JPS6070087A - 生理活性物質ｓν−５８８４，その製造法及び制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、スフアニロティラス属に属する菌株が生産す
る生理活性物質、その製造法及びこれを含む制癌剤に関
するものである。

制癌剤には、微生物細胞壁成分や担子菌類の生産する多
糖類等を有効成分とするものが知られているが９本発明
者らは、さらに有効な物質を検索した結果、スフアニロ
ティラス属の細菌の生産する粘液性物質が強力な制癌効
果を有する新知見を得１本発明を完成するに至った。

本発明の生理活性物質は、スフアニロティラス属の菌の
形成する外鞘（Ｓｈｅａｔｈ）の外壁面にできる粘液層
（スライム層）から分離回収される。スフアニロティラ
ス属の細菌は極めて形態的に特徴のあるもので、面画を
培養すると増殖した菌体は一見菌糸状の形態となる。す
なわち、菌体は連鎖状に連なり、ストロ−状の外鞘に包
まれたフィラメント構造を形成する。この外鞘は強固で
あり容易に崩壊できないが、この外壁面には粘液層が蓄
積されている。

４− スフアニロティラス属の菌株の一種であるスフアエロテ
ィラス・ナタンス（Ｓｐｈｄｅｒｏｔｉｌｕ、ｓ　ｎａ
ｔａｎｓ］工ＡＭ−１２０？Ｓ８について９本菌の培養
物から菌体を集め菌体成分と制癌作用の関係を調べた。

試験に用いた試料は、培養菌体を殺菌後、凍結乾燥した
全菌体（Ａ）、ロマノ法（Ｒｏｍａｈｏ　）　等の方法
に準じて調製した菌体の外鞘区分ＣＢ）及び後述する方
法で回収した粘液性画分の硫安塩析物（０）の６点であ
る。動物試験方法は後述の実施例に準するが。

試験結果は次表の通りである。

この結果より、スフアエロティラス・ナタンス菌体中の
制癌物質は、外鞘粘液画分にあることが判明した。

本発明にはスフアニロティラス属の菌株が使用出来るが
２代表例としてスフアエロティラス・ナタンスエＡＭ−
１２０６８がある。

本菌株の菌学的性質は次の通りである。

菌体（細胞）は巾が１〜２ミクロン、長さが２〜１０ミ
クロンの長稈状であり、複数のペン毛を束状に発生させ
ている。外鞘の表面は平滑で菌体は一列に連続している
。本菌株は東京大学応用微生物研究所の保有登録様より
分譲された株であり。

不菌株の諸性質はザ・ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジイ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）　６７゜２７８〜２９１　及びマイクロバ
イオロジカルーレビュウズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）　、Ｔｕｎｅ、　１９７８゜
３２９〜６５６に記載されている。なお、同菌株は通産
省微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄
第７２４１号）。

次に本発明の生理活性物質５Ｎ−５８８４の理化学的性
質を説明する。

■元素分析値： 本市の元素分析結果は次の通りである。

炭素　４１　〜４６　係 水素　６．２〜６４係 窒素　５．８〜６５係 ■分子量： 不品のゲル濾過による分子量は５０，０００以上である
。

■融点： 不品は２４０〜２５０℃で褐変し、２７０〜２７５℃で
分解するり ■比旋光度： 不品の０２５チ水溶液について旋光度を測定し。

比旋光度〔α〕２Ｄ′をめたところ　−８，１６±１．
４７であった。

φ）紫外線吸収スペクトル： ２６０〜２８０ｎｍに弱いピーク又はシュルダーが出現
する。

不品の０．１％水溶液の２００〜３４５　ｎｍの測定波
長７− における吸収スペクトラムを第１図に示す。

■赤外線吸収スペクトラム 不品のＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルを第２
図に示す。’！ｒ、５００〜３．２００α　の吸収は（
−ＯＨ）に、２，９００引　の吸収はアルキルに。

１、６００Ｇ　の吸収は（−００−ＮＨ−）　に起因す
るものと思われ、これらを総合すると糖及び蛋白質の存
在が示唆される。

■溶剤に対する溶解性： 本市は水に溶ｐＨトするが、メタノール、アセトン、ク
ロロホルム、ベンゼン、ヘキサン等には全く溶解しない
。

■呈色反応： 本市の呈色反応結果は以下の通りである。

８− ■成分組成： 不品の糖及び蛋白量を７エノール硫酸法及びケルメール
法にて測定した結果、糖・蛋白比率は。

糖　質　４０　±　５％ 蛋白質　５ｏ　±　５％ である。

［相］糖質部の構成： 不品の構成中性糖を酸分解−ガスクロマト法により分析
の結果 グルコース　１００ フコース　８２〜９０ ラムノース　９８〜１１０ エリスロース　１４〜　フ　８ 未同定糖　２０〜２８ の構成北軍である。

