JPS61124377A - 新規ハイブリドーマおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規ハイブリドーマ、その製造法訃よび用途に
関する。

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発され、近年盛んにな
ってきたハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の
製造法は、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す
抗体が得られることや、必要に応じて自由に多量にしか
も常に均質な標品を再現性よく得られるなど多くの利点
がある。このような意味から、ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体（以下ＭｏＡｂ　　と略記することが
ある）取得の方法は多方面にわたってその有効性が高く
評価されている。またその利用法として単に抗原の検出
だけでなく微量成分の精製や診断薬への応用が展開され
ておシ、さらに予防薬、治療薬への応用も考えられて−
る。

これらの利用法の中で予防薬、治療薬のようにヒトに直
接投与する場合以外はマウスＭｏＡｂを使うことが可能
であるが、予防薬、治療薬の場合には、ヒトにとって異
質蛋白であるマウスＭｏＡｂを用いることは適当ではな
い。何故ならば、マウス蛋白を投与した場合、ヒト体内
にマウス蛋白が入ることによ）抗体が誘起され、その作
用が軽減するのみならず、異質蛋白が引きおこすアレル
ギーに応による危険性があるからである。

一般にと）ＭｏＡｂの研究はマウスのそれに比べて大巾
に遅れている。その理由゛はヒ）ＭｏＡｂ産生株ｔ［ｉ
！造する方法がマウスのそれに比べて困難が多く、成功
例が少ないためである。

と）ＭｏＡｂ産生株の代表的な製造法としてヒト−ヒト
ハイブリドーマを用いる方法、ヒト−マウスヘテロハイ
ブリドーマを用いる方法、エプスタイン−パー　ウィル
ス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ　ｖｉｒ、ｕａ　；以下Ｅ
ＢＶと略記する）でトランスホームさせた樹立細胞を用
いる方法などがある。これらの方法を用いた研究結果は
最近多く報告されているが、実用的には各々欠点がある
ことが指摘されているウヒトーヒトハイブリドーマは一
般的に融合効率が低く、又、マウス−ヒトハイブリドー
マはヒト染色体が脱落し易く、ヒト抗体産生能の安定性
が悪い。又、ＥＢｖトランスホーマントは得られた抗体
産生細胞のクローニングが難しい。このため目的抗体を
産生しない細胞の増歿率が速い場合、抗体産生の安定性
が低下してくるといわれている。

これらの実験系に対して、まだ報告例は少ないが、最近
報告されたマウヌーヒトヘテロハイブリドーマを親株と
して抗体産生細胞と融合させ、目的のヒト抗体を産生ず
るハイブリドーマを得る方法は、これらの欠点を改善し
た有用なヒｔ−ＭｏＡｂ産生株取得法である〔プロシー
ジング　オプ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイエン
ス、８０゜７３０８−７３１２（１９８３））。

Ｂ型肝炎つイμス（ＨＢｖ）は、最後に残された重大感
染症といわれ、アジアを中心として全世界に２億２日本
には入口の約２．７％およそ３１０万人の潜在的患者が
いるといわれる。これらの潜在患者の多くはいわゆる無
症候性のＢ型肝炎つイｌｖヌ表面抗原（ＨＢａＡｇ）キ
ャリヤーであるが、ＨＢＶの持続感染と慢性肝炎、肝硬
変、さらには肝癌との間に密接な関係があるといわれ、
ＨＢＶ感染を如何にして予防し、又治療するかという問
題は予防医学、治療医学上の極めて大きな問題である。

ＨＢＶによる感染は血液を介して起こるといわれておシ
、患者における輸血や人工透析の場合、あるいは医療従
事者における注射針、メスを通じての汚染などの水平感
染と、ＨＢｓＡｇキャリヤーから生まれた児への垂直感
染が考えられる。これら感染の予防法として抗ＨＢａＡ
ｇ抗体を投与する受動免疫療法とワクチン投与による能
動免疫療法とがある。最近の遺伝子操作法あるいはペプ
チド合成法の急速な進展により、能動免疫療法への期待
が大きく高まっている。しかし能動免疫療法だけでは抗
体産生能の低下した免疫不全者への適用はむつかしく、
又、母子間感染や医療汚染などの場合のように早期に効
果を期待したい場合には、受動免疫が必要となり、完全
な予防のなめには、能動免疫と受動免疫の両面からの対
業が必要である。

