JPS6075432A - ネオカルチノスタチン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、優れ九制癌作用を有する下記式（１）％式％
（１） 〔式中、Ｑ万Ｑはネオカルチノスタチンの１位のアラニ
ン残基中の１級アミン基および２０位のりが１ないし４
のアルカノール、アルキル基の炭素数が１またけ２のエ
チレングリコールモノアルキルエーテル、もしくはアル
キル基の炭素数が１または２のグリセリンジアルキルエ
ーテルから水酸基を除いたアルコール残基である。）：
マレイン−５− １個のカルボキシル基から水酸基が除かれた形の、該ネ
オカルチノスタチン残基との結合手を有しての炭素原子
の結合手はネオカルチノスタチン残基と結合するもので
あることを意味する）を構成単位とし、かつ平均分子量
が８００以上２，５００以下である１価の部分半エステ
ル化スチレンマレイン酸共重合残基を意味する。〕 で示される新規化合物ネオカルチノスタチン誘導体およ
びその製造方法に関する。 ネオカルチノスタチン（以下、ＮＣ８と略記する）はス
トレプトミセス・カルチノスタデカス・バリ７７トＦ−
４１−りｏ　ヤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｒｚｉ
ｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ　ｖａｒ、　Ｆ−４１Ｋｕｒｏｙ
ａ　）の培養物中に産生される蛋白質性抗癌物質であシ
（特公昭４２−２１７５２号、米国特許第３，３３４，
０２２号）、その−次構造は本発明者の一人である前出
によって、６− アミノ酸総残基数が１０９の推定分子量１０，７００の
ものとして報告されている（　５ｃｉｅｎｃｅ、　１７
８巻。 ８７５〜８７６頁、１９７２年及びＡｒｃｈ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　１６３巻、３７９〜３８５頁）
０癌の治療においては、癌細胞の転移が最も重要な問題
であり、就中特にリンパ節転移が最大の問題である。先
に、本発明者はＮＣ８の毒性の軽減と薬効の持続性を高
め、かつ薬物をリンパ系に特異的に移行せしめることに
ついて種々研究した結果、ＮＣ８の分子中に存在する２
個の１級アミン基を部分加水分解スチレン無水マレイン
酸共重合体と反応せしめて得られる下記式（ＩＩ）Ｏ■
−＠］−■　（ＩＩ） 〔式中、０は式（１）と同じＮＣ８残基金意味し、ＣＥ
りは主鎖にＩ！！！！垂しているカルボキシル基のうち
の１個がＮＣ８分子中の１級アミン基との間で酸アミド
結合を形成している分子量２，５００〜ｓｏ、ｏｏｏの
スチレンマレイン酸共重合体残基を意味する。〕 で示されるＮＣ８誘導体が上記目的に合致すると７− とを見出し特許出願した（特開昭５３−１１７０９５号
）。 しかしながら、上記のＮＣ８誘導体は水性基剤に溶解し
て静脈投与できるものの、親油性については不充分であ
った。本発明者らは、親水性と親油性を合せ持たせ、腫
瘍親和性をいっそう向上させることについてさらに検討
を進めた結果、ＮＣ８を部分中エステル化スチレン無ホ
マレイン酸共重合体（以下、Ｅ−８ＭＡと略記する）と
反応させることによって形成される下記式（ＩＩＩ）化
スチレンマレイン酸共重合体残基を意味し、ｎは１〜３
５の整数を意味する。〕 で示されるＮＣ８複合体が前記式（ｎ）で示されるＮＣ
３ｌｉ導体よりも腫瘍親和性が高いためさらに優れた抗
癌作用を発揮でき、また親水性と同時に親油性にも優れ
ているため水性製剤を調製して使用できる上に油性製剤
としての適用にも即してい８− ることを認め、かかる複合体についても特許出願を行っ
た（特願昭５７−３１，５５５号および特願昭５８−１
５，０７５号）。かかるＮＣ８複合体は式（ＩＩＩ）に
おけるｎが１ないし３５の範囲で種々の値をと）うるの
であるが、実施例として具体的に製造されているもの￥
′ｉｎの値が５以上のものであった。 かかる複合体について、抗腫瘍活性に平行であるとされ
ティ；Ｅｒ　（Ｎ、　ｌ５ｈｉｄａ、　Ｋ、　Ｍｉｙａ
ｚａｋｉ　、　Ｋ。 Ｋｕｍａｇａｉ　ａｎｄ　Ｍ　、　Ｒｉｋｉｍａｒｕ、
　Ｊ　、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、（’ｆ’ｏｋｙｏ）Ｓｅｔ
、　ＡＩ　８．６８（１９６５）］］サルーすｅ　ルｆ
　７菌（Ｓａｒｃｉｎａ　１ｕｔｅａ　）に対する抗菌
活性（以下、ルテア活性と略記する）を見ると、かかる
ＮＣ８複合体はＮＣ８に比し活性が約１／】０に着しく
低下しており、１回当りの投与量が制限される動脈投与
において薬効が不充分であった。かかるようなルテア活
性が低い原因としては、部分半エステル化スチレンマレ
イン酸共重合体残基の含有率が高いためＮＣ８残基に由
来する活性が希釈されたものと考えられた。 本発明者らは、Ｉｌｉｌｉ−８ＭＡを原料として、部分
半９− エステル化スチレンマレイン酸共重合体残基の含有率が
低くてルテア活性が高いＮＣ８肪導体を得るべくさらに
鋭意検討を重ねた結果、ＮＣ８とＥ−８ＭＡとを反応さ
せた後、かかる反応生成物の中から、ＮＣ３Ｉ分子に対
して２分子のＥ−８ＭＡが酸アンド結合を形成すること
によって結合していｂＮｃＳ誘導体を単離することに成
功し、本発明に至った。すなわち本出願の第１の発明は
前記式（Ｉ）で示されるＮＣ８誘導体である。 上記のＮＣ８誘導体（１）は、ＮＣ８と特定のＥ−８Ｍ
Ａとを高い反応率で反応させ、しかる後に反応生成物を
ゲルＰ遇することによってはじめて単離されるものであ
る。すなわち、本出願の第２数が１ないし４のアルカノ
ール、アルキル基の炭素数が１または２のエチレングリ
コールモノアルキルエーテル、もしくはアルキル基の炭
素数が１１０− または２のグリセリンジアルキルエーテルから水酸基を
除いたアルコール残基である。）、およびｇｏｏ　＜　
ＭＷ　＜２，５００　（■）Ｍｗ／Ｍｎ　＜　１．５−
１．１　ｘ　１０”−’　Ｍｗ　（Ｖ）〔式中、　ＭＷ
　Ｉｄ　Ｅ−８ＭＡの重量平均分子量を意味し、ＭｎＦ
ｉＥ−８ＭＡＯ数平均分子量を意味する。〕を満足する
Ｅ−８ＭＡをＮＣ８に対して過剰量使用して水性溶媒中
でＮＣ８と反応させ、しかる後に反応生成物をゲル濾過
して、前記式（Ｉ）で示されるＮＣ８誘導体を単離する
ことを特徴とするＮＣ８誘導体の製造方法である。ＮＣ
８とＥ−８ＭＡとを水性溶媒中で反応させると、反応終
了後の反応液中には、本発明のＮＣ３ｉ導体（Ｉ）の他
に、ｇ−８ＭＡの無水マレイン酸環部分が加水分解・開
環して生成する部分半エステル化スチレンマレイン酸共
重合体（以下、Ｉ−８ＭＡの加水分解開環物と称する）
、未反応ＮＣ８，下記式（■）［相］ｆ−ＣＤ　（■） 〔式中、回はＮＣ８の１位のアラニン残基または２０位
のりジン残基いずれか一方に含まれる１級アミン基から
１個の水素原子を除いた１価のＮＣ８残基を意味する。 ［株］Ｄ　ｔｒｌ、式（１）におけるものと同じ意味を
有する０〕 で示される。ＮＣ８９導体（Ｉ）に至る中間仲質、およ
び下記式（■）、（■）、（■） 〔式中、＠Ｄは式（１）におけるものと同じ意味を有す
る。口は式（■）におけるものと同じ意味を有する。■
は式（１）におけるものと同じ意味を有する。口は、ス
チレン残基、半エステル化マレイン酸残基、マレイン酸
残基、およびマレイン酸残基中の１個のカルボキシル基
から水酸基が除かれた形であってＮＣ８残基との結合手
を有している２個の残基を構成単位とする２価の部分半
エステル化スチレンマレイン共重合体残基を意味する。 ｍは１または２を童昧する。〕で示される副生成物など