■酸性・塩基性・中性の区別： 不品は弱酸〜中性物質であり、０１％溶解液のＰＨは６
１±０．３である。

＠外観： 不品は白〜淡黄色の粉末である０ これらの理化学的特徴から制癌作用を有する活性成分は
高分子の糖・蛋白複合体と推定される。

次に、スフアニロティラス属に属する菌株の培養物から
生理活性物質５Ｎ−５８８４の製造法につめて述べる。

培養はグルコース等の炭素源、ペプトン等の窒素源及び
各種の無機塩類を含有する液体培地調製・殺菌の後、ス
フアニロティラス属の菌株を接種し９通気攪拌培養を行
う。培養条件はｐＨ６〜８．培養温度１５〜４０℃、培
養時間１６〜１２０時間が好ましい０通気攪拌培養とし
ては通常の回転振盪培養やジャー、タンク培養器を用込
ることができる。接種後、数時間で菌体の増殖が活発と
なり、培養温度３０℃の場合には３６〜４８時間で菌体
量は最高となる。培地組成的には、ザ・ジャーナル・オ
プ・バクテリオフジ−６フ巻２７８〜２９１（１９５４
）に記載されたストークス培地が基礎培地として好まし
・い。利用できる炭素源は多く、グルコース、フラクト
ース、ガラクトース。

マルトース、シュクロース、キシロース等の糖類の他、
メタノール、エタノール等のアルコール類。

グリセリン、マンニット等の糖アルコール類、クエン酸
、フマール酸、リンゴ炸、酢酸等の有機酸類を資化生育
する。しかしながら、澱粉、セロビオース、イヌリン等
は利用できない。窒素源としては有機及び無機の一般的
窒素源を利用できる。

有機窒素源としてはアスパラギン酸、グルタミン酸等の
アミノ酸類、ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、カゼ
イン氷解物等を利用して生育し、無機の窒素源としても
アンモニウム塩類、硝酸塩類を利用する。無機塩類とし
てはリン酸塩類、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、
塩化第−鉄等を組合せて用いる他、微量のマンガン、亜
鉛、銅等の塩類の添加も有効である０その他に生育因子
としてビタミン、２の微量飽加が必要であるが、窒素諒
としてペプトン、カザミノ酸等メチオニンを含有する場
合はその限りでない。尚２通常の培養技法であるｐＨ２
温度９通気量、攪拌数のコントロールや消泡剤の添加を
必要により行うこともできる。

培養終了後、培養物を遠心分離等により固型物を集め、
固型物は水又は生理食塩水で洗浄し、湿菌体とする。湿
菌体は５〜２０倍量（重量）の水に懸濁しホモジナイザ
ーにかけ光分に機械的衝撃を塀えることにより菌体外鞘
の粘液層を形成していた粘液物を溶離させる。この機械
的処理はホモジナイズが一般的であるが勿論他の物理的
手段を用いてもよい。機械的処理を加えた懸濁液を遠心
分離等により、菌体、外鞘断片等を除去した清澄液中に
は目的物である粘液物質が含まれるが、同物質の回収は
塩析法、有機溶剤沈澱法等により行う。

即ち粘液物質含有液は必要によっては濃縮したのち、伽
酸アンモニウム等の一般的塩析法により。

又はアルコール等の一般的有機溶剤沈澱法により沈澱化
を行う。本操作により活性物質は塩析法の場合０４〜０
．８飽和濃度区分に、有機溶剤沈澱法の場合４０〜８０
ｑ６溶剤濃度区分に集められる。

沈澱回収した活性区分は更に脱塩、ゲルｐ過、イオン交
換クロマトグラフィー、等の精製手段により精製を行う
ことができる。しかし一般的には塩析、有機溶剤沈澱等
の濃度選択を行うことにより最も強い活性を示す粘液性
物質を集めることが手軽な精製手段である。硫安塩析の
場合、制癌効果の最も高い粘液性物質は０．５〜０．６
飽和区分に集められたものである。尚、核酸関連物質の
混入を防止するために、ストレプトマイシン硫酸塩を粘
性液中に加え、沈澱除去することもできる。

本発明の生理活性物質８Ｎ−５８８４を制癌剤として使
用する場合、経口及び非経口の投与が行われるが、その
投与量は癌の種類、症状、投与回数等により異るが、一
般的には一日一回の投与量として不品を経口投与の場合
２〜２００　”ｉ／’ｋ　＊非経口投与の場合０．０３
〜３０１１Ｍ＋ｇが標準とされる。尚。

