JPS6384488A - ヒトリンパ球様細胞株およびハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規ヒトリンパ球様細胞株、ハイブリドーマ
、抗体および抗体の製造法に関する。

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発され、近年盛んにな
ってきたハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の
製造法は、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す
抗体が得られることや、必要に応じて自由に多量にしか
も常に均質な標品を再現性よく得られるなど多くの利点
がある。このような意味から、ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体（以下ＭｏＡｂと略記することがある
。）取得の方法は多方面にわたってその有効性が高く評
価されている。またＭｏＡｂの利用法として単に抗原の
検出だけでなく微量成分の精製や診断薬への応用が展開
されており、さらに予防薬、治療薬への応用も考えられ
ている。

これらの利用法の中で予防薬、治療薬のようにヒトに直
接投与する場合以外はマウスＭｏＡｂを使うことが可能
であるが、予防薬、治療薬の場合には、ヒトにとって異
質蛋白であるマウスＭｏＡｂを用いることは適当ではな
い。何故ならば、マウス蛋白を投与した場合、ヒト体内
にマウス蛋白が入ることにより抗体が誘起され、その作
用が軽減するのみならず、異質蛋白が引きおこすアレル
ギー反応による危険性があるからである。

一般にヒトＭｏＡｂの研究はマウスのそれに比べて大巾
に遅れている。その理由はヒトＭｏＡｂ産生株を製造す
る方法がマウスのそれに比べて困難が多く、成功例が少
ないためである。

ヒトＭｏＡｂ産生株の代表的な製造法としてヒト−ヒト
ハイブリドーマを用いる方法、ヒト−マウスヘテロハイ
ブリドーマを用いる方法、エプスタイン−バーウイルス
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ　　ｖｉｒｕｓ；以下ＥＢＶ
と略記することもある。）でトランスホームさせた樹立
細胞を用いる方法などがある。これらの方法を用いた研
究結果は最近多く報告されているが、実用的には各々欠
点があることが指摘されている。すなわち、ヒト−ヒト
ハイブリドーマは一般的に融合効率が低く、又、マウス
−ヒトハイブリドーマはヒト染色体が脱落し易く、ヒト
抗体産生能の安定性が悪い。又、ＥＢＶ　）ランスホー
マントは得られた抗体産生細胞のクローニングが難しい
。このため目的抗体を産生じない細胞の増殖率が速い場
合、抗体産生の安定性が低下してくるといわれている。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、最後に残された重大感
染症といわれ、アジアを中心として全世界に２億人１日
本には人口の約２．７％およそ３１０万人の潜在的患者
がいるといわれる。これらの潜在患者の多くはいわゆる
無症候性のＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キ
ャリヤーであるが、ＨＢ　Ｖの持続感染と慢性肝炎、肝
硬変、さらには肝癌との間に密接な関係があるといわれ
、ＨＢ　Ｖ感染を如何にして予防し、又治療するかとい
う問題は予防医学、治療医学上の極めて大きな問題であ
る。

ＨＢＶによる感染は血液を介して起こるといわれており
、患者における輸血や人工透析の場合、あるいは医療従
事者における注射針、メスを通じての汚染などの水平感
染と、Ｔ（ＢｓＡｇキャリヤーから生まれた児への垂直
感染が考えられる。これら感染の予防法として抗＋（Ｂ
ｓＡｇ抗体を投与する受動免疫法とワクチン投与による
能動免疫法とがある。最近の遺伝子操作法あるいはペブ
ヂド合成法の急速な進展により、能動免疫療法への期待
が大きく高まっている。しかし能動免疫療法だけでは抗
体産生能の低下した免疫不全者への適用はむつかしく、
また母子間感染や医療汚染などの場合のように早期に効
果を期待したい場合には、受動免疫が必要となり、完全
な予防のためには、能動免疫と受動免疫の両面からの対
策が必要である。

受動免疫の材料として、現在市販されているγ−グロプ
リン製剤の大部分には抗ＨＢｓＡｇｔｉ’Ｃ体が含まれ
ているものの、その力価は低く　ＨＢ　Ｖ感染予防効果
は余り期待できない。一方、高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体
価を有するヒト免疫グロブリン製剤（ＨＢＩＧ）につい
ては多くの臨床試験を通じてその有効性と安全性が広く
認められているが、ＨＢ■Ｇ取得は、高力価抗体価を有
するヒトの血液を用いるため材料に著しい制限がある。

