JPS61124381A - アルカリプロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １−亙一旦一１ 本発明は、新規アルカリプロテアーゼ及びその製造法に
関する。

発　　明　　の　　背　　景 アルカリプロテアーゼ、即ちアルカリ領域で高いタンパ
ク分解活性を持つプロテアーゼは、微生物特にアルカリ
性培地に好んで成育する好アルカリ性微生物により生産
されやすいことが報告されている。例えばバチルス属の
細菌によって生産される場合としては、特公昭４８−２
７９４号、特公昭５５−４６７１１号、特公昭５６−４
２３６号等が、放線菌によって生産される場合としては
、特公昭５４−１１３９６号等が公知である。

一方、アルカリプロテアーゼは皮革工業、食品工業、繊
維工業等の工業的用途に多量に用いられるだめに、従来
よりも更に生産性良く酵素を生産することが要望されて
いる。

本発明者は、上記要望を満足させるのを目的として、１
％炭酸ナトリウムを添加したアルカリ性培地（ｐＨ１０
）を用い土壌を対象としてスクリーニングを行った結果
、バチルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　）属に属する新菌株
である８２１−２株がアルカリ性培地において著量のア
ルカリプロテアーゼを生産すること、このアルカリプロ
テアーゼが新規酵素であること等を見い出し、本発明を
完成するに至った。

の　　　　　び　　果 本発明は、下記特性を有する新規アルカリプロテアーゼ
ＮＦ−１、 （ア）性状：無色針状結昌、 （イ）分子量：約３００００　（ゲル濾過法による）、 （つ）水溶液の紫外線吸収スペクトル＝２７５〜２８０
　ｎｍに極大吸収を示す、 （１）　吸光係数（１，”ｌ１２８０ｎｍ）　：　６．
　Ｏｌ（オ）ｌ解性：水に可溶、メチルアルコール、エ
チルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶、 （力）カゼインを基質にした場合の至適ｐＨ：ｐＨ１０
゜５〜１１．５、 （キ）ｐＨ安定性：　ｐＨ５〜１１．５において３０℃
で２４時間放置した場合、６０％以上のプロテアーゼ活
性が残存する、 （り）カゼインを基質にした場合の至適温度：約６０℃
、 （ケ）熱安定性：ｐＨ１０で１０分間の処理では５０℃
まで安定であり、６０℃で５０％の残存活性があり、６
５℃では完全に失活する、（コ）安定化及び阻害：Ｃａ
２＋で安定化され、ＰＣＭＢ　（パラクロロマーキュリ
ツク安息香酸）及びＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸
）では失活せず、ＤＦＰ（ジイソプロピルクロロホスフ
ェート）では失活する、 （す）比活性：　９０００ｕ／■り、並びにバチルス属
に属し、アルカリプロテアーゼＮＦ−１を生産する微生
物をアルカリ性培地に培養し、培養液中に該酵素を蓄積
させ、これを採取することを特徴とするアルカリプロテ
アーゼＮＦ−１の製造法に係る。

上記本発明によれば、新規アルカリプロテアーゼを生産
性良く収得することができる。

前記のバチルス属に属する新菌株であるＢ２１−２株は
、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託され、微生物
寄託番号は微工研菌寄第７９３５号である。

Ｂ２１−２株は、下記菌学的性賀を有する。培地はすべ
て１％炭酸ナトリウムを加え、１）ＨＩＯに調整したも
のを用いた。

（ａ）形　態 大きさは０．７〜０．８Ｘ２．３〜３．２μｍの桿菌で
ある。胞子を形成し、大きさは０．６〜０．７Ｘ１．１
〜１．４μｍの卵型である。運動性があり、周鞭毛を有
する。また、ダラム染色性は陽性であり、抗酸性は陰性
である。

