JPS6231911B2

JPS6231911B2 -

Info

Publication number: JPS6231911B2
Application number: JP24480084A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Fujiwara
Original assignee: OOSAKAFU
Current assignee: OOSAKAFU
Priority date: 1984-11-19
Filing date: 1984-11-19
Publication date: 1987-07-10
Also published as: JPS61124381A

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野本発明は、アルカリプロテアーゼの新規な製造
法に関する。発明の背景アルカリプロテアーゼ、即ちアルカリ領域で高
いタンパク分解活性を持つプロテアーゼは、微生
物特にアルカリ性培地に好んで成育する好アルカ
リ性微生物により生産されやすいことが報告され
ている。例えばバチルス属の細菌によつて生産さ
れる場合としては、特公昭48−2794号、特公昭55
−46711号、特公昭56−4236号等が、放線菌によ
つて生産される場合としては、特公昭54−11396
号等が公知である。一方、アルカリプロテアーゼは皮革工業、食品
工業、繊維工業等の工業的用途に多量に用いられ
るために、従来よりも更に生産性良く酵素を生産
することが要望されている。本発明者は、上記要望を満足させるのを目的と
して、１％炭酸ナトリウムを添加したアルカリ性
培地（PH10）を用い土壌を対象としてスクリーニ
ングを行つた結果、バチルス（Bacillus）属に属
する新菌株であるB21−２株がアルカリ性培地に
おいて著量のアルカリプロテアーゼを生産するこ
と等を見い出し、本発明を完成するに至つた。発明の構成及び効果本発明は、下記特性を有するアルカリプロテア
ーゼNF−１、 (ア) 性状：無色針状結晶、 (イ) 分子量：約30000（ゲル過法による）、 (ウ) 水溶液の紫外線吸収スペクトル：275〜280n
ｍに極大吸収を示す、 (エ) 吸光係数（Ｅ^１％_１ｃｎ280nｍ）：6.0、 (オ) 溶解性：水に可溶、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶、 (カ) カゼインを基質にした場合の至適PH：PH10.5
〜11.5、 (キ) PH安定性：PH５〜11.5において30℃で24時間
放置した場合、60％以上のプロテアーゼ活性が
残存する、 (ク) カゼインを基質にした場合の至適温度：約60
℃、 (ケ) 熱安定性：PH10で10分間の処理では50℃ま
で安定であり、60℃で50％の残存活性があり、
65℃では完全に失活する、 (コ) 安定性及び阻害：Ca²⁺で安定化され、
PCMB（パラクロロマーキユリツク安息香酸）
及びEDTA（エチレンジアミン四酢酸）では失
活せず、DFP（ジイソプロピルクロロホスフ
エート）では失活する、 (サ) 比活性：9000u／mg、を生産するバチルス属に属する微生物をアルカリ
性培地に培養し、培養液中に該酵素を蓄積させ、
これを採取することを特徴とするアルカリプロテ
アーゼNF−１の製造法に係る。上記本発明は、アルカリプロテアーゼを生産性
良く収得しうる新規製造法を提供するものであ
る。前記のバチルス属に属する新菌株であるB21−
２株は、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託
され、微生物寄託番号は微工研菌寄第7935号であ
る。 B21−２株は、下記菌学的性質を有する。培地
はすべて１％炭酸ナトリウムを加え、PH10に調整
したものを用いた。 (a) 形態大きさは0.7〜0.8×2.3〜3.2μｍの桿菌であ
る。胞子を形成し、大きさは0.6〜0.7×1.1×
1.4μｍの卵型である。運動性があり、周鞭毛
を有する。また、グラム染色性は陽性であり、
抗酸性は陰性である。 (b) 培地における生育状態１％炭酸ナトリウムを含む培地で30℃、２〜
３日間培養した時の生育状態を第１表に示す。