このような観点から、抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏＡｂ産生株
を用いて多量に均質な抗ＨＢｓＡｇヒトＭｏＡｂを製造
する方法は有用性が高いものと思われる。

発明が解決しようとする問題点 たとえば抗ｌ−ｌＢｓＡｇ抗体などの抗体を産生ずるハ
イブリドーマの取得が種々試みられているが、本発明は
、抗体を安定に産生ずるハイブリドーマ。

該ハイブリドーマの製造に用いられる細胞株、該ハイブ
リドーマを用いる抗体の製造法および該抗体を提供する
ものである。

問題点を解決するための手段 本発明者は、６−チオグアニン（６−ＴＧ）抵抗性ヒ）
Ｂリンパ芽球様細胞Ｗｌ−Ｌ２株（米国アルドンジョー
ンズ・セル・サイエンス・センター所属のＤｒ、　Ｇ、
　５ａｔｏ　　より提供を受けた）から得たウワバイン
抵抗性株ＴＡＷ−９２５がＥＢ■トランスフォーマント
と高い融合効率を示すことを見い出し、ヒトＭｏＡｂ産
生ハイブリドーマ取得のための有用な親株となることを
見い出した。

本発明者らは、さらに、抗ＨＢｓＡｇ抗体産生トランス
フォーマントをＴＡＷ−９２５と融合することにより、
安定に該抗体を産生ずるハイブリドーマを製造できるこ
と、さらに該ハイブリドーマを用いて安定に抗ＨＢｓＡ
ｇヒトＭｏＡｂを製造できることを見い出した。

本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２
５またはその継代株、（２）ヒトＢリンパ球様細胞株Ｔ
ＡＷ−９２５またはその継代株と、エプスタイン−バー
ウイルスによって形質転換されたヒトリンパ球とのハイ
ブリドーマ、（３）該ハイブリドーマを培地に培養し、
抗体を採取することを特徴とする抗体の製造法、および
（４）該ハイブリドーマにより産生された抗体に関する
。

本明細書においては、ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−
９２５を、ｒＴＡＷ−９２５味」と略称することもある
。

ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５は、ＨＡＴ（ヒ
ボキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性・ウ
ワバイン抵抗性株であり、たとえば米国アルドンジョー
ンズ・セル・サイエンス・センター所属のＤｒ、Ｇ、５
ａｔｏより提供を受けた６−チオグアニン（６−ＴＧ）
抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細胞ＷＩ−Ｌ２株から取得す
ることができる。

一般にヒト由来ＨＡＴ感受性・クワバイン抵抗性細胞株
は公知の方法により調製することができる。

例えば、ヒト由来リンパ球様細胞株を培養する際に、培
地中の６−ＴＧおよびウワバイン濃度を徐々に上昇させ
ていくことにより、細胞株が本来所有していた性質に影
響を及ぼさず、ＨＡＴ感受性・ウワバイン抵抗性株を得
ることができる。このようにしてマーカーを導入した細
胞株は、ヒト抗体産生細胞との細胞融合の親株として用
いることができるが、融合効率の高いものをあらかじめ
選択しておくことが望ましい。

継代株としては、例えば該ＴＡＷ−９２５株を単に継代
培養した株は勿論、これを再びクローニングすることに
より得られたクローン株等ＴＡＷ−９２５から派生した
株すべてがあげられる。

ＴＡＷ−９２５株又はその継代株と融合させる抗体産生
ヒトリンパ球系細胞としては、正常ヒト由来のリンパ球
でもよいし、例えば目的とする抗体がＴ（ＢＶのような
感染性の物質に対するものであれば該物質に感染したヒ
トリンパ球でしよい。