が存在しうる。これらの未反応物２よび副生成物のなか
でも特に、未反応ＮＣ８，ｇ−８ＭＡの加水分解開環物
および式（ＩＶ）で示される中間生成物が５本発明のＮ
ＣＦ３誘導体（１）を分離する上で問題となる。後述す
るように、本発明者らは、ＮＣ８に対して過剰のＥ−８
ＭＡを用いて反応系中のＮＣ８を高い反応率で反応させ
ることによ）未反応のＮＣ８および中間生成物（Ｖｌ）
の残存を避け、さらに、分子量と分子量分布とを限定し
たＥ−８ＭＡを原料として使用することによって生成す
るＮＣ８誘導体（１）とＥ−８ＭＡの加水分解開城物と
をゲル濾過することによる分離を容易にしておシ、これ
らによってＮＣ８訪導体（１）の単離に成功したもので
ある。本発明のＮＣ８鋳導体は純粋に得られるため、医
薬として実用に供することが可能となった。 本発明のＮＣ３ｉｌｌ導体（１）は驚くべきことにＮＣ
８に近い高いルテア活性を示した。かかるＮＣ８＠導体
は親水性でめると同時に親油性でも１３− あるので、水性基剤に溶解することによって水性注射剤
を調製することもまたリピオドール（仏画ラボラドワー
ル・ゲルベ社製リビオドールウルトラ７Ａ／イド−ヨー
ド化ケシ油脂肪酸エチルエステル）等を油性基剤として
油性製剤を調製することもできるため、静脈内、動脈内
、皮下、筋肉内、腹腔内など種々の方法で投与すること
が可能である。特に、動脈内投与法においては、一般に
一回当シの投与量が制限されるため高活性を有する本発
明のＮＣ８誘導体（１）を用いることによってはじめて
抗癌剤としての有効な使用が可能になった。 以下、本発明について詳細に説明する。 まず、かかるＮＣ８誘導体（１）の構造について述べる
と、ＮＣ８訪導体（１）は１個のＮＣ８残基に２個の部
分半エステル化スチレンマレイン酸共重合体残基が酸ア
ミド結合によって結合したもの・である。ＮＣ８残基を
構成するＮＣ８は、１９７２年発行の５ｃｉｅｎｃｅ　
１７８巻８７５〜８７６頁に明示されているように１位
のアラニン残基中および２，０位のりジン残基中にのみ
各々１個（合計２個）の１４− １級アミン基を有するタンパク質である。ＮＣ８分子中
には、この２個の１級アミン基の他に、多数の水酸基、
２級アミノ基などの官能基が含まれているが、本発明の
ＮＣ８誘導体においては、かかる２１固の１級アミノ基
以関の官能基は部分半エステル化スチレンマレイン酸共
重合体残基との結合に関与しない。すなわち、本発明の
ＮＣ８訪導体（１）の構成単位の１つであるＮＣ８残基
は、ＮＣ８中の上記の２個の１級アミノ基よシ１個ず　
。 つ、合計２個の水素原子が除かれた形のものであわ、２
個の結合手を有している。 本発明のＮＣＳＲ誘導体おけるもう一つの構成成分であ
る部分半エステル化スチレンマレイン酸炭素数が１ない
し４のアルカノール、アルキル基の炭素数が１または２
のエチレングリコールモノアルキルエーテル、もしくは
アルキル基の炭素数が１または２のグリセリンジアルキ
ルエーテルから水酸基を残いたものをアルコール残基（
Ｒ）として有する半エステル化マレイン酸残基 ；およびマレイン酸残基中の１個のカルボキシル基から
水酸基が除かれた形の、ＮＣ８残基との結中カルボニル
基の炭素原子の結合手はＮＣ８残基と結合するものであ
ることを意味する）を構成単位とする。かかる共重合体
残基は原料のＥ−ＨＭＡに由来するものである。上記の
共重合体残基において、残基（ｄ）はＥ−８ＭＡ中の無
水マレイン酸残して生成したものであり、残基（Ｃ）は
Ｅ−８ＭＡ中のＮＣ８と反応しなかった無水マレイン酸
残基７５（水性溶媒中で加水分解して生成したものであ
る。 マタ、残基（ａ）　オヨび（ｂ）は、それぞれＥ　−Ｓ
　ＭＡ中のスチレン残基および半エステル化マレイン酸
残基に対応する。これらの残基（ａ）　、　（ｂ）　、
　（ｃ）および（ｄ）の構成割合については、後述のよ
うにＮＣ８との反応性の上からＥ−ＨＭＡの重合体組成
が選択されるためそれに依存して異なるが、原料のＥ−
ＨＭＡには分子量および組成に分布が存在するので、結
果として残基（ａ）　％　（ｂ）　％　ＣＣ’）および
（ｄ）の構成割合についても分布が存在する（但し、残
基（ｄ）はかかる共重合体残基中に必ず１個だけ存在す
る）。例えば、原料のＥ−ＨＭＡの個々の分子について
見ると、無水マレイン酸残基を１個しか含有しないＥ−
８ＭＡ分子がＮＣ８分子と反応することによって形成さ
れる部分半エステル化スチレンマレイン酸共重合体残基
中にはマレイン酸残基が存在しない。しかしながら、原
料のに一８ＭＡには前述のように組成の分布があるため
無水マレイン酸残基を２個以上含有するＥ！−８ＭＡ分
子も同時に存在し、かかる分子がＮＯ８分子と反応する
ことによって、マレイン酸残基を１個以上含有する部分
半エステル化スチレンマレイン酸共重合体残基が形成さ
れる。従って、得られる共重合体残基は、ｇ−ＨＭＡと
同様、個々の共重合体残基につ１７− いて見るとその分子量および各構成残基の構成割合に分
布があるだめ、かかる構成残基の存在は平均的に把握さ
れるべきものである。無水マレイン酸残基の平均含有個
数が少ないＥ−ＨＭＡを原料に用いた場合においても、
２個以上の無水マレイン酸残基を有するＥ−８ＭＡ分子
が存在するため、生成するＮＣ８誘導体中の部分半エス
テル化スチレンマレイン酸共重合体残基について平均的
に見れば、１個以下の少量であるかもしれないが必ずマ
レイン酸残基は構成単位として含有される。このように
、本発明においては、かかる共重合体残基中の各構成残
基の存在を平均個数で把握すると、残基（ｄ）が１個で
ある他は必ずしも整数個であるとは限らず、１個以下の
少量であってもよい。 次に、本発明のＮＣ３ｐ導体中における部分半エステル
化スチレンマレイン酸共重合体残基部分の平均分子量に
ついてみると、８００以上２，５００以下であることが
重要である。かかる平均分子量は後述の実施例に示す方
法によってめられるが、この平均分子量が２，５００よ
シ大きい共重合体残基１８− を有するＮＣＳ誘導体は、後述するように反応後の生成
物から分離することが困難となる。−Ｅ＆かかる平均分
子量が８００より小さい共重合体残基を有するＮＣ８篩
導体は、実用上、使用しにくい。 本発明のＮＣ８誘導体を得るにあたり、反応原料のＥ−
８ＭＡの選択が重要であるので、次にこの点について述
べる。Ｅ−８ＭＡは、前述のように、スチレン残基（イ
）、半エステル化マレイン酸残基（ロ）および無水マレ
イン酸残基（ハ）を構成単位とする。Ｉ−８ＭＡ中にお
ける残基（イ）と、残基（ロ）およびＣ−＞　ｋ合せた
ものとの構成モル比率は、実質的に約１；１〜１．３：
］であることが好ましい。 さらに好ましくは約１：１である。かかる構成比率は、
Ｅ−８ＭＡを水性溶媒中に溶解しながらＮＣ８と反応さ
せる際、Ｅ−８ＭＡの水性溶媒への溶解性の点から主と
して選択される。残基（イ）の構成比率が高いＥ−８Ｍ
Ａはどかかる水性溶媒への溶解性が不良となり好ましく
ない。なお、残基（イ）の比率が１よシも小さいものは
、スチレンと無水マレイン酸との共重合によシ得ること
が実質上、不可能である。 残基（ロ）と（ハ）との構成比率についてみると、ＩＤ
−８ＭＡとＮＣ８との反応におけるＥ−８ＭＡの水性溶
媒への溶解性と、ＮＣ８との反応性との双方から、Ｅ−
８ＭＡ中における残基（ハ）の、残基（ロ）および（ハ
）を合計したものに対する構成割合（無水マレイン酸環
の含有率）は１５モルチ以上６５モルチ以下（半エステ
ル化率では３５モルチ以上８５モルチ以下）であること
が好ましい。さらに好ましくは２０モルチ以上６０モル