受動免疫の材料として、現在市販されているγ−グロプ
リン製剤の大部分には抗Ｆ！Ｂ　ｓ　Ａｇ抗体が含まれ
ているものの、その力価は低（ＨＢＶ感染予防効果は余
り期待できない。一方、高力価の抗ＨＢａＡｇ抗体価を
有するヒト免疫グロブリン製剤（ＨＢＢＯ３については
多くの臨床試＠を通じてその有効性と安全性が広く認め
られているが、■ＢＩＧ取得は、高力価抗体価を有する
ヒトの血液を用いるため材料に著しい制限がある。

このような観点から、抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏＡｂ産生株
を用いて自由に多量に均質な抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏＡｂ
を製造する方法は有用性が高いが、これまでに抗ＨＢａ
ＡｇヒトＭｏＡｂを産生ずる細胞株についてはハイブリ
ドーマの手法を用いた当抗体産生株の報告はみられない
。その理由として前述シたようなとトーヒトハイブリド
ーマあるいはマウス−ヒトハイブリドーマ実験系におい
て指摘されているような欠点があるためと考えられる。

抗ＨＢａＡｇヒトＭｏＡｂの唯一の報告としてＩＢｖト
ランスホーマントを用いた製造方法（特開昭５５−３１
２号公報）があるものの、前述したように細胞のクロー
ニングが難しいため比較的少数の細胞を播種し継代金繰
り返すという手間のか−る方法がとられてお〕、方法論
としてすぐれていると社いい難く、厳密には単一抗体と
しての信憑性を欠くものである。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、ＨＢＶ感染の予防、治療に重要な意味を
もつヒト抗ＨＢａＡｇモノクローナμ抗体を製造する方
法として、実用性の高い方法を鋭意比較検討し、これま
で得られていなかった抗ＨＢａＡｇヒトＭｏＡｂ産生ハ
イブリドーマを初めて製造することに成功した。

本発明者らは、当抗体産生ハイブリドーマを製造し、さ
らに当ハイブリドーマを用いて抗ＨＢａＡｇヒ）ＭｏＡ
ｂを製造し、その性状を明らかにし本発明を完成した。

問題点を解決するための手段 本発明は、 （１）ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞
株とのハイブリドーマと、抗ｌｌＢｓＡｇ抗体を産生ず
るヒトリンパ球系細胞とからなる、抗ＨＢａＡｇＭｏＡ
ｂｉ産生するクローン化されたハイズリドーマ。

（２）　　と）リンパ球系細胞と異種動物のリンパ球種
細胞株とのハイブリドーマと、抗ＨＢａＡｇ抗体を産生
ずるヒトリンパ球系細胞とを細胞融合し、得られる融合
細胞から抗ＨＢｓＡｇ　ＭｏＡｂを産生するハイブリド
ーマを選択し、これをクローニングすることを特徴とす
るクローン化された該ハイズリドーマの製造法、および （３）上記ハイブリドーマを用いて抗ＨＢｓＡｇ　Ｍ。

Ａｂを生成、蓄積せしめ、とれを採取することを特徴と
する該ＭｏＡｂの製造法 を提供するものである。

上記ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞株
とのハイブリドーマに関し、ヒトリンパ球系細胞として
健常人から得られる正常リンパ球やヒト株化リンパ球細
胞が挙げられる。正常リンパ球は、稈臓、リンパ節、末
梢血などいずれのものでもよいが、入手し易さの点から
末梢血リンパ球（ＰＢＬ　）が有利に用いられる。これ
らのリンパ球系細胞はそのまま用いてもよいが、予めボ
ゾクローナ〃なマイト−ジエン（ホークライードマイ亭 トージエンなど）で活性しておくのが好ましい。

異種動物のリンｈ球様細胞株としては、ヒト以外の哺乳
動物（例えば、マウス、ラット等の実験動物）のリンパ
球由来の細胞株が挙げられ、と９わけ融合実験で最も実
績があシ、細胞融合効率。

増殖性等のすぐれたマウスミエローマ細胞株、とＤわｆ
ｆヒボキサンチン・グアニン・ホスホリポシルトランヌ
フエフーゼ欠損株（ＨＧＰＲＴ”株）のようなマーカー
をもった細胞が有利に用いられる。