これらヒトリンパ球は、牌臓、リンパ節、末梢血などの
いずれのものでもよいが、入手し易さの点から末梢血リ
ンパ球（ＰＢＬ）が有利に用いられる。

これらリンパ球系細胞はそのまま用いても上いが、イン
ビトロにとり出し、抗原やポリクローナルなりリンパ球
マイト−ジエン（例、ホークライードマイト−ジエンや
スタフィロコッカスアウレウスコーワンＩ等）で刺激し
た後、ヒトリンパ球様細胞株と融合させてもよいし、ま
た別の方法として、インビトロにとり出したリンパ球に
ＥＢＶを感染させ、−旦不滅化したリンパ球から目的と
する抗体産生細胞を選別・濃縮し、これをヒトリンパ球
様細胞株と融合させてもよいが、より効率的に目的とす
る抗体産生ハイブリドーマを取得するためには、ＥＢＶ
Ｉ−ランスフォーマントを用いる方が好ましい。

ＥＢＶは、正常細胞を増殖型の細胞に形質転換させるウ
ィルスとして知られており［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）、２６９，４２０（１９７７）］該ウつルス含有材料
としてはマーモセット細胞Ｂ９５−８株［プロシージン
グ・オブ・ナンヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ）、胆、１９０（１９７３）］の培養上清か
用いられる。

ヒトリンパ球をＥＢＶによって形質転換するには、リン
パ球の培養用培地にリンパ球が約０．５〜５ｘｌＯ’個
／滅好ましくは約ｌＸｌ０’個／成になる様浮遊させ、
この浮遊液ｌに対し、Ｂ９５−８培養上清を適量加え、
約３７℃で約１時間、軽く振とうすることにより感染さ
せた後、約３７℃で約５〜３０日間培養することにより
行なうことができる。

上記ヒトリンパ球様細胞株とＥＢ■トランスフォーマン
トとのハイブリドーマの製造のためには、これらの両細
胞をセンダイウィルスポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）等の融合剤を用いたり、電気刺激等の方法で融合させ
ることができる。ＰＥＧを用いる場合の一例を挙げるが
もちろんこの方法に限定される訳ではない。ＰＥＧの重
合度は一般に約１０００〜６０００．処理時間は約０．
５〜３０分、ａ度は約１０〜８０％等が用いられるが、
好ましい条件の一例としてＰＥＧ　　６０００を約３５
〜５５％で約４〜ＩＯ分、細胞を約３７℃のウォーター
バス中で処理することにより、効率よく融合させろこと
ができる。融合細胞は、ＨＡ　Ｔ＋ウワバイン添加培地
などを用いることにより選択的に増殖させることができ
る。増殖してきた各ハイブリドーマの上清について、例
えば抗ＨＢｓＡｇ抗体の場合、該抗体価を測定し、陽性
の細胞を選ぶ。抗ＨＢｓＡ４抗体測定のためには種々の
変法が可能であるが、例えば市販のオーツブＥＩＡキッ
ト等を用いたエンザイムイムノアッセイ法（ＥｒＡ法）
等により容易に測定できる。

選択培地で増殖を示し、かつＥＩＡ法によりたとえば抗
１−１ＢｓＡｉｃｔｉ’ｃ体産生のみられたウェルの細
胞は、限界希釈法等によりクローニングを行うことがで
きる。クローン化された細胞の上清については、同様に
スクリーニングを行い抗体価の高いウェルの細胞を増や
すことにより、目的のハイブリドーマクローンが得られ
る。

ところで、ＨＢｓＡｇには４Ｎのサブタイプ（ａｄｒ。

ａｄｗ、　ａｙｒ、　ａｙｗ）があることが知られてい
る。本発明によりいずれのサブタイプのＭｏＡｂも製造
できる。

又、得られた細胞が真にハイブリドーマであるコトは、
ＨＡＴウワバイン培地で生育することから明確であるが
、さらに染色体分析等により一層明確に判定することが
できる。

上記した本発明のハイブリドーマを用いて抗体を生成、
蓄積せしめ、これを係数することにより抗体を製造する
ことができる。

該抗体の生成、蓄積は、本発明のハイブリドーマを培養
することにより行われる。培養は、液体培地中または動
物の腹腔内（通常ヌードマウス等哺乳動物の腹腔内）で
行うが、本発明のハイブリドーマは液体培地中で培養す
ることが好ましい。