チ以下である。 かかる無水マレイン酸環の含有率が１５モルチを下まわ
るＦ２−８ＭＡはＮＣ８との反応性があま）高くな（、
ＮＣ８の反応率を充分に高くすることができない。逆に
、無水マレイン酸環の含有率が６５モルチを上まわるＥ
−８ＭＡは、残基（ロ）の、残基（ロ）および（−・）
を合計したものに対する構成割合（半エステル−化率）
が３５モルチ未満であり、極性の高いカルボキシル基の
含有率が低いため、ＮＣ８との反応系である水性溶媒に
対する溶解性が不足する。 原料Ｅ−８ＭＡ中の残基（ロ）についてみると、残基（
ロ）の存在は、前述のように生成物であるＮＣ８誘導体
（Ｉ）において半エステル化マレイン酸残基（ｂ）を与
えることによってかかるＮＣ８訪導体の腫瘍親オ

【Ｊ性
を高める効果を与える点で１ｆＬ要である。 しかしながら残基（ロ）中のアルコール残基があまり炭
素数の多いものであると、Ｅ−８ＭＡの水性反応溶媒へ
の溶解性が不良とな）好ましくない。Ｅ−８ＭＡ中の残
基（ロ）は、スチレン無水マレイン酸共重合体をアルコ
ールと反応させて一部の無水マレイン酸残基にアルコー
ル分子を付加し開環させることによって導入されるもの
であるが、残基（ロ）中のアルコール残基を与えるアル
コールとしては、前述のＮＣ８誘導体の部分半エステル
化スチレンマレイン酸共重合体残基の構造について示し
たとおシ炭素数が１ないし４のアルカノールとしてメタ
ノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプ
ロピルアルコール、ｎ−フーｙ−ルアルコール、イソブ
チルアルコール、８６Ｃ−ブチルアルコールおよびｔｅ
ｒｔ−ブチルアルコールが；ア２１− ルキル基の炭素数が１または２のエチレングリコールモ
ノアルキルエーテルとして２−メトキシエタノールおよ
び２−エトキシエタノールか：アルキル基の炭素数がＪ
ｔだ＃ｊ２のグリセリンシアルギルエーテルとして２，
３−ジメトキシ−１−プロパツール、２−エトキシ−３
−メトキシ−１−プロパツール、３−エトキシ−２−メ
トキシ−１−プｑ　ハノール、２．３−ジェトキシグロ
バノール、１．３−ジメトキシ−２−プロパツール、１
−エトキシ−３−メトキシ−２−プロパツールおよび１
゜３−ジェトキシ−２−プロパツールが４０−ｔ’うれ
る。 本発明においては出発原料として用いられるＥ−８ＭＡ
について上述のような構成のものが好まし囲にるること
が必要である。 式（ＩＶ）は、すでに規定したＮＣ８誘導体中のＥ−８
ＭＡに由来スる部分牛エステル化スチレンマレイン酸共
重合体残基部分の平均分子量範囲に対比するものである
。原料の］ｌｉＣ−ＨＭＡには分子量分布２２− が存在しており、かかる分布の中で比較的高い分子量域
にあるＥ−ＳＭＡ分子はど、ＮＣ８との反応位置である
無水マレイン酸残基の平均含有数が多いためＮＣ８との
反応性が比較的高（、ＮＣ８との反応後にＮＣ８誘導体
中の部分半エステル化スチレンマレイン酸共重合体残基
を形成する確率が高くなる。この結果、原料Ｅ−８ＭＡ
の重量平均分子量と生成するＮＣ８誘導体中のかかる共
重合体残基の平均分子量とでは厳密には差異があり、後
者は前者に比べてやや高い値になる傾向がある。 しかしながら、後述の実施例からも明らかなようにこの
差異はそれほど大きなものではなく、実質的にＥ−ＳＭ
Ａの重量平均分子量は部分半エステル化スチレンマレイ
ン酸共重合体残基の平均分子量にほぼ対応するものと考
えてさしつかえない。 本発明のＮＣ８誘導体を製造するためには、特に、重量
平均分子量が２，５００以下であり、かつ式（Ｖ）で示
される特定の狭い分子量分布を有するＥ−８ＩＶＩＡを
反応に用いることか重要である。本発明のＮＣ８誘導体
は反応液のゲル濾過においてＥ−ＳＭＡの加水分解開環
物よジもはやく溶出するものの、両者はかなりの部分に
おいて重複して溶出する傾向がある。しかしながら、上
記のように平均分子量および分子量分布を調整したＥ−
ＳＭＡをＮＣ８との反応に用いた場合、反応後の反応液
中に存在するＮＣ８誘導体（１）に比しＥ−ＳＭＡの加
水分解開環物の分子サイズが充分小さいためゲル濾過に
おける両成分の溶出時間差が充分に大きくなり、また両
成分の分子量分布幅が充分に狭いためゲル濾過における
両成分の個々の溶出時間の幅が充分に狭くなる。この結
果として、ゲル濾過による両成分の分離性がよくなりＮ
Ｃ８誘導体（１）の単離が可能になる。 本発明のＮＣ８誘導体を製造する上においては、上述の
よりなＥ−ＳＭＡを用いるが、用いたに一８ＭＡによっ
て、生成するＮＣ８誘導体の部分半エステル化スチレン
マレイン酸共重合体残基の構成も決ってくることになる
。かかるＥ−ＳＭＡはスチレン無水マレイン酸共重合体
（以下、ＳＭＡと略記する）を部分半エステル化するこ
とによって得られる。しかしながら、通常の重合条件に
よって製造されるＳＭＡは、分子量分布が広く分子量分
布指数（Ｍｗ／Ｍｎ）が約２．０またはそれ以上でおる
。かかるＳＭＡを部分半エステル化して得られるＥ−Ｓ
ＭＡはやはシかかる広い分子量分布を維持しているため
、このＥ−ＳＭＡをＮＣ８と反応させても、反応生成物
中よりゲル濾過によってＮＣ８誘導体（１）を単離する
ことは困難である（後述の比較例２参照）。従って、通
常の方法に従って重合した分子量分布の広いＳＭＡを部
分半エステル化する前か後で分別することによって分子
量分布を調整するととが好ましい。分別方法としては溶
解度法または限外沢過法等を用いることができるが、最
も好ましいものはＳＭＡを分別溶解法によって分別し、
得られた分子量分布の狭いＳＭＡを次に部分半エステル
化することによって１ｌｉｌニ−ＳＭＡに変換する方法
である。かかるＳＭＡの部分半エステル化反応は、用い
るアルコールの種類および使用量（ＳＭＡに対するモル
比率）によって生成するＥ−ＳＭＡのアルコール残基の
種類および無水２５− マレイン酸残基の含有率を任意に調整することができる
。 このようにして得られたＥ−ＳＭＡは、次に水性溶媒中
でＮＣ８と反応せしめる。目的とするＮＣ８誘導体の構
造式（１）から明らかなように、ＮＣ８１分子に対して
２分子のＥ−ＳＭＡが反応して結合すればよいため、理
想的にはＥｌニーＳＭＡの使用量はＮＣ３Ｉモルに対し
て２モルである。しかしながら、実際には前に記したよ
うに、Ｅ−ＳＭＡ中の無水マレイン酸残基部分は％ＮＣ
８分子中の１級アξノ基および水分子と競争的に反応し
て、あるものはＮＣ８分子との間で酸アミド結合を形成
し、またあるものはマレイン酸残基に変換されるため、
Ｅ−ＳＭＡの中にはＮＣ８と全く反応することなく加水
分解・開環し部分半エステル化スチレンマレイン酸共重
合体に変換されるものがあり、かかる開環物はもはやＮ
Ｃ８と反応することはできない。 従って、Ｅ−ＳＭＡはＮＣ８に対して理論モル比率より
も過剰に使用する仁とが必要である。すなわち、反応せ
しめる上で使用すべきＢ−ＳＭＡおよび２６− ＮＣ８の重量関係についてみると、Ｅ−８ＭＡの重量平
均分子量が式（ＩＶ）で示されるように８００〜２．５
００でありＮＣ８の分子量が１０，７００であることか
ら、Ｅ−８ＭＡの使用量は、その平均分子量によっても
異なるが、ＮＣ３Ｉ重量部に対して０．１５重量部（重
量平均分子量が８０００Ｅ−８ＭＡの場合）ないし０．
４７重量部（重量平均分子量が２，５００のＥ−８ＭＡ
の場合）よりも過剰であることが必要である。特に、Ｅ
−８ＭＡの平均分子量が小さい場合あるいは無水マレイ
ン酸残基の含有率が低い場合などには、１分子当りに含
有される無水マレイン酸残基の平均個数が少なく、その
