５−３１５ に記載されている方法に
より分離し、そして特徴付けた。ＧＡＴ、１０ 中の一
ターを含有する酵母ＤＮＡ断片を、ゲル電気泳動により
分離した。Ｅｃｏ Ｒ，Ｉリンカ−をＴ４リガーゼによ
りＡｖａ Ｉ 部位に連結し、そして得られた断片をＹ
Ｒｐ１７中にクローニングした。得られた断片を Ｘｂ
ａＩ により切断し、そして線状分子を、エキソヌクレ
アーゼ Ｂａｌ ３１により種々の時間にわたって消化
した。（Ｇｒａｙ等。
より分離し、そして特徴付けた。ＧＡＴ、１０ 中の一
ターを含有する酵母ＤＮＡ断片を、ゲル電気泳動により
分離した。Ｅｃｏ Ｒ，Ｉリンカ−をＴ４リガーゼによ
りＡｖａ Ｉ 部位に連結し、そして得られた断片をＹ
Ｒｐ１７中にクローニングした。得られた断片を Ｘｂ
ａＩ により切断し、そして線状分子を、エキソヌクレ
アーゼ Ｂａｌ ３１により種々の時間にわたって消化
した。（Ｇｒａｙ等。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ＋ｊｄｇＲ，ｅ、ｓ、（１９７５）
２ ： １４５９−１４９２ ； Ｍｃｋｎｌｇｈｔ
及びＫｌｎｇｓｂｕｒｙ。
２ ： １４５９−１４９２ ； Ｍｃｋｎｌｇｈｔ
及びＫｌｎｇｓｂｕｒｙ。
５ｃｉｅｎｃｅ （１９８２） ２１７ ： ３１６−
３２４ ）ａＸｂａ Ｉ合成リンカ−を、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを甲いて、得られた分子に連結し、そして酵
母ベクター中で再クローニングした。まず、得られたプ
ラスミドＤＮＡのランダムな１セツトを制限酵素切断に
よりスクリーニングすることにより、欠失部位のおよそ
の同定を行った。次に転写出発部位近傍の欠失を決定し
た。ＧＡＩＪｌの真正なＡＴＧの４塩基前に合成Ｘｂａ
Ｉリンカ−を含有する３個の欠失体が同定される。さ
らに、正常な転写出発部位から数塩基上流に合成Ｘｂａ
Ｉ ＩＪンカーを含有する他のクローンが同定された
。次に、これら２つのプラスミドを、Ｘｂａ Ｉ によ
り切断した。
３２４ ）ａＸｂａ Ｉ合成リンカ−を、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを甲いて、得られた分子に連結し、そして酵
母ベクター中で再クローニングした。まず、得られたプ
ラスミドＤＮＡのランダムな１セツトを制限酵素切断に
よりスクリーニングすることにより、欠失部位のおよそ
の同定を行った。次に転写出発部位近傍の欠失を決定し
た。ＧＡＩＪｌの真正なＡＴＧの４塩基前に合成Ｘｂａ
Ｉリンカ−を含有する３個の欠失体が同定される。さ
らに、正常な転写出発部位から数塩基上流に合成Ｘｂａ
Ｉ ＩＪンカーを含有する他のクローンが同定された
。次に、これら２つのプラスミドを、Ｘｂａ Ｉ によ
り切断した。
接着末端をＤＮＡポリメラーゼ■により満たし、そして
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼにより Ｂａｍ ＨＩリンカ
−を付加した。次に、得られた分子６ ＢａｍＨＩ及び
Ｅｃｏ ＲＩで切断し、キして分散プロモーターを含有
する断片をゲル電気泳動により分離し、そして ｙｃｐ
５０ベクターに挿入した。ＹＣｐ５０ ベクターは
Ｙｌｐ ５ と称される親プラスミドから構成した。５
ｔｒｕｈｌ 等、 ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９７９） ７
６ ： １０３５−１０３９ を参照のこと。
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼにより Ｂａｍ ＨＩリンカ
−を付加した。次に、得られた分子６ ＢａｍＨＩ及び
Ｅｃｏ ＲＩで切断し、キして分散プロモーターを含有
する断片をゲル電気泳動により分離し、そして ｙｃｐ
５０ベクターに挿入した。ＹＣｐ５０ ベクターは
Ｙｌｐ ５ と称される親プラスミドから構成した。５
ｔｒｕｈｌ 等、 ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９７９） ７
６ ： １０３５−１０３９ を参照のこと。
Ｒ，Ｉ断片をこのベクターのユニーク Ｆｉｃｏ ＲＩ
部位に挿入した。さらに、中央に位置するセントロによ
り部分解し、接着末幽をＤＮＡポリメラーゼ含有する断
片＠ Ｈｉｎ ｄ ■ により切断し、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■により接着末端を満たし、そしてゲル電気泳動に
よりこの断片を分離した。次にこの断片ｆ Ｐｖｕ ｌ
により切断し、そしてＴａＰ１遺伝子中の Ｈｌｎ
ｄ ■部位に平滑末端を有し。
部位に挿入した。さらに、中央に位置するセントロによ
り部分解し、接着末幽をＤＮＡポリメラーゼ含有する断
片＠ Ｈｉｎ ｄ ■ により切断し、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■により接着末端を満たし、そしてゲル電気泳動に
よりこの断片を分離した。次にこの断片ｆ Ｐｖｕ ｌ
により切断し、そしてＴａＰ１遺伝子中の Ｈｌｎ
ｄ ■部位に平滑末端を有し。
ＡＲ８１及びＣＥＮ４かうＰｖｕ ｌ［部位に至る断片
をゲル電気泳動により分離した。この断片を共有結合的
に、Ｐｖｕ ｌ’［により切断した Ｙｌｐ５に、Ｔ４
ＤＮＡ リガーゼにより連結した。断片の方向は１２
時の位置から時計まわりにＴＥＴ耐性遺伝子、 ＵＲＡ
’３ 、 ＣＥＮ ４ 、 ＡＲ８１、Ｃ０ＬＩ 複製
開始点、ＡＭＰ耐性である。
をゲル電気泳動により分離した。この断片を共有結合的
に、Ｐｖｕ ｌ’［により切断した Ｙｌｐ５に、Ｔ４
ＤＮＡ リガーゼにより連結した。断片の方向は１２
時の位置から時計まわりにＴＥＴ耐性遺伝子、 ＵＲＡ
’３ 、 ＣＥＮ ４ 、 ＡＲ８１、Ｃ０ＬＩ 複製
開始点、ＡＭＰ耐性である。
ＹＣ，５０ベクターに挿入された２個の断片から得られ
る２つのクローンからのＤＮＡを分離し、そして Ｅｃ
ｏ ＲＩで切断した。Ｂｃｏ Ｒ・■部位をＤＮＡポリ