培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地［イスコ
ツ培地とハムＦＩ２培地の等屯混合培地（Ｉ弓４培地）
、ｒ’ｔＰＭ１　１６４０培地など］に牛胎児血清、ガ
ンマグロブリンを含存しない牛胎児血清、または哺乳動
物の面浩を、ｑ在居よ物のスＩモ化工程お上び塩析、脱
塩工程を含む精製処理に付すことによって製造される哺
乳動物血清由来の動物細胞培養用組成物［特開昭６０−
１４５０８８号公報］を添加したものなどが挙げられる
。

培養は通常約３〜６０日間、好ましくは約５〜ｌＯ日間
、約３０°〜３８℃、好ましくは約３７℃で行う。

このようにして生成、蓄積した抗体は、所望により通常
の蛋白質の精製手段により分離精製することができる。

例えば、培養上清を遠心分離により取り出し、塩析（通
常的３０〜６０％の硫酸アンモニウムを用いる）し、遠
心分離等で沈殿物を分取し、透析後遠心分離等により沈
殿物を除去し、上清をカラムクロマトグラフィー（Ｄ　
Ｅ　Ａ　Ｅセルロースカラム等）に付し、溶出すること
により精製抗体を製造することができる。

たとえば本発明により製造される抗ＨＢｓＡｇモノクロ
ーナル抗体は下記の性状を有する。

（＋）　　ＨＢｓＡｇと特異的に結合する。

（２）　　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて標準免疫グロブリンのＩ−１鎖およびＬ鎖の分子
量に完全に一致する２本のバンドのみを示す。

本発明により製造される抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗
体は均質で高力価であり、公知の抗ＨＢ　ｓＡｇ抗体活
性を有するヒト免疫グロブリン製剤（ＨＢＩＧ）［ニュ
ーイングランド・ジャーナル・才ブ・メジシン（Ｎｅｗ
　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＭｅｄ
ｉｃｉｎｅ）　、　　２９１．　　ｌ　３７８（１９７
４）］と同様にＢ型肝炎つィルス症の診断、予防、治療
に用いることができる。使用法（投与ｍ）については公
知のＩ（ＢＩＧに対応する抗体価で用いればよい。

本発明のヒトリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５またはそ
の継代株は、ハイブリドーマを製造する際の親株として
用いることができる。

本発明のハイブリドーマを用いて、ヒト抗体を製造する
ことができる。

本発明の方法で得られたヒト抗体は、単に抗原の検出、
微量成分の精製や診断薬への応用のみならず、予防薬１
治療薬として哺乳動物（例、マウス。

ラット、ネコ、犬、ニワトリ、ブタ、ウン、ウマ、サル
。

ヒト）に投与することが可能である。

本発明の方法で得られた抗体、たとえば抗ＨＢｓＡｇ抗
体は、ヒト免疫グロブリンであり、公知の抗１−ｌＢｓ
Ａｇ活性を有するポリクローナルな免疫グロブリン（ガ
ンマ−グロブリン製剤）と同様にＢ型肝炎つィル又症の
予防・治療に育効に用いることができる。抗ＨＢｓＡｇ
抗体はヒト由来であるため、抗原性、毒性はきわめて低
い。その使用量（投与量）については、公知のガンマ・
グロブリン製剤に対応する抗体価を使用するとよい［基
礎と臨床、１３゜４２９４（１９７９）］。該抗体たと
えば抗ＨＢｓＡｇ抗体を投与するにあたっては、それ自
体あるいは適宜の薬理的に許容され得る担体、賦形剤、
希釈剤などと混合し、注射剤等の剤型で非経口的に哺乳
動物（例、サル（チンパンジー）、ヒト］に投与するこ
とができる。

本発明のヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５は、融
合効率が高いので、効率良くハイブリドーマを製造する
ことができる。

本発明のハイブリドーマは、長期にわたって抗体の産生
能が低下しないので、これを用いることにより効率良く
抗体を製造することができる。

本発明の抗体は、ヒト由来の抗体であるため、ヒトに投
与した場合、マウス、ラット等異種動物由来の抗体に比
べて、ヒトに対する抗原性は極めて低（、副作用も殆ん
どないと考えられ、疾病の予防・治療のために直接ヒト
に投与することが可能である。

実施例 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、実施例１に開示するヒトＢリンパ芽球様細胞株Ｔ
ＡＷ−９２５は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に昭和
６１年８月２０日から寄託番号ＩＦ０　５００９５とし
て寄託されている。