よりなＥ−８ＭＡは無水マレイン酸残基を全く有しない
（すなわちＮＣ８との反応性を全く有しない）Ｂ−８Ｍ
Ａ分子の存在割合が高いため、Ｅ−ｆ９ＭＡを大過剰使
用することが重要である。ＮＣ８とＥ−８ＭＡとの反応
率を充分に高くするためには、ＩＤ−８ＭＡの使用量は
上記のようにＥ−８ＭＡの平均分子量、構造などによっ
て異なるものの、一般にＮＣ８１重量部に対して２重量
部以上１５重量部以下であることが好ましく、さらに好
ましくは３重量部以上１２重量部以下である。Ｅ−８Ｍ
Ａの使用量がＮＣ３Ｉ重量部に対して１５１ｉｔ部よシ
も多い場合、反応後の溶液中にＮＣ８との反応に与らな
かったＥ−８ＭＡの加水分解開環物が多く存在するため
、次の分離操作上の能率が悪く実用的ではない。 さらに、ＮＣ８とＥ−８ＭＡとの反応において、反応溶
液中でのＮＣ８とＥ−８ＭＡとを合計した濃度は１０重
量％以上３５重量優以下であることが好ましく、１５重
１にチ以上３２重量％以下であることがさらに好ましい
。かかる反応溶液中における合計濃度が１０重量％を下
まわる場合にはＮＣ８とＥ−８ＭＡとの反応速度が小さ
くＥ−８ＭＡ中の無水マレイン酸残基は加水分解を受け
る機会が増加するため、充分に高いＮＣ８の反応率を得
ることは困難になる。逆に、ＮＣ８とＥ−８ＭＡとの合
計濃度が３５重量％を上まわると反応溶液の粘度が高く
なりすぎ、攪拌が困難になるため好ましくない。 また、ＮＣ８とＥ−８ＭＡとの反応は、通常、重炭酸ナ
トリウム、酢酸ナトリウムまたはｌ炭酸アンモニウム等
の水性塩溶液中にＮＣ８を溶解しておき、次にこの溶液
に粉末状のＥ−８ＭＡを添加することによシ実施される
。これらの水性塩の濃度は特には規定されないが、水浴
液の川は７．５以上９．５以下、さらに望ましくは８．
０以上８．７以下に常時、維持されていることが好まし
い。溶液の川が７．５よシも小さい場合には、Ｅ−８Ｍ
Ａは水溶液に不溶または難溶となり、ＮＣ８との反応に
充分な溶解濃度にすることができないか、あるいは溶解
に長時間を要するため実用的でない。また反応溶液の…
が９．５よりも大きい場合には、溶液中でＮＣ８の生物
活性が低下するおそれがあシ好ましくない。さらに、Ｎ
Ｃ８の生物活性を失なわないためには、遮光下で、１５
℃以下の比較的低い温度で反応させることが好ましい。 以上のような反応条件を選ぶことによって、ＮＣＳ　、
！ｌ：Ｅ−８ＭＡとの反応におけるＮＣ８中の１級アミ
ノ基の反応率は、後述の実施例に示すように約９０モル
チ以上、多くの場合は約９５モルチ２９− 以上という高い数値を実現することが可能となる。 このような高反応率にすることにより、未反応ＮＣ３Ｆ
ｉ実質的に消滅しかつＮＣ８の２個の１級アミノ基のう
ち１個のみがＢ−８ＭＡと反応して生成する式（Ｍ）で
示される中間物質は極めて少なくなる。一方、ＮＣ８の
１級アミノ基の反応率の向上につれて式（■）、（■’
）　、（ＩＸ）に示される副生成物が増加すると予想さ
れたが、意外にもこれらの副生成物は少なく本発明の目
的物の生成率が非常に高いことが判明した。またこれら
副生成物は以下に述べる精製法によシ分離除去すること
ができる。 次に、得られた反応液をゲル濾過することによシ反応液
から本発明のＮＯ８１％導体が単離される。 ゲル濾過に用いる担体は、排除限界分子量が球状タンパ
クで５０，０００〜１５０，０００、好ましくは６０．
０００〜１００，０００のものの中から選ばれ、本発明
のＮＣ８誇導体（１）を得る上で特に好ましいものはセ
ファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（これらはスウェー
デン国、ファーマシア社製）およびバイオゲルＰ−６０
，Ｐ−１００（これらは米国、バイオ３０− −ランド社製）である。その他のゲル濾過条件について
は溶出液のクロマトグラムにより分離状態を判断するこ
とによって任意に好ましいものを選定することができる
。なお、ゲル沢過を有効に実施するためには、ＮＣ８と
Ｅ−８ＭＡとの反応終了後の反応液をゲル沢過する前に
、予め球状タンパクの分画分子量が１０，０００程度の
透析チューブまたは限外沢過膜を用いて透析または限外
Ｐ遇することによって、脱塩と同時に部分的に、ＮＣ８
とは未反応のＥ−８ＭＡの加水分解開環物を除去してお
くととが好ましい。 本発明のＮＣ８誘導体（１）は、上記のようなゲル濾過
によシ他の反応生成物より分離して溶出する。かかる分
取した溶出液は次に凍結乾燥等の手段によって溶媒除去
され、本発明のＮＣ８誘導体（Ｉ）が単離される。この
ようにして単離式れた物質が式（１）のような構造を有
するものであることは、後述の実施例に示される同定デ
ータより確認された。 本発明のＮＣ８誘導体（１）をヒトに投与するには、癌
の原発部位、手術後の癌摘出部位等の局所組織内投与法
、皮肉、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、経口等の投与
法、及び局所への塗布、噴霧、生薬、膀胱内注入の外用
的投与法が好適である。 投与前は投与法と癌の悪性度、癌のＳ類、患者の病状及
び一般状幅、癌の進行度等によって一定ではなく、また
手術後等のリンパ節転移予防等の目的か、あるいは治療
目的かによって異なるが、例えば動脈内投与の場合、１
回に最高５■で半月ごとに１回、また静脈内投与の場合
、１回に１〜３岬で半日ごとに１回ずつ投与するのが好
ましい。 局所塗布、経口投与法では更に投与量を増量することも
可能である。 なお、本発明のＮＣ８誘導体（１）ＵＸＸ線造影ソリビ
オドール超音波によシ懸濁可溶化する。本発明のＮＣ８
誘導体（■）１〜２岬／リビオドール１　ｗｅの油性製
剤を動脈内投与すると、腫瘍血管内にリビオドール及び
当該薬物が長期にとどまるので、強力に抗腫瘍効果を発
揮する。また、リビオドールに懸濁可溶化することによ
り、本発明のＮＣ８誘導体（１）が局所に滞留する状態
がＸ線によって観察することができる。 本発明のＮＣ８誘導体（１）は、後述の実施例に示すよ
うに従来の式（ＩＩＩ）で示されるＮＣ８複合体に比し
はるかにＮＣ８に近い高いルテア活性を示す。このため
、１回当りの投与量が制限されている上記のような動脈
注射において優れた効果がある０ また、本発明のＮＣ８誘導体（１）は１〜９％重炭酸ナ
トリウム水溶液に溶解する。この水溶液を静脈内に投与
すると、当該薬物はリンパ管に多く分布するので強力な
制癌作用を発揮する。本発明のＮＣ８誘導体（Ｉ）は、
全血中におけるルテア活性の半減期が約１０〜３０分で
あり、ＮＣ８の半減期が約２〜３分であるのに比し、活
性効果がはるかに長い期間持続することが後述の実施例
において確認されておｊ５、ＮＣ８では不充分であった
抗腫瘍活性の持続性が大幅に改善されている。このため
、上記のような静脈注射においても少ない投与回数で優
れた効果を示す。 ３３− なお、いずれの投与経路の場合でも、ＮＣ８＃導体（１
）は腫瘍組織（部位）によく集積する。かかる部位にお
いてＮＣ８誘導体（１）は、そのままあるいは一部は加
水分解を受けてＮＣ８が遊離し抗ｊ道瘍性を発揮し、そ
の後はＮＣ８部分、部分半エステル化スチレンマレイン
酸共重合体部分がいずれも体外に排出されるため安全で
ある。 このように、本発明のＮＣ８誘導体（１）は抗癌剤とし
て非常に優れた効果を示す。 以下、実施例を挙げて本発明を説明する。 実施例１ （１）〔スチレン無水マレイン酸共重合体の重合〕１５
０を内容積の耐圧容器にクメン３０ｔを充填し、これを
１５０℃に加熱しておきながら、無水マレイン酸３．５