薬剤剤型としては、液状・粉状・顆粒状・打錠等の各種
剤型化が可能であり、製剤化の為の各種協加剤の使用に
は特別の制限はない。

１３一 本発明の生理活性物質５Ｎ−５８８４の安全性は高く、
マウス及びラットを用いた試験での経口及び腹腔投与の
急性青性値は以下の逼りである。

次に実施例を以って、不発明を底切するが、特にこれに
よって不発明は限定されない。

実施例 グルコース５０ｔ、ペプトン５０１　、　ＭｇＳＯ４・
７ＨｔＯ４ｇ　、　ＯａＯｅｔ　１　？、　ＦｅＯ／、
拳　（ＳＨ，００，２ｇ。

ビタミンＢ１２１０μｇを含有する１［１ｊの培地を小
型発酵槽にて殺菌後、予め同培地で培養した種菌液２０
０ｄを入れ、３０℃にて４８時間通気攪拌培養を行った
。培養終了後、菌体をシャープンス型遠心機で集め、生
理食塩水で洗浄後。

再び遠心分離により、湿菌体１２０ｔを集めた。

湿菌体に１．２ｔの水を加えて懸濁し、冷却しなからワ
ーリング・ブレンダーにて１０分間ホモジナイズした後
、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、　１５分）にかけた。

上澄液１２ｔに１２ｔのストレプトマイシン５Ｒ酸塩を
塀え２発生した不溶性物質を遠心分離（８，ＯＯＯｒｐ
ｍ、　１５分）にて取り除いた。

次いで上澄液に４０係飽和量となる２６７０１の硫安を
茄え数時間ゆるやかに攪拌後、生じた沈澱物を遠心分離
（５，０００ｒｐｍ　１０分）にて除外し。

更に硫安１６２０．ｔを加え６０％飽和濃度とした。

１夜放置後、塩析物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ　１
５分）にかけて集め、１００ｍ／の水に溶解後、流水中
にて１昼夜透析を行った後、少量の不溶物を遠心分離（
１２，０００ｒ１ｍ　１５分）にて取り除き。

清澄液区分を凍結真空乾燥にて乾燥し、淡褐色の粉末２
．６ｇを得た。更に精製のため上記粉末２ｔを少量の水
に溶解し、セファロース４Ｂ（ファルマシア社）を用い
たカラムクロマトグラフィーな行い活性画分を回収した
。凍結乾燥後の生理活性−質５Ｎ−５８８４は白色粉末
であり。

採取量は１．１．１？であった。

次に生理活性ＩＪｉ／Ａ質５Ｎ−５８８４を用論ての制
癌試験結果を示す。

試験例 実験動物は一群１０頭ｄｄＹ系雄性５週令マウスを使用
した。腫瘍細胞は、同種マウス腹腔にて７目間隔で継代
したエールリ１．ヒ腹水型腫瘍細胞を用いた。腫瘍細胞
（Ｉ　Ｘ　１０　０ｅｌｌＢ　）ヲマウス腹腔内に接種
し、翌日から１日おきに計７回、生理食塩水に溶かした
試料溶液を腹腔内に投与して、平均生存日数及び６０日
後の生存率を対照群（生理食塩水のみ投与）と比較した
。

結果は次表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は生理活性物、質５Ｎ−５８８４の紫外線吸収ス
ペクトル図であり、第２図は同物質の赤外線吸収スペク
トル図である。 特許出願人 クミアイ化学工業株式会社 １７一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１次の理化学性質を有する生理活性物質ＳＮ−８８
   ４ ■元素分析値： 炭素　４１〜４３　係 水素　６，２〜６．４％ 窒素　５．８〜６．５係 ■分子量ニ ゲル濾過による分子量はｓｏ、ｏｏｏ以上である。 ■融点： ２４０〜２５０℃で褐変し、２７０〜２７５℃で分解す
   る〇 ■比旋光度： ０、２５１水溶液について旋光度を測定し。 比旋光友〔α〕２ＤＩロー８１６±１．４７■紫外ｉ吸
   収スペクトル： 第１図に黙られる通りの特性吸収を示す。 ■赤外線吸収スペクトル： 第２図に見られる特性を示す。 ■溶解性： 水に溶解するが、メタノール、アセトン。 クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンに全く溶解しない。 ■呈色反応： ■成分組成： フェノール硫酸法で糖質４０±５％、ケルダール法にて
   蛋白質５０±５％である。 ［相］糖質部の構成； 構成中性糖を酸分解−ガスクロマト法により１次の通り
   である。 グルコース　１００ フコース　８２〜９０ ラムノース　９８〜１１０ エリスロース　１４〜１８ 未同定糖　２０〜２８ （２）　スフアニロティラス属に属する生理活性物質５
   Ｎ−５８８４生産菌を培地に培養し、培養物より生理活
   性物質５Ｎ−５８８４を採取することを特徴とする生理
   活性物質５Ｎ−５８８４の製造法。 （３）　生理活性物質５Ｎ−５８８４を有効成分として
   含有することを特徴とする制癌剤。 ３−