また、実施例４に開示するヒトＢハイブリドーマＷ４７
１−７．２４はＩＦＯに昭和６１年８月２０日から寄託
番号ＩＦＯ５００９４として寄託されている。

実施例１　（ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５の
取得） 米国アルトンノヨーンズ・セル・サイエンス・センター
より混供を受けた６−ＴＧ抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細
胞Ｗ［−Ｌ２株は、ＨＡＴ感受性を示した。そこでさら
に本株をウワバイン抵抗性とすべく０．００５μＭａ度
のウワバインを含有するＩＯ％牛脂児血清（Ｆｅ２）添
加イスコツ培地とハムＦ−１２培地の等量混合培地（Ｉ
・Ｈ−１０Ｆ）で培養を開始し、ウワバイン濃度を順次
２倍ずつ上昇させ培養を続けることにより、０．５μＭ
濃度のウワバインに抵抗性を示す細胞株ＴＡＷ−９２５
（ＩＦＯ５００９５）を得た。

実施例２　　（ＴＡＷ−９２５株とＥＢ■トランスフォ
ーマント間の細胞融合効率） ＥＢＶトランスフォーマントは、正常ヒトＰＢ■７にＥ
ＢＶを感染させることにより得た。すなわち、健康人の
ヒト末１１’ｊ血からＦｉｃｏｌｌ　−１１ｙｐｏｑｕ
ｅを用いた比重遠心法で、リンパ球を分離し、（Ｉ・Ｈ
−２０Ｆ）にｌＸｌ０’個／旋になるよう浮遊させた。

このリンパ球浮遊液ｌに対しＥＢＶを含有するＢ９５−
８細胞培養上清を容量にして１０の割合に加え、３７℃
で１時間軽く振とうしながら感染を行なった。感染後、
９６ウエルマイクロプレートにｌウェル当り２ＸＩＯ’
個播種し、３７℃炭酸ガス培養器で２〜４週間培養を行
ない、トランスフォーマントを得た。このようにして得
られたトランスフォーマントとＴＡＷ−９２５株とをｌ
＝１の細胞比になるよう混合し、４５％ＰＥＧ６０００
（コツホライト社製）で７分間処理することによって、
細胞融合を行なった。融合後、トランスフォーマントを
　Ｉ・Ｉ−（−１０Ｆに６×１０３〜８Ｘ１０’個／成
になるよう浮遊させ、リンプロ２４ウエルマルチデイシ
ユに１ｇずつ播種し、３７℃炭酸ガス培養器内で培養し
た。培養２４時間後、ＨＡ　Ｔ・ウワバイン（ヒボキサ
ンチ：／：Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ、アミノブチリ：／：
４　ｘ　１０−’Ｍ。

チミジン：　　１．６Ｘ１０″″５Ｍ、ウワバイン＝５
ＸＩＯ″″Ｂ　Ｍ　）含有Ｉ・Ｈ−１０Ｆ（ＨＡＴＯ）
培地をｌｄ加えることによりＨＡＴＯ選択培養を開始し
た。さらに、最初加えた日から３．５．７日の奇数日後
に、旧液をｌ滅捨て、１ｒｎｆｌの新しいＨＡ　Ｔ　Ｏ
培地を加えることにより、ＨＡＴＯ選択培養を継続した
。結果を第１表に示す。ハイブリドーマの増殖は、細胞
融合後１０〜１４日に認められた。

ハイブリドーマの出現頻度は、トランスフォーマント１
０８個当り１６，７〜６０．６個であり、ＴＡＷ−９２
５株は、トランスフォーマントと非常に高い融合効率を
示すことが判明した。

（以下余白） 第１表 ＥＢＶ　Ｉ−ランス　　　　　　　増殖ウェル数フォー
マント１播種細胞数ｌ′！／播種ウェル数　頻度ｌｌ３
Ａａｘ　１０’　　　　　９９／１４４Ａ　　　　　　
４Ｘ　１０’　　　　　８０／１４３Ａ　　　　　　８
Ｘ　１０３２４／１４４　　　　１６．７Ｂ４Ｘ　１０
’　　　　　９５／　９６Ｂ　　　　　　ｌＸｌ０’　
　　　　４５／　９６　　　　６２．５８　　　　　６
Ｘ　１０’　　　　　８８／　８８Ｂ　　　　　　６Ｘ
１０３１９／　４８　　　　６０．６Ｃ６ＸＩＯ’　　
　　　４４／　４４ ″’　Ａ、Ｂ又はＣのＥＢ■トランスフォーマントとＴ
ＡＷ−９２５との間で細胞融合を行った。