ｋｇ、クメン２０ｔ１スチレン３．７輪および過酸化ベ
ンゾイル２００？からなる均一溶液を６５分間で連続的
にフィードした。フィード後も１５０℃で６０分間攪拌
を続けた後、室温まで冷却しｎ−ヘキサン３０１を加え
ることによりて生成ポリマーを析出させた。液相を除去
３４− して析出したポリマーを取出し、粉砕後、ｎ−ヘキサン
で洗浄し乾燥した。得られたポリマーＭは７．３梅であ
った。蒸気浸透圧法（以下Ｖ２Ｏ法と略記する）でめた
数平均分子ｉｔ（Ｍｎ）は１，６８０であった。また、
核磁気共鳴スペクトル測定によシ、得られたポリマーは
スチレンと無水マレイン酸のモル比が１８１の共重合体
であることが確認された。 （２）〔スチレン無水マレイン酸共重合体の分別〕（１
）で得たスチレン無水マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）４
０Ｆを７セト：／１．４ｔに溶解し、表面シラン処理を
したガラスピーズ（平均粒径０．１ｇｍ）３．８ｋｆを
加えた後アセトンを蒸発させることによってガラスピー
ズ表面にＳＭＡを付着させた。 内径８０■、長さ８０ｃｒｎのカラムに上記のＳＭＡヲ
付着したガラスピーズとアセトン−ｎ−ヘキサン混合液
（２５℃における容積比が８８９２であるもの）１．４
ｔを充填した後、系の温度を２５℃に保ちつつ３種のア
セトン−ｎ−ヘキサン混合液を順次（アセトンとｎ−ヘ
キサンとの２５℃における容積比が、（１）８：９２の
もの０．６　ｔ、　（ｉＤ　２２！　７８　（１）もノ
３．ＯＩｓ　（ＩｉＨ４：　６ｃ、　ｏも）３．０　ｔ
の順に）フィードしながら下部より液を溶出させた。上
記のアセトンとｎ−ヘキサンとの容積比が３４１６６の
混合液をフィードしている間の溶出液を減圧下濃縮し乾
燥することによって６．３１の試料を得た。かかる試料
をゲルパーミェーションクロマトグラフィ（以下、ＧＰ
Ｃと略記する）で測定したところ、重量平均分子ｆｉ：
（Ｍｗ）は１，３５０゜数平均分子量（Ｍ　ｎ　）け１
，１７０　（Ｍｗ／Ｍｎ＝　１．１６　）であった。な
お、ＶＰＯ法で測定したＭｎは１．１７０であった。 （Ｉｌｌ）　Ｃ分別、ｓ　Ｍ　Ａの部分半ｎ−ブチルエ
ステル化〕（２）で得た分別ＳＭＡ６．Ｏｒ、ｎ−ブチ
ルアルコール１．９５Ｆ、ジオキサンＪ５ｍｌおよび酢
酸リチウム０．０６　Ｆを試験管に入れ封管した後、２
４時間室温で振とうして均一に溶解した。この醪沼を９
０℃に１７時間保った後、水湯に冷却して反応液を取出
し、ジオキサンで２倍に希釈して凍結乾燥し、ついでさ
らに真空乾燥して淡黄色フレーク状の物質を得た後、こ
れを粉砕して７．８２の粉末を得た。これをＫＢｒ粉末
ディスクにより赤外熱吸収スペクトルを測定し、波数１
，７８０　ａｔｒ　’と７００ｃｔｎ’での光学密度よ
シ、かかる粉末は残存無水マレイン酸埋含有率が３０．
５モル％（１分子中に含まれる無水マレイン酸環は平均
１．７個である部分半ｎ−ブチルエステル化スチレン無
水マレイン酸共重合体（以下、Ｂｕ−ＳＭＡと略記する
）であることが確認された。ＧＰＣによりＭｗは１，４
８０．Ｍｎは１．２９０であり、Ｍｗ／Ｍｎは１．１５
であった。 （４）（Ｎ　ＣＳ　、！：Ｂｕ−８ＭＡとの反応〕ネオ
カルチノスタチン（ＮＣ８）０．２０ｒを０．８Ｍ重炭
酸す）　ＩＪウム水溶液５．０　ｔｎｌに水冷、遮光下
で浩解し、攪拌しつつ粉末状のｎｕ−ＳＭＡを数回にわ
けて計１．０２Ｆ添加した。このようにして溶液の川を
８．５前後に維持しながら９７時間反応させたところ、
ＮＣ８の１級アミノ基の反応率は９７．５モル優に達し
た。なお、かかる１級アミノ基の反応率は、反応液より
株数した少量の試料全希釈してトリニトロベンゼンスル
ホン酸を反応３７− させ生じたニトロベンゼン紡導体を可視部吸収スペクト
ロメータによシ分光学的に１級アミン基を定量する方法
（以下、ＴＮＢＳ法と略記する）に基づいて決定するこ
とができる。 得られた反応液を分画分子［８，０００の透析チューブ
（ユニオンカーバイド社製、米国）に移し、水冷、遮光
下で５ｍＭｆｉ炭酸アンモニウム水溶液に対して、外液
を度々とりかえながら３日間透析した。 かかる粗精製溶液の一部を］０ｍＭ重炭酸アンモニウム
水溶液で希釈し、ｆ４１７．９で、東洋曹達■製Ｇ−３
０００８Ｗカラムを用いて描かせたＧＰＣ曲線を第１図
に示す。波長２５４　ｎｍおよび２８０ｎｍ双方の紫外
線に対して極大ピークを示す保持時間１６分の吸収は、
ＮＣ８誘導体（１）であシ、２５４　ｎｍに対してのみ
極大ピークを示す保持時間１９分の吸収はＢｕ−ＳＭＡ
の加水分解開環物である０ （５）　［Ｎ　Ｃ８訪導体（１）の精製〕透析後の反応
液のうちの１／２を、セファデッ３８− クスＧ−７５（ファーマシア社、スウェーデン国）を充
填した内径５０１ｍ、長さ６０ｔ：ｍのカラム（Ｋ６０
／６０、ファーマシア社、スウェーデン国）に注入し、
１０℃、遮光下で５ｍＭ３ｔｊ炭酸アンモニウム水溶液
をキャリヤーとし、流速６．０　ｍｅ　７ｍ　ｉ　ｎで
溶出した。溶出液は波長２５４　ｎｍにおける吸収を連
続的に測定し、レコーダー上にクロマトグラムを描かせ
てモニターした（第２図）。試料注入開始よシロ０分か
ら１００分の間での溶出液を分取し、これを４℃以上に
ならない条件で凍結乾燥した。この操作を透析後の残り
の反応液に対しても同一条件で緑返した。とのようにし
て得られたｆｆＩ製ＮＣ８誘導体（１）は合計１８６〜
であった。 得られたＮＣ８誘導体はドデシル硫酸ナトリウムを含有
するポリアクリルアミドディスクゲルを用いて電気泳動
測定したところ単一スポットを示した。東洋曹達■製Ｇ
−３ＱＯＯ８Ｗカラムを用い１０ｍＭ重炭酸アンモニウ
ムを移動相とし、Ｆｔ（７，９で測定したＧＰＣは第３
図（ａ）に示すように鋭い単一ピークを示した。 ＴＮＢＳ法により、１級アミノ基の存在は認められなか
った。 元素分析の結果は、Ｎ１１１．４３重皿％、Ｃ：５１．
９９重量％、ｆ−Ｉ：６．３２重皿％であった。 かかる窒素含有率に基づ（ＮＣ８）ｌ導体の平均分子量
は１３，３００である。かかる平均分子Ｍｄ１、下記式
（Ｘ）　、、、　、、／１．ｌｄＭｄ　＝嗜翻ｌＮＦ３
５！４　（Ｘ） Ｎ る。水モはＮＣ８の元素分析による窒素含量を表Ｎ目 し、曇今＝１４．２４東量−とする。ＮｄはＮＣ８誘導
体の元素分析による窒素含量（重量％）を表す。〕によ
って算出した。一方、式（１）で示されるＮＣ８誘導体
の平均分子量は、ＧＰＣによりめたＥ−ＳＭＡの重量平
均分子ｉｔｌ、４８０に基づくと１０．７００＋１．４
８０Ｘ２＝１３，６６０であるが、前述の窒素含有率に
基づく平均分子量はこの値とよく一致しているため、本
実施例で得られたものは、式（１）で示されるように１
個のＮＣ８残基に２個の部分半エステル化スチレンマレ
イン酸共重合体残基が結合していることがわかる。この
ようにして決定したＮＣ３ｐ導体の平均分子量（Ｍｄ）
より、ＮＣＳ誘導体中に含有される部分中エステル化ス
チレンマレイン酸共重合体残基部分の平均分子量（Ｍｒ
）は下記式（ＸＩ） Ｎ Ｍｒ　＝　（Ｍｄ　−抛も）／２　（ＸＩ）〔式中、Ｍ
ｒｉｔＮＣ８誘導体中の部分半エステル化スチレンマレ
イン酸共重合体残基部分の平均分とする。〕 に基づいてめられる。かかる方法によるとＭｒ、−１，
３００であった。この値は、ＧＰＣによ請求めた原料の
Ｅ−ＳＭＡの重量平均分子量１，４８０に比して大差な
い。 融点測定を試みたが明瞭な融点を示さなかった。 ＫＢｒ錠剤法による赤外部吸収スペクトル（以下、ＩＲ
スペクトルと略記する）を第４図（ａ）に、０．５Ｍ重
炭酸水溶液中での紫外可視部吸収スペクトル４１− （以下、ＵＶスペクトルと略記する）を第５図（ａ）に