上記ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞株
とのハイブリドーマ（ヘテロハイブリドーマ）の製造の
ためには、これらの両細胞をセンダイウイμス、ポリエ
チレングリコ−Ａ／（ＰＥＧ）等の融合剤を用いた）、
電気刺激等の方法で融合させることができる。ＰＥＧを
用いる場合の一例を挙げるがもちろんこの方法に限定さ
れる訳ではない。ＰＥＧの重合度はふつう１ｏｏｏ−６
０００、処理時間は０．５〜３０分、濃度は１０〜８０
％等が用いられるが、好ましい条件の一例としてＰｇＧ
６０００ｔ−３５−５５％で４〜１０分処理することに
よシ、効率よく融合させることができる。上記第一段目
の融合細胞の選択的増殖のための培地として各穂の組み
合わせが可能であるが、有利に用いられる一例としてＨ
ＧＰＲＴ　　マウスミエローマ細胞株とヒトＰＢＬとを
融合させる場合、融合細胞は例えばヒボキサンチン、ア
ミツブゾリン、チミジン培地（ＨＡＴ培地）やアザセリ
ン、ヒポキサンチン培地（ＡＨ培地）等を用いて選択的
に増蔑させることができる。

第２段目の細胞融合は、上に述べたヘテロハイブリドー
マと、抗ＨＢｓＡｇ抗体を産生ずるヒトリンパ球系細胞
を融合させる処理である。親株となるヘテロハイブリド
ーマの有利な一例としてＨＧＰＲＴ−マウスミエローマ
細胞株とヒトＰＢＬの融合体からなるヘテロハイブリド
ーマを用いる場合について以下に述べる。前述したヘテ
ロハイブリドーマはＨＧＰＲＴ　　となっているが再び
ＨＧＰＲで−等のマーカーを入れることができる。この
ためには例えば８−アザグアニン（８ＡＺＧ）等を培地
に加え、その濃度を順次増加して付く方法等によシ目的
を達成できる。このようにしてマーカーを導入したヘテ
ロハイブリドーマは第２段目の細胞融合の親株として用
いることができる。実際に目的の抗ＲＢａＡｇ抗体産生
細胞と融合する前に、複数のご一カー導入ヘテロハイブ
リドーマについてヒ）ＰＢＬとの融合により、融合効率
やハイブリドーマの増殖性、クローニングの容易性やヒ
トＭｏＡｂ産生能の安定性をチェックし、最適の親ヘテ
ロハイブリドーマ株を選択しておくことは、大変有効で
ある。この選択に際して、抗体非分泌のへテロハイブリ
ドーマを選んでおくことが好ましい。

一方、ヘテロハイブリドーマと融合させる抗ＨＢａＡｇ
抗体を産生ずるヒトリンパ球系細胞は正常ヒトリンパ球
でもよいし、又ＥＢＶ　）ランスホーマント等の株化細
胞を用いることもできる。ヒトリンパ球と夛わけ過去に
抗原としてのＩＩＩＢＹ感染を受けたと考えられる抗ｆ
ｉＢａＡｇ抗体陽性のヒトリンパ球をインビトロにとり
出し、抗原（１！ＢｅＡｇ　）やボリクローナμなりり
ンバ球マイトージエン（ホークライードマイト−ジエン
やスタフイロコカスアクレウスコーワンエ等）で刺激し
た後、ヘテロハイブリドーマと融合させることにより、
よシ効率的に目的とするハイブリドーマが得られる。ま
たインビトロにとシ出したリンパ球に上述したような刺
激を与え、さらにＩＢＭを感染させる方法等も、細胞を
一旦不滅化できる方法として適用できる。ＥＢｖによる
トランスホーメーションは外部からＥＢＹを加えること
により一層効率的となるが、加えなくてもインビトロで
培養するだけで自然にトランスホームする場合があるこ
とも知られている。しかしＥＢＶ）ランスホーマント自
体は、クローニングがむつかしく、従って抗体産生が不
安定となることが多いので、このＤＢｖトランヌホーマ
ントとヘテロハイブリドーマを融合させることによシ、
得られたハイブリドーマはクローニングが可能となシ、
又抗体産生も安定するので好都合である。本細胞融合は
第１段目の細胞融合と全く同様に行うことができる。こ
の場合、選択培地としてＨＡＴ培地やＡＨ培地を用いる
ことによリハイブリドーマの選択的増殖が得られるが、
ヒト細胞としてＥＢＶ　）ランスホーマント等の株細胞
を用いる場合には、上記選択培地にさらにウワバインを
加えることにより目的が達成される。