（１））培地における生育状態 １％炭酸ナトリウムを含む培地で３０℃、２〜３日間培
養した時の生育状態を第１表に示す。

菌の色は、培養初期には白色ないし黄白色であるが、培
養後期には黄色となる。

（Ｃ）生理的性質 （１）最適生育条件 ｐＨ：１０前後、 温度＝３０〜４０℃。

（２）硝酸塩の還元：還元しない。

（３）脱窒反応：嫌気性下では生育しない。

（４）ＭＲテスト：アルカリ性培地のため明らかでない
。

（５）ＶＰテスト：陰性。゛ （６）インドールの生成：生成しない。

（７）硫化水素の生成：生成しない。

（８）デンプンの加水分解：加水分解あり。

（９）クエン酸の利用：クリステンセン培地では利用す
るが、コーザー培地では利用しない。

（１０）硝酸塩の利用：利用しない。

（１１）アンモニウム塩の利用：利用しない。

（１２）ウレアーゼ活性：アルカリ性培地のため明らか
でない。

（１３）オキシダーゼ活性：陽性。

（１４）カタラーゼ活性：陽性。

（１５）ｌ素に対する態度：好気性。

（１６）Ｏ−Ｆテスト：１！気性下では生育しない。

（１７）糖類から酸の生成の有無＝アルカリ性培地のた
め、酸生成による指示薬の変化が明確でなく、不明。

（１８）ゼラチンの液化：液化する。

（ｄ）その他の性質 （１）塩化ナトリウムへの耐性＝５％塩化ナトリウムを
含む培地で生育する。

（２）本国は、種々の培地でアルカリプロテアーゼを培
地中に分泌、生産するが、多量に生産するためには大豆
粉の添加を必要とし、添加なしではアルカリプロテアー
ゼを多量には生産しない。

本国は、好気性の有胞子細菌であること、中性培地では
生育し難く、アルカリ性培地において非常に良く生育し
、最適生育条件としてのｐＨは約１０であること等から
好アルカリ性のバチルス属に属するといえる。一般にバ
チルス属に属する菌種の生育条件としてのｐＨ値は、ｐ
Ｈ５〜８であり、一般のバチルス属と好アルカリ性バチ
ルス属とは明らかに区別される。

本国と同様の好アルカリ性バチルス属の菌株としては、
Ｎｏ、４（特公昭５５−４６７１１号）、Ｎｏ、２２１
及びＮｏ、５８　（特公昭４８−２７９４号）、Ｎｏ、
６（特公昭５６−４２３６号）等が公知であり、これら
はいずれも炭酸ナトリウムを含んだｐＨ１０程度の培地
で非常に良く生育する。しかしながら、下記第２表に示
す各菌株の生理的性質の相違から明らかな通り、本国は
これらの菌株と明確に区別される。

第　　２　　表 （注）＋：陽性又は利用する。

ｍ：陰性又は利用しない。

±：不明確又はわずかに生育もしくは利用する。

以上の通り、バチルス属に属する８２１−２株は明らか
に公知の菌株と区別され、バチルス属の新菌株であると
認められる。本発明において用いる菌株としては、本発
明の目的に合致する限り、バチルス属に属する８２１−
２株自体のみでなく、その自然的及び人工的変異株のい
ずれも包含されることは勿論である。

本菌株は、ブドウ糖、デンプン等の炭素源や有機窒素源
を含むアルカリ性培地（例えば１％ポリペプトン、１％
大豆粉、２％グルコース、０．１％リン酸水素２カリ、
１％炭酸ナトリウム）にすみやかに生育するがこれから
炭酸ナトリウムを除いた中性の同じ培地では、生育し難
い。

従って、本発明の培地においては通常の中性に生育する
バチルス属の培養方法は適用できず、培地のｌ）Ｈを１
０程度とするようにアルカリの添加を必要とする。かか
る条件下での培養の場合、炭素源としてはブドウ糖、デ
ンプン等が好適に用いられ、窒素源としてはポリペプト
ン、大豆粉、コーンステイープリカー、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン等の有機窒素源が好適に用いられる。

そのほか培養には通常燐酸塩を添加するが、更に培地ｐ
Ｈを１０程度とするため、炭酸ナトリウム等のアルカリ
を通常１％程度加える。特に酵素生産には炭素源として
グルコース、窒素源としてポリペプトン又は肉エキスが
よく、また多量の酵素を生産するためには大豆粉の存在
が必要であり大豆粉によって２素は誘導的に生産される
。この点から、本菌株と他の公知菌株とは酵素生産の機
作が遺伝子レベルで違っていることが判る。

培養温度は、高くなると生育には有利であるが、高くな
り過ぎると酵素自体の自己消化も激しく不利になること
から、通常３０℃程度が酵素生産には適当である。３０
’Ｃで前記培地における培養によると、アルカリプロテ
アーゼの生産は２０時間すぎから始まり、４０〜５０時
間で最大となり培養液中通常５０００ｕ／ｍ以上に達す
る。それ以降は徐々に失活する。

酵素の採取 このようにして本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は
培養され、その培養液中にアルカリプロテアーゼが分泌
、蓄積される。培養終了後、遠心分離、濾過等で菌体を
除去した後、培養炉液に硫酸アンモニウム等の塩析剤あ
るいはアルコール、アセトン等の有懺溶剤を添加するこ
とにより酵素を沈澱せしめ、この沈澱物を濾過、遠心分
離等で脱水、乾燥すると粗酵素粉末が得られる。さらに
この粗製酵素は、当分野の公知の分離、精製手段、例え
ば吸着剤、イオン交換体、ゲル濾過剤等を用いて精製す
ることができる。