示す。これらのスペクトルは式（１）で示される本発明
のＮＣ８誌導体の構造を支持する。 実施例２ 実施例１（１）で得たＳＭＡを分別する際、第３のアセ
トン−ｎ−ヘキサン混合液として３８８６２のものを用
い、他は実施例１（２）と同様にして分別しＭｗ　１，
４８０、Ｍｎ　１，２３０　（Ｍｗ／Ｍｎ　１．２０　
）の分別ＳＭＡを得た。かかる分別ＳＭＡのうち４．Ｏ
ｖをｘｆｉ／−ルｏ、８０　？、ジオキサ７１’ｌ＊ｌ
、酢酸リチウム４０ηを用い、他は実施向１（８）と同
一条件でエステル化し、無水環含有率２４．θモル％（
１分子当シの無水環は平均１．６個）の部分半エチルエ
ステル化スチレン無水マレイン酸共］ｉ合体（以下、Ｅ
ｌ：ｊ−ＳＭＡ、！：略記する）４．９Ｆを得た。ＭＷ
は１．５８０、Ｍｎは１，３４０、Ｍｗ／Ｍ　ｎ　＝　
１．１８であった０ 実施例１（４）と同様に、０．２ｆのＮＣ８を０．８Ｍ
の重炭酸す）　Ｕラム水溶液５．０肩ｅに溶解した後。 １．２ｆのＥｊ−ＳＭＡを数回に分けて添加した。か４
２− かる反応中、溶液の田は８，５前後に維持した。添加開
始よシ２７時間後、１級アミン基の反応率は９７．５モ
ル％であった。反応液を直ちに透析して得られた透析液
３１３　ｗｇをゲル沢過した後、凍結乾燥し１４８■の
精製ＮＣ３誘導体（１）を得た。 かかるＮＣ８誘導体は電気泳動法で単一スポットを示し
た○ａｐｃは第３図（ｂ）に示す。ＴＮＢＳ法により１
級アミノ基は検出されなかった。元素分析値は、Ｎ：Ｉ
Ｏ，７４重量％、Ｃ；　５２．９０創１、Ｈｘ６．１８
重量％であった。これに基づく平均分子量は１４，２０
０であり、部分中エチルエステル化スチレンマレイン酸
共重合体残基部分の平均分子量は１，７５０であった。 ＩＲスペクトルおよびＵＶスペクトルは第４図（ｂ）お
よび第５図（ｂ）に示す。 これらのデータから、式（１）で示される本発明のＮＣ
８訪導体の構造は確認された。 実施例３ 実施例１（１）で作成したＳＭＡを、アセトン−ｎ−へ
キサン混合液の第２液、第３液におけるアセトン容積が
それぞれ２３％、３７％であるものを用いて実施例１（
２）と同様にして分別し、Ｍｗｌ、４８０．Ｍｎ　１，
２５０　（ＶＰＯ法ではＭｎ　１，２３０　）、Ｍｗ／
Ｍｎ＝１．１８の分別８ＭＡｆ：９．１ｒ得た。かかる
分別ＳＭＡのうち４．０１を、アルコールとしてエチル
セロソルブ１．６０り、酢酸リチウム０．０４２とを用
いて、実施例１（８）と同様にして反応し、無水環含有
率２５．４モル％（１分子当りの無水環は平均１．６個
）、Ｍｗ　１，７００、Ｍｎ　１，４４０　（Ｍｗ／Ｍ
ｎ＝１．１９）の部分中２−エトキシエチルエステル化
スチレン無水マレイン酸共重合体（以下、Ｅｔ−Ｃｅｌ
ｌ−ＳＭＡと略記する）を４．９１得た。 実施例１（４）と同様にして、ＮＣ８０，２ｒｅ溶解し
た０、８Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液５．　Ｑ　ｍｅに、
　Ｆｄ−Ｃｅｌｌ−８ＭＡ計１．３２を数回に分けて添
加溶解した。溶液の所を８．５前後に維持しながら反応
させ、Ｅｔ−Ｃｅｌｌ−ＳＭＡ　添加開始より９８時間
経過した時、アミノ基反応率は９７．６モル％となった
。かかる反応液を透析、ゲル沢過、凍結乾燥することに
よって１８９キの精製ＮＣ８誘導体（１）を得た。 かかるＮＣ３ｐ導体は電気泳動法で単一スポットを示し
た。ＧＰＣは第３図ＣＣ）に示す。ＴＮＢＳ法により１
級アミノ基は検出されなかった。元素分析値は、Ｎ：１
０．７２重量％、Ｃ：　５３．４９劃０、Ｈｓ６．３８
重量％であった。これに基づく平均分子量は１４，２０
０であり、部分中２−エトキシエテルエステル化スチレ
ンマレイン酸共重合体残基部分の平均分子量は１，７５
０であった。ＩＲスペクトルおよびＵＶスペクトルは第
４図（ｅ）および第５図（Ｃ）に示す。これらのデータ
から、式（１）で示される本発明のＮＣ３ｐ導体の構造
は確認された。 実施例４ 実施例２で得た分別ＳＭＡ６．Ｏｒにｎ−ブチルアルコ
ール１．６０ｆ、ジオキサン１６ＷＬｌおよび酢ＩＩ　
＋７チウムＯ，０６Ｆを用いて部分半エステル化し、無
水環含有率４４．４モルチ（１分子当）の無水環は平均
２．８個）のＢｕ　−ＳＭＡ　４３．３　ｔを得た。Ｍ
Ｗは１．６６０　、　Ｍｎは１，３９０　（Ｍｗ／Ｍｎ
　＝　１．１８　）であった。かかるＢｕ−ＳＭＡを実
施例１（４）と同様にして７０時間反応させたところＮ
Ｃ８の１級アミノ基の反応率は９９．３モル％であった
。以下、生成物４５− を透析、ゲルｒ週、凍結乾燥し、１８２〜の精製ＮＣ８
綽導体（１）を得た。元素分析値は％　Ｎ！１０．６７
１４４’％、　Ｃ：　５２．０６］ｔ−ｊｉ目、Ｈ：６
．２２重量％であった。平均分子量は１４，３００であ
り、部分中ｎ−ブチルエステル化スチレンマレイン酸共
重合体残基部分の平均分子量はｉ、ｓ　ｏ　ｏである。 実施例５ 分別したＳＭＡをメタノールにより、部分中メチルエス
テル化して無水環含有率２５．０モルチ（１分子尚シの
無水環は平均１，７個）　、　Ｍｗ　１，５］　ＯＭｎ
　１，２８０　（Ｍｗ／Ｍｎ　−１，１８）　ノ部分半
メチＡ／　ｘ　ｘチル化スチレン無水マレイン酸共重合
体（以下、Ｍｅ−ＳＭＡと略記する）を得た。かかるＭ
ｅ　−ＳＭＡを実施例２と同様にしてＮＣ８と反応させ
た後に精製し、対応するＮＣ８誘導体（１）を単離した
。元素分析値は、Ｎ：］００．８７重量％Ｃ；５２．８
１重量％、ａｓａ、１ｉ重量％であった。平均分子量は
１４，０００であわ、部分中メチルエステル化スチレン
マレイン酸共重合体残基部分の平均分子量は１，６５０
である。 ４６− 実施例６ 分別したＳＭＡを１．３−ジェトキシ−２−プロパツー
ル６により部分半エステル化して無水環含有率２５．３
モル％（１分子量りの無水環は平均１．６個）、Ｍｗ　
１，９６０　、Ｍｎ　１，６５０　（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．
１９）の部分半】−（エトキシメチル）−２−エトキシ
エチルエステル化スチレン無水マレイン酸共重合体を得
た。かかる共重合体を実施例３と同様にしてＮＣ８と反
応させた後に精製し、対応するＮＣ８誘導体（１）を単
離した。元素分析値は、Ｎ１１０．２５重量％、Ｃ：５
３．５８重量％、Ｈ：６．５１重量％であった。平均分
子量は１４，９００であわ、部分半１−（エトキシメチ
ル）−２−エトキシエチルエステル化スチレンマレイン
酸共重合体残基部分の平均分子量は２，１００である。 実施例７ 実施例１〜３で得られたＮＣ８訪導体についてサルシナ
・ルテア菌に対する抗菌活性（ルテア活性）を測定した
。サルシナ・ルテアＰＣＩＩＯ０１株を接種した寒天培
地上に各種濃度のＮＣ８誘導体の希釈液を直径８＋ｗの
円状に広げ、これを３７℃で１２時間培養することによ
って阻止円直径が１３１１ＩＩＩ＋になる希釈液濃度を
め、それをＮＣ８におけるかかる有効濃度を１とする相
対値で示すことによってルテア活性の指標とした。マウ
スに対する急性毒性として、生後５〜６週令の雄性のＩ
ＣＲ系マウス（１群６匹）に対し尾静脈内１回投与し、
この後１４日間観察することによってＬＤｉｏを測定し
た。これらのルテア活性および急性毒性のデータは第１
表に示す。本発明のＮＣ８訪導体はＮＣ８に近いルテア
活性を有していながら、急性毒性は大幅に低減されてい
ることがわかる０ また、ヒトの新鮮血中１００μｔ／ｍｌとして３７℃で
インキュベートしながら残留ルテア活性を測定すること
によって得た不活化曲線を第６図に示す。この図から全