ｍ″　ｌウェル当り播種したトランスフォーマント数。

１融合頻度はトランスフォーマント１０６ｇ当りの数で
ポアソン分布からもとめた。

実施例３　（抗ＨＢｓＡｇ抗体産生ハイブリドーマの取
得） 抗ＨＢｓＡｇ抗体陽性ヒトＰＩ３Ｌを実施例２に記載の
方法でトランスフォーメーションを行ない、抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体産生ＥＢＶトランスフォーマント（ＴＡＩ−４７
株）を得た。ここで得られたＴ、ｌｌ−４７株とＴＡＷ
−９２５株とを実施例２に記載の方法で細胞融合し、Ｈ
ＡＴＯ選択培養を行なった。細胞融合して１０〜１４日
後、播種した３８ウエル中、３５ウエルにハイブリドー
マの増殖を認め、培養上清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体を市販
のオーサブＥＩＡキット（グイナポット社製）を用いた
エンザイム　イムノアッセイ（ＥＩＡ）法で測定した。

スナワチ、ＨＢｓＡｇをコートしたポリスチレンボール
に各ハイブリドーマ培養上清を２００μＱ加え、　４０
°Ｃで２時間反応させた後、生理食塩水でよく洗浄した
。洗浄後、ホースラディンユペルオキシダーゼ（１−（
ｒｔＰ）でラベルされたＨＢｓＡｇを加え、４０℃で２
時間反応させた。反応終了後ポリスチレンホールを生理
食塩水でよく洗浄し、キットに付されている基質液２０
０μＱを加え酵素反応を室温で１５分間行ない、１規定
硫酸で反応を停止させた。停止後、タイターテックマル
ヂスキャン　（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍで
色素ｍを定量した。その結果３５ウエル中９ウエルの培
養上清中に抗ＨＢｓＡｇ抗体の存在を認めた（第１図参
照）。

実施例４　（抗ＨＢｓＡｇ抗体産生ハイブリドーマのク
ローニング） 抗体活性陽性の３ウエル（Ｗ４７１−１．Ｗ４７１−７
．Ｗ４７１−９）の各ハイブリドーマを、限界希釈法に
よってクローニングを行なった。すなわち、ハイブリド
ーマが２個／戒になるよう■・Ｈ−１０Ｆに浮遊させ、
９６六マイクロプレート（ヌンク社製）にｌウェル当り
０．１ｄずつ分注した。分注する際、フィダー細胞とし
てＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５Ｘ１０
５個になるよう加えた。このようにして、約２週間後に
は、細胞の増殖が認められるようになり、上清を採取し
て、抗体の有無を実施例３記載のオーサブＥＩＡキット
を用いたＥＩＡ法で調べた。その結果、Ｗ４７１−１．
Ｗ４７１−７．Ｗ４７１−９から得られた各２５クロー
ン全てに抗体活性を認めた。上記７５クローンの中でも
とりわけヒトＢハイブリドーマＷ４７１−７．２４（Ｉ
ＦＯ５００９４）は増殖が速く、抗ＨＢｓＡｇ抗体の産
生能も高かった。

実施例５　　（ＴＡＷ−９２５およびＷ４７１−７゜２
４細胞の染色体分析） 実施例１で得られたＨＡＴ感受性ウワつイン抵抗性株Ｔ
ＡＷ−９２５（ＩＦＯ５００９５）および実施例４で得
られた抗ＨＢｓＡｇヒトＭ　ｏ　Ａ　ｂ産生Ｗ４７１−
７．２４株（ＩＦＯ５００９４）の染色体の解析を行な
った。