【表】菌の色は、培養初期には白色ないし黄白色で
あるが、培養後期には黄色となる。 (c) 生理的性質 (1) 最適生育条件 PH：10前後、温度：30〜40℃。 (2) 硝酸塩の還元：還元しない。 (3) 脱窒反応：嫌気性下では生育しない。 (4) MRテスト：アルカリ性培地のため明らか
でない。 (5) VPテスト：陰性。 (6) インドールの生成：生成しない。 (7) 硫化水素の生成：生成しない。 (8) デンプンの加水分解：加水分解あり。 (9) クエン酸の利用：クリステンセン培地では
利用するが、コーザー培地では利用しない。 (10) 硝酸塩の利用：利用しない。 (11) アンモニウム塩の利用：利用しない。 (12) ウレアーゼ活性：アルカリ性培地のため明
らかでない。 (13) オキシターゼ活性：陽性。 (14) カタラーゼ活性：陽性。 (15) 酸素に対する態度：好気性。 (16) Ｏ−Ｆテスト：嫌気性下では生育しな
い。 (17) 糖類からの酸の生成の有無：アルカリ性
培地のため、酸生成による指示薬の変化が明
確でなく、不明。 (18) ゼラチンの液化：液化する。 (d) その他の性質 (1) 塩化ナトリウムへの耐性：５％塩化ナトリ
ウムを含む培地で生育する。 (2) 本菌は、種々の培地でアルカリプロテアー
ゼを培地中に分泌、生産するが、多量に生産
するためには大豆粉の添加を必要とし、添加
なしではアルカリプロテアーゼを多量には生
産しない。本菌は、好気性の有胞子細菌であること、中性
培地では生育し難く、アルカリ性培地において非
常に良く生育し、最適生育条件としてのPHは約10
であること等から好アルカリ性のバチルス属に属
するといえる。一般にバチルス属に属する菌種の
生育条件としてのPH値は、PH５〜８であり、一般
のバチルス属と好アルカリ性バチルス属とは明ら
かに区別される。本菌と同様の好アルカリ性バチルス属の菌株と
しては、No.4（特公昭55−46711号）、No.221及
びNo.58（特公昭48−2794号）、No.6（特公昭56
−4236号）等が公知であり、これらはいずれも炭
酸ナトリウムを含んだPH10程度の培地で非常に良
く生育する。しかしながら、下記第２表に示す各
菌株の生理的性質の相違から明らかな通り、本菌
はこれらの菌株と明確に区別される。