血中でのルテア活性の半減期は、実施例１ＯＮＣ８訪導
体が３２分、実施例３のＮＣ８誘導体が８分である。対
照のＮＣ８はかカーる半減期が２〜３分であり、これに
比して本発明０ＮＣ８訪導体は全血中での活性の持続性
がはるかに優れていることがわかる。 さらに、実施例１のＮＣ８９導体を用いて、エールリッ
ヒ固型癌に対する抗腫瘍活性を検定した。 その結果を第２表に示す。本発明のＮＣ８誘導体はＮＣ
８と同程度の腫瘍阻止性を有していることがわかる。 第　１　宍 １）阻止円直径が１３ｍとなる濃度を、ＮＣ８を基準と
する相対値で示した。 ４９− 第２表 腫瘍；エールリッヒ固型癌 移植細胞数！５Ｘ］０６個／マウス（皮下）マウス：　
ｄｄＹ、♂、５週令 投与＝腹腔内、腫瘍移植後１．２．４．５．６日目に１
回ずつ（計５回） 判定：腫瘍阻止率（チ）−（Ｃ−Ｔ）Ｘ１００／Ｃ但し
、Ｃ：対照群の平均腫瘍サイズ（−）Ｔ！治療群の平均
腫瘍サイズ（−） 腫瘍移植後２週目にて判定 生存率工腫瘍移植後４週目にて判定 ５０− 比較例１ 試験管中にＭｗ　３，５２０、Ｍｎ１ｓａｏ、Ｍｗ／Ｍ
　ｎ＝１．９２のスチレン無水マレイン酸共重合体１０
？。 酢酸リチウムＯ，１ｒ、ｎ−ブチルアルコール２．８１
およびジオキサン２５Ｉ１１１！を仕込み、上部を溶封
したのち２４時間室温で振とうして均一に溶解した。つ
いで得られた溶液を１５時間加熱し、しかる後室温に冷
却してから反応液を取シ出し、ジオキサンにて約２倍に
希釈してから凍結乾燥し、ついでさらに真空乾燥して淡
黄色フレーク状のＢｕ−ＳＭＡを得た。かかるＢｕ−Ｓ
ＭＡはＭＷ４，４９０、Ｍｎ　２，２８０　（Ｍｗ／Ｍ
ｎ＝　１．９６　）であり、残存する無水マレイン酸残
基の含有率は２８モモル優１分子当勺の無水環は平均２
．８個）でありｋ。 ＮＣ８０，５ｆを０．５　Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液５
０ｍ１に水冷、遮光下で溶解し、攪拌しつつ粉末状のＢ
ｕ　−ＳＭＡ　を加えた。３．ｏｙのＢｕ−ＳＭＡ　を
数回にわけて添加し、完全に溶解するまで十分に攪拌し
た。溶解後４〜６℃にて１６時間靜漬し、ＮＣ８の１級
アミン基の反応率は７１．７モル優に達した。なお攪拌
中反応系の川は８．３より８，７の間に維持されていた
。ついで反応液をセロファン中 チューブ中に移し、１０Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液】
ｔに対して加圧下に４〜６℃で３日間透析液を度々とり
かえつつ透析した。透析終了後の反応液を凍結乾燥し、
白色わた状の同形物として式（Ｄｌ）で示されるＮＣ８
複合体を得た。元素分析値はＮ：３．４２重量褒、Ｃ：
　６０．５１重量％、Ｈ；６．３６重量％でめった。こ
の窒素含有率に基づき式（Ｘ）を適用して得られた平均
分子量は約４４，６００であり、ＮＣ８残基１モルに対
して複合体を形成している部分半ｎ−ブチルエステル化
スチレンマレイン酸共重合体残基は平均約７モルである
。また、かかるＮＣ８複合体のルテア活性を実施例７の
方法によって有効濃度の相対値でめたところ、ＮＣ８が
１であるのに対し、本比較例のＮＣ８複合体は１８．０
であり、本発明のＮＣ８誘導体（１）に比して活性がか
なり低いことがわかる。 比較例′２ 比較例１で用いたＳＭＡを分別することなく部分半ｎ−
ブチルエステル化して無水理含有率２９．８モル％（１
分子当υの無水環平均含有数２．９個）、Ｍｗ４，４７
０、Ｍｎ　２，２８０　（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９６　）　
ｔＤ　Ｂｕ　−ＳＭＡを得た。かかるＢｕ−ＳＭＡを実
施例１（４）と同様にしてＮＣ８と反応させＮＣ８中の
１級アミン基反応率が９９．６モル優に至った。この反
応液を透析して得た粗精製溶液のＧＰＣを第７図に示す
。かかる溶液のＧＰＣは実施例１におけるＧＰＣ（第１
図）に比べて幅の広い曲線であり、かつ２８０μｍにお
ける光吸度（ｈ　２８０）と２５４１ｍにおける吸光度
（ｈ２５りとの比がｈ　２ｓｏ　／ｈ　５Ｉｓ４＝　０
．３６と低い（実施例］における第１図ではｈｓｓｏ／
ｈａｓ４−０．９０）ことから、ＮＣ８１１導体のピー
クとＢｕ−ＳＭＡの加水分解開環物のピークとは重積し
ていることがわかる。とのＧＰＣから明らかなよりに、
重量平均分子量が高く分子量分布の広いＢｕ−ＳＭＡを
用いた場合、生成したＮＣ８誘導体をかかる溶液中から
ゲル濾過によって単離することは不可能である。 ５３−

【図面の簡単な説明】

第１図はＮＣ８とＥ−ＳＭＡとの反応生成物の透析後の
ＧＰＣの例である。第２図は、かかる反応生成物のゲル
濾過におけるクロマトグラムの例である。第３図（ａ）
　、　（ｂ）および（Ｃ）は本発明のＮＣ８誘導体のＧ
ＰＣの例である。館３図（ｄ）は、本発明のＮＣ８訪導
体の原料であるＮＣ８のＧＰＣの例でおる。第４図（ａ
）　、（ｂ）および（Ｃ）は本発明のＮＣ３ｉ１％導体
のＩＲスペクトルの例である。第４図（ｄ）は本発明の
ＮＣ８誘導体の原料であるＮＣ８のＩＲスペクトルの例
である。第５図（ａ）。 （ｂ）および（Ｃ）は本発明のＮＣ８訪導体のＵＶスペ
クトルの例である。第５図（ｄ）は本発明のＮＣ８誘導
体の原料であるＮＣ８のＵＶスペクトルの例である。第
６図は本発明のＮＣ８誘導体および原料であるＮＣ８の
ルテア活性Ω不活化を示すグラフの例である。第７図は
分子量分布の広いＥ−ＳＭＡをＮＣ８と反応させた後、
透析して得た溶液のＧＰＣの例である。 ５４− 算　Ｉ　図 １０１２１４１６　＋８２０２２２４２６２１１　１０
１２１４１６旧２０２２２４保持時間（加　保持時角（
釦 鰐　２　閃 ０　５０　１００　１５０ イ呆持昨向　（介） 箸　３　ｇ ｆａ）　（ｂｌ 保持時＄１＋Ｔｈ）　保持時用（炉 区画の浄書（内容コニ変更なし） 第３　図 慕　４　図 （ａｌ ミ皮数（ｃｍ＝） （ｂ） り支　牧　（ｃｍ−’１ 図面の浄書・１内容に変更なし） 落　４　図 （Ｃ） 液　放　（ｃｍ’） 第　５　回 （０１（ｂ） シ文盲９ミ　（η、ｍｌ　ラ皮　長　（ｎ、ｍ）図面の
浄書（内容に変更なし） 痺５悶 （Ｃ）　（ｄ） 波長（ｎｍ）　ラ皮長（ｎｍ） 第　６　図 ＯＩｌｌ　３０　４５　ｇｏ　７５　９０下佑ｆ乙侍向
（今） 第　７　目 保持時開（介） 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 ネオカルチノスタチン誘導体及びその製造方法３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 倉敷市酒津１６２１番地 （１０８）株式会社り　ラ　し 代表取締役　上　野　他　− 東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１（６６７）山之
内製薬株式会社 代表者森　岡　茂　夫 東京都豊島区南池袋１丁目２４番５号 株式会社科薬抗生物質研究所 ４、代　理　人 倉敷市酒津青江山２０４５の１ 株式会社　り　ラ　し　内 電話東京０３　（２７７）　３１８２ ５、補正命令の日付 昭和５８年１１月２９日 ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 第３図、第４図及び第５図の各（ｅ）、　（ｄ）の図番
号を記載したものを別紙の通り提出する（内容に変更な