上記第２段目の細胞融合によって選択培地で増殖してき
た各ハイブリドーマの上清について抗■ＢｓＡｇ　　抗
体価を測定し、陽性の細胞を選ぶ。抗ＨＢａムｇ抗体測
定のためには種々の変法が可能であるが、例えば市販の
オーサブＩｒＡキット等を用いたエンザイムイムノアツ
セイ法（ＥＩＡ法）等によシ容易に測定できる。

選択培地で増殖を示し、かつＥＩＡ法によシ抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体産生のみられたウニ〃の細胞は、限界希釈法等に
よシクロー二ングを行うことができる。クローン化され
た細胞の上滑については、同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウニμの細胞を増やすことにより、目的の
ハイブリドーマクローンが得られる。

ＨＢｓＡｇＫは４種のサブタイプ（Ａｄｒ、　　ａｄｗ
。

０”！　ｒ＋　αｙｗ）があることが知られている。本
発明によりいずれのサブタイプのＭｏＡｂも製造できる
が、得られたＭｏＡｂがどのタイプを認識しているかと
いうことは抗原として各サブタイプのＨＢａＡｇを用い
たブロッキングテストにより容易に判定することができ
る。

又、得られた細胞が真にハイブリドーマであることは、
ＨＡＴ培地で生育することから明確であるが、さらに染
色体分析等によシ一層明確に判定することができる。

上記した本発明のハイブリドーマを用いて抗１ｉＢａＡ
ｇＭｏＡｂ　を生成、蓄積せしめ、これを採取すること
によシ抗ＨＢａＡｇＭｏＡｂ　　を製造することができ
る。

該ＭｏＡｂの生成、蓄積は、本発明のハイブリドーマを
インキュベートすることによシ行われる。

インキュベーションは、液体培地中または動物の腹腔内
（通常メートマウス等浦乳動物の腹腔内）で行うが、本
発明のハイブリドーマは液体培地中で培養することが好
ましい。

培地としては、例えば動物細胞培養用組成物地〔イスコ
ツ培地とハ４１２丁培地の等全混合培地（工・Ｈ培地）
、ＲＩ’Ｍ１１６４０培地など〕に牛胎児血清、ガンマ
グｐプリンを含有しない牛胎児血清、または哺乳動物の
血清を混在微生物の不活化工程および塩析、脱塩工程を
含む精製処理に付すことによって製造される哺乳動物血
清由来の動物細胞培養用組成物〔特願昭５９−５２１号
明細書（昭和５９年１月７日出願〕を添加したものなど
が挙げられる。

培養は通常５〜１０日間、３０’−３８℃好ましくは３
７℃で行う。

この上う（して生成、蓄積した抗ＨＢｓＡｇ　Ｍ。

Ａｂは、所望によシ通常の蛋白質の精製手段によシ分＃
ｉ精製することができる。

例えば、培養上清を遠心分離によシ取プ出し、塩析（通
常３０〜６０％の硫酸アンモニウムを用いる）し、遠心
分離等で沈殿物を分取し、透析後遠心分離等によ）沈殿
物を除し、上清をカフムクａ−ｒトゲラフイー（ＤＩＡ
Ｉセルロースカフム等）に付し、溶出することによシ精
製ＭｏＡｂを製造することができる。

本発明により製造されるモノクローナμ抗体は下記の性
状を有する。

（１）ＨＢｓＡｇと特異的に結合する （２）ＨＢｓＡｇの４種のサブタイプ（ａｄｗ、　ａｄ
ｒ。

＆７Ｗ、　ａｙｒ）の’Ｉ　ａ’に＃かのサブタイプと
結合する （３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミトゲ／ｌ／電気泳動に
おいて標準免疫グロブリンの■鎖およびＬ鎖の分子量に
完全に一致する２本のバンドのみを示す。

本発明によシ製造される抗Ｆ！ＢｓＡｇモノクローナｙ
抗体は均質で高力価であり、公知の抗ＥＩＢａＡｇ抗体
活性を有するヒト免疫グリプリン製剤（ＨＢ工Ｇ）〔ニ
ューイングランド　ジャーナル　オプメジクン、２９１
．１３７８（１９７４））と同様にＢ型肝炎つィルス症
の診断、予防、治療に用いることができる。使用量（投
与量）については公知のＥＩＢ工Ｇに対応する抗体価で
用いればよい。