【表】以上の通り、バチルス属に属するB21−２株は
明らかに公知の菌株と区別され、バチルス属の新
菌株であると認められる。本発明において用いる
菌株としては、本発明の目的に合致する限り、バ
チルス属に属するB21−２株自体のみでなく、そ
の自然的及び人工的変異株のいずれも包含される
ことは勿論である。培地本菌株は、ブドウ糖、デンプン等の炭素源や有
機窒素源を含むアルカリ性培地（例えば１％ポリ
ペプトン、１％大豆粉、２％グルコース、0.1％
リン酸水素２カリ、１％炭酸ナトリウム）にすみ
やかに生育するがこれから炭酸ナトリウムを除い
た中性の同じ培地では、生育し難い。培養従つて、本発明の培地においては通常の中性に
生育するバチルス属の培養方法は適用できず、培
地のPHを10程度とするようにアルカリの添加を必
要とする。かかる条件下での培養の場合、炭素源
としてはブドウ糖、デンプン等が好適に用いら
れ、窒素源としてはポリペプトン、大豆粉、コー
ンステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、カ
ゼイン等の有機窒素源が好適に用いられる。その
ほか培養には通常燐酸塩を添加するが、更に培地
PHを10程度とするため、炭酸ナトリウム等のアル
カリを通常１％程度加える。特に酵素生産には炭
酸源としてグルコース、窒素源としてポリペプト
ン又は肉エキスがよく、また多量の酵素を生産す
るためには大豆粉の存在が必要であり大豆粉によ
つて酵素は誘導的に生産される。この点から、本
菌株と他の公知菌株とは酵素生産の機作が違伝子
レベルで違つていることが判る。培養温度は、高くなると生育には有利である
が、高くなり過ぎると酵素自体の自己消化も激し
く不利になることから、通常30℃程度が酵素生産
には適当である。30℃で前記培地における培養に
よると、アルカリプロテアーゼの生産は20時間す
ぎから始まり、40〜50時間で最大となり培養液中
通常5000u／ml以上に達する。それ以降は徐々に
失活する。酵素の採取このようにして本発明のアルカリプロテアーゼ
生産菌は培養され、その培養液中にアルカリプロ
テアーゼが分泌、蓄積される。培養終了後、遠心
分離、過等で菌体を除去した後、培養液に硫
酸アンモニウム等の塩析剤あるいはアルコール、
アセトン等の有機溶剤を添加することにより酵素
を沈澱せしめ、この沈澱物を過、遠心分離等で
脱水、乾燥すると粗酵素粉末が得られる。さらに
この粗製酵素は、当分野の公知の分離、精製手
段、例えば吸着剤、イオン交換体、ゲル過剤等
を用いて精製することができる。このようにしてアルカリプロテアーゼを精製す
ることができるが、本酵素の製造法については、
後記実施例でさらに具体的に説明する。なおプロ
テアーゼ活性は次のような方法で単位が定められ
る。プロテアーゼ活性の測定と単位カゼイン0.6％を含むホウ酸緩衝液（PH11.5）
５mlに酵素液（被験液）１mlを加え30℃、10分間
反応させた後、５mlのトリクロロ酢酸混液
（0.11Mトリクロロ酢酸、0.22M酢酸ナトリウム、
0.33M酢酸）を加え、更に20分間、30℃に放置し
た後、過し、液について275nｍの吸光度を
測定する。１単位の酵素とは上記条件下で１分間
に１マイクログラムのチロシンを生成する酵素量
をいう。本発明により収得される本発明アルカリプロテ
アーゼは、後述する通り新規な酵素であり、NF
−１と命名された。アルカリプロテアーゼNF−１は、種々の蛋白
質を分解する作用を有し、その特性性は下記の通
りである。 (1) 性状：無色針状結晶。 (2) 分子量：約30000（ゲル過法による）。 (3) 水溶液の紫外線吸収スペクトル：275〜280n
ｍに極大吸収を示す。 (4) 吸光係数（Ｅ^１％_１ｃｎ280nｍ）：6.0。 (5) 溶解性：水に可溶、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶。 (6) 至適PH及びPH安定性カゼインを基質にした場合の至適PHは10.5〜
11.5であり、本酵素はPH５〜11.5において30
℃、24時間放置した場合、約60％以上のプロテ
アーゼ活性が残存する。プロテアーゼ活性とPHとの関係を第１図に示
す。第１図において、PH７〜8.5の活性はトリ
ス−塩酸緩衝液を、PH９〜10.5の活性は炭酸−
水酸化ナトリウム緩衝液を、PH11〜12の活性は
リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ用
いて測定した。また、プロテアーゼ活性のPH安
定性を第２図に示す。第２図において、１は５
ｍＭのCa²⁺を含む酢酸緩衝液を、２は５ｍＭ
のCa²⁺を含むトリス−塩酸緩衝液を、３は５
ｍＭのCa²⁺を含むホウ酸緩衝液をそれぞれ用
いて測定した。 (7) 作用適温の範囲基質としてカゼインを用い、PH10.0（５ｍＭ
のCa²⁺を含むホウ酸緩衝液）で10分間反応さ
せたときの酵素の相対活性を第３図に示す。第
３図から明らかな通り、酵素は60℃で最大活性
を示す。 (8) 温度安定性５ｍＭの塩化カルシウムを含むPH10のホウ酸
緩衝液を用い酵素液を10分間加熱し、熱安定性
を調べた。その結果を第４図に示す。本発明の
酵素は、PH10において、50℃まで安定であり、
60℃で50％の残存活性があり、65℃では完全に
失活する。 (9) 安定化及び阻害 Ca²⁺で安定化され、PCMB（パラクロロマー
キユリツク安息香酸）及びEDTA（エチレンジ
アミン四酢酸）では失活せず、DFP（ジイソ
プロピルクロロホスフエート）では失活する。 (10) 比活性 9000u／mgである。上記各特性を示す本発明により得られるアルカ
リプロテアーゼNF−１と従来公知のアルカリプ
ロテアーゼとの比較を、下記第３表に示す。