し）。 手続補正書（自発） １、事件の表示 昭和５８年特許願第１４５４１８号 ２、発明の名称 ネオカルチノスタチン誘導体及びその製造方法３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 倉敷市酒津１６２１番地 （１０８）株式会社　り　ラ　しく１４力＼２名）代表
取締役　上　野　イ也　− ４、代　理　人 倉敷市酒津青江山２０４５の１ 株式会社　り　ラ　し　内 ５補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、図面の簡単な説明の欄
および図面 ６、補正の内容 （１）明細書第１３頁第４行のｒ■Ｊを［■１に補正す
る。 （２）明細書第１５頁第７行の「関与しない」を１夾質
的に関与しない」に補正する。 （３）明細書第２５頁第９行の「通常の方法」のあとに
〔たとえば、ＵＳＰ　３，２４５，９３３　、特公昭４
７−４４５５２号等の記載にしたがって、連鎖移動剤と
しての機能をもつ溶媒（クメン、Ｐ−シメン、エチルベ
ンゼン等）の中で過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル等
の開始剤を用いてスチレンと無水マレイン酸を９０〜２
００℃で溶液重合させる。〕を挿入する。 （４）明細書第３０頁第１８行の「Ｇ−７５Ｊの前に１
Ｇ−５０、」を追加挿入する。 （５）明細書第３１頁第１１行の「好ましい。」のつぎ
に「まだ、反応液をゲル沖過にょシ予備精製したあと、
さらにゲル沖過を行う２段ゲル沖過法により本発明のＮ
Ｃ’Ｓ　ｐ導体を単離することもできる。・」を挿入す
る。 （６）明細書第３５頁第８行の１された」のあとに１（
第８図参照）−１を挿入する。 （７）明細書第３９頁第１０行の１これを４℃以上にな
らない条件で」を削除する。 （８）明細書第４０頁第１行〜第２行、第４３頁第７行
〜第８行および第４５頁第１行〜第２行のＪＴＮＢＳ法
により、１級アミノ基の存在は認められなかった。」を
削除する。 （９）明細書第４７頁第１５行の［−２，１００である
。Ｊのあとに行を改めて下記実施例を挿入する。 ［実施例７ 重合触媒として過酸化ベンゾイルのかわりに過酸化ジク
ミルを用い、その他の条件は実施例１　（１）　〜（３
）と同様にして作成したＢｕ　ＳＭＡ　（Ｍｗｌ、、６
２０　、Ｍｗ／Ｍｎ　１．１０　）を用いて次のように
してＮＣ８誘導体（Ｉ）を製造した。 ＮＣ８Ｏ，６７ｆを０．８Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液２
０ｒｎｌに水冷・遮光下で溶解し、攪拌しつつＢｕ　Ｓ
ＭＡを数回にわけて計ｓ、ｏｏ　ｆ　ｋ添加し、声を８
．３以上に維持しつつ、５０時間反応を行った。 ＮＣ８の１級アミノ基の反応率は９７．８モル％であっ
た。 得られた反応液を水で希釈して９ｏ−とし、セファデッ
クスＧ−７５（ファーマシア社、スウェーデン国）を充
填した内径５０．のカラム（充填長さ９０　ｃｘ　）に
注入し、５℃遮光下で５ｍＭ重次酸アンモニウム水溶液
をキャリヤーとし、流速４．０　ｍ／／ｍｉｎで溶出し
た。実施例１と同様に溶出液について波長２５４　ｎｍ
における吸収を測定しながら、試料注入後１時間４０分
〜６時間４０分の間での溶出液を分取した。分取液量は
１０５０−であった。これを限外沖過膜５Ｍ１４５３９
　（ザルトリウス社製、西ドイツ国、分画分子量１万）
を用いて６０ｍ／に濃縮した。 濃縮し九分取液のうちの％、３ｏ−をバイオゲルＰ−６
０（パイオヲッド社、米国）を充填した内径５０ｍ１Ｉ
のカラム（充填長さ６０．）に注入し、５℃遮光下で５
ｍＭ重度酸アンモニウムをキャリヤーとし、流速１．２
　ｒｎｌ／ｍｉｎで溶出した。上述と同様にして試料注
入後１２時間４５分〜１６時間５分の間での溶出液を分
取し、ついで、上記と同じ限外沖過膜を用いて濃縮し、
しかる後凍結乾燥して２６６．５■の精製ＮＣ８誘導体
（Ｉ）を得た。 得られた誘導体の元素分析値はＮ　：　１１．３１　重
量％、Ｃ：　５２．９７重量％、Ｈ：　６．４０重量％
であった。平均分子量は１３４７０であシ、部分半ブチ
ルエステル化スチレンマレイン酸共ｍ合体ｓｘ部分の平
均分子量は１３８５であった。Ｊａ１明細書第４７頁第
１６行および第５２頁第１４行の「実施例７」を「実施
例８」に補正する。 αυ明細書第５４頁第１９行の「例である。」のつぎに
［第８図は本発明のＮＣ８誘導体製造に用いるスチレン
無水マレイン酸共重合体の分別前の核磁気共鳴ヌベクト
ルの例である。」、を挿入する。 （イ）図面を別紙のとおシ追加する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　下記式（Ａ） Ｑ−０−＠＠　（Ａ） Ｃ式中、（９はネオカルチノスタチンの１位のアラニン
   残基中の１級アミノ基および２０位のりジン残基中の１
   級アミノ基からそれぞれ１個の水素原子を除いた２価の
   ネオカルチノスタチン残基を意味し、心０はスチレン残
   基カノール、アルキル基の炭素数が１または２のエチレ
   ングリコールモノアルキルエーテル、モしくはアルキル
   基の炭素数が１または２のグリセリンジアルキルエーテ
   ルから水酸基を除いた１− アル；−ル残基である。）；マレイン酸残基のカルボキ
   シル基から水酸基が除かれた形の、該ネオカルチノスタ
   チン残基との結合手を有してい炭素原子の結合手はネオ
   カルチノスタチン残基と結合するものであることを意味
   する）を構成単位とし１、かつ平均分子量が８ｏＯ以上
   ２，５００以下である１価の部分半エステル化スチレン
   マレイン酸共重合体残基を意味する。〕 で示されるネオカルチノスタチン誘導体。 いし４のアルカノール、アルキル基の炭素数が１またけ
   ２のエチレングリコールモノアルキルエーテル、もしく
   はアルキル基の炭素数が１または２２− のグリセリンジアルキルエーテルから水酸基を除いたア
   ルコール残基である）、および無水マレイスチル化スチ
   レン無水マレイン酸共重合体であって、下記式（Ｂ）お
   よび（Ｃ） ｓｏｏ＜ＭＷ　＜２，５００　（Ｂ） Ｍｗ／Ｍｎ　＜　１．５−１．Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍｗ　
   （Ｃ）〔式中、Ｍｗｔｄ該共重合体の重量子均分子指を
   意味し、　Ｍｒｌは該共重合体の数平均分子量を意味す
   る。〕 を満足する部分半エステル化スチレン無水マレイン酸共
   重合体を、ネオカルチノスタチンに対して過剰量使用し
   て水性溶媒中でネオカルチノスタチンと反応させ、しか
   る後に反応化成物をゲル濾過して、下記式（Ａ） 〔式中、Ｃ万）はネオカルチノスタチンの１位のアラニ
   ン残基中の１級アミノ基および２０位のりジン残基中の
   １級アミン基からそれぞれ１個の水３− 素原子ヲ除いた２価のネオカルチノスタチン残基の炭素
   数が１または２のエチレングリコールモノアルキルエー
   テル、もしくはアルキル基の炭素数が１″！たは２のグ
   リセリンジアルキルエーテルから水酸基を除いたアルコ
   ール残基である。）；マ残基中の１個のカルボキシル基
   から水酸基が除かれた形の、該ネオカルチノスタチン残
   基との結合ボニル基の炭素原子の結合手はネオカルチノ
   スタチン残基と結合するものであることを意味する）を
   構成単位とし、かつ平均分子量がｓｏｏ以上２．５００
   以下である１価の部分牛エステル化スチレ４− ンマレイン酸共重合残基を意味する。〕で示されるネオ
   カルチノスタチン誘導体を単離することを特徴とするネ
   オカルチノスタチン誘導体の製造方法。