JPS611397A - ５９バリンインスリン様成長因子１およびその製造法 - Google Patents
５９バリンインスリン様成長因子１およびその製造法Info
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- JPS611397A JPS611397A JP60069630A JP6963085A JPS611397A JP S611397 A JPS611397 A JP S611397A JP 60069630 A JP60069630 A JP 60069630A JP 6963085 A JP6963085 A JP 6963085A JP S611397 A JPS611397 A JP S611397A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
この発明は５９バリンインスリン様成長因子Ｉ（以下５
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と略称する）、保護ペプチド融合
５９Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１（以下融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１と略称する）、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする
遺伝子、融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝
子、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を含有するプラスミ
ド、融合５９ＶａｌｉＧＦ−１ｆｆｌ伝子を含有するプ
ラスミド、融合５９Ｖａ ｌ −Ｉ ＧＦ −１ｉｆｔ
伝子含有プラスミドを含有する宿主生物およびそれらの
製造法に関する。 ５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、インスリン様の活性および
軟・冑による硫酸塩取込みを刺激する活性を有するとと
もに細胞内での蛋白およびＤＮＡの合成を増強しうる。 従って、それは成長の促進にを用でありうる。 また糖尿病の七ｎ床治療においてもを用でありうる。 組換えＤＮＡ（遺伝子組換え）技術ならびに関連技術の
適用が、最も有効な５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−■の大量製造
法となると考えられた。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は新規であり、そのアミノ酸配列
は以下の如く表わすことができる。 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ ｌ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ、
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ｓｅｒ−人ｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ
−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ｇ１．ｕ−Ｃｙ ｓ −Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−９ｅｒ−Ｃｙｓ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａこの発明の発明者らは、
以下の諸必須工程を用いて大量の５９Ｖａ Ｉ −ＩＣ
；Ｆ −１を製造することに成功した。 工程１ ”Ｖａｌ−ＪＧＦ−１をコードする遺伝子を製造するプ
ロセス。所望により、このプロセスに続いて、保８１！
ペプヂドをコードする遺伝子を、ＳｑＶ、−ことがなる
ところの、融合５９ｙ ａｔ−ＩＣＦ−１ｉｆｌ伝子、すなわち保護ペプチドと
融合した５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードする遺伝子を
製造するプロセスを設ける。 適当な「リンカ−」には、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−ＩＪ伝転
子上流に保護ペプチドを連結するための適当な制限酵素
３．２識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする遺伝
子が包含され得て、「リンカ−」自身が該保護ペプチド
を構成する。 とくに好ましい「リンカ−」は後記の実施例中で例示さ
れているごときものである。 さらに、該５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の下流に、こ
れに隣接して、ターミネークーを挿入しうる。 適当な「ターミネータ−」は、適当な制限酵素認識部位
をコードする遺伝子が含まれうる。 とくに好ましい「ターミネークー」は後記の実施例中で
例示されているごときものである。 適当な［融合”Ｖａ Ｉ Ｉ ＧＦ １％すなわち
保８便ヘブチトと融合した”Ｖａ １−ＩＧＦ−ＩＪは
、後記の実施例において説明１例示されるごときもので
ある。 工程２ プロｔ−−りＪ転子および”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ −１
をコードする遺伝子または融合Ｓ９’Ｖａｌ−ＩＣＦ−
■をコードする遺伝子をプラスミド中に挿入することか
らなる発現ベクター製造プロセス。 適当な「発現へククー」には、プラスミドｐｓｄＶ２ｔ
ｒｐ、ｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ
、ｐＳｄＶ２−１ａｃ、ｐＳｄＶ２−ＮＴ４９などが含
まれうる。 とくに適当な「）゛ラスミドＪｌこは、ｐＢＲ３２２な
どが含まれうる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。 適当な「宿主生物」には、＃キ毎エシェリキア・コリ
（［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （たと
えば、エシェリキア・コリＩＩＢＩＯＩ、エシェリキア
・コリ１１１２０１１、エシェリキア・コリＭＭ２９４
など）などが含まれうる。 工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養することからな
る５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１または副；合Ｓ″■ａｌ−Ｉ
ＣＦ−１製造プロセス。 合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を単離するプロセス。 工Ｉ旦（任意） 前記融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護ペプチド脱離反
応に付すことからなる”Ｖａｔ−ＩＣＦ −■製造プロ
セス。 ［融合５９Ｖａ ｌ −ＩＣＦ−１すなわち保護ペプチ
ドと融合した”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ＩＪなる表現における
「保護ペプチド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼ
による分解に対して５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護する
ために使用され、該融合５９Ｖａ １−ＩＣＦ−１の脱
離反応によって除去される。 すなわち、該融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、脱離反応
によって５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を調製するための中間
体であり、従って該保護ペプチドは、天然または合成の
蛋白、天然または合成のペプチド、あるいはそれらの断
片から誘導された任意の脱離可能な保護ペプチドであり
うる。 適当な［融合５９Ｖａ １−ＩＧＦ−１ｊには、蛋白ペ
プチドのメチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合し
た５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１が含まれうる。 この脱離反応に使用される適当な試薬には、臭化シアン
などが含まれる。 この工程では、蛋白ペプチドがそれのメチオニンを介し
て”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と融合している場合には、融合
５９Ｖａｔ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いる脱離反
応によって高収率で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に転化できる
。 木ＤＱ離反応は、反応に悪影響を及はさない通常の溶媒
中で緩和な条件下に実施できる。 上記５″Ｖａｌ−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列から、いく
つかの特定の非自明の基準に従って、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。”Ｖａｌ−１ＧＦ−１遺伝子を、
クローニングヘククーとしての既知のプラスミドに挿入
することによって、クローン化した。組換えプラスミド
から５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子を切出し、つぎに、
プロモーターによる制御下での”Ｖａ １−ＩＣＦ−’
ｊｉｆｆ伝子の発転子極大ならしめるように特にデザイ
ンされたプラスミド中に５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ −１
ｉｆｌ伝子を挿入した。この場合、所望により、保護ペ
プチドをコードする構造遺伝子が前記”Ｖａｌ−ＩＣ；
Ｆ −１遺伝子の上流にかつそれに隣接して挿入される
。 以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発明はそれ
らに限定されるものではない。 （１）”Ｖａ Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝了の調製とクローニ
ング； ｆｌ） ５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の調製：遺伝
暗号の多様性のため、上記アミノ酸配列から、”Ｖａｌ
−ＩＣＦ−１をコードする多数のヌクレオチド配列を予
言することが可能である。 多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。 まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよう
、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが望
ましい。 さらに、周知のクローニングヘクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきである。第三に、
合成が不必要に複雑であってはならず、また、遺伝子の
組立てを容易にすべく、誤まうた交差ハイブリッド化を
極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル（ｏｆｆ−ｄ
ｉａｇｏｎａｌ）な相互反応をできるだけ避けるように
ずべきである。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子部分をコードするために選
んだ好ましい配列を一例を以下に示ずことができる： Ｇｌｙ Ｐｒ。 ３−ドする”” ５’−ＧＧＴ−ＣＣＴ−コー
ドしないｔ貨： ３シｃｃｂ−ａＧＡ−ＣＴＴ−
ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ −
ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ −ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−
ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−Ｃ
ＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
ＳｅｒＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−Ｇ
ＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＭＧ
−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−
ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−Ａｒｇ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ 工
１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧＣ−
ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ’−ＧＧＴ−ＡＴＣ−
ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧ
Ｃ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ
−ＣＴＴ−Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ ＬｅｕＴＧ
Ｃ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ
−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−
ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙ
ｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ
ＬｙｓＧＭ−ＧＴＴ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＧ−ＭＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ −ＣＴＴ
”ＣＡＡ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−
ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−Ｓｅｒ Ａｌａ ＴＣＣ−ＧＣＧ’−３’ ＡＧＧ−ＣＧＣ−５’ この明細書におりる配列の表示において、Ａ。 Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：ｏ −
ｐ −ｏ−ｏ −ｐ −ｏ − ＋１ ）Ｉ
Ａ ＧＣ
Ｔ また、５′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次
式を意味する： Ａ Ｇ Ｔ そして、３′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ
次式を意味する： ｏ ＨＣ
Ｔ 上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮に入れると
き、次の少しく長い配列を選択することができる。 実際、この発明の適当な実施態様として、ＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨ１部位を選択して、それぞれ５′末端およ
び３′末端に導入することができる。 さらに、ノチオニンコドン（ＡＴＧ） を、ＩＧＦ−１
のＮ末端アミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿
入し、２種の停止コドン（ＴＣ；ＡおよびＴＡＧ）を、
Ｃ末端コドンの下流に、これに隣接して、挿入した。 （ＡｖａＩＩ］ ｖ −Ｆ Ｌ、 ナイｌｉ ： ３ ’ −
Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ
−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＣＭ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｉｎ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＣＴＧ−ＣＭ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−
ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−Ｔ
ＡＣ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＭＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＴＴＣ−ＭＣ−ＡＡＡ−
ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−Ａ
ＧＣ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧ
Ｇ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧ
Ｃ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ
−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−Ｇ
ＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴ
Ｇ−ＣＴＴ−Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ ＬｅｕＴＧＣ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−
ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−Ａ
ＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴ
Ａ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ａｌａ ＬｙｓＳｅｒ Ａｌａ ５ｔｏｐ ５
ｔｏｐ ＢａｍＨ工ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧ−
３’八ＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’
本発明は、相当する多数のオリゴヌクレオチドフ゛ロッ
クのハイフ゛りンド化およびライゲーションからなるこ
とを特徴とする、前記のこ゛とき遺（立子の製造方法に
も関するものである。 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： 実Ｗ、３０種の合成オリコヌクレオチドを作成すること
によって、上記の拡張された配列を有する分子を合成す
ることとした。それら合成メ゛リゴヌクレオチドを所定
の段階でノーイブリッド化し、ライゲートするとき、上
記の二ｆｆｉ鎖ヌクレメ′チド配列を与えるものである
。 この明細書におけるオリゴヌクレオチド類の合成に関す
る記載においては、次の略号を用いる。 Ａｐ、ｃｐ、Ｃｐおよび’ｒｐは、それぞれ次式を意味
する： ＨＨ Ａｐ Ｇｐ Ｃｐ 、 Ｔｐまた、３′末端
のＡ、 Ｇ、 ＣおよびＴは、それぞれ次式を意味する
： 八〇 ＨＨ ＣＴ Ａ”ｐ ｏ、 Ｇ”ｐ ｏ、 ＣＩｌ″ｐ ｏ、 ’Ｉ
″ｐｏおよび＾ＣＵｐｏは、それぞれ次式を意味する。 ８□ ６ｉＢｐ。 Ａ ｐ。 ＣＢｚｐｏ Ｔｐｏ ＡｃＵｐ。 ＤＭＴｒはジメｊ−キシトリチルであり、Ｂはアデニニ
ル、グアニニル、シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保８ＵＪは示さない）、Ｕはウラシルであり、 ＡＣはアセデルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。 オリゴヌクレオチド類は次の通りである：（１１ＨＯＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｌ
ｌ（２１ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１＋３１ ＨＯＣｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧＯ）
Ｉ （Ｂｌ）＋４１ ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐ
ＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｂ２１（５
） ＨＯＣｐＧｐＧβＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１ｌ＋６１ ＨＯＡｐＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＴＯＨ１ｃ２）（７１ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨＩＤＩＩ＋
８１ ＋ｌ０ＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｄ２１（９） ＨＯＧ
ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＧｐＴＯＨ（Ｅｌ）（１０１ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｅ２１
（１１１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯＧｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧＯＨ（Ｆ２１＋１３１ ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ
（Ｇｌ）（１４） １（ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２＋（１
５１ｆｒＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＩＩ ＴＨＩＩｆ１６）ＨＯＣ
ｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡＯＨ（Ｂ２）（１７１ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（工１）
（１８） ＨＯＣｐＴｐ’ＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（工２）（１９１Ｈ
ＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌ）（２０）、ＨＯＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯ
Ｈ（Ｊ２１［２１）ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌｌｆ２２１
ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｋ２１（２３） Ｉ（ＯＣｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣ
ｐＴＯＨ（Ｌｌ）（２４） ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（
Ｌ２’１（２５１ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨｆＭ１’１（２
６） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐΔｐＧ
ｐｃｐＡｐｃｐＡｐＧＯＨ（Ｍ２）（２７） ＨＯＣ
ｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＡＯＨｆＮｌｌ（２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２１
ｆ２９）ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴ
ｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＯｌｌＤＯ） ＨＯＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（０２）
その逐次カンブリング反応を第１表に示す。 攬 社 ｔコ モノ （またはジ、あるいはトリ）マー（１）は、広瀬
の方法（Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素１ｓｓ
Ｎ、１工、２２５ （１９８０）、日本で発行）によっ
て調製でき、カンプリングはリン酸トリエステル法（Ｒ
，Ｃｒｅａ ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、 ８． ２３３１ （１９８０）″
およびＭ、 Ｌ、 ＤｕｃｋｗｏｒＬｈら、Ｎ ｕ
ｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
９． １６９１ （１９８１） ）により、セルロー
ス担体上で実施できる。 とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌクレオチドＨ
ＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐ Ａ
ｐ Ｃｐ ＣｐｃｐｃｐｃｐＴｐ八ｐＴｐＧＯＨへＧｌ
）の合成に関して、合成法を説明することとする。ヘキ
サデカヌクレオチドＧ１合成のフローチャートを第２表
に示す。 ７Ｑ７１〜 （ｉｉ ）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド
化とライゲーション を 極小にするために、一連の工程においてオリゴヌクレオ
チド類をハイブリッド化し、ライゲートする。第１図で
は、オリゴヌクレオチドを ヒ（―は５′−ボスボリル
化末Ｏ：１；をπ味する）で表わし、ブロックされたオ
リゴヌクレオチド類ばたとえば←ムー（、、ｔ＋−はラ
イゲーションの位置を意味する）で表わしである。ライ
ゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われ
る。 オリゴヌクレオチドＡ１．８１およびＡ２：Ｃ１、Ｂ２
