JPS609792B2 - アデノシンモノホスフエ−トデアミナ−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアデノシンモノホスフェートデアミナーゼ（以
下ＡＭＰデアミナーゼと略記する）に関するものである
。

ＡＭＰデアミナーゼは別名ＡＭＰアミノヒドロラーゼ、
５′ーアデニル酸デアミナーゼ又はアデニル酸デアミナ
ーゼを称される酵素であって、アデノシンモノホスフェ
ート（以下ＡＭＰと略記する）を加水分解してィノシン
モノホスフェート（以下ＩＭＰと略記する。

）とアンモニアを生成する反応に関与する。従来のＡＭ
Ｐデアミナーゼは動物組織、特に骨格筋に多く存在し、
心筋、平滑筋、肝臓およびミオシンからも分離されたり
、また血球中に存在することがよく知られている。しか
し、これらの原料から採取した酵素はいずれも不安定で
あって、特に中性からアルカリ性での活性発現が低く、
産業的に利用制限を受ける場合が多い。また動物臓器に
給源を求めた場合、酵素を大量に製造することが困難で
あり、したがって、そのコストが高くなるという欠点が
ある。本発明者等はその給源を微生物に求めて広くスク
リーニングした結果、酵母菌体からＡＭ円デアミナーゼ
を採取する事に成功し、しかもその酵素が従来から知ら
れている動物起源の酵素より作用ｐＨ城が広く、工業的
に利用価値の高いＡＭ円デアミナーゼであることを見出
し、本発明に到達した。

すなわち本発明は少なくとも下記性質｛１１〜‘７｝を
有してなる新規なＡＭＰデアミナーゼである。｛１１
ＡＭＰ＋日２０→ＩＭＰ十ＮＨ３上記のごとくＡＭ円を
加水分解してＩＭＰとアンモニアを生成する。

■ 分子量が２８００００〜３２００００（ゲル猿過法
）、８００００（ＳＤＳ電気泳動法）である。

【３｝ 至適ｐＨが７．５〜７．８（リン酸緩衝液中）
である。

【４｝ 安定ｐＨが７〜８（リン酸緩衝液中）である。

■ 至適温度３５００付近（リン酸緩衝液中）である。
職 安定温度が４０００以下（リン酸緩衝液中）である
。｛７ー ＡＭＰに対する物値が２×１０‐６Ｍ（ＡＴ
Ｐを含む）である。

本発明の酵素は酵母を培養し、培養物から採取すること
ができる。

本発明に用いる酵母はサッカロマィセス属、ハンゼヌラ
属、クロェケラ属、キャンディダ属、トルロプシス属、
エンドミコプシス属に属するＡＭＰデアミナーゼ生産菌
であればいずれでもよい。

また本発明における酵母の培養形式は液体培養、固体培
養のいずれによってもよく、例えばグルコース、ポリベ
プトンを主栄養源として酵母エキス、麦芽エキス、およ
び若干の無機塩を添加して通気燈拝して酵母を培養する
方法、または亜硫酸パルプ廃液、廃糖密を主原料として
酵母を培養する方法などがある。

さらに製パン用に培養された酵母、ビール製造用に培養
された酵母等も前記方法に培養された酵母と同様に使用
できる。培養条件は一般に培養温度２５〜３５００、好
ましくは３０００付近、培養時間８〜４報時間、好まし
くは１０〜１母時間である。本発明では培養物からＡＭ
Ｐデアミナーゼを採取するに当って、菌体から酵素を溶
出させるいかなる方法を採用してもよい。

例えばガラスビーズ、石英砂等で磨砕する方法、トルェ
ンによる自己消化法、界面活性剤、酵母細胞壁溶解酵素
で溶菌させる方法などが利用できる。特にガラスビーズ
を用いて機械的に磨砕する方法が有効である。精製酵素
を得るには、酵素を溶出させた菌体を適当な分解手段で
除去した後、溶出液を直接或いは濃縮後、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル様過
法等を用いて行なう。特にフオスフェート・セルローズ
を用いるカラムクロマトグラフィーの応用が有効である
。本発明により得られる酵素は次の性質を有する。｛１
１ 作用 ＡＭ円および水に作用して、ＩＭＰとアンモニアを生成
する。

｛２１ 分子量が２８００００〜３２００００（ゲル猿
過法）、８００００（ＳＤＳ電気泳敷法）である。

■ 至適ｐＨは第１図に示されるように７．５〜７．８
である。

至適ｐＨの測定は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、１
０ｍＭ ＡＭＰ、牛血清ァルブミン（斑Ａ）０．２の９
／羽および酵素を加えて行なった。従来の動物起源のＡ
Ｍｍデアミナーゼは至適ＰＨが６．４または５．９であ
る。

【４’安定ｐＨ‘ま第３図に示されるように７〜８であ
る。

安定ｐＨの測定は４００、２蝿時間、５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液中あるいは５０ｍＭグリシン−水酸化カリ
ウム緩衝液中にて行なった。第３図中、ｏ−−ｏは５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、■−−■は５０ｍＭグリ
シン−水酸化カリウム緩衝液中を示す。【５｝ 至適温
度は第２図に示される通り３５ｏｏ付近である。