メラーゼ■により満たし、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて再連結した。この方法により１個の Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ部位が除去され、そして分散プロモーターが ＹＣｐ
５０に融合した。
る２つのクローンからのＤＮＡを分離し、そして Ｅｃ
ｏ ＲＩで切断した。Ｂｃｏ Ｒ・■部位をＤＮＡポリ
メラーゼ■により満たし、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて再連結した。この方法により１個の Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ部位が除去され、そして分散プロモーターが ＹＣｐ
５０に融合した。
ＧＡＬ１プロモーターの転写の方向は、上記のごとく、
およそ１２時の位置において時計方向であった。Ｅｃｏ
ＲＩ 部位及びＧＡＬｌｏからＧＡＬ Ｉ中の Ａｖ
ａ Ｉ の間のＤＮＡ＝ｉ含んで成るＤＮＡ断片を調製
することにより他のクローンを分離した。 Ａｖａ 部
位を、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼによるＥｃｏ ＲＩ リ
ンカ−の平滑末端連結によって、Ｅｃｏ ＲＩ 部位に
転換し次。対応する Ｆｉｃｏ ＲＩ断片を ＹＣｐ５
０中に挿入した。、得られたプラスミド−ｆ：Ｅｃｏ
ＲＩにより部分的に消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■によ
り満たし、そして再連結し、そして ＹＣｐ５０間に
Ｅｃｏ ＲＩを有し、そしてＲＩ部位を有する。
およそ１２時の位置において時計方向であった。Ｅｃｏ
ＲＩ 部位及びＧＡＬｌｏからＧＡＬ Ｉ中の Ａｖ
ａ Ｉ の間のＤＮＡ＝ｉ含んで成るＤＮＡ断片を調製
することにより他のクローンを分離した。 Ａｖａ 部
位を、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼによるＥｃｏ ＲＩ リ
ンカ−の平滑末端連結によって、Ｅｃｏ ＲＩ 部位に
転換し次。対応する Ｆｉｃｏ ＲＩ断片を ＹＣｐ５
０中に挿入した。、得られたプラスミド−ｆ：Ｅｃｏ
ＲＩにより部分的に消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■によ
り満たし、そして再連結し、そして ＹＣｐ５０間に
Ｅｃｏ ＲＩを有し、そしてＲＩ部位を有する。
以上、３種のプラスミドＤＮＡの調製について記載した
が、これらのすべては ＹＣｐ５０仲で構成され、そし
て１個の Ｅｃｏ ＲＩ部位を有する。
が、これらのすべては ＹＣｐ５０仲で構成され、そし
て１個の Ｅｃｏ ＲＩ部位を有する。
１つは、ガラクトキナーゼすなわちＧＡＬ １ の本来
の転写出発部位の数塩基上流にあり、第２はＧＡＬ １
の正常なリーダーを含有するがガラクトキナーゼの開始
に使用される真正ＡＴＧから４塩基で止まっている。第
３はガラクトキナーゼの構造遺伝子中にある。
の転写出発部位の数塩基上流にあり、第２はＧＡＬ １
の正常なリーダーを含有するがガラクトキナーゼの開始
に使用される真正ＡＴＧから４塩基で止まっている。第
３はガラクトキナーゼの構造遺伝子中にある。
同様の技法を用いることにより、ＧＡＬ １０ プロモ
ーターの下流配列を操作し、他のユニーク制限部位を設
け、２つの部位に異る２つの構造遺伝子導入し、そして
同時発現を伴って２つの遺伝子の制御されな発現を達成
することができる。
ーターの下流配列を操作し、他のユニーク制限部位を設
け、２つの部位に異る２つの構造遺伝子導入し、そして
同時発現を伴って２つの遺伝子の制御されな発現を達成
することができる。
この発明に従えば新規な構成物が提供され、この場合、
遺伝子の転写制御に有用なようにプロモータ一群が操作
される。分散 ＧＡＬ １−１０プロモーターは、２個
の異る遺伝子又は同一の遺伝子の同時的に制御された転
写を可能にし、これによってこのプロモーターを認識す
る酵母又は他の宿主において、広範囲の種類の生成物を
製造することができる。
遺伝子の転写制御に有用なようにプロモータ一群が操作
される。分散 ＧＡＬ １−１０プロモーターは、２個
の異る遺伝子又は同一の遺伝子の同時的に制御された転
写を可能にし、これによってこのプロモーターを認識す
る酵母又は他の宿主において、広範囲の種類の生成物を
製造することができる。
以上、例示又Ｆｉ例によフこの発明をいく分詳細に説明
したが、これはこの発明の理解を明確にするためのもの
であって、この発明の範囲内において多くの変形、に法
を実施できることは言うまでもない。
したが、これはこの発明の理解を明確にするためのもの
であって、この発明の範囲内において多くの変形、に法
を実施できることは言うまでもない。
麩下余白
６５７−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、酵母ＧＡＬ １−１０分散プロモーターをおよそ対
称的に配置している約２０００ ｂｐ未溝のＤＮＡ断片
。 塩基対から上流の塩基対に末端を有する特許請求の範囲
第１項記載のＤＮＡ断片。 ６、 前記末端が開始コドンから上流に存在する特許請
求の範囲第２項記載のＤＮＡ断片。 ４、 前記末端が前記開始コドンの約２０塩基対内にあ
る特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ断片。 ５、酵母ＧＡＬ１−１０分散プロモーターを有するＤＮ
Ａ断片、及び該プロモーターから下流に逆向きに酵母に
とって外来性の遺伝子を含んで成るＤＮＡ構成物。 ６、酵母複製系を有する特許請求の範囲第５項記載のＤ
ＮＡ構成物。 （１） 、ｍ、す Ｚ 酵母により認識されるマーカーを有する特許請求の
範囲第５項記載のＤＮＡ構成物。 ａ 酵母複製系、原核生物複製系、及び少なくとも１個
のマーカーを有する特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ
構成物。 ９ 酵母ＧＡＬ１−１０分散プロモーターを有するＤＮ
Ａ断片、及び該プロモーターから下流に逆向きに酵母に
とって外来性の遺伝子を含んで成るＤＮＡ構成物を含有