およびＣ２；ＤＩ、ＥｌおよびＤ２ｉＦ１、Ｂ２および
Ｆ２；’Ｇｌ、Ｈ１およびＧ２１１び にＯｆ、Ｎ２およびｏ２をハイブリッド化し、−イゲー
トして、それぞれ相当するブロック１〜を得た。この場
合、オリゴヌクレオチド八１． Ｂ１およびＡ２なら
びに０１．Ｎ２および０２からそれぞれ得たブロック１
および１０を互いにハイブリッド化し、ライゲートして
、ダイマーを形成させた。ブロック２と３；４と５；６
と７および８と９をハイブリッド化し、ライゲートして
、それぞれブロック１１，１２．１３および１４を得た
。ブロック１，１５．１６およびｌＯをハイブリッド化
し、ライゲートし、かくして得たライゲーション生成物
を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ＋ｌｌで切断して、目的と
するポリヌクレオチド５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を得た。 ｆ２１ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子のクローニング
＝５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−ＩＪ伝転子クローニングの
ため・、これを、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を挿入
できる適当な酵素認識部位をもつ適切なプラスミド、す
なわちクローニングベクターに挿入する・。 この発明の適当な−・具体化例としζ、ニジエリラスミ
ド（たとえばｐ１３Ｒ３２２，ｐＢＲ２３５など）に挿
入し、クローニングを行った。 ま たとえば、第ち図に示された通りの、Ｅｃ ｏＲ１およ
びＢａｍ１１１部位ををするプラスミＦｐＢＲ３２２（
商業的に入手可能）を使用した場合には、このブラース
ミドをＥＣ０ＲＩおよびＢ ａ ｍ ｔｌ Ｉで切断し
た。この場合には、そのプラスミドは、ＥＣ０ＲＩおよ
びＢａｍＨｌで切断したときの長い方の断片上に、アン
ピシリン抵抗性のコード（Ａｍ ｐで示す）を有し、テ
トラサイクリン抵抗性のコード（Ｔｅｔで示す）は、Ｂ
ａ ｍ Ｈ１部位切断の結果消失する。Ｅ ｃ ｏ
ＲＩ −Ｂ ａ ｍ ｔｌ Ｉで切断したプラスミドｐ
ＢＲ３２２の長い方の断片化し、ライゲートした。かく
して得た混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転ｐＳｄＶ２と名付しノる。 （３） プラスミドｐＳｄＶ２中の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１ｉｌｌ伝子の配列 マキサム−ギルバー） （Ｍａ ｘ ａ ｍ−Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ）法を使用できる。 ”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１ｉ１１伝子の配列決定のため、
ブラスミｌ：’ ｐ Ｓ ｄ Ｖ ２をＥＣｏ’１１で
ン肖化し、つぎに、α−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡ Ｍ
Ｖ逆転写酵素で処理した。３２Ｐ標識線状プラスミ１
′をＢａｍＨＩで消化して、二つの断片（２２４ｂｐ、
４．。 ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断片（２２４ｂｐ）をＳ
Ａ、７土、５６０ （１９７７））により分析した。 他方、プラスミドｐＳｄ■２を先に３ ａ ｍ １１■
で消化し、次に上記の通りにして３２Ｐで標識した。線
状プラスミドをＥｃｏｌ’？！で消化して二つの断片（
２２４ｂ ｐ、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方
の断片（２２４ｂｐ）をマキサムーギルノ＜−ト法で分
析した。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側力１ら配列
決定を行った結果は、設計したＳ９■ａｌ−Ｉ Ｇ Ｆ
−１逍伝子と一敗した。 〔２〕プロモーター遺伝子の調製とクローニンク°：宿
主生物から融合５９Ｖａｌ−’ＩＧＦ−１を得るため、
プロモーター遺伝子を設計した。 かかる基準で得たプロモーター遺伝子を、それが５９Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１または融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を
コーｌ′する遺伝子の上流にかつそれＧこ隣接する位置
をとるよう、プラスミド中に挿入する。 この発明の適当な具体化例として、合成のｔｒρプロモ
ーターＩ遺伝子またはｔｒｐフ゛ロモーター■遺伝子を
調製した。 （１）合成ｔｒｐブロモークー■逍伝子転子製とクロー
ニング： 実際には、１４種の合成オリゴヌクレオチドフ゛口・ν
りを作成し、それぞれの−末鎖が少くとも７塩基ずつ重
なるように組立て、完全な二重鎖ヌクレオチド配列を得
ることによって、１０７ｂｐの分子を合成した。 ｃｏＲＩ ３ ’ −ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＭＧＡ
ＣＣＧＴＴＴＡＴＭＧＡＣＴＴ−ＥｃｏＲ工 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドφ凸〒≠Ｉｆｆは次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（八）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｂｌ（３） ｌｌ０ＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４）
ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄｌ（５１ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡＯＨ（Ｅ）（６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ＋（
７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴ○ＩＩ （Ｇｌ（８）
ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈｌ（９１ＨＯＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯ
Ｈ（Ｉｌｆｌｏｌ ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ（Ｊｌ（１
１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋｌ（１２１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１３１ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍｌ（
１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｎｌこれらの合成法は、上記へキザヌクレ
オチドＨｏ Ａ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ
ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴ
ｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成を参照すれば説明されよう。 （ｉｉ）化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション
： オリゴヌクレオチド類を、第り図に示したごと＜”Ｖａ
ｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の場合と同様の方法に従って、ハ
イブリッド化し、ライゲートした。 （ｉｉｉ ）合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の分母ク
ローニング： 合成ｔｒｐプロモーターＩＪ伝子転子ローニングのため
、合成ＬｒｐプロモーターＩを挿入できる適当な酵素認
識部位をもつ適当なプラスミドに、合成ｔｒｐプロモー
ター酵素を挿入する。この発明の好ましい一実施ｃ、様
として、クローニングを、第４図に示した通り、プラス
ミ１°ｐ［３１？３２５（商業的に人手できる）を用い
て実施した。プラスミドｐＢ、Ｒ３２５をＥｃｏＲｌで
切断し、合成ｔｒｐプロモーターＩをそれに挿入した。 このようにして得たプラスミドｐ ＳＴ−１を用いて旦
ｌＣｏ１ｔ ＩＩ Ｂ １０１を形質転換した。 （２）合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の調製二上記合
成Ｌｒｐプロモーター■をプラスミドに正しい方向で挿
入するため、合成ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ１部
位の次にある長さの塩基封鎖をもち、３′末端にＢａｍ
Ｈ１部位をもつ、次のタイプの合成プロモーターずなわ
ち合成Ｌｒｐブロモーターロを８周製した。 実際には、２２種のオリゴヌクレオチド−〇〒毎を作成
し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。 ＥｃｏＲｌ ５’−ＭＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＭＣＧＧＴＴＣ
ＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＭ−３嘗−ＡＣＧＧＣＴ
ＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡ
ＧＡＣＴＴ−ＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＭＴＴＭＴＣ
ＡＴＣＧＭＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣ−Ｅｃ
ｏＲよ りａｍＨ工 （１）オリゴヌクレオチドの合成： ８種のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡＩ（２１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ［５Ｂ
ｌ（３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣＩ＋４１ ＨＯＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨｆｓＤｌ＋５１ ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ１
１６１ １１０ＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＩ（（ＳＦ１（７） ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴ
ＯＨ（ＳＧ）＋８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨＩこれらの合成
法は、前記へキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧ ｐ Ｇ ｐ Ｃｐ Ｔ ｐ
Ａ ｐ Ｔ ｐ Ｇ ＯＨ（Ｇ １ ）の合成を参照
すれば説明されよう。 （１１）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッド
化とライゲーション： 子の場合と同様のやり方に従ってハイブリッド化し、ラ
イゲートした。 （３）合成Ｌｒｐプロモーター■遺伝子の分子クローニ
ング： 合成Ｌｒｐプロモーター１１ｉＨ伝子をプラスミドに挿
入した。この発明の適当な一具体化例として、Ｌｒｐブ
ロモ−クー■遺伝子をプラスミドｐＢｌ”１びＢ ａ
ｍ ＨＩによってその部位を開裂することによって、挿
入した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＴｒｐ
ＥＢ７と名付りる。 〔３〕量白ペプチドＬ Ｈ遺伝子の調製とクローニング
： ５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１と融合できる保護ペプチド
の適当な−・イ列として、蛋白ベプチーしＩＩが調製さ
れている。 （１１蛋白ペプチドＬ、ｔｌ遺伝子の調製：組合せ、完
全な二本鎖ヌクレオチド配列を得るごとによって、２３
３ｂｐの分子を合成することとした。 ヨードしない、、１７ 、 ３’−Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣ
Ａ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−八ｓｐ Ｐｒｏ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＧｌｙＬｙｓ Ｌｅｕ ＬｙＳＡ
ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工１６ Ｍｅｔ５０
Ｈｉｎｄ
エエエＧｉｎ Ｓｅｒ Ｇ１．ｎ Ｉｃｅ Ｖａｌ、Ｓ
ｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＰｈｅ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ 工ｌｅ ＧｌｎＴ
ＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＣ−ＧＡ！ｒ−Ｇ
ＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｔ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ
−ＴＣＧ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＬｙＳＳｅｒ Ｖａｌ ５
ｔｏｐ ５ｔｏｐ Ｂ：１ｍＸ１工（ｉ）オリゴヌクレ
オヂド類の合成； オリゴヌクレオチド婉＃テ学頚は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨｆａ２
］（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（ａ３１（４１ＨＯＴｐＧ
ｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＧＯＨｆａ４）（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（ａ５１（６
１ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨｆａ６）（刀 ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐ
ＡＯＨ（ｂｌｌ・＋８１ ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２）（
９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（１０） ＨＯＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ｂ４）（１１１ＨＯ八へＴｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５１（
１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３） Ｈ
ＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ａｌｌ（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
（ｃ２）（１５１１１０ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨｆｃ３１（１６）
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＧＯｌｌ （ｃ４）（１７１ＨＯＴｐ
ＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＡＯＨ（ｃ５１（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｃ６
１（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨｆａｌｌ（２０１＋（
ＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＴＯＨｆｄ２）（２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ＋６
３１（２２）ＩＩＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３） Ｈ
ＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＧＯＩｌ （ｄ５］（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨｆ
ｄ６）（２５１ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐ八ＯＨ（ｅｌｌ（２６１ＨＯ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧへＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣ
ｐＣｐＡＯＨ（ｅ２１（２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｅ
３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（ｅ４１＋２９１
ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴ
ｐＣｐＡｐＴＯＨｆｅ５）ｔ３０） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１
）＋３１１ ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２１（３２１ＨＯＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１（ｉ
ｉ）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリた通り、
”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子の場合と同様の・やり
方で、ハイブリッド化しライゲートした。 （２）蛋白ペプチドＬＨｉｌｉ転子の分串クローニング
：蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子をプラスミドに挿入した。 この発明の適当な一興体化例として、蛋白ペプチＦＬｌ
ｌｉｆｉ転子をプラスミドｐ１３Ｒ３２２に、第弁イ図
に示した通り、ＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩによってそ
の部位を開裂することにより、挿入した。かくして得た
プラスミドをプラスミドｐＬ ＩＩ ｌ ０７と名付け
る。 （４）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１発現ベクターの構築：
”Ｖａｔ−ＩＣＦ−１遺伝子を、プロモーター遺伝子を
含有するプラスミドに挿入し、”Ｖａｌ−ｌ ＧＦ−１
遺伝子を用いて宿主生物を形質転換した。 この発明の適当な一具体化例として、次の組換えプラス
ミドを、Ｅ、 ｃｏｌｔ中で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｉ遺伝
子を発現させるべく確立した。 （１） 組み換えプラスミドｐＳｄＶ２ ｔ ｒｐの
構築：上で調製したグラスミ６ドｐ ５Ｔ−１をＥＣＯ
Ｒ■で消化し、生した大きい断片に５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１遺伝子を挿入した。こうして得た組換えプラスミド
をプラスミドｐＳＶ２ｔｒｐと名付、旦。 ＋２＋ ＆ｆｌ換えプラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔ
ｒｐの構築ニ プラスミドｐ Ｔ ｒ ｐ ＩＥ Ｂ ７をＥｃｏＲＩ
およびＢａ昆ＨＩで消化し、生じた大型断片（４，１ｋ
ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって分離した。 一方、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子をプラスミドｐｓｄ
Ｖ２から車離し、上記プロモータヘククー（４，１ｋｂ
ｐ）とライゲートした。得られたアンピシリン抵抗性、
テトラサイクリン感受性形質転換体の二つからプラスミ
ドを車離し、制限酵素による消化と電気泳動とによって
、５９Ｖａｌ−ＩＣｌ３−１遺伝子を含有していること
を確認した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＳ
ｄＶ２−３２２ｔｒｐと名付け、このプラスミドを含存
す（５）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子およびプロモ
ーター遺伝子の配列決定： マキサム−ギルハート（Ｍａｘａｍ−ＧｉｌｂｅｒＬ
）法を使用できる。 （１） プラスミドｐＳｂＶＺｔｒｐ中の５９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１ｉｆｔ伝子および合成Ｌｒｐプロモーター
１遺伝子の配列ニ ブラス゛ミドｐＳｄＶ２ｔｒｐ中の”Ｖａｌ−ＩＣＦ−
１遺伝子および合成ｔｒｐプロモーター１遺伝子の配列
を、後記プラスミドｐ３ｄＶ２−３２２ｔｒｐの場合と
同様のやり方で決定した。 （２） プラスミドｐｓｄｖ２−３２２ｔｒｐ中の５
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１ｉ）１伝子および合成ｔｒｐプロ
モーターＩ遺伝子の配列； ”Ｖａ Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝子および合成Ｌｒｐプロモ
ータＩ遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐｓｄＶ２
−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰ （バク
テリア アルカリホスファターゼ）で処理し、つぎに、
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで処理した。 標識されたＤＮＡをＩＩ ｉ ｎ ｒ Ｉで消化して、
二つの断片（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。 これらの断片をマキ→ノ・ムーギルバート法により分析
した。 （Ａ、 ＭａｘａｍとＷ、 Ｇ１１ｂｅｒ
Ｌ、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ ＳΔ５
１土、５６０（１９７７、））、判明した配列は、”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子および合成プロモーター遺伝子
の設計配列と一致した。 〔６〕融合５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１発現ベクターの
構築： ”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子の上流にリンカ−を介
在させまたはさせずに、保護ペプチドをコードする遺伝
子を”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１逍伝子と連結することにより
、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を調製
した。 このプロセスにおいては、最後のアミノ酸としてメチオ
ニンをもつ蛋白ペプチドを５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１と融
合させる。 このようにして得た融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、次の
通りである。 本発明は、かかる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するもの築： この発明の適当な一興体化例として、次のタイプの、蛋
白ペプチドＬ ｌ−１と融合した５９Ｖａｌ−ＩＧＦＩ
をコードする遺伝子の発現ベクターを調製した。 本発明は、保護ペプチドをコードする遺伝子を、リンカ
−を介在させまたはさせずに、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺
伝子と該”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉｉｆｉ伝子の転子で連結
して構築されるかかる遺伝子の発明のためのプロセスに
も関するものである。 ｉ社通七ｉにより宿主生物を形質転換する。 こ、の発明の好適な一興体化例として、旦３匹旦中で蛋
白ペプチドＬｌ（ｉｆｆ伝子転子現させるべく、次の、
ｔ、１１ｔＡえプラスミドを確立した。 Ｔｒｐプロモーター■プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ
０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片（４，
１ｋｂｐ）を７ガロースゲル電気泳動により分離した。 他方、蛋白ペプチドＬ ＩＩ遺伝子をプラスミドｐＬＨ
Ｉ０７から単離し、前記プロモーターベクター（４，１
ｋｂｐ）とライゲートした。この混合物を用いてＥ、ｃ
ｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピ
シリン低抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一
つからプラスミドを単離し、それが蛋白ペプチドＬｌ１
ｍ転子を含有していることを、制限酵素による消化と電
気泳動とによって圃認した。このようにして得上記で調
製したプラスミドｐＬ Ｈｔ ｒ ｐをｔｌ １ｎｄｌ
ＵおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大きい断片を分取
アガロースゲル電気泳動によって分離した。一方、”Ｖ
ａ ｌ −Ｉ ＧＦ −ｊｉｆｆ伝子を転子記ＥｃｏＲ
ＩおよびＢ ａ ｍ Ｈｆ消化により、上で調製したプ