作用および実施例 以下、参考例および実施例によシ本発明をよシ具体的に
説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない
。

なお実施例において開示する（マウス・ヒト）−ヒトハ
イブリドーマＨＢＩ［−４３，１は財団法人り酵研究所
（ＩＦ’Ｏ）に寄託番号工Ｆ’Ｏ−Ｃ；：”ＱＱｏ７と
して寄託されている。

参考例１　ヒト抗体の測定法 ヒト抗体の測定法は、エンザイム　リンクドイムノソー
ベント　アッセイ（Ｉｎ工８Ａ法）ｔ−用もた。すなわ
ち、ヤギ抗ヒトｒｇＧ　ｔたは工ｇＭｔ−１５μｆ／ｍ
ｌ　になるよう０．０１ＭのＮａＣ１を含有する０、０
１Ｍ９ン酸緩衝液（ｐｏｌｉｏ）に浮遊させ、９６ウエ
μマイクロブＶ−）の各ウニ〃に１００μｊずつ分注し
、４℃で２４時間反応させた。反応後ウェルの余剰の結
合部位をふさぐ之め２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含
有リン酸緩衝液を１００μｊずつ分注し、４℃で２４時
間処理し、ＩＬＩ３ＡＫ使用するプＶ−）を作製した。

このように製造したプレートに培養上清を１００μ！加
え、２４℃で３時間反応させた。反応後、生理食塩水で
よく洗浄し、ホースラデイシュベμオキンダーゼ（ＨＲ
Ｐ）でラベルしたヤギ抗ヒトＸｇＧ　あるいは工ｇＭ抗
体を各ウニ／Ｌ’Ｋ１００μｌ加え、室温で３時間反応
させた。反応終了後、各ウニ／Ｌ／を生理食塩水でよく
洗浄し、１０ｍ１の０．１Ｍクエン酸ｉ衝液に２２ｑの
オｙソフエニレンジアミン、１０μｊのＨ２Ｏ２を加え
た酵素基質溶液１００μｍを各ウニｙに加えて、酵素反
応を室温で１５分行ない、１規定硫酸で反応を停止させ
た。

反応停止後、タイターテツクマμチスキャン（）−社）
を用いて波長４９２ＪＬＯ＋で発色色素量を測定し、抗
体含量の分ったとトエｇＭ　あるいは工ｇＧ（７４２７
社）との比較から抗体量を定量した。

゛参考例２　マウス−ヒトヘテロハイブリドーマの製造
と８−アザグアニン耐性株の製造 （１）　　マウス−ヒトへテロハイブリドーマの製造健
常人のヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ
　　を用いた比重遠心法で、リンパ球（ＰＢＬ）を分離
し、１０％非動化牛脂児血清を含有する工・■培地（工
・Ｈ−１０Ｆ’）に２Ｘ１０／ｄになるよう浮遊させた
。このリンパ球浮遊液を組織培養用フラスコ（コーニン
グ社ａｒ−１５０７フヌコ〕に分注し、３２μ９／ｄの
濃度になるよりボークフィートマイト−ジエン（ＰＷＭ
）を添加して、３７℃、炭酸ガスふらん器内で、３日間
培養した。

培養後リンパ球とＨＧＰＲＴ欠損マウスミエローマ細胞
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ　　（Ｐ２Ｈ４）〔カレン
トトピックス　イン　ミクロバイオロジー　アンド　イ
ムノロジー、８１．１−７（１９７８）〕とを、２：１
の細胞比になるよう混合し、４５％ＰＥＧ６０００（コ
ツホライト社製）で７分間処理することによって、細胞
融合を行なった。

融合後、膵癌細胞を工・１’Ｉ−１０Ｆ’に２Ｘ１０’
／ｄになるよう浮遊させ、リンプロ２４ウエルマｙチデ
イシユに１ｄずつ播種し、３７℃、炭酸ガス＾らん器内
で培養した。培１１２４時間後、ＨＡＴ（ヒボキサンチ
ン：ｌＸ１０　　’Ｍ、アミノデデリン：４に１０　　
Ｍ、　　チミジン１６Ｘ１０−５Ｍ）含有Ｘ・Ｆｌ−１
０３’（ＨＡＴ培地）を１ｍ加えることＫよシＩＩＩＡ
Ｔ選択培養を開始した。さらに、最初加えた日から３．
５．７日の奇数８後に、旧液を１ｄ捨て、１ｍｌの新し
いＨＡＴ培地を加えることによ、９．１！ＡＴ選択培養
を継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後１０
〜１４日に認められた。