【表】

【表】本発明により得られるアルカリプロテアーゼ
NF−１は、第３表に示す特性のいずれかにおい
て公知のアルカリプロテアーゼとは異なり、新規
な酵素と認められる。特に第３表にあげられたう
ちでも番号８に記載されている酵素は、NF−１
に最もよく類似すると考えられるが、PH安定性及
び熱安定性において明確に区別される。かくして、本アルカリプロテアーゼNF−１
は、新規酵素であると認められた。実施例以下本発明を、実施例を挙げて説明する。実施例１大豆粉10ｇ、ポリペプトン10ｇ、グルコース20
ｇ、リン酸カリウム１ｇ、酵母エキス0.5ｇを900
mlの水に溶かし、90mlづつ坂口フラスコに分注し
115℃、15分間殺菌した。一方、無水炭酸ナトリ
ウム10ｇを水100mlにとかし、115℃、15分間殺菌
した溶液を上記の坂口フラスコに10mlづつ加え
た。あらかじめ20〜24時間前培養した菌を接種
し、30℃において40〜48時間振盪培養を行なつ
た。遠心分離によつて菌体を除去した培養液の
アルカリプロテアーゼの活性を測定したところ約
5000u／mlであつた。この培養液に硫酸アンモニウムを0.7飽和に
なるように添加し、一晩放置後、沈澱した酵素蛋
白をセライトを用いて過した。酵素活性は
756u／mgタンパクで、回収率は95％であつた。
この粗製酵素を50ｍＭ NaClを含む20ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.8）に溶解し、透析の後、
同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースカラム
に通した。着色物質等の不純物は吸着され、活性
区分は通過した。流出液（490mg）の活性は
8344u／mlで回収率は61％であつた。この画分を
限外過あるいは塩析で濃縮の後、10ｍＭのリン
酸緩衝液（PH7.6）に溶解し、透析した。同緩衝
液で平衡化したCM−セルロースカラムに通すと
酵素は吸着され、これを０から0.5M濃度までの
NaClでグラジエント溶出を行なつた。溶出液
（245ml）の活性は11600u／mlであり、比活性は
mgタンパク当り9000uであつた。回収率は43％で
あつた。溶出液に硫酸アンモニウム粉末を0.7飽
和になるように加え、一晩放置した。得られた沈
澱物を遠心分離し、少量の５ｍＭ塩化カルシウム
溶液に溶解し、粉末の硫酸アンモニウムを0.3飽
和になるように加え、冷蔵庫に放置するとNF−
１の無色針状結晶が析出した。実施例２実施例１の培地のポリペプトンに代え、より安
価な魚肉エキスを用いて30℃、40〜48時間培養を
行なつたところ、培養液のアルカリプロテアー
ゼの活性は6200u／mlであつた。この培養液に粉
末の硫酸アンモニウムを0.5飽和になるように加
えると酵素は沈澱した。この沈澱物をセライトを
用いて過すると粗酵素が得られ、回収率は60％
であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によつて得られるアルカリプロ
テアーゼNF−１の活性とPHの関係を示すグラ
フ、第２図はアルカリプロテアーゼNF−１の活
性のPH安定性を示すグラフ、第３図はアルカリプ
ロテアーゼNF−１の活性と温度の関係を示すグ
ラフ、第４図はアルカリプロテアーゼNF−１の
活性と熱安定性の関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記特性を有するアルカリプロテアーゼNF
−１、 (ア) 性状：無色針状結晶、 (イ) 分子量：約30000（ゲル過法による）、 (ウ) 水溶液の紫外線吸収スペクトル：275〜280n
ｍに極大吸収を示す、 (エ) 吸光係数（Ｅ^１％_１ｃｎ280nｍ）：6.0、 (オ) 溶解性：水に可溶、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、アセトン及びエーテルに不溶、 (カ) カゼインを基質にした場合の至適PH：PH10.5
〜11.5、 (キ) PH安定性：PH５〜11.5において30℃で24時間
放置した場合、60％以上のプロテアーゼ活性が
残存する、 (ク) カゼインを基質にした場合の至適温度：約60
℃、 (ケ) 熱安定性：PH10で10分間の処理では50℃ま
で安定であり、60℃で50％の残存活性があり、
65℃では完全に失活する、 (コ) 安定性及び阻害：Ca²⁺で安定化され、
PCMB（パラクロロマーキユリツク安息香酸）
及びEDTA（エチレンジアミン四酢酸）では失
活せず、DFP（ジイソプロピルクロロホスフ
エート）では失活する、 (サ) 比活性：9000u／mg、を生産するバチルス属に属する微生物をアルカリ
性培地に培養し、培養液中に該酵素を蓄積させ、
これを採取することを特徴とするアルカリプロテ
アーゼNF−１の製造法。２微生物がバチルス属に属するB21−２株であ
る特許請求の範囲第１項に記載の製造法。