それぞれの細胞約２ＸｌＯ’個を２μｇ／ｄのコルヒチ
ン（和光純薬工業株式会社製）を含むｌＯ威の増殖用培
地に浮遊した。３７℃で１．５時間培養後、細胞を２５
０　ｘｇで１０分間遠心し、沈渣を３成の７５ｍＭＫＣ
ｌに浮遊し２４℃で１５分間静置した。その後、遠心法
により固定液（酢酸：メタノール＝　１　：３）を用い
て細胞を２度洗った後、数滴の同固定液に浮遊し、スラ
イドグラス上に乗せ風乾した。このようにして得た標本
をギムザ染色液で染色し、顕微鏡下で観察した（ギムザ
法）。

この染色標本を同固定液を用いて脱染免役、０．０２％
トリプシン（ギブコ社製）溶液を含むリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ、ｐＨ５，８）でθ℃、６分間処理したのち、ＰＢ
Ｓで洗い、再びギムザ溶液で染色し、顕微鏡下で観察し
た（Ｇバンド法）。

その結果、ＴＡＷ−９２５の染色体は４６本。

ＸＹで、３ｑ−，９Ｑ−、Ｉ　７ｐ−、ｔ（１３：？）
。

ｔ（２１ニア）の特徴を示した。一方、Ｗ４７１−７．
２４の染色体数は、９２〜９４で上述のＴＡＷ−９２５
の染色体の特徴を合わせ持っていることが分った。

実施例６　（モノクローナル抗体の製造）（１）ハイブ
リドーマのモノクローナル抗体産生性 実施例４で得たＷ４７１−７．２４（ＩＦＯ５００９４
）をｌ−Ｈ−１０Ｆ’に５ＸｌＯ’個／−になるよう浮
遊させリンプロ２４ウエルマルチデイシユにｌｄずつ播
種し、播種後経口的に培養上清を採取して、生細胞数と
抗体量を検索した。生細胞数はトリパンブリーによる染
色法で、抗体定量は下記に記載のエンザイム　リンクド
イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いた。

すなわち、ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭを１５Ｍｇ／
滅になるよう０．０１ＭのＮａＣ１を含有する０、０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浮遊させ、９６ウエル
マイクロプレートの各ウェルに１００μＱずつ分注し、
４℃で２４時間反応させた。反応後ウェルの余剰の結合
部位をふさぐため２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有
リン酸緩衝液を１００μρずつ分圧し、４℃で２４時間
処理し、ＥＬＩＳＡに使用するプレートを作成した。こ
のように製造したプレートに培養上清を１００μＱ加え
、２４°Ｃで３時間反応させた。反応後、生理食塩水で
よく洗浄し、ＨＲＰでラベルしたヤギ抗ヒトＩｇＧある
いはＩｇＭ抗体を各ウェルに１００μρ加え、室温で３
時間反応させた。反応終了後、各ウェルを生理食塩水で
よく洗浄し、１０ｄのＯ、ｌ　Ｍクエン酸緩衝液に２２
ｍｇのオルソフェニレンジアミン。

１０μＱのＨｔ　Ｏｔを加えた酵素基質溶液１００μσ
を各ウェルに加えて、酵素反応を室温で１５分行ない、
ｌ規定硫酸で反応を停止させた。反応停止後、マルチス
キャンを用いて波長４９２ｎｍで発色色素量を測定し、
抗体含量の分ったヒトＩｇＭあるいはＩｇＧ（マイルス
社）との比較から抗体量を定量した。

その結果、該ハイブリドーマの増殖倍加時間は２０時間
、抗体はＩｇＧクラスで、産生量は２．６μｇ／ｄであ
ることが分った。また該ハイブリドーマからの抗体産生
は非常に安定で樹立して９ケ月を経過した時点において
らなお産生量の低下は認められていない。

（ＩＩ）モノクローナル抗体の製造 ヒトＢハイブリドーマＷ４７１−７．２４（’ＩＦＯ５
００９４）を、グロブリン画分を除去した牛胎児血清３
ｍｇ／ｍ、インシュリン２μｇ／ｄ。

トランスフェリン２μｇ／蔵、エタノールアミン２μＭ
およびセレナイト２．５×１０−ｆ′Ｍを含有するＩ−
Ｈ培地に浮遊させ３７°Ｃで４時間培養を行なった。こ
の培養上清１０１２に硫酸アンモニウムを４７％の濃度
になるように加え、４°Ｃで攪拌しながら６０分間塩折
合行ない、遠心（１０，０００回転、１５分間）を行な
って沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭＮａＣ１含有２０
ｍＭ１−リス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に溶遊し、同溶液
２１２に対して透析を行なった。２時間後、２Ｑの新し
い同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。