（２）８−アザグアニン耐性株の取得 （１）で得られたマウス−ヒトヘテロハイブリドーマで
、増殖能が優れかつ抗体産生の認められない株を、Ｉｉ
ＡＴｇ受性株とすべく、８−アザグアニン（８−ＡＺＧ
）添加培地での培養を行なった。

すなわち１μＭ濃度の８−Ａ　Ｚ　Ｇ’）含有するＲＰ
Ｖニー１０ｒで培養を開始し、８−ＡＺＧ濃度をｌμＭ
から順次２倍ずつ上昇させ培養を続けた。

１００μＭの８−ＡＺＧに耐性となった株くついてＨＡ
Ｔｇ受性を検討し、感受性株を６株（ＨＭ１〜６）得た
。

実施例１ （＋３　　各ｍマウス−とトヘテロハイブリドーマ株ト
ヒトＰＢＬ間の融合の比較 参考例２で得られた６種のＨＡＴ感受性マウス−ヒトヘ
テロハイブリドーマ株各々の細胞融合効率’ｚＰ３Ｕ１
のそれと比較検討するため、３２μｑ／ｌｎｔのＰＷＭ
存在下で５〜７日間培養を行なったＰＢＬと細胞融合を
行なった。第１表は、その結果を示したもので、Ｐ２Ｈ
４を親株とした場合、融合効率は高いものの安定に抗体
を産生ずるハイブリドーマは得られなかった。一方、マ
ウス−ヒトヘテロハイブリドーマを親株とした場合、特
にＨＭ３〜５では、Ｐ２Ｈ４より融合効率は高く、得ら
れたハイブリドーマの抗体産生も安定していた。

（腫）抗ＨＢ８Ａｇ抗体産生ハイブリドーマの製造実施
例１（１）で得られたマウス−ヒトヘテロハイブリドー
マＨＭ−５と、抗ＨＢｓＡｇ抗体陽性ヒトＰＢＬ″’ｋ
　３２　ｔｔ　９ｊｍｌのＰＷＭで２日間処理して得た
リンパ球とを１：２の割合に混合し、４５％ＰＫ０６０
００（コツホライト社製）で３７℃。

７分間処理することによシ細胞融合を行った融合後ＥＩ
Ｍ−５細胞をニーＨ−１０）’に２ＸＩ０５／ｄになる
よう浮遊させ、リンプロ２４ウエルマルチデインユに１
ｄずつ播種し、３７℃、炭酸ガスふらん器内で培養した
。培養２４時間後、ＨＡＴ培地をｌｌ１ｌ加えることに
よ、１ｊ）ＨＡＴ選択培養を開始した。さらに、最初加
えた日から３．５．７日の奇数８後Ｋ、旧液を１　ｗｌ
捨て、１ｄの新しいＨＡＴ培地を加え、選択培養を継続
した。細胞融合して１０〜１４日後、播種した８０つ二
μ中、５６のウニｙにハイブリドーマの増殖を認め、３
伏線代後、培養上清中の抗ＨＢａＡｇ抗体を市販の“オ
ーサブＩＩＡ”キット（ダイナボット社）を用いたエン
ザイム　イムノ　アッセイ（ＥＩＡ）法”？’゛測定し
た。すなわち、ＨＢｓＡｇ４コートしたポリスチレンボ
ー〃に各ハイブリドーマ培養上清を２００μ！加え、４
０℃で２時間反応させた後、生理食塩水でよく洗浄した
。洗浄後、ＴＩＲＰでラベルしたＨＢｓＡｇを加え、４
０℃で２時間反応させた。叉応終了後ポリスチレンポー
μを生理食塩水でよく洗浄し、キットに付されている基
質液を２００μノ加え酵素度広を室温で１５分行ない、
１規定硫酸で反応を停止させた。停止後、マルチスキャ
ンを用いて波長４９２ｎｍで色素量を定量した。その結
果、５６ウエｙ中１５ウニμの培養上清中に抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体の存在を認めた。