このようにしてアルカリプロテアーゼをＩＩ製すること
ができるが、本酵素の製造法については、後記実施例で
さらに具体的に説明する。なおプロテアーゼ活性は次の
ような方法で単位が定められる。

プロテアーゼ活　の測定と単 カゼインＯ８６％を含むホウ酸緩衝液（ｐＨ１１゜５）
５１１２に酵素液（被験液）１−を加え３０℃、１０分
間反応させた後、５Ｉ！１２のトリクロロ酢酸混液（０
，１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２ＭＩ￥酸ナトリウム
、０．３３ＭＩ￥ｌ）！加え、更に２０分間、３０℃に
放置した後、Ｐｉし、炉液について２７５　ｎｌの吸光
度を測定する。

１単位の酵素とは上記条件下で１分間に１マイクログラ
ムのチロシンを生成する酵素量をいう。

上記により収得される本発明アルカリプロテアーゼは、
後述する通り新規な酵素であり、ＮＦ−１と命名された
。

アルカリプロテアーゼＮＦ−１は、種々の蛋白質を分解
する作用を有し、その特性は下記の通りである。

（１）性状：無色針状結晶。

（２）分子量：約３００００　（ゲル濾過法による）。

（３）水溶液の紫外線吸収スペクトル：２７５〜２８０
　ｎｍに極大吸収を示す。

（４）　吸光ｆｌＡ数（Ｅｔｃ、　２８０ｒｖ）　：　
６．００（５）溶解性：水に可溶、メチルアルコール、
エチルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶。

（６）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 カゼインを基質にした場合の至適ｐＨ値は１０．５〜１
１．５であり、本酵素はｐ）−１５〜１１．５において
３０℃、２４時間放置した場合、約６０％以上のプロテ
アーゼ活性が残存する。

プロテアーゼ活性とｐＨとの関係を第１図に示す。第１
図において、ｐＨ７〜８．５の活性はトリス−塩酸緩衝
液を、ｐＨ９〜１０．５の活性は炭酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液を、ｐＨ１１〜１２の活性はリン酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液をそれぞれ用いて測定した。また、プロ
テアーゼ活性のｐＨ安定性を第２図に示す。第２図にお
いて、■は５ｍＭのＣａ２＋を含む酢酸緩衝液を、■は
５ｍＭのＣａ２＋を含むトリス−塩酸緩衝液を、■は５
ｍＭのＣａ２＋を含むホウｌ！緩衝液をそれぞれ用いて
測定した。

（７）作用適温の範囲 基質としてカゼインを用い、ｐＨ１０，０（５ｍＭのＣ
ａ２＋を含むホウ酸１１１１液）で１０分間反応させた
ときの酵素の相対活性を第３図に示す。第３図から明ら
かな通り、本発明の酵素は６０℃で最大活性を示す。

（８）温度安定性 ５ｍＭの塩化カルシウムを含むｐＨ１ｏのホウ酸緩衝液
を用い酵素液を１０分間加熱し、熱安定性を調べた。そ
の結果を第４図に示す。本発明の酵素は、ＤＨｌｏにお
いて、５０’Ｃまで安定であり、６０℃で５０％の残存
活性があり、６５℃では完全に失活する。

（９）安定化及び阻害 Ｃａ２＋で安定化され、ＰＣＭＢ　（パラクロロマーキ
ュリツク安息香ＩＩ＞及びＥＤＴＡ　（エチレンジアミ
ン四酢酸）では失活せず、ＤＦＰ（ジイソプロピルクロ
ロホスフェート）では失活する。

（１０）比活性 ９０００ｕ／Ｎｇである。

上記各特性を示す本発明のアルカリプロテアーゼＮＦ−
１と従来公知のアルカリプロテアーゼとの比較を、下記
第３表に示す。

本発明のアルカリプロテアーゼＮＦ−１は、第３表に示
す特性のいずれかにおいて公知のアルカリプロテアーゼ
とは異なり、新規な酵素と認められる。特に第３表にあ
げられたうちでも番号８に記載されている酵素は、ＮＦ
−１に最もよく類似すると考えられるが、ｐＨ安定性及
び熱安定性において明確に区別される。

かくして、本アルカリプロテアーゼＮＦ−１は、新規酵
素であると認められた。

実　　施　　例 以下本発明を、実施例を挙げて説明する。

実施例１ 大豆粉１０Ｑ１ポリペプトン１０ｇ、グルコース２Ｃ１
、リン酸カリウム１ｇ、酵母エキス０．５０を９００四
の水に溶かし、９ＯＩＩＩＱづつ坂ロフラスコに分注し
１１５℃、１５分間殺菌した。