するエピゾーム性要素を有する酵母宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50842683A | 1983-06-27 | 1983-06-27 | |
| US508426 | 1983-06-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070084A true JPS6070084A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=24022696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59130207A Pending JPS6070084A (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-26 | 分散プロモ−タ− |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0132309A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6070084A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0550023A (ja) * | 1991-08-22 | 1993-03-02 | Tomoegawa Paper Co Ltd | 帯状物の乾燥法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
| EP0128743A3 (en) * | 1983-06-07 | 1985-12-27 | Genex Corporation | Expression of foreign genes in yeast |
| US5024941A (en) * | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
| DE3605035A1 (de) * | 1986-02-18 | 1987-08-20 | Strahlen Umweltforsch Gmbh | Plasmid pws101, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| GB8726953D0 (en) * | 1987-11-18 | 1987-12-23 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast expression system |
| JP2791418B2 (ja) | 1987-12-02 | 1998-08-27 | 株式会社ミドリ十字 | 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体 |
| US5436141A (en) * | 1989-02-24 | 1995-07-25 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Method for synthesizing stable single-stranded CDNA in eukaryotes by means of a bacterial retron and products |
| AU7586991A (en) * | 1990-03-21 | 1991-10-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Yeast expression vectors |
| US6172039B1 (en) | 1990-04-16 | 2001-01-09 | Apex Bioscience, Inc. | Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast |
| AU2896092A (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Yeasts containing multiple mammalian cytochromes for degrading complex chemical mixtures |
| DE69732378D1 (de) * | 1997-05-27 | 2005-03-03 | Hanil Synthetic Fiber Co Ltd | Verfahren zur herstellung von rekombinanten eiweissen durch verwendung von hocheffizienten expressionsvektoren aus saccharomyces cerevisiae |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
| EP0128743A3 (en) * | 1983-06-07 | 1985-12-27 | Genex Corporation | Expression of foreign genes in yeast |
-
1984
- 1984-06-25 EP EP84304279A patent/EP0132309A3/en not_active Withdrawn
- 1984-06-26 JP JP59130207A patent/JPS6070084A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0550023A (ja) * | 1991-08-22 | 1993-03-02 | Tomoegawa Paper Co Ltd | 帯状物の乾燥法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0132309A3 (en) | 1985-12-27 |
| EP0132309A2 (en) | 1985-01-30 |
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