（ＩＩ）　　抗ＨＢａＡｇ抗体産生ハイブリドーマのク
ローニング 抗体活性陽性の２ウニ／ｌ／（ＨＢＩ［［−ｚｓ、Ｈｖ
Ｎ−４３）の各ハイブリドーマを、限界希釈法によって
クローニングを行なった。すなわち、ハイブリドーマが
２個／ｄになるよう工・Ｈ−１０Ｆ’に浮遊させ、９６
穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウニ〃当り０．
１　ｗｌずつ分注した。分注する際、フィダー細胞とし
てＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの胸ＷａＩｍ胞をウニ〃当
シ５×１０　個になるよう加え大。このようにして、約
２週後には、細胞の増殖が認められるようになシ、上清
を採取して、抗体の有無を実施例１（１）記載の“オー
サブＥ工Ａ”キットを用い゛たＥ工人法で調べた。その
結果、ＩＩＩＢ■−２５では３７クローン中２１クロー
ン、ＥＢＢＮ−４３では３７クローン中１９クローンに
抗体活性を認めた。上記４０クローンの中でもとシわけ
（マウス・ヒト）−ヒトハイブリドーマＨＢＩ［−４３
，１は増殖が速く、抗ＨＢＩ！ＩＡｇ抗体の産生も高か
った。

実施例２　モノクｐ−すｙ抗体の製造 （１）　　ハイブリドーマのモノクローナル抗体産生性
実施例１（１）で得た（マウス・ヒト）−ヒトハイブリ
ドーマＨＢＩ［−４１１を工・Ｈ−１０Ｆ’に５×１０
４個／Ｍｔになるよう浮遊させリンプロ２４ウエルマル
チデイシユに１ｇｌずつ播種し、播種後経日的に培養上
清を採取して、生細胞数と抗体量を検索した。生細胞数
はトリバンプルーによる染色決で、抗体の定量は参考例
１記載の方法で行なった。

その結果、該ハイブリドーマの増殖倍加時間は２９時間
、抗体はＴｇＧクラスで産生量はλ８μｇ／　ｗｌであ
ることが分った。

（Ｉｔ）　　モノクローナル抗体の認識するＨＢｓムｇ
サブタイプ 実施例２（１）で得られたＭｏＡｂ　　ＨＥＭ−４３゜
１含有上清を２５００！に希釈し、その２５μｍと、予
め力価をそろえて２倍段階希釈したＨＢｓＡｇの各サブ
タイプの未精製抗原標品（ａｄｒｌａｍ　、　ａｄｗ　
１０種、ａｙｒ１種、ｔａ、ｙｖ５種；−ずれもＨＢａ
Ａｇ腸性のヒトの血液由来のもの）各２５μｍとをそれ
ぞれ混合し３７℃で６０分間反応した（プレインキュベ
ーシミン）。反応後ソれぞれの反応液と、精製したａｄ
ｒ、ａｄｗおよびａｙｗの３ｍのＨＢ　ａ　Ａｇ　ｋ　
：ｆ　−）　１．り羊赤血Ｒ（ＳＲＢＣ）とを室温で６
０分間反応した（受身赤血球凝集反応）。

上記の結果、いずれのサグタイプのＩＨ３ｓＡｇ（３２
〜６４倍希釈）とブレインキュベートした場合にも、Ｈ
ＢａＡｇ’（：！−）した羊赤血球へのＭ　ｏ　Ａ　ｂ
　ＨＢＩ［−４３、■の結合が抑制され、血球凝集の阻
害が見られた。従って上記ＭｏＡｂは共通抗原でαブタ
−ミントを認識していることを示している。すなわちＨ
ｏＡｂＨＢＩ［−４３，１は、ｌｌＢａＡｇの４種のサ
ブタイプ（ａｄｗ、ａｄｒ。