至適温度の測定は５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．８）
中、ｌｏｗＭ ＡＭＦ、既ＡＯ．２雌′の‘および酵素
を加えて行なった。｛６｝ 安定温度は第４図に示され
る通り４０００以下である。

安定温度の測定は１粉ご間、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）中にて行なった。‘７１ＡＭＰに対する物値
は２×１０‐５Ｍ（ＡＴＰを含む場合）また２×１０−
５Ｍ（ＡＴＰを含まない場合）である。

‘８｝ 金属の影響は第１表に示される通りである。

第１表【９｝ 基質特異性はＡＭＰに対して特異性が高
く、アデニン、アデノシン、ＡＴＰを分解しない。

Ｏ■ ＡＴＰ、アルカリ金属、Ｍず十およびポリアミン
によって活性化される。ＯＵ リン酸により酵素作用が
抑制される。

本発明において酵素活性は次の方法により測定した。Ａ
ＭＰ２０ｍＭ、塩化カリウム４０ｍＭ、斑ＡＯ．２の９
／私、リン酸緩衝液（ＰＨ７．５）を含む溶液へ酵素を
加えて、３７０で１び分間反応させ、フェノール試薬、
ニトロプルシツド、アンチホルミンを用いるインドフェ
ノール法により生成するアンモニア量に応じて生じた色
素を６３帥ｍで測定した。ＡＭＰデアミナーゼは３７ｑ
Ｃにて１分間に１マイクロモルのアンモニアを生成する
量を１単位とした。本発明のＡＭＰデアミナーゼの性質
は一般に知られている動物起源の酵素よりも作用ｐＨ城
が広いこと、特にアルカリ側に対しても作用域を有する
点で、ＡＴＰ関与のリガーゼとの共役作用による各種生
体成分の定量が可能となり、臨床検査への応用が大きく
改良される。

例えば血中遊離脂肪酸を定量する際、ＡＴＰ関与の合成
酵素（アシル・コェンザィムＡ・シンセターゼ）と共に
本発明の酵素を用いることにより、生成するＡＭＰを測
定することができる。次に本発明を実施例により説明す
る。

実施例 １ 市販パン酵母（サッカロマィセスセルビシェハンゼンの
培養菌体）２５０夕を等量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５
）に懸濁し、ガラスビーズにて１８分間磨砕した。

遠心分離により上清を採取し、その２５０の‘に硫安１
１Ｍを添加して沈殿部分を回収し、５０の‘の溶液とし
た。続いて透析脱塩後、２５０の【容量のフオスフェー
ト・セルローズ・カラムに負荷し、リン酸緩衝液の濃度
を高めてＡＭＰデアミナーゼを溶出した。この操作を２
回繰返してＡＴＰデアミナーゼを含まない酵素溶液とし
た後、凍結乾燥により５単位／ｍ９の酵素粉末１００の
ｏを得ることができた。収率は１４．７であった。比活
性は３４３単位／雌蛋白で、ＳＤＳ電気泳動で単一ハン
ドとなった。得られた酵素の性質は次の通りである。

【１’ＡＭＰを加水分解してＭＰとアンモニアを生成す
る。

｛２’分子量が２８００００〜３２００００（ゲル猿過
法）、８００００（ＳＤＳ電気泳動法）、３６００００
（沈降平衡法）｛３｝ 至適ｐＨが７．５〜７．８（リ
ン酸緩衝液中）である。

‘４１ 安定ｐＨが７〜８（リン酸緩衝液中）である。

【５｝ 至適温度が３５ｏＣ付近（リン酸緩衝液）であ
る。【６１ 安定温度が４０ｏｏ以下（リン酸緩衝液中
）である。

｛７｝ ＡＭＰに対する舵値が２×１０‐６Ｍである。

図面の簡単な説明第１図は本発明の酵素の至適ｐＨを示
す。

第２図は本発明の酵素の至適温度を示す。第３図は本発
明の酵素の安定ｐＨを示す。第４図は本発明の酵素の安
定温度を示す。第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記性質（１）〜（７）を有してなる新
   規なアデノシンモノホスフエートデアミナーゼ。 （１） アデノシンモノホスフエート＋Ｈ＿２Ｏ→イノ
   シンモノホスフエート＋ＮＨ＿３ 上記のごとくアデノ
   シンモノホスフエートを加水分解してイノシンモノホス
   フエートとアンモニアを生成する。 （２） 分子量が２８００００〜３２００００（ゲル濾
   過法）、８００００（ＳＤＳ電気泳動法）である。 （３） 至適ｐＨが７．５〜７．８（リン酸緩衝液中）
   である。 （４） 安定ｐＨが７〜８（リン酸緩衝液中）である。 （５） 至適温度３５℃付近（リン酸緩衝液中）である
   。（６） 安定温度が４０℃以下（リン酸緩衝液中）で
   ある。 （７） アデノシンモノホスフエートに対するｋｍ値が
   ２×１０＾−＾６Ｍ（アデノシントリホスフエートを含
   む）である。