一方、無水炭酸ナトリウム１０９を水１００回にとかし
、１１５℃、１５分間殺菌した溶液を上記の坂ロフラス
コに１０−づつ加えた。あらかじめ２０〜２４時間前培
養した菌を接種し、３０℃において４０〜４８時間振盪
培養を行なった。遠心分離によって菌体を除去した培養
か液のアルカリプロテアーゼの活性を測定したところ約
５０００Ｕ／−であった。

この培ｌｔＰ液に硫酸アンモニウムを０．７飽和になる
ように添加し、−晩放置後、沈澱した酵素蛋白をセライ
トを用いて濾過した。酵素活性は７５６Ｕ／ＩＱタンパ
クで、回収率は９５％であった。　この粗製酵素を５０
ｍＭ　　ＮａＣ（ｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐ）−１８，８）に溶解し、透析の後、同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに通した。着色物
質等の不純物は吸着され、活性区分は通過した。流出液
（４９０或）の活性は８３４４ｕ／鵬で回収率は６１％
であった。この画分を限外濾過あるいは塩析で濃縮の後
、１０ｍＭのリン′Ｆｌｉ緩衝液（ｐＨ７゜６）に溶解
し、透析した。同緩衝液で平衡化したＣＭ−セルロース
カラムに通すと酵素は吸着され、これを０から０．５Ｍ
１１度までのＮａＣ（＋でグラジェント溶出を行なった
。溶出液（２４５ＷｆＪ）の活性は１１６００ｕ／ＩＱ
であり、比活性はＩ１ｇタンパク当り９０００ｕであっ
た。回収率は４３％であった。溶出液に硫酸アンモニウ
ム粉末を０゜７飽和になるように加え、−晩装置した。

得られた沈澱物を遠心分離し、少量の５ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液に溶解し、粉末の硫酸アンモニウムを０゜３飽
和になるように加え、冷蔵庫に放置するとＮＦ−１の無
色針状結晶が析出した。

実施例２ 実施例１の培地のポリペプトンに代え、より安価な魚肉
エキスを用いて３０”Ｃ１４０〜４ｓｒｓ間培養を行な
ったところ、培養炉液のアルカリプロテアーゼの活性は
６２００ｕ／−であった。この塔養液に粉末の硫酸アン
モニウムを０．５飽和になるように加えると酵素は沈澱
した。この沈澱物をセライトを用いて濾過すると粗酵素
が得られ、回収率は６０％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によって得られるアルカリプロテアーゼ
ＮＦ−１の活性とｐＨの関係を示すグラフ、第２図はア
ルカリプロテアーゼＮＦ−１の活性のｐＨ安定性を示す
グラフ、第３図はアルカリプロテアーゼＮＦ−１の活性
と温度の関係を示すグラフ、第４図はアルカリプロテア
ーゼＮＦ−１の活性と熱安定性の関係を示すグラフであ
る。 （ｊＸ　　上） 第１図 第３図 ↓７ｔ（”Ｃ） 第４図 うＩ置’Ｃ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記特性を有する新規アルカリプロテアーゼＮＦ
   −１、 （ア）性状：無色針状結晶、 （イ）分子量：約３００００（ゲルろ過流による）、 （ウ）水溶液の紫外線吸収スペクトル：２７５〜２８０
   ｎｍに極大吸収を示す、 （エ）吸光係数（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ２８０ｎｍ）
   ：６．０、（オ）溶解性：水に可溶、メチルアルコール
   、エチルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶、 （カ）カゼインを基質にした場合の至適ｐＨ：ｐＨ１０
   ．５〜１１．５、 （キ）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１１．５において３０℃で
   ２４時間放置した場合、６０％以上のプロテアーゼ活性
   が残存する、 （ク）カゼインを基質にした場合の至適温度：約６０℃
   、 （ケ）熱安定性：ｐＨ１０で１０分間の処理では５０℃
   まで安定であり、６０℃で５０％の残存活性があり、６
   ５℃では完全に失活する、（コ）安定化及び阻害：Ｃａ
   ＾２＾＋で安定化され、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキユ
   リツク安息香酸）及びＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
   酸）では失活せず、ＤＦＰ（ジイソプロピルクロロホス
   フエート）では失活する、 （サ）比活性：９０００ｕ／ｍｇ。 ［２］バチルス属に属し、アルカリプロテアーゼＮＦ−
   １を生産する微生物をアルカリ性培地に培養し、培養液
   中に該酵素を蓄積させ、これを採取することを特徴とす
   るアルカリプロテアーゼＮＦ−１の製造法。 ［３］微生物がバチルス属に属するＢ２１−２株である
   特許請求の範囲第２項に記載の製造法。