ａｙｗ、ａｙｒ）のいずれのサブタイプとも結合する。

（１）　　モノクローナル抗体の製造 （マウス・ヒト）−ヒト　ハイブリドーマ！ＩＢＭ−４
３，１ｔ、グロブリン画分を除去した牛胎児血清３Ｍｇ
Ｚ宥ｌ、インシュリン２μｆ／ｌｄ、トランスフェリン
２μ９／ｍｌ　　＋エタノールアミン２μｙおよびセレ
ナイトＺ５Ｘ１０−８Ｍを含有する工・■培地に浮遊さ
せ３７℃で４時間培養を行なった。との培養上清１０ｊ
に硫酸アンモニウムを４７％の濃度になるように加え、
４Ｃで攪拌しながら６０分間塩析を行ない、遠心（１０
ρＯＯ回転、１５分間）１−行なって沈殿物を得た。沈
澱物を５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１含有２０ｍＭ）リス緩衝
溶液（ｐＨ７，９）に浮遊し、同溶液２ｊに対して透析
を行なった。２時間後、２１の新しい同じ透析液に換え
、さらに１５時間透析を行表った。透析後、沈澱を除去
するため１０，０００回転１５分間遠心七行なり１上清
をＡ２８ｏの値が２０〜３ｏの濃度になるように調整し
た。このサンプルを充分量の５０ｍＭ−ＮａＣ１含有ト
リス緩衝溶液で神化した５ｔｘｌＯＤ　Ｅ　Ａ　Ｉ　＋
ｔＡ／ロースカフム（ワットマンＤｇ５２　）にかけ、
５０　ｍＭ　ＮａＣ１含有トリス緩衝溶液でよく洗った
後、５０ｍＭ−５００ｍＭＨａｃｋを含む同緩衝液の濃
度勾配塩溶液を用いてＬ５ｇｔ／分の流出速度で分画を
行なって素通シ分囮を濃縮し、モノクローナル抗体ＨＢ
ＩＩｒ−４３，１を得た。抗体の純度の確認にはラエム
リらの方法〔ネイｆヤ−，２２７，６８０−６８５，（
１９７０））に準じて５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲ／
ｌ／電気泳動を用いた。すなわち硫安樵析し、ＤＥＡＥ
セ〃ロースカラムで素通勺した分＠を、２−メルカプト
エタノ−μで還元を行ない１０％ＳＤＳゲμ。

１８０ボ〃ト、１５時間泳動を行なった。その結果、分
子量約５２キロダｐトン前後に■鎖、約２８キロダ〃ト
ン前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。

Ｑｖ）　　モノクローナル抗体のサブクラスＨＢＭ−４
３．１−ｅ−ノクローナｙ抗体のサプクヲスは、実施例
２（ｉ）で精製した抗体とヒツジ抗ヒトエｇＧ１．工ｇ
Ｇ２．　　工ｇＧ３．　　工ｇＧ４（マイ〃ス社ンとの
寒天内沈降反応（イムノロジカルメソッド　ゲμ　デイ
フエージミンテクニツク　プヲツクウエルオックスフォ
ード（１９６４年）で検討した。結果は、モノクローナ
ル抗体とヒツジ抗ヒ）ＩｇＧ１　　抗体との間に１つの
バンドが認められ、他の抗ヒト抗体との間には、バンド
の形成はみられなかった。従って該モノクローナル抗体
はＩｇＧ１サプクフスに属するものであることが判明し
た（第２表）。

第２表 抗　　　　原　　　　抗　体　　沈降線の有無本発明の
モノクローナル抗体　技工ｇＧ１　　　　＋Ｉｐ　　　
　　　　　　　　　　Ｇ２　　　　　−〃　　　　　　
　　　　　　　Ｇ３　　　　−〃　　　　　　　　　Ｇ
４　　　− 発明の効果 本発明の抗Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原モノクローナｙ抗
体を産生ずるクローン化されたハイブリドーマは、完全
にクローン化されておシ、当該ハイブリドーマを用いて
高純度の上記モノクローナル抗体を効率よく製造するこ
とができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞
   株とのハイブリドーマと、抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
   抗体を産生するヒトリンパ球系細胞とからなる、抗Ｂ型
   肝炎ウイルス表面抗原モノクローナル抗体を産生するク
   ローン化されたハイブリドーマ。
2. （２）ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞
   株とのハイブリドーマと、抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
   抗体を産生するヒトリンパ球系細胞とを細胞融合し、得
   られる融合細胞から抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原モノク
   ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これ
   をクローニングすることを特徴とするクローン化された
   該ハイブリドーマの製造法。
3. （３）ヒトリンパ球系細胞と異種動物のリンパ球様細胞
   株とのハイブリドーマと、抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
   抗体を産生するヒトリンパ球系細胞とからなる、抗Ｂ型
   肝炎ウイルス表面抗原モノクローナル抗体を産生するク
   ローン化されたハイブリドーマを用いて抗Ｂ型肝炎ウイ
   ルス表面抗原モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とする該モノクローナル抗体
   の製造法。