透析後、沈澱を除去するためｔｏ、ｏｏｏ回転１５分間
遠心を行ない、上清をＡ２１Ｈの吸光度値が２０〜３０
の濃度になるように調整した。このザンブルを充分量の
５０ｍＭ−ＮａＣ１含有トリス緩衝溶液で順化した５ｄ
のＤＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥ、、）に
かけ、５０ｍＭＮａＣ１含有トリス緩衝溶液でよく洗っ
た後、５０ｍＭ−５００ｍＭＮａＣ１を含む同緩衝溶液
の濃度勾配塩溶液を用いて１．５ｄ／分の流出速度で分
画を行なって素通り分画を濃縮し、モノクローナル抗体
Ｗ４７１−７．２４を得た。抗体の純度の確認にはラエ
ムリらの方法［ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２２
７，６８０−６８５　　（１９７０）］に準じて５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。すなわち
硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラムで素通りした分
画を、２−メルカプトエタノールで還元を行ない１０％
５ＤＳ−ゲル、１８０ボルト、２５時間泳動を行なった
。その結果、分子量約５２キロダルトン前後にＩ］鎖、
約２８キロダルトン前後にＬ鎖の２つのバンドが認めら
れた。

（ＩＩ［）モノクローナル抗体のサブクラスＷ４７１−
７．２４モノクローナル抗体のサブクラスは上記実施例
６（■）で精製した抗体とヒツジ抗ヒトＩｇＧ　ｌ、Ｉ
ｇＧ２．　１ｇＧ３，１ｇＧ４（マイルス社）との寒天
沈降反応［プログレス・イン・アレルギー（Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ　　ｉｎ　　Ａｌｌｅｒｇｙ）、　５，１（１９
５８）］で検討した。結果は、モノクローナル抗体とヒ
ツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体との間に１つのバンドが認めら
れ、他の抗ヒト抗体との間には、バンドの形成はみられ
なかった。従って該モノクローナル抗体はＩｇＧ１サブ
クラスに属するものであることが判明した（第２表）。

第２表 沈降　の 抗原　　　　抗体　宵　無 本発明のモノクローナル抗体　抗１ｇＧ１　　　　＋本
発明のモノクローナル抗体　抗１ｇＧ２　　　−本発明
のモノクローナル抗体　抗１ｇＧ３　　　−本発明のモ
ノクローナル抗体　抗ＩｇＧ４　　　−発明の効果 本発明のヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５は融合
効率が高く、とくにＥＢＶトランスフォーマントとの融
合効率が高く、ヒト抗体産生ハイブリドーマ取得のため
の親株として有効に用いることができ、また本株を用い
ることによって得られたハイブリドーマは、抗体を効率
よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３で得られたＴＡ〜Ｖ−９２５株とＴ
ＡＩ−４７株との細胞融合によって得られたハイブリド
ーマの培養上清中に於ける抗ＨＢ　ｓＡｇ抗体価を波長
４９２ｎｍにおける吸光度で示す。 出願人　工業技術院長　　飯　塚　幸　三＄　１　図 ウニ）し番号

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）、ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５または
   その継代株。
2. （２）、ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５または
   その継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形
   質転換されたヒトリンパ球とのハイブリドーマ。
3. （３）、抗体を産生する特許請求の範囲第２項記載のハ
   イブリドーマ。
4. （４）、抗体がＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対するヒト
   モノクローナル抗体である特許請求の範囲第３項記載の
   ハイブリドーマ。
5. （５）、ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５または
   その継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形
   質転換されたヒトリンパ球との抗体を産生するハイブリ
   ドーマを培地に培養し、抗体を採取することを特徴とす
   る抗体の製造法。
6. （６）、抗体がＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対するヒト
   モノクローナル抗体である特許請求の範囲第５項記載の
   製造法。
7. （７）、ヒトＢリンパ球様細胞株ＴＡＷ−９２５または
   その継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形
   質転換されたヒトリンパ球との抗体を産生するハイブリ
   ドーマにより産生された抗体。
8. （８）、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対するヒトモノク
   ローナル抗体である特許請求の範囲第７項記載の抗体。