ラスミドｐＳｄＶ２から単離し、その上流に、それに隣
接して、オリゴヌクレオチＩ’ｍ１およびｍ２をリンカ
−として連結した。こうして得たリンカ一つき５９Ｖａ
［−ｒＧＦ−１遺伝子を上記プラスミドｐ Ｌ Ｈｔ
ｒ ｐの大型断片とライゲートした。混合物を用いて
且１匹旦 ）＋１３１０１を形質転換した。得られたア
ンピシリン抵抗性、テトラサイクリン惑受性の形質転換
体の一つからプラスミドをｊ■離し、それが、蛋白ペプ
チドＬｌｌと融合した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子を含有することを、制限酵素による消化と電気
泳動とによって確認した。かくして得たプラスかくして
１：また、蛋白ペプチドＬＳＩ融合”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ
−１をコードする遺伝子は次の通りである。 ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎコ
ードする鎖： ｓ １−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−コードしない鎖、 ３
Ｉ−ｃ−ＴＡｃ−ＡｃＡ−ｈＴａ−Ａｃａ−ａＴｃ−Ａ
ｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−
ＴＡＴ−ＣＴＡ−ＡＡＡ−ＣＡＡ−ＧＣＡ−ＣＡＡ−Ａ
ＡＣ−ＣＴＴ−八ＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡ
Ｔ−ＴＴＴ−ＣＴＴ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−
ＴＴＣ−Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇ
ｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ
−ＴＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−
ＴＣＡ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−八
人Ａ−ＴＴへ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴ
Ａ−ＣＡＴ−ＣＧＣ−八ｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ 工１ｅ
Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＭＧ
−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＡＡ
Ｔ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙ
ｓ工１ｅ Ｍｅｔ八Ａへ−ＴＧＧ−八ＡＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴ
Ｇ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉ
ｎｄエエＩ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｉｎ工ｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＧｌｕ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ ＴｈｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
ＧｉｎＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ −ＧＭ−ＣＴ
Ｇ−ＧＴＴ −ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＧＡ
Ｃ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ −ＧＡＣ−ＣＡ
Ａ−ＣＴＧ −ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ −ＰｈｅＶａ
ｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＴＴＴ −ＧＴＡ−ＴＧＴ−
ＧＧＴ−ＧＡＴ −ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−
ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−Ｃ
ＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｇ−Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ ＡｒｇＡＡＡ−Ｃ
ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧ
Ｃ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ
−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ、−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ 工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃ
ｙｓＰｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＶａＩＴＴＴ−Ｃ
ＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧ
Ｔ−ＣＴＧ−ＧＭ−ＧＴＴ −ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ
−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−
ＣＴＴ−ＣへＡ−Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＭＧ−Ｃ
ＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−八ＴＧ−ＡＣ
Ａ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ
−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−５ｔｏｐ ５ｔｏｐ Ｂａ
ｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ 八ＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチドＬ Ｈ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＩ”
−１をコードする遺伝子は次の通りである；Ａｓｐ Ｐ
ｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＴＡＴ−
ＧＴＡ−八Ｍ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＭＣ−ＣＴＴ−
ＭＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＣＴ
Ｔ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−ＴＴＣ−Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ
−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ−
ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−ＣＧ
Ｃ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ
−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−
ＡＴＴ−ＴＴＧ−へＡＧ−ＣＴＡ−ＴＴへ−ＣＣＴ−Ｔ
Ｇへ−ＧＡＡ−八ＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＴＡＡ−７１
，ＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工１ｅ Ｍｅ
ｔＡＡＴ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ−
ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ −ＴＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−Ｔ
ＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉｎｄエエエ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ 工１ｅＶａｌ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−ＡＧＣ−
ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ−Ｔ
ＴＣ−ＭＧ−ＣＴＴ−ａＴｃ−Ｔｃｃ−ａｒＴ−ＴＡＡ
ＬｃＡＧ−Ａｃｃ−ｕ野−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＣ−Ｇ
ＡＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐ？
＋ｅＭｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ ＴｈｒＧＭ−Ｇ
ＴＡ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＧＭ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＧＧＴ
−ＣＣＴ−ＧＭ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−Ｇ
ＴＡ−ＣＴＴ−ＭＧ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ
−ＴＧＡ−Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＧｉｎＣＴ
Ｇ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴＴ
−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＭ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−Ｃ
ＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＣＧ
Ａ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
ＡｓｎＴＴＴ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧ
Ｔ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ
−ＣＡＴ−八ＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−
ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ ＡｒｇＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−
ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−Ｃ
ＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣ
Ｇ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−八ＧＡ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ Ａ
ｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ ＣｙｓＰｈｅ Ａｒｇ Ｓｅ
ｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＶａｌＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−
ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−Ｇ
Ｍ−ＧＴＴ−Ｎ彷−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−
ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＣＭ−Ｔｙ
ｒ ＣｙｓＡｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡｌａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣ
Ｔ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＭＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＪ彷−
ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ
−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−
ＣＧＣ−５’ｆ２１ ”Ｖａ １−ＩＣＦ−１遺伝子
の下流にかつそれに隣接するターミネークーをイ１する
蛋白ペプチド遺伝子と融合した”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−
１をコードする遺伝子の発現ヘククーの構築： クーミネークーが該Ｓ″’Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の
下流にかつそれに隣接する位置に挿入されうる。 適当な「クーミネーター」としては、適切な酵素認識部
位をコードする遺伝子が含まれうる。 ｆａ＋ オリゴヌクレオチド１■の合成；１４種のオ
リゴヌクレオチドをさらに合成した。 ＋４１ ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（八１）（２） ＨＯＧｐ
ＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯＨｆＢ’）（３） ＨＯＴｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧｐＧｐＡＯＨｌｃ’１（４１ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６
１ ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ
（Ｆ’１１７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＴＯ）ｌ （Ｇ’）（８１ＨＯＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｈ’）＋９１ ＋１０ＧｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＩＩ
（工１）（１０１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧＯ）（ｆ、ｆｆ
’１（１１） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯ）Ｉ （Ｋ’１（１２） ＨＯ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ＋Ｌ’１
ｆ１３） １ｌＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＣｐＧＯＨｔＭ’）（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐ
ＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ｆｂｌ 化学合成オリゴ
ヌクレオチド類のライゲーション： 示した通り、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の場合と同様のやり
方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてクーミネー
ターＳを得た。 （ｉｉ）クーミネークーＬ（ｔｅｒｌ−）Ｉの場合と同
様のやり方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてク
ーミネーターＬを得た。 ｔｅｌ ターミネークーＳおよびクーミネークーＬの
クローニング： クーミネークーＳおよびクーミネーターＬを、それぞれ
”Ｖａｌ−ＩＣ，Ｆ−１ｉｆｌ伝子の下流にか（３）
β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ヘクターの構築； （ａｌ 組み換えプラスミドｐｓａｖ２−１ａｃの構
築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−１ａｃを実施例２２に記載の方
法で構築した。 ｆｂｌ 組み換えブー７スミドｐＳｄＶ２−ＮＴ４９
の構築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−、、ＮＴイ９を実施例２４゜に
記載の方法で構築した。 （Ｃ１β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−１０Ｆ −
，１をコードする遺伝子： β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ ＩＣＦ−■をコ
ードする遺伝子は次の通りである：Ｔｈｒ Ｍｅｔ工ｌ
ｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｖａｌ ＬｅｕＡＣＣ−ＡＴＧ−ＡＴＴ−ＡＣＧ−Ｇ
ＡＴ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＧＴＣ−ＧＴＴ−ＴＴ
Ａ−ＴＧＧ−ＴＡＣ−ＴＭ−ＴＧＣ−ＣＴＡ−ＡＧＴ−
ＧＡＣ−ＣＧＧ−ＣＡＧ−ＣＭ−ＭＴ−Ｇｌｎ Ａｒ
ｇ 八ｒｇ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＴｈｒＣＭ−ＣＧＴ
−ＣＧＴ−ＧＡＣ−ＴＧＧ−ＧＡＡ−ＭＣ−ＣＣＴ−Ｇ
ＧＣ−ＧＴＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＣＴ
Ｇ−ＡＣＣ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＧＡ−ＣＣＧ−ＣＭ−
ＴＧＧ−Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ ＰｈｅＣＡＡ
−ＣＴＴ−ＭＴ−ＣＧＣ−ＣＴＴ−ＧＣＡ−ＧＣＡ−Ｃ
ＡＴ−ＣＣＣ−ＣＣＴ−ＴＴＣ−ＧＴＴ−ＧＡＡ−ＴＴ
Ａ−ｃｃｃ−ＧＡＡ−ＣＧＴ−ＣＧＴ−ＧＴＡ−ＧＧＧ
−ＧＧＡ−ＡＡＧ −八ｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ
Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｒｇ ＴｈｒＧＣＣ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−
ＣＧＴ−八ＡＴ−ＡＧＣ−ＧＭ−ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＣＧ
Ｃ−ＡＣＣ−ＣＧＧ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＧＣＡ−ＴＴＡ
−ＴＣＧ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＣＧＧ−ＧＣＧ−ＴＧＧ−
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＡｓｎＧｌｙ Ｇｌｕ
Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ 八ｌａ Ｐｒ。 ＧＧＣ−ＧＭ−ＴＧＧ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＣＣ−ＴＧ
Ｇ−ＴＴＴ−ＣＣＧ −ＧＣＡ−ＣＣＡ −ＣＣＧ −
ＣＴＴ−ＡＣＣ−ＧＣＧ−ＭＡ−ＣＧＧ−ＡＣＣ−ＡＭ
−ＧＧＣ−ＣＧＴ −ＧＧＴ −Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ ＡｓｐＧＭ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＣＣＧ −Ｇ
Ｍ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−ＣＴＧ −ＧＡＧ −ＴＧＣ−Ｇ
ＡＴ −ＣＴＴ−ＣＧＣ−ＣＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＴ−Ｔ
ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＡＣＧ −ＣＴＡ−Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａ
ｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ ５ｅｒＣＴＴ−ＣＣＴ−
ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＧＡＴ−ＡＣＴ−ＧＴＣ−ＧＴＣ−Ｇ
ＴＣ−ＣＣＣ−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＡ−ＣＴＣ−ＣＧ
Ｇ−ＣＴＡ−ＴＧＡ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＧＧＧ
−ＡＧＴ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｉｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ工１ｅＭＣ−
ＴＧＧ−ＣＡＧ−ＡＴＧ−ＣＡＣ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−Ｇ
ＡＴ−ＧＣＧ−ＣＣＣ−ＡＴＣ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＧＴ
Ｃ−ＴＡＣ−ＧＴＧ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＣＴＡ−ＣＧＣ
−ＧＧＧ−ＴＡＧ−Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ 工１−ｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ 八ｓｎＴＡＣ−ＡＣＣ−ＭＣ−ＧＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＡＴ−ＣＣＣ−ＡＴＴ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ｍ
Ｔ−ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＴＴＧ−ＣＡＴ−ＴＧＧ−ＡＴＡ
−ＧＧＧ−ＴＭ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＴＴＡ−Ｐｒｏ Ｐ
ｒｏ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ＧｌｙＣＣＧ−ＣＣＧ−ＴＴＴ−
ＧＴＴ−ＣＣＣ−ＡＣＧ−ＧＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−Ａ
ＣＧ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＡＡＡ−ＣＭ−ＧＧＧ
−ＴＧＣ−ＣＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−
Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＰｈｅＡｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＳｅｒＴＧＴ−ＴＡＣ−
ＴＣＧ−ＣＴＣ−ＡＣＡ−ＴＴＴ−ＭＴ−ＧＴＴ−ＧＡ
Ｔ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＧＡＧ
−ＴＧＴ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−ＣＴＴ−
ＴＣＧ−Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ工１ｅ Ｉｌｅ ＰｈｅＴＧＧ−
ＣＴＡ−ＣＡＧ−ＧＭ−ＧＧＣ−ＣＡＧ−ＡＣＧ−ＣＧ
Ａ−ＡＴＴ−ＡＴＴ−ＴＴＴ−ＡＣＣ−ＧＡＴ−ＧＴＣ
＝ＣＴＴ−ＣＣＧ−ＧＴＣ−ＴＧＣ−ＧＣＴ−ＴへＡ−
ＴＡＡ−ＡＡＡ−Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓ
ｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔ’ｒｐ Ｃ
ｙｓＧＡＴ−ＧＧＣ−ＧＴＴ−八ＡＣ−ＴＣＧ−ＧＣＧ
−ＴＴＴ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＴＧＧ−ＴＧＣ−ＣＴＡ−
ＣＣＧ−ＣＡＡ−ＴＴＧ−ＡＧＣ−ＣＧＣ−八ＡＡ−Ｇ
ＴＡ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＡＣＧ−Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｉｎ
Ａｓｐ ＳｅｒＭＣ−ＧＧＧ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−ＧＴ
Ｃ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＡＧ−ＧＡＣ−ＡＧＴ
−ＴＴＧ−ＣＣＣ−ＧＣＧ−ＡＣＣ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−
ＡＴＧ−ＣＣＧ−ＧＴＣ−ＣＴＧ−ＴＣＡ−Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ａｌａ ＰｈｅＣＧＴ−ＴＴＧ−ＣＣＧ−
ＴＣＴ−ＧＭ−ＴＴＴ−ＧＡＣ−ＣＴＧ−ＡＧＣ−ＧＣ
Ａ−ＴＴＴ−ＧＣＡ−ＡＡＣ−ＧＧＣ−ＡＧＡ−ＣＴＴ
−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＧＡＣ−ＴＣＧ−ＣＧＴ−ＡＡＡ−
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ
ＭｅｔＴＴＡ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＧＧＡ−ＧＭ−ＭＣ−
ＣＧＣ−ＣＴＣ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＡＴＧ−へへＴ−Ｇ
ＣＧ−ＣＧＧ−ＣＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＣＧ−ＧＡ
Ｇ−ＣＧＣ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−Ｖａｌ Ｌａｕ Ａｒｇ
Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ ＧｌｕＧＴＧ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＴＧＧ−ＡＧ
Ｔ−ＧＡＣ−ＧＧＣ−ＡＧＴ−ＴＡＴ−ＣＴＧ−ＧＡＡ
−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＧＣＡ−ＡＣＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−
ＣＣＧ−ＴＣＡ−ＡＴＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ −Ａｓｐ
Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ 工１ｅ ＰｈｅＧＡＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ
−ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＣＧＧ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＧＧＣ−
ＡＴＴ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＣＴＡ−ＴＡＣ−Ａ
ＣＣ−ＧＣＣ−ＴＡＣ−ＴＣＧ−ＣＣＧ−ＴＡＡ−ＭＧ
−２１０２２’Ｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈ
ｉｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ＴｈｒＧｌｎ 工１ｅ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ａｒｇ ＰｈｅＣ八Ａ−へＴＣ−ＡＧＣ−ＧＡ
Ｔ−ＴＴＣ−ＣＡＴ−ＧＴＴ−ＧＣＣ−ＡＣＴ−ＣＧＣ
−ＴＴＴ−ＧＴＴ−ＴＡＣ−ＴＣＧ−ＣＴＡ−ＡＡＧ−
ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＧＧ−ＴＧＡ−ＧＣＧ−ＡＡＡ−Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａ
ｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇ１＋ｊ
Ａｌ−ａＡＡＴ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＴＴＣ−ＡＧＣ−Ｃ
ＧＣ−ＧＣＴ−ＧＴＡ−ＣＴＧ−ＧＡＧ−ＧＣＴ−ＴＴ
Ａ−ＣＴＡ−ＣＴＡ−ＭＧ−ＴＣＧ−ＧＣＧ−ＣＧＡ−
ＣＡＴ−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＣＧＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ａｓｐ ＴｙｒＧＭ−ＧＴＴ−ＣＡＧ−ＡＴＧ−Ｔ
ＧＣ−ＧＧＣ−ＧＡＧ−ＴＴＧ−ＣＧＴ−ＧＡＣ−ＴＡ
Ｃ−ＣＴＴ−ＣＭ−ＧＴＣ−ＴＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−
ＣＴＣ−ＡＡＣ−ＧＣＡ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｇｌ−ｎ Ｇｌｙ ＧｌｕＣＴＡ−ＣＧＧ−ＧＴＡ
−ＡＣＡ−ＧＴＴ−ＴＣＴ−ＴＴＡ−ＴＧＧ−ＣＡＧ−
ＧＧＴ−ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＧＣＣ−ＣＡＴ−ＴＧＴ −
ＣＭ−ＡＧＡ−ＭＴ −ＡＣＣ−ＧＴＣ−ＣＣＡ−ＣＴ
Ｔ −Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ 八ｌａ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
ＧｌｙＡＣＧ−ＣＡＧ−ＧＴＣ−ＧＣＣ−ＡＧＣ−
ＧＧＣ−ＡＣＣ−ＧＣＧ−ＣＣＴ−ＴＴＣ−ＧＧＣ−Ｔ
ＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＣＧＧ−ＴＣＧ−ＣＣＧ−ＴＧ
Ｇ−ＣＧＣ−ＧＧＡ−ＡＡＧ−ＣＣＧ−Ｇｌｙ Ｇｌｕ
工１ｅ 工３−ｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｙｒ ＡｌａＧＧＴ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＡＴ
Ｃ−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＧＧＴ−ＴＡＴ
−ＧＣＣ−ＣＣＡ−ＣＴＴ−ＴへＡ−ＴＡＧ−ＣＴＡ−
ＣＴＣ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＡＴＡ−ＣＧＧ−八
ｓｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ ＡｓｎＧＡＴ−ＣＧ
Ｃ−ＧＴＣ−ＡＣＡ−ＣＴＡ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＭＣ−
ＧＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＣ−ＣＴＡ−ＧＣＧ−ＣＡＧ−Ｔ
ＧＴ−ＧＡＴ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＴＴＧ−ＣＡＧ−ＣＴ
Ｔ−ＴＴＧ−Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ ＬｅｕＣ
ＣＧ−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＧＣＣ−ＧＡ
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−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＧＡＡ−
ＧＴＴ−ＭＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡ
Ｇ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＣＡＡ−Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡｌａＴＡＣ−ＴＧＴ−Ｇ
ＣＴ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−八人
Ａ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−Ｇ
ＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧ
Ｇ−ＣＧＣ−５’〔７〕宿主生物での５″Ｖａ ｌ −
ＩＧＦ −１遺伝子の発現： ５９Ｖａ ｌ −ＩＧＦ−１遺伝子を発現させるため、
こうして得たプロモーフ遺伝子と５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１遺伝子とを有するプラスミドを用いて宿主生物を形質
転換し、つぎにそのプラスミドを存する宿主生物を、同
化可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、
好気性条件下に（たとえば振とう培養、深部培養など）
培養する。 栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース。 フルクトース、スクロース、グリセリン、でん粉などの
ごとき炭水化物である。包含されうる他の炭素源は、キ
シロース、ガラクトース、マルトース、デキストリン、
ラクトースなどである。 好ましい窒素ｄｒＡは、酵母エキス、ペプトン、グルテ
ン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵
母、小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸な
どのごとき無機および有機の窒素化合物である。 の量の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使
用に適しているので、それらは必ずしも純粋な形で使用
することを要しない。所望の時には、炭酸カルシウム、
燐酸ナトリウムまたはカリウム。 塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩類、銅
塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。 培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成できる
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。攪拌は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより遂行しうる。 醗酵は、通常約２０℃と４２°Ｃとの間の温度で、好ま
しくは３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時
間にわたって行う。 こうして産出された５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１または融合
”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１は、他の既知の生物学的活性
物質の回収に一般的に用いられる慣用の手段によって培
養培地から回収できる。一般的には、産出された５９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−１または融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は宿
主生物の細胞中に見出され、従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉまたは融合５９Ｖａ、１−ＩＧＦ−’ Ｉは、培養
液を濾過または遠心分離して得られる細胞から、減圧下
の濃縮、超音波処理などの細胞破砕、ＨＰＬＣ，凍結乾
燥。 ｐＨ１１節、樹脂（たとえばアニオンまたはカチオン交
換樹脂、非イオン性吸着樹脂）を用いての処理、慣用の
吸着剤（たとえば活性炭、珪酸、シリカゲル、セルロー
ス、アルミナ）での処理、ゲル濾過、晶出などの常法に
よって、分離できる。 （１） プラスミドｐ３ｄＶ２ｔｒｌ’を用いての基
６ｃｏｌｉ中での”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の発現ｐ
ｓｄＶ２ｔｒｐ含有旦９匹旦 ＨＢＩＯＩをＬブロス中
で一夜培養したものをトップ１〜フ不含不含Ｍ９培地で
希釈し、細胞を、β−インドールアクリル酸誘導の条件
下に、３７℃で３時間インキユヘートした。”Ｖａｌ−
ＩＧＦ−１産生の検出は、矢内原の方法〔矢内原ら、Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒ−ｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎ
ｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８３） ）に従
って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ Ｉ断片（２６−４６）の抗
体を用いて、放射免疫測定法（以下ＲＩＡという）によ
り行った。 （２） プラスミドｐＳｄＶ２−３２２ ｔ ｒｌｌ
）を用いての旦６匹旦 中での５９Ｖａ ｌ −ＩＧ
Ｆ−１遺伝子の発現 プラスミドｐｓｄＶ２−３２２ｔｒｐを含有する旦９匹
旦 ＨＢ １０１をＬブロス中で一夜培養したものを、
トリプトファン不含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドール
アクリル酸誘導条件下に細胞を３７℃で３時間インキユ
ヘートした。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産生の検知は、矢内
原の方法に従って、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１断片（２６
−４６）の抗体を用いＲＩＡによって行った。 〔８〕融合５９Ｖａ ］ −１ＣＦ−Ｉをコードする遺
伝子の宿主生物中での発現： （１）蛋白ペプチドＬ Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を
コードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白ペプチド
ＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を
発現させるため、プロモーター遺伝子と、蛋白ペプチド
ＬＨ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉとを有するプラスミドを
用いて宿主生物を形質転換し、つぎに、そのプラスミド
を有する宿主生物を適当な培地中で培養する。得られた
培養液から蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦい
ての、旦、延中での発現： ｐＬＨ３ｄ、Ｖｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳまたはｐ
Ｌ、Ｈ３ｄＶｔｒｐＬを含有する旦９匹旦ＨＢ １０１
をＬブロス中で一夜培養したものを、トリプトファ不含
含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールアクリル酸誘導の
条件下に細胞を３７°Ｃで３時間インキユヘートした。 融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産出の検知は、矢内原の方
法〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８（１９８３））
に従って、”Ｖａ ｌ −ＩＣＦ −１断片（２６−４
６）の抗体を用いる放射免疫測定法（以下ＲＩＡという
）によって実施した。 （ｉｔ）蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ −
１の単離： 培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。遠心分離によってベレ
ットを集め、つぎに、０．１Ｍのジチオスレイトール（
以下、ＤＴＴと略称する）を含有する８Ｍ尿素溶液に溶
解した。遠心分離後、溶液を３３００カラムクロマトグ
ラフイにより精製した。ＲＩＡによって検知された活性
画分を集め、透析して、所望の成分を含をする蛋白を得
た。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、正規
の位ｉＴＥ、（１５５００）に融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
ｉが検出された。 こうして得た蛋白ペプチドＬ Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉは次の通りである。 Ｃｙｓ −Ｔｙｒ −Ｃｙ ｓ −Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ ５−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｌｙ ５−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ −Ａｓ ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ｓ −
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓ ｎ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、−Ｇｌｙ
−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−へｒｇ−Ｌｙｓ−工
１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−６ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａ
ｌ−９ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ｕ−Ｖａｌ−Ｌｙ ｓ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇ １ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −Ｇ １ｙ−Ａｌａ−Ｇ １ｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ １ｎ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙ ｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｇ １ｙ−Ｐｈ ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ ｎ−Ｌ
ｙ ５−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５
ｅｒ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏｌ１０５ｅｒ−６ｅｒ−Ａｒ工：Ｌｅ−Ｖａｎ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙ ｓ −（Ｊｓ−ＰｈｅＪ、ｒｇ−５
ｅ ｒ−Ｃｙｓ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ １−Ｔｙ ｒ −Ｃｙ ｓ
−Ａｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ−Ｐ ｒｏ−
Ａｌａ−Ｌ＋ｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ （２） β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−■をコードする遺伝子の宿主生物中での発現＝ｐｓ
ｄＶ２−１ａＣを含有する宿主生物またはｐＳｄＶ２−
ＮＴ４９およびｐＮＴ２０４を含有する宿主生物を用い
、蛋白ペプチドＬ ｔｌ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝社母
＝＃の場合と同様のやり方に従って、β−ガラクトシダ
ーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝十≠＝４を得た。 こうして得た融合５″Ｖａｌ−１’ＧＦ＝転曇＝→は次
の通りである。 Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−Ａ
ｒｑ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇ ｌｙ −Ｖａ １−Ｔｈｒ −Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓ ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−１１
ｉ ５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −八１ａ−５ｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−９ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｈ ａ
−Ａｌ ａ−Ｔｒｐ−Ｐ ｈｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ −
Ｐ ｒｏ−Ｇ １ｕ−Ａ １ ａ−Ｖａ １−Ｐ ｒｏ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙ ５
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−八ｌａ−Ａｓｐ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ７Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −
Ｖａ”ｈ −Ｐ ｒｏ−Ｔｈ ｒ −Ｇ １ｕ−Ａｓｎ
−Ｐ ｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙ ５−Ｔｙｒ−
９ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｖａ
１−Ａｓ ｐ−Ｇ ｌｕ −Ｓｅ ｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
１１ｅ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−９ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
ｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ −Ｇ Ｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｖ
ａ １−Ｇ １ｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｓ ｅ ｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Δｒｑ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａ １−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−９ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇ １ｙ−
６ｅｒ−Ｔｙ ｒ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ
−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａ ｌ−
５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ｌｙｓ −Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−５ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａ １−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ、ｕ−
八ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ −Ａｌａ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−工１ｅ−工１
ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｌａ−Ａｓ ｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −Ｖａ １−Ｇ ｌｕ −
Ａ ｓ ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−工ｌｅ −Ｐ ｒ Ｏ−Ａ Ｓ ｎ
−Ｌｅ ｕ −Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ｈｉ ５−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１
ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−工１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉ ５−Ｇｌｕ−Ｈｉ ｓ −Ｈｉ ５−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｙ−Ｇｌ ｎ −Ｖａ
１−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇ １ｕ−Ｇｌ ｎ −Ｔｈｒ
−Ｍｅ ｔ−Ｖａ １−Ｇ ｉｎ −Ａｓｐ−工１ｅ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａ １−Ａｒｇ−Ｃ
ｙ ５−５ｅ ｒ−Ｈｉ ５−Ｔｙｒ−Ｐ ｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｈｉ ｓ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓ、ｐ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐ ｒｏ
−Ａｒｇ−’Ｉ’ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｍ
ｅｔ−Ｓ ｅｒ −Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ −Ｖａ １−Ｔ
ｈ ｒ−Ａｒｇ −＋４ｅ ｔ−Ｖａ １−Ｇｌ ｎ−
Ａｒｇ−Ａｓ ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ −Ｈｉ ｓ −Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−工１ｅ−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ −Ｈｉ ５
−Ａｓｐ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
−工１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇ １ｎ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ：Ｌａ −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−工１ｅ−
工１ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ ｒｏ−
Ｌｙ ｓ −Ｔｒｐ−５ｅｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｌａｕ−６ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌ
ｅｕ−ＣｙＳ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌ
ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｐｈａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｎ−Δｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ
７Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ −Ｖａ
１−Ａｓｐ −Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌｙ
ｓ −Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ａ１ａ７Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ−）ｉｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ −Ａｒｇ−Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−
Ｈｉ ５−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ １ｕ
−Ａｌ ａ−Ｌｙ ｓ −Ｈｌｓ −Ｇ ｌ ｎ−Ｇ
１ｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−工１ｅ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈ ｒ −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉ ｓ −Ｓ ｅｒ−
Ａｓ ｐ−Ａｓ ｎ −Ｇ １ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−）
１ ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅ ｔ−Ｖａ １−Ａｌ ａ−Ｌ
ｅｕ−ＡＳｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ −Ｓｅ ｒ−Ｇｌｙ−Ｇ １ｕ−Ｖａｌ −Ｐｒ
ｏ７Ｌｅｕ −Ａ ｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−Ｖ、ａｌ −Ａｒ
ｇ−Ｖａ １−Ｖａｌ −Ｇ Ｉｎ −Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ −Ａｌ、ａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−１１ｅ−５ｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ −Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ ＝Ａ１ａ−Ｇ １ｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ −Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
１ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ −Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ
−Ｐ ｈｅ−Ａｓ ｎ −Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒ
ｐ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙ ｓ −Ｌｙ ｓ
−Ｇ １ ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ａ
ｓｐ−工ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ −Ｖａ １−Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ−
Ｔｒｐ−Ｌｙ ５−Ａｌ ａ −Ａｌ ａ−Ｇ ｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈａ−工１ｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−工１ｅ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−８７０８Ｅ
］０ Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ａｒｇ−工
１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
−Ｖａ １−Ａｓ ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−１１ａ１−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｙ−Ｐ ｒｏ−Ｈｉ
ｓ −Ｇ ｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇ ｉｎ −Ｐｈｅ −Ａｓｎ−工１ｅ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｈｉｓ−
Ａｒｇ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ｇ １ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｎ −工１ｅ−Ａｓｐ −Ｇ １ｙ−Ｐｈｅ
−Ｈｉ ｓ −Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−９ｅｒ７Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ
−Ｍｅ七−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ＝Ｌｅｕ−
Ｃｙ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ −Ｖａ
１−Ａｓｐ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｐｈｅ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｓ ｒ−５ｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−７１１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ １ｕ−Ｖａ Ｌ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙ ５−５ｅｒ−Ａｌａ
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と略称する）、保護ペプチド融合
５９Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１（以下融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１と略称する）、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする
遺伝子、融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝
子、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を含有するプラスミ
ド、融合５９ＶａｌｉＧＦ−１ｆｆｌ伝子を含有するプ
ラスミド、融合５９Ｖａ ｌ −Ｉ ＧＦ −１ｉｆｔ
伝子含有プラスミドを含有する宿主生物およびそれらの
製造法に関する。 ５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、インスリン様の活性および
軟・冑による硫酸塩取込みを刺激する活性を有するとと
もに細胞内での蛋白およびＤＮＡの合成を増強しうる。 従って、それは成長の促進にを用でありうる。 また糖尿病の七ｎ床治療においてもを用でありうる。 組換えＤＮＡ（遺伝子組換え）技術ならびに関連技術の
適用が、最も有効な５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−■の大量製造
法となると考えられた。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は新規であり、そのアミノ酸配列
は以下の如く表わすことができる。 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ ｌ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ、
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ｓｅｒ−人ｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ
−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ｇ１．ｕ−Ｃｙ ｓ −Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−９ｅｒ−Ｃｙｓ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａこの発明の発明者らは、
以下の諸必須工程を用いて大量の５９Ｖａ Ｉ −ＩＣ
；Ｆ −１を製造することに成功した。 工程１ ”Ｖａｌ−ＪＧＦ−１をコードする遺伝子を製造するプ
ロセス。所望により、このプロセスに続いて、保８１！
ペプヂドをコードする遺伝子を、ＳｑＶ、−ことがなる
ところの、融合５９ｙ ａｔ−ＩＣＦ−１ｉｆｌ伝子、すなわち保護ペプチドと
融合した５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードする遺伝子を
製造するプロセスを設ける。 適当な「リンカ−」には、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−ＩＪ伝転
子上流に保護ペプチドを連結するための適当な制限酵素
３．２識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする遺伝
子が包含され得て、「リンカ−」自身が該保護ペプチド
を構成する。 とくに好ましい「リンカ−」は後記の実施例中で例示さ
れているごときものである。 さらに、該５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の下流に、こ
れに隣接して、ターミネークーを挿入しうる。 適当な「ターミネータ−」は、適当な制限酵素認識部位
をコードする遺伝子が含まれうる。 とくに好ましい「ターミネークー」は後記の実施例中で
例示されているごときものである。 適当な［融合”Ｖａ Ｉ Ｉ ＧＦ １％すなわち
保８便ヘブチトと融合した”Ｖａ １−ＩＧＦ−ＩＪは
、後記の実施例において説明１例示されるごときもので
ある。 工程２ プロｔ−−りＪ転子および”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ −１
をコードする遺伝子または融合Ｓ９’Ｖａｌ−ＩＣＦ−
■をコードする遺伝子をプラスミド中に挿入することか
らなる発現ベクター製造プロセス。 適当な「発現へククー」には、プラスミドｐｓｄＶ２ｔ
ｒｐ、ｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ
、ｐＳｄＶ２−１ａｃ、ｐＳｄＶ２−ＮＴ４９などが含
まれうる。 とくに適当な「）゛ラスミドＪｌこは、ｐＢＲ３２２な
どが含まれうる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。 適当な「宿主生物」には、＃キ毎エシェリキア・コリ
（［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （たと
えば、エシェリキア・コリＩＩＢＩＯＩ、エシェリキア
・コリ１１１２０１１、エシェリキア・コリＭＭ２９４
など）などが含まれうる。 工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養することからな
る５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１または副；合Ｓ″■ａｌ−Ｉ
ＣＦ−１製造プロセス。 合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を単離するプロセス。 工Ｉ旦（任意） 前記融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護ペプチド脱離反
応に付すことからなる”Ｖａｔ−ＩＣＦ −■製造プロ
セス。 ［融合５９Ｖａ ｌ −ＩＣＦ−１すなわち保護ペプチ
ドと融合した”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ＩＪなる表現における
「保護ペプチド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼ
による分解に対して５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護する
ために使用され、該融合５９Ｖａ １−ＩＣＦ−１の脱
離反応によって除去される。 すなわち、該融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、脱離反応
によって５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を調製するための中間
体であり、従って該保護ペプチドは、天然または合成の
蛋白、天然または合成のペプチド、あるいはそれらの断
片から誘導された任意の脱離可能な保護ペプチドであり
うる。 適当な［融合５９Ｖａ １−ＩＧＦ−１ｊには、蛋白ペ
プチドのメチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合し
た５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１が含まれうる。 この脱離反応に使用される適当な試薬には、臭化シアン
などが含まれる。 この工程では、蛋白ペプチドがそれのメチオニンを介し
て”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と融合している場合には、融合
５９Ｖａｔ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いる脱離反
応によって高収率で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に転化できる
。 木ＤＱ離反応は、反応に悪影響を及はさない通常の溶媒
中で緩和な条件下に実施できる。 上記５″Ｖａｌ−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列から、いく
つかの特定の非自明の基準に従って、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。”Ｖａｌ−１ＧＦ−１遺伝子を、
クローニングヘククーとしての既知のプラスミドに挿入
することによって、クローン化した。組換えプラスミド
から５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子を切出し、つぎに、
プロモーターによる制御下での”Ｖａ １−ＩＣＦ−’
ｊｉｆｆ伝子の発転子極大ならしめるように特にデザイ
ンされたプラスミド中に５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ −１
ｉｆｌ伝子を挿入した。この場合、所望により、保護ペ
プチドをコードする構造遺伝子が前記”Ｖａｌ−ＩＣ；
Ｆ −１遺伝子の上流にかつそれに隣接して挿入される
。 以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発明はそれ
らに限定されるものではない。 （１）”Ｖａ Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝了の調製とクローニ
ング； ｆｌ） ５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の調製：遺伝
暗号の多様性のため、上記アミノ酸配列から、”Ｖａｌ
−ＩＣＦ−１をコードする多数のヌクレオチド配列を予
言することが可能である。 多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。 まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよう
、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが望
ましい。 さらに、周知のクローニングヘクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきである。第三に、
合成が不必要に複雑であってはならず、また、遺伝子の
組立てを容易にすべく、誤まうた交差ハイブリッド化を
極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル（ｏｆｆ−ｄ
ｉａｇｏｎａｌ）な相互反応をできるだけ避けるように
ずべきである。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子部分をコードするために選
んだ好ましい配列を一例を以下に示ずことができる： Ｇｌｙ Ｐｒ。 ３−ドする”” ５’−ＧＧＴ−ＣＣＴ−コー
ドしないｔ貨： ３シｃｃｂ−ａＧＡ−ＣＴＴ−
ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ −
ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ −ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−
ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−Ｃ
ＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
ＳｅｒＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−Ｇ
ＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＭＧ
−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−
ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−Ａｒｇ Ａｒｇ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ 工
１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧＣ−
ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ’−ＧＧＴ−ＡＴＣ−
ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧ
Ｃ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ
−ＣＴＴ−Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ ＬｅｕＴＧ
Ｃ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ
−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−
ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙ
ｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ
ＬｙｓＧＭ−ＧＴＴ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＧ−ＭＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ −ＣＴＴ
”ＣＡＡ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−
ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−Ｓｅｒ Ａｌａ ＴＣＣ−ＧＣＧ’−３’ ＡＧＧ−ＣＧＣ−５’ この明細書におりる配列の表示において、Ａ。 Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：ｏ −
ｐ −ｏ−ｏ −ｐ −ｏ − ＋１ ）Ｉ
Ａ ＧＣ
Ｔ また、５′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次
式を意味する： Ａ Ｇ Ｔ そして、３′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ
次式を意味する： ｏ ＨＣ
Ｔ 上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮に入れると
き、次の少しく長い配列を選択することができる。 実際、この発明の適当な実施態様として、ＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨ１部位を選択して、それぞれ５′末端およ
び３′末端に導入することができる。 さらに、ノチオニンコドン（ＡＴＧ） を、ＩＧＦ−１
のＮ末端アミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿
入し、２種の停止コドン（ＴＣ；ＡおよびＴＡＧ）を、
Ｃ末端コドンの下流に、これに隣接して、挿入した。 （ＡｖａＩＩ］ ｖ −Ｆ Ｌ、 ナイｌｉ ： ３ ’ −
Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ
−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＣＭ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｉｎ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＣＴＧ−ＣＭ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−
ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−Ｔ
ＡＣ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＭＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＴＴＣ−ＭＣ−ＡＡＡ−
ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−Ａ
ＧＣ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧ
Ｇ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧ
Ｃ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ
−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−Ｇ
ＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴ
Ｇ−ＣＴＴ−Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ ＬｅｕＴＧＣ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−
ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−Ａ
ＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴ
Ａ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ａｌａ ＬｙｓＳｅｒ Ａｌａ ５ｔｏｐ ５
ｔｏｐ ＢａｍＨ工ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧ−
３’八ＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’
本発明は、相当する多数のオリゴヌクレオチドフ゛ロッ
クのハイフ゛りンド化およびライゲーションからなるこ
とを特徴とする、前記のこ゛とき遺（立子の製造方法に
も関するものである。 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： 実Ｗ、３０種の合成オリコヌクレオチドを作成すること
によって、上記の拡張された配列を有する分子を合成す
ることとした。それら合成メ゛リゴヌクレオチドを所定
の段階でノーイブリッド化し、ライゲートするとき、上
記の二ｆｆｉ鎖ヌクレメ′チド配列を与えるものである
。 この明細書におけるオリゴヌクレオチド類の合成に関す
る記載においては、次の略号を用いる。 Ａｐ、ｃｐ、Ｃｐおよび’ｒｐは、それぞれ次式を意味
する： ＨＨ Ａｐ Ｇｐ Ｃｐ 、 Ｔｐまた、３′末端
のＡ、 Ｇ、 ＣおよびＴは、それぞれ次式を意味する
： 八〇 ＨＨ ＣＴ Ａ”ｐ ｏ、 Ｇ”ｐ ｏ、 ＣＩｌ″ｐ ｏ、 ’Ｉ
″ｐｏおよび＾ＣＵｐｏは、それぞれ次式を意味する。 ８□ ６ｉＢｐ。 Ａ ｐ。 ＣＢｚｐｏ Ｔｐｏ ＡｃＵｐ。 ＤＭＴｒはジメｊ−キシトリチルであり、Ｂはアデニニ
ル、グアニニル、シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保８ＵＪは示さない）、Ｕはウラシルであり、 ＡＣはアセデルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。 オリゴヌクレオチド類は次の通りである：（１１ＨＯＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｌ
ｌ（２１ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１＋３１ ＨＯＣｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧＯ）
Ｉ （Ｂｌ）＋４１ ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐ
ＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｂ２１（５
） ＨＯＣｐＧｐＧβＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１ｌ＋６１ ＨＯＡｐＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＴＯＨ１ｃ２）（７１ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨＩＤＩＩ＋
８１ ＋ｌ０ＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｄ２１（９） ＨＯＧ
ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＧｐＴＯＨ（Ｅｌ）（１０１ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｅ２１
（１１１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯＧｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧＯＨ（Ｆ２１＋１３１ ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ
（Ｇｌ）（１４） １（ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２＋（１
５１ｆｒＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＩＩ ＴＨＩＩｆ１６）ＨＯＣ
ｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡＯＨ（Ｂ２）（１７１ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（工１）
（１８） ＨＯＣｐＴｐ’ＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（工２）（１９１Ｈ
ＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌ）（２０）、ＨＯＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯ
Ｈ（Ｊ２１［２１）ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌｌｆ２２１
ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｋ２１（２３） Ｉ（ＯＣｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣ
ｐＴＯＨ（Ｌｌ）（２４） ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（
Ｌ２’１（２５１ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨｆＭ１’１（２
６） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐΔｐＧ
ｐｃｐＡｐｃｐＡｐＧＯＨ（Ｍ２）（２７） ＨＯＣ
ｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＡＯＨｆＮｌｌ（２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２１
ｆ２９）ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴ
ｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＯｌｌＤＯ） ＨＯＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（０２）
その逐次カンブリング反応を第１表に示す。 攬 社 ｔコ モノ （またはジ、あるいはトリ）マー（１）は、広瀬
の方法（Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素１ｓｓ
Ｎ、１工、２２５ （１９８０）、日本で発行）によっ
て調製でき、カンプリングはリン酸トリエステル法（Ｒ
，Ｃｒｅａ ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、 ８． ２３３１ （１９８０）″
およびＭ、 Ｌ、 ＤｕｃｋｗｏｒＬｈら、Ｎ ｕ
ｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
９． １６９１ （１９８１） ）により、セルロー
ス担体上で実施できる。 とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌクレオチドＨ
ＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐ Ａ
ｐ Ｃｐ ＣｐｃｐｃｐｃｐＴｐ八ｐＴｐＧＯＨへＧｌ
）の合成に関して、合成法を説明することとする。ヘキ
サデカヌクレオチドＧ１合成のフローチャートを第２表
に示す。 ７Ｑ７１〜 （ｉｉ ）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド
化とライゲーション を 極小にするために、一連の工程においてオリゴヌクレオ
チド類をハイブリッド化し、ライゲートする。第１図で
は、オリゴヌクレオチドを ヒ（―は５′−ボスボリル
化末Ｏ：１；をπ味する）で表わし、ブロックされたオ
リゴヌクレオチド類ばたとえば←ムー（、、ｔ＋−はラ
イゲーションの位置を意味する）で表わしである。ライ
ゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われ
る。 オリゴヌクレオチドＡ１．８１およびＡ２：Ｃ１、Ｂ２
およびＣ２；ＤＩ、ＥｌおよびＤ２ｉＦ１、Ｂ２および
Ｆ２；’Ｇｌ、Ｈ１およびＧ２１１び にＯｆ、Ｎ２およびｏ２をハイブリッド化し、−イゲー
トして、それぞれ相当するブロック１〜を得た。この場
合、オリゴヌクレオチド八１． Ｂ１およびＡ２なら
びに０１．Ｎ２および０２からそれぞれ得たブロック１
および１０を互いにハイブリッド化し、ライゲートして
、ダイマーを形成させた。ブロック２と３；４と５；６
と７および８と９をハイブリッド化し、ライゲートして
、それぞれブロック１１，１２．１３および１４を得た
。ブロック１，１５．１６およびｌＯをハイブリッド化
し、ライゲートし、かくして得たライゲーション生成物
を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ＋ｌｌで切断して、目的と
するポリヌクレオチド５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を得た。 ｆ２１ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子のクローニング
＝５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−ＩＪ伝転子クローニングの
ため・、これを、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を挿入
できる適当な酵素認識部位をもつ適切なプラスミド、す
なわちクローニングベクターに挿入する・。 この発明の適当な−・具体化例としζ、ニジエリラスミ
ド（たとえばｐ１３Ｒ３２２，ｐＢＲ２３５など）に挿
入し、クローニングを行った。 ま たとえば、第ち図に示された通りの、Ｅｃ ｏＲ１およ
びＢａｍ１１１部位ををするプラスミＦｐＢＲ３２２（
商業的に入手可能）を使用した場合には、このブラース
ミドをＥＣ０ＲＩおよびＢ ａ ｍ ｔｌ Ｉで切断し
た。この場合には、そのプラスミドは、ＥＣ０ＲＩおよ
びＢａｍＨｌで切断したときの長い方の断片上に、アン
ピシリン抵抗性のコード（Ａｍ ｐで示す）を有し、テ
トラサイクリン抵抗性のコード（Ｔｅｔで示す）は、Ｂ
ａ ｍ Ｈ１部位切断の結果消失する。Ｅ ｃ ｏ
ＲＩ −Ｂ ａ ｍ ｔｌ Ｉで切断したプラスミドｐ
ＢＲ３２２の長い方の断片化し、ライゲートした。かく
して得た混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転ｐＳｄＶ２と名付しノる。 （３） プラスミドｐＳｄＶ２中の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１ｉｌｌ伝子の配列 マキサム−ギルバー） （Ｍａ ｘ ａ ｍ−Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ）法を使用できる。 ”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１ｉ１１伝子の配列決定のため、
ブラスミｌ：’ ｐ Ｓ ｄ Ｖ ２をＥＣｏ’１１で
ン肖化し、つぎに、α−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡ Ｍ
Ｖ逆転写酵素で処理した。３２Ｐ標識線状プラスミ１
′をＢａｍＨＩで消化して、二つの断片（２２４ｂｐ、
４．。 ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断片（２２４ｂｐ）をＳ
Ａ、７土、５６０ （１９７７））により分析した。 他方、プラスミドｐＳｄ■２を先に３ ａ ｍ １１■
で消化し、次に上記の通りにして３２Ｐで標識した。線
状プラスミドをＥｃｏｌ’？！で消化して二つの断片（
２２４ｂ ｐ、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方
の断片（２２４ｂｐ）をマキサムーギルノ＜−ト法で分
析した。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側力１ら配列
決定を行った結果は、設計したＳ９■ａｌ−Ｉ Ｇ Ｆ
−１逍伝子と一敗した。 〔２〕プロモーター遺伝子の調製とクローニンク°：宿
主生物から融合５９Ｖａｌ−’ＩＧＦ−１を得るため、
プロモーター遺伝子を設計した。 かかる基準で得たプロモーター遺伝子を、それが５９Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１または融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を
コーｌ′する遺伝子の上流にかつそれＧこ隣接する位置
をとるよう、プラスミド中に挿入する。 この発明の適当な具体化例として、合成のｔｒρプロモ
ーターＩ遺伝子またはｔｒｐフ゛ロモーター■遺伝子を
調製した。 （１）合成ｔｒｐブロモークー■逍伝子転子製とクロー
ニング： 実際には、１４種の合成オリゴヌクレオチドフ゛口・ν
りを作成し、それぞれの−末鎖が少くとも７塩基ずつ重
なるように組立て、完全な二重鎖ヌクレオチド配列を得
ることによって、１０７ｂｐの分子を合成した。 ｃｏＲＩ ３ ’ −ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＭＧＡ
ＣＣＧＴＴＴＡＴＭＧＡＣＴＴ−ＥｃｏＲ工 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドφ凸〒≠Ｉｆｆは次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（八）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｂｌ（３） ｌｌ０ＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４）
ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄｌ（５１ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡＯＨ（Ｅ）（６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ＋（
７） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴ○ＩＩ （Ｇｌ（８）
ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈｌ（９１ＨＯＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯ
Ｈ（Ｉｌｆｌｏｌ ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ（Ｊｌ（１
１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋｌ（１２１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１３１ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍｌ（
１４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｎｌこれらの合成法は、上記へキザヌクレ
オチドＨｏ Ａ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ
ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴ
ｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成を参照すれば説明されよう。 （ｉｉ）化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション
： オリゴヌクレオチド類を、第り図に示したごと＜”Ｖａ
ｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の場合と同様の方法に従って、ハ
イブリッド化し、ライゲートした。 （ｉｉｉ ）合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の分母ク
ローニング： 合成ｔｒｐプロモーターＩＪ伝子転子ローニングのため
、合成ＬｒｐプロモーターＩを挿入できる適当な酵素認
識部位をもつ適当なプラスミドに、合成ｔｒｐプロモー
ター酵素を挿入する。この発明の好ましい一実施ｃ、様
として、クローニングを、第４図に示した通り、プラス
ミ１°ｐ［３１？３２５（商業的に人手できる）を用い
て実施した。プラスミドｐＢ、Ｒ３２５をＥｃｏＲｌで
切断し、合成ｔｒｐプロモーターＩをそれに挿入した。 このようにして得たプラスミドｐ ＳＴ−１を用いて旦
ｌＣｏ１ｔ ＩＩ Ｂ １０１を形質転換した。 （２）合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の調製二上記合
成Ｌｒｐプロモーター■をプラスミドに正しい方向で挿
入するため、合成ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ１部
位の次にある長さの塩基封鎖をもち、３′末端にＢａｍ
Ｈ１部位をもつ、次のタイプの合成プロモーターずなわ
ち合成Ｌｒｐブロモーターロを８周製した。 実際には、２２種のオリゴヌクレオチド−〇〒毎を作成
し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。 ＥｃｏＲｌ ５’−ＭＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＭＣＧＧＴＴＣ
ＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＭ−３嘗−ＡＣＧＧＣＴ
ＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡ
ＧＡＣＴＴ−ＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＭＴＴＭＴＣ
ＡＴＣＧＭＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣ−Ｅｃ
ｏＲよ りａｍＨ工 （１）オリゴヌクレオチドの合成： ８種のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡＩ（２１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ［５Ｂ
ｌ（３） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣＩ＋４１ ＨＯＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨｆｓＤｌ＋５１ ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ１
１６１ １１０ＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＩ（（ＳＦ１（７） ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴ
ＯＨ（ＳＧ）＋８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨＩこれらの合成
法は、前記へキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧ ｐ Ｇ ｐ Ｃｐ Ｔ ｐ
Ａ ｐ Ｔ ｐ Ｇ ＯＨ（Ｇ １ ）の合成を参照
すれば説明されよう。 （１１）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッド
化とライゲーション： 子の場合と同様のやり方に従ってハイブリッド化し、ラ
イゲートした。 （３）合成Ｌｒｐプロモーター■遺伝子の分子クローニ
ング： 合成Ｌｒｐプロモーター１１ｉＨ伝子をプラスミドに挿
入した。この発明の適当な一具体化例として、Ｌｒｐブ
ロモ−クー■遺伝子をプラスミドｐＢｌ”１びＢ ａ
ｍ ＨＩによってその部位を開裂することによって、挿
入した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＴｒｐ
ＥＢ７と名付りる。 〔３〕量白ペプチドＬ Ｈ遺伝子の調製とクローニング
： ５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１と融合できる保護ペプチド
の適当な−・イ列として、蛋白ベプチーしＩＩが調製さ
れている。 （１１蛋白ペプチドＬ、ｔｌ遺伝子の調製：組合せ、完
全な二本鎖ヌクレオチド配列を得るごとによって、２３
３ｂｐの分子を合成することとした。 ヨードしない、、１７ 、 ３’−Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣ
Ａ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−八ｓｐ Ｐｒｏ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＧｌｙＬｙｓ Ｌｅｕ ＬｙＳＡ
ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工１６ Ｍｅｔ５０
Ｈｉｎｄ
エエエＧｉｎ Ｓｅｒ Ｇ１．ｎ Ｉｃｅ Ｖａｌ、Ｓ
ｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＰｈｅ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ 工ｌｅ ＧｌｎＴ
ＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＣ−ＧＡ！ｒ−Ｇ
ＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｔ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ
−ＴＣＧ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＬｙＳＳｅｒ Ｖａｌ ５
ｔｏｐ ５ｔｏｐ Ｂ：１ｍＸ１工（ｉ）オリゴヌクレ
オヂド類の合成； オリゴヌクレオチド婉＃テ学頚は次の通りである： （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨｆａ２
］（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（ａ３１（４１ＨＯＴｐＧ
ｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＧＯＨｆａ４）（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（ａ５１（６
１ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨｆａ６）（刀 ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐ
ＡＯＨ（ｂｌｌ・＋８１ ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２）（
９） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（１０） ＨＯＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ｂ４）（１１１ＨＯ八へＴｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５１（
１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３） Ｈ
ＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ａｌｌ（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
（ｃ２）（１５１１１０ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨｆｃ３１（１６）
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＧＯｌｌ （ｃ４）（１７１ＨＯＴｐ
ＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＡＯＨ（ｃ５１（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｃ６
１（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨｆａｌｌ（２０１＋（
ＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＴＯＨｆｄ２）（２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ＋６
３１（２２）ＩＩＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３） Ｈ
ＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＧＯＩｌ （ｄ５］（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨｆ
ｄ６）（２５１ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐ八ＯＨ（ｅｌｌ（２６１ＨＯ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧへＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣ
ｐＣｐＡＯＨ（ｅ２１（２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｅ
３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（ｅ４１＋２９１
ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴ
ｐＣｐＡｐＴＯＨｆｅ５）ｔ３０） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１
）＋３１１ ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２１（３２１ＨＯＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１（ｉ
ｉ）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリた通り、
”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子の場合と同様の・やり
方で、ハイブリッド化しライゲートした。 （２）蛋白ペプチドＬＨｉｌｉ転子の分串クローニング
：蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子をプラスミドに挿入した。 この発明の適当な一興体化例として、蛋白ペプチＦＬｌ
ｌｉｆｉ転子をプラスミドｐ１３Ｒ３２２に、第弁イ図
に示した通り、ＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩによってそ
の部位を開裂することにより、挿入した。かくして得た
プラスミドをプラスミドｐＬ ＩＩ ｌ ０７と名付け
る。 （４）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１発現ベクターの構築：
”Ｖａｔ−ＩＣＦ−１遺伝子を、プロモーター遺伝子を
含有するプラスミドに挿入し、”Ｖａｌ−ｌ ＧＦ−１
遺伝子を用いて宿主生物を形質転換した。 この発明の適当な一具体化例として、次の組換えプラス
ミドを、Ｅ、 ｃｏｌｔ中で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｉ遺伝
子を発現させるべく確立した。 （１） 組み換えプラスミドｐＳｄＶ２ ｔ ｒｐの
構築：上で調製したグラスミ６ドｐ ５Ｔ−１をＥＣＯ
Ｒ■で消化し、生した大きい断片に５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１遺伝子を挿入した。こうして得た組換えプラスミド
をプラスミドｐＳＶ２ｔｒｐと名付、旦。 ＋２＋ ＆ｆｌ換えプラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔ
ｒｐの構築ニ プラスミドｐ Ｔ ｒ ｐ ＩＥ Ｂ ７をＥｃｏＲＩ
およびＢａ昆ＨＩで消化し、生じた大型断片（４，１ｋ
ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって分離した。 一方、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子をプラスミドｐｓｄ
Ｖ２から車離し、上記プロモータヘククー（４，１ｋｂ
ｐ）とライゲートした。得られたアンピシリン抵抗性、
テトラサイクリン感受性形質転換体の二つからプラスミ
ドを車離し、制限酵素による消化と電気泳動とによって
、５９Ｖａｌ−ＩＣｌ３−１遺伝子を含有していること
を確認した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＳ
ｄＶ２−３２２ｔｒｐと名付け、このプラスミドを含存
す（５）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子およびプロモ
ーター遺伝子の配列決定： マキサム−ギルハート（Ｍａｘａｍ−ＧｉｌｂｅｒＬ
）法を使用できる。 （１） プラスミドｐＳｂＶＺｔｒｐ中の５９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１ｉｆｔ伝子および合成Ｌｒｐプロモーター
１遺伝子の配列ニ ブラス゛ミドｐＳｄＶ２ｔｒｐ中の”Ｖａｌ−ＩＣＦ−
１遺伝子および合成ｔｒｐプロモーター１遺伝子の配列
を、後記プラスミドｐ３ｄＶ２−３２２ｔｒｐの場合と
同様のやり方で決定した。 （２） プラスミドｐｓｄｖ２−３２２ｔｒｐ中の５
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１ｉ）１伝子および合成ｔｒｐプロ
モーターＩ遺伝子の配列； ”Ｖａ Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝子および合成Ｌｒｐプロモ
ータＩ遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐｓｄＶ２
−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰ （バク
テリア アルカリホスファターゼ）で処理し、つぎに、
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで処理した。 標識されたＤＮＡをＩＩ ｉ ｎ ｒ Ｉで消化して、
二つの断片（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。 これらの断片をマキ→ノ・ムーギルバート法により分析
した。 （Ａ、 ＭａｘａｍとＷ、 Ｇ１１ｂｅｒ
Ｌ、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ ＳΔ５
１土、５６０（１９７７、））、判明した配列は、”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子および合成プロモーター遺伝子
の設計配列と一致した。 〔６〕融合５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１発現ベクターの
構築： ”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子の上流にリンカ−を介
在させまたはさせずに、保護ペプチドをコードする遺伝
子を”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１逍伝子と連結することにより
、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を調製
した。 このプロセスにおいては、最後のアミノ酸としてメチオ
ニンをもつ蛋白ペプチドを５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１と融
合させる。 このようにして得た融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、次の
通りである。 本発明は、かかる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するもの築： この発明の適当な一興体化例として、次のタイプの、蛋
白ペプチドＬ ｌ−１と融合した５９Ｖａｌ−ＩＧＦＩ
をコードする遺伝子の発現ベクターを調製した。 本発明は、保護ペプチドをコードする遺伝子を、リンカ
−を介在させまたはさせずに、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺
伝子と該”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉｉｆｉ伝子の転子で連結
して構築されるかかる遺伝子の発明のためのプロセスに
も関するものである。 ｉ社通七ｉにより宿主生物を形質転換する。 こ、の発明の好適な一興体化例として、旦３匹旦中で蛋
白ペプチドＬｌ（ｉｆｆ伝子転子現させるべく、次の、
ｔ、１１ｔＡえプラスミドを確立した。 Ｔｒｐプロモーター■プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ
０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片（４，
１ｋｂｐ）を７ガロースゲル電気泳動により分離した。 他方、蛋白ペプチドＬ ＩＩ遺伝子をプラスミドｐＬＨ
Ｉ０７から単離し、前記プロモーターベクター（４，１
ｋｂｐ）とライゲートした。この混合物を用いてＥ、ｃ
ｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピ
シリン低抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一
つからプラスミドを単離し、それが蛋白ペプチドＬｌ１
ｍ転子を含有していることを、制限酵素による消化と電
気泳動とによって圃認した。このようにして得上記で調
製したプラスミドｐＬ Ｈｔ ｒ ｐをｔｌ １ｎｄｌ
ＵおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大きい断片を分取
アガロースゲル電気泳動によって分離した。一方、”Ｖ
ａ ｌ −Ｉ ＧＦ −ｊｉｆｆ伝子を転子記ＥｃｏＲ
ＩおよびＢ ａ ｍ Ｈｆ消化により、上で調製したプ
ラスミドｐＳｄＶ２から単離し、その上流に、それに隣
接して、オリゴヌクレオチＩ’ｍ１およびｍ２をリンカ
−として連結した。こうして得たリンカ一つき５９Ｖａ
［−ｒＧＦ−１遺伝子を上記プラスミドｐ Ｌ Ｈｔ
ｒ ｐの大型断片とライゲートした。混合物を用いて
且１匹旦 ）＋１３１０１を形質転換した。得られたア
ンピシリン抵抗性、テトラサイクリン惑受性の形質転換
体の一つからプラスミドをｊ■離し、それが、蛋白ペプ
チドＬｌｌと融合した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子を含有することを、制限酵素による消化と電気
泳動とによって確認した。かくして得たプラスかくして
１：また、蛋白ペプチドＬＳＩ融合”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ
−１をコードする遺伝子は次の通りである。 ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎコ
ードする鎖： ｓ １−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−コードしない鎖、 ３
Ｉ−ｃ−ＴＡｃ−ＡｃＡ−ｈＴａ−Ａｃａ−ａＴｃ−Ａ
ｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−
ＴＡＴ−ＣＴＡ−ＡＡＡ−ＣＡＡ−ＧＣＡ−ＣＡＡ−Ａ
ＡＣ−ＣＴＴ−八ＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡ
Ｔ−ＴＴＴ−ＣＴＴ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−
ＴＴＣ−Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇ
ｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ
−ＴＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−
ＴＣＡ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−八
人Ａ−ＴＴへ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴ
Ａ−ＣＡＴ−ＣＧＣ−八ｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ 工１ｅ
Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＭＧ
−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＡＡ
Ｔ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙ
ｓ工１ｅ Ｍｅｔ八Ａへ−ＴＧＧ−八ＡＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴ
Ｇ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉ
ｎｄエエＩ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｉｎ工ｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＧｌｕ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ ＴｈｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
ＧｉｎＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ −ＧＭ−ＣＴ
Ｇ−ＧＴＴ −ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＧＡ
Ｃ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ −ＧＡＣ−ＣＡ
Ａ−ＣＴＧ −ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ −ＰｈｅＶａ
ｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＴＴＴ −ＧＴＡ−ＴＧＴ−
ＧＧＴ−ＧＡＴ −ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−
ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−Ｃ
ＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｇ−Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ ＡｒｇＡＡＡ−Ｃ
ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧ
Ｃ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ
−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ、−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ 工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃ
ｙｓＰｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＶａＩＴＴＴ−Ｃ
ＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧ
Ｔ−ＣＴＧ−ＧＭ−ＧＴＴ −ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ
−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−
ＣＴＴ−ＣへＡ−Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＭＧ−Ｃ
ＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−八ＴＧ−ＡＣ
Ａ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ
−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−５ｔｏｐ ５ｔｏｐ Ｂａ
ｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ 八ＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチドＬ Ｈ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＩ”
−１をコードする遺伝子は次の通りである；Ａｓｐ Ｐ
ｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＴＡＴ−
ＧＴＡ−八Ｍ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＭＣ−ＣＴＴ−
ＭＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＣＴ
Ｔ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−ＴＴＣ−Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ
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ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−ＣＧ
Ｃ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ
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Ｇへ−ＧＡＡ−八ＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＴＡＡ−７１
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ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−Ｔ
ＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉｎｄエエエ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ 工１ｅＶａｌ Ｓｅｒ Ｐｈ
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ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＣＭ−Ｔｙ
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Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡｌａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣ
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−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−
ＣＧＣ−５’ｆ２１ ”Ｖａ １−ＩＣＦ−１遺伝子
の下流にかつそれに隣接するターミネークーをイ１する
蛋白ペプチド遺伝子と融合した”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−
１をコードする遺伝子の発現ヘククーの構築： クーミネークーが該Ｓ″’Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の
下流にかつそれに隣接する位置に挿入されうる。 適当な「クーミネーター」としては、適切な酵素認識部
位をコードする遺伝子が含まれうる。 ｆａ＋ オリゴヌクレオチド１■の合成；１４種のオ
リゴヌクレオチドをさらに合成した。 ＋４１ ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（八１）（２） ＨＯＧｐ
ＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯＨｆＢ’）（３） ＨＯＴｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧｐＧｐＡＯＨｌｃ’１（４１ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６
１ ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ
（Ｆ’１１７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＴＯ）ｌ （Ｇ’）（８１ＨＯＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡ
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ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＩＩ
（工１）（１０１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧＯ）（ｆ、ｆｆ
’１（１１） ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯ）Ｉ （Ｋ’１（１２） ＨＯ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ＋Ｌ’１
ｆ１３） １ｌＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＣｐＧＯＨｔＭ’）（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐ
ＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ｆｂｌ 化学合成オリゴ
ヌクレオチド類のライゲーション： 示した通り、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の場合と同様のやり
方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてクーミネー
ターＳを得た。 （ｉｉ）クーミネークーＬ（ｔｅｒｌ−）Ｉの場合と同
様のやり方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてク
ーミネーターＬを得た。 ｔｅｌ ターミネークーＳおよびクーミネークーＬの
クローニング： クーミネークーＳおよびクーミネーターＬを、それぞれ
”Ｖａｌ−ＩＣ，Ｆ−１ｉｆｌ伝子の下流にか（３）
β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ヘクターの構築； （ａｌ 組み換えプラスミドｐｓａｖ２−１ａｃの構
築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−１ａｃを実施例２２に記載の方
法で構築した。 ｆｂｌ 組み換えブー７スミドｐＳｄＶ２−ＮＴ４９
の構築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−、、ＮＴイ９を実施例２４゜に
記載の方法で構築した。 （Ｃ１β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−１０Ｆ −
，１をコードする遺伝子： β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ ＩＣＦ−■をコ
ードする遺伝子は次の通りである：Ｔｈｒ Ｍｅｔ工ｌ
ｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｖａｌ ＬｅｕＡＣＣ−ＡＴＧ−ＡＴＴ−ＡＣＧ−Ｇ
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Ａ−ＴＧＧ−ＴＡＣ−ＴＭ−ＴＧＣ−ＣＴＡ−ＡＧＴ−
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ＧＣ−ＧＴＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＣＴ
Ｇ−ＡＣＣ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＧＡ−ＣＣＧ−ＣＭ−
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ＡＴ−ＣＣＣ−ＣＣＴ−ＴＴＣ−ＧＴＴ−ＧＡＡ−ＴＴ
Ａ−ｃｃｃ−ＧＡＡ−ＣＧＴ−ＣＧＴ−ＧＴＡ−ＧＧＧ
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Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｒｇ ＴｈｒＧＣＣ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−
ＣＧＴ−八ＡＴ−ＡＧＣ−ＧＭ−ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＣＧ
Ｃ−ＡＣＣ−ＣＧＧ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＧＣＡ−ＴＴＡ
−ＴＣＧ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＣＧＧ−ＧＣＧ−ＴＧＧ−
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＡｓｎＧｌｙ Ｇｌｕ
Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｐｈｅ
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ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＡＣＧ −ＣＴＡ−Ｌ
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ｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ ５ｅｒＣＴＴ−ＣＣＴ−
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ＴＣ−ＣＣＣ−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＡ−ＣＴＣ−ＣＧ
Ｇ−ＣＴＡ−ＴＧＡ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＧＧＧ
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Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ工１ｅＭＣ−
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ＡＴ−ＧＣＧ−ＣＣＣ−ＡＴＣ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＧＴ
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ｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｉｎ
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ＣＧ−ＣＧＧ−ＣＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＣＧ−ＧＡ
Ｇ−ＣＧＣ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−Ｖａｌ Ｌａｕ Ａｒｇ
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ＡＴＴ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＣＴＡ−ＴＡＣ−Ａ
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−２１０２２’Ｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈ
ｉｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ＴｈｒＧｌｎ 工１ｅ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ａｒｇ ＰｈｅＣ八Ａ−へＴＣ−ＡＧＣ−ＧＡ
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ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＧＧ−ＴＧＡ−ＧＣＧ−ＡＡＡ−Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａ
ｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇ１＋ｊ
Ａｌ−ａＡＡＴ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＴＴＣ−ＡＧＣ−Ｃ
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ｇ Ａｓｐ ＴｙｒＧＭ−ＧＴＴ−ＣＡＧ−ＡＴＧ−Ｔ
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ｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒ
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ＴＡ−Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌ
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Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｒｇ Ａｓｐ
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Ｇ−ＣＧＣ−５’〔７〕宿主生物での５″Ｖａ ｌ −
ＩＧＦ −１遺伝子の発現： ５９Ｖａ ｌ −ＩＧＦ−１遺伝子を発現させるため、
こうして得たプロモーフ遺伝子と５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１遺伝子とを有するプラスミドを用いて宿主生物を形質
転換し、つぎにそのプラスミドを存する宿主生物を、同
化可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、
好気性条件下に（たとえば振とう培養、深部培養など）
培養する。 栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース。 フルクトース、スクロース、グリセリン、でん粉などの
ごとき炭水化物である。包含されうる他の炭素源は、キ
シロース、ガラクトース、マルトース、デキストリン、
ラクトースなどである。 好ましい窒素ｄｒＡは、酵母エキス、ペプトン、グルテ
ン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵
母、小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸な
どのごとき無機および有機の窒素化合物である。 の量の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使
用に適しているので、それらは必ずしも純粋な形で使用
することを要しない。所望の時には、炭酸カルシウム、
燐酸ナトリウムまたはカリウム。 塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩類、銅
塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。 培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成できる
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。攪拌は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより遂行しうる。 醗酵は、通常約２０℃と４２°Ｃとの間の温度で、好ま
しくは３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時
間にわたって行う。 こうして産出された５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１または融合
”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１は、他の既知の生物学的活性
物質の回収に一般的に用いられる慣用の手段によって培
養培地から回収できる。一般的には、産出された５９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−１または融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は宿
主生物の細胞中に見出され、従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉまたは融合５９Ｖａ、１−ＩＧＦ−’ Ｉは、培養
液を濾過または遠心分離して得られる細胞から、減圧下
の濃縮、超音波処理などの細胞破砕、ＨＰＬＣ，凍結乾
燥。 ｐＨ１１節、樹脂（たとえばアニオンまたはカチオン交
換樹脂、非イオン性吸着樹脂）を用いての処理、慣用の
吸着剤（たとえば活性炭、珪酸、シリカゲル、セルロー
ス、アルミナ）での処理、ゲル濾過、晶出などの常法に
よって、分離できる。 （１） プラスミドｐ３ｄＶ２ｔｒｌ’を用いての基
６ｃｏｌｉ中での”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の発現ｐ
ｓｄＶ２ｔｒｐ含有旦９匹旦 ＨＢＩＯＩをＬブロス中
で一夜培養したものをトップ１〜フ不含不含Ｍ９培地で
希釈し、細胞を、β−インドールアクリル酸誘導の条件
下に、３７℃で３時間インキユヘートした。”Ｖａｌ−
ＩＧＦ−１産生の検出は、矢内原の方法〔矢内原ら、Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒ−ｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎ
ｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８３） ）に従
って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ Ｉ断片（２６−４６）の抗
体を用いて、放射免疫測定法（以下ＲＩＡという）によ
り行った。 （２） プラスミドｐＳｄＶ２−３２２ ｔ ｒｌｌ
）を用いての旦６匹旦 中での５９Ｖａ ｌ −ＩＧ
Ｆ−１遺伝子の発現 プラスミドｐｓｄＶ２−３２２ｔｒｐを含有する旦９匹
旦 ＨＢ １０１をＬブロス中で一夜培養したものを、
トリプトファン不含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドール
アクリル酸誘導条件下に細胞を３７℃で３時間インキユ
ヘートした。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産生の検知は、矢内
原の方法に従って、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１断片（２６
−４６）の抗体を用いＲＩＡによって行った。 〔８〕融合５９Ｖａ ］ −１ＣＦ−Ｉをコードする遺
伝子の宿主生物中での発現： （１）蛋白ペプチドＬ Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を
コードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白ペプチド
ＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を
発現させるため、プロモーター遺伝子と、蛋白ペプチド
ＬＨ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉとを有するプラスミドを
用いて宿主生物を形質転換し、つぎに、そのプラスミド
を有する宿主生物を適当な培地中で培養する。得られた
培養液から蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦい
ての、旦、延中での発現： ｐＬＨ３ｄ、Ｖｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳまたはｐ
Ｌ、Ｈ３ｄＶｔｒｐＬを含有する旦９匹旦ＨＢ １０１
をＬブロス中で一夜培養したものを、トリプトファ不含
含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールアクリル酸誘導の
条件下に細胞を３７°Ｃで３時間インキユヘートした。 融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産出の検知は、矢内原の方
法〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８（１９８３））
に従って、”Ｖａ ｌ −ＩＣＦ −１断片（２６−４
６）の抗体を用いる放射免疫測定法（以下ＲＩＡという
）によって実施した。 （ｉｔ）蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ −
１の単離： 培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。遠心分離によってベレ
ットを集め、つぎに、０．１Ｍのジチオスレイトール（
以下、ＤＴＴと略称する）を含有する８Ｍ尿素溶液に溶
解した。遠心分離後、溶液を３３００カラムクロマトグ
ラフイにより精製した。ＲＩＡによって検知された活性
画分を集め、透析して、所望の成分を含をする蛋白を得
た。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、正規
の位ｉＴＥ、（１５５００）に融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
ｉが検出された。 こうして得た蛋白ペプチドＬ Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉは次の通りである。 Ｃｙｓ −Ｔｙｒ −Ｃｙ ｓ −Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ ５−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −Ｌｙ ５−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ −Ａｓ ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ｓ −
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓ ｎ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、−Ｇｌｙ
−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−へｒｇ−Ｌｙｓ−工
１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−６ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａ
ｌ−９ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ｕ−Ｖａｌ−Ｌｙ ｓ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇ １ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −Ｇ １ｙ−Ａｌａ−Ｇ １ｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ １ｎ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙ ｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｇ １ｙ−Ｐｈ ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ ｎ−Ｌ
ｙ ５−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５
ｅｒ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏｌ１０５ｅｒ−６ｅｒ−Ａｒ工：Ｌｅ−Ｖａｎ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙ ｓ −（Ｊｓ−ＰｈｅＪ、ｒｇ−５
ｅ ｒ−Ｃｙｓ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ １−Ｔｙ ｒ −Ｃｙ ｓ
−Ａｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ−Ｐ ｒｏ−
Ａｌａ−Ｌ＋ｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ （２） β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−■をコードする遺伝子の宿主生物中での発現＝ｐｓ
ｄＶ２−１ａＣを含有する宿主生物またはｐＳｄＶ２−
ＮＴ４９およびｐＮＴ２０４を含有する宿主生物を用い
、蛋白ペプチドＬ ｔｌ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝社母
＝＃の場合と同様のやり方に従って、β−ガラクトシダ
ーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝十≠＝４を得た。 こうして得た融合５″Ｖａｌ−１’ＧＦ＝転曇＝→は次
の通りである。 Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−Ａ
ｒｑ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇ ｌｙ −Ｖａ １−Ｔｈｒ −Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓ ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−１１
ｉ ５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −八１ａ−５ｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−９ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｈ ａ
−Ａｌ ａ−Ｔｒｐ−Ｐ ｈｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ −
Ｐ ｒｏ−Ｇ １ｕ−Ａ １ ａ−Ｖａ １−Ｐ ｒｏ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙ ５
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−八ｌａ−Ａｓｐ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ７Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −
Ｖａ”ｈ −Ｐ ｒｏ−Ｔｈ ｒ −Ｇ １ｕ−Ａｓｎ
−Ｐ ｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙ ５−Ｔｙｒ−
９ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｖａ
１−Ａｓ ｐ−Ｇ ｌｕ −Ｓｅ ｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
１１ｅ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−９ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
ｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ −Ｇ Ｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｖ
ａ １−Ｇ １ｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｓ ｅ ｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Δｒｑ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａ １−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−９ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇ １ｙ−
６ｅｒ−Ｔｙ ｒ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ
−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａ ｌ−
５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ｌｙｓ −Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−５ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａ １−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ、ｕ−
八ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ −Ａｌａ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−工１ｅ−工１
ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｌａ−Ａｓ ｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −Ｖａ １−Ｇ ｌｕ −
Ａ ｓ ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−工ｌｅ −Ｐ ｒ Ｏ−Ａ Ｓ ｎ
−Ｌｅ ｕ −Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ｈｉ ５−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１
ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−工１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉ ５−Ｇｌｕ−Ｈｉ ｓ −Ｈｉ ５−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｙ−Ｇｌ ｎ −Ｖａ
１−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇ １ｕ−Ｇｌ ｎ −Ｔｈｒ
−Ｍｅ ｔ−Ｖａ １−Ｇ ｉｎ −Ａｓｐ−工１ｅ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａ １−Ａｒｇ−Ｃ
ｙ ５−５ｅ ｒ−Ｈｉ ５−Ｔｙｒ−Ｐ ｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｈｉ ｓ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓ、ｐ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐ ｒｏ
−Ａｒｇ−’Ｉ’ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｍ
ｅｔ−Ｓ ｅｒ −Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ −Ｖａ １−Ｔ
ｈ ｒ−Ａｒｇ −＋４ｅ ｔ−Ｖａ １−Ｇｌ ｎ−
Ａｒｇ−Ａｓ ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ −Ｈｉ ｓ −Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−工１ｅ−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｈｉ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ −Ｈｉ ５
−Ａｓｐ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
−工１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇ １ｎ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ：Ｌａ −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−工１ｅ−
工１ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ ｒｏ−
Ｌｙ ｓ −Ｔｒｐ−５ｅｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｌａｕ−６ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌ
ｅｕ−ＣｙＳ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌ
ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｐｈａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｎ−Δｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ
７Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ −Ｖａ
１−Ａｓｐ −Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌｙ
ｓ −Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ａ１ａ７Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ−）ｉｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ −Ａｒｇ−Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−
Ｈｉ ５−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ １ｕ
−Ａｌ ａ−Ｌｙ ｓ −Ｈｌｓ −Ｇ ｌ ｎ−Ｇ
１ｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−工１ｅ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈ ｒ −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉ ｓ −Ｓ ｅｒ−
Ａｓ ｐ−Ａｓ ｎ −Ｇ １ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−）
１ ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅ ｔ−Ｖａ １−Ａｌ ａ−Ｌ
ｅｕ−ＡＳｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ −Ｓｅ ｒ−Ｇｌｙ−Ｇ １ｕ−Ｖａｌ −Ｐｒ
ｏ７Ｌｅｕ −Ａ ｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−Ｖ、ａｌ −Ａｒ
ｇ−Ｖａ １−Ｖａｌ −Ｇ Ｉｎ −Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ −Ａｌ、ａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−１１ｅ−５ｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ −Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ ＝Ａ１ａ−Ｇ １ｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ −Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
１ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙ ｓ −Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ
−Ｐ ｈｅ−Ａｓ ｎ −Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒ
ｐ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙ ｓ −Ｌｙ ｓ
−Ｇ １ ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ａ
ｓｐ−工ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ −Ｖａ １−Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ−
Ｔｒｐ−Ｌｙ ５−Ａｌ ａ −Ａｌ ａ−Ｇ ｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈａ−工１ｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−工１ｅ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−８７０８Ｅ
］０ Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ａｒｇ−工
１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
−Ｖａ １−Ａｓ ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−１１ａ１−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｙ−Ｐ ｒｏ−Ｈｉ
ｓ −Ｇ ｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇ ｉｎ −Ｐｈｅ −Ａｓｎ−工１ｅ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｈｉｓ−
Ａｒｇ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ −Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ｇ １ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｎ −工１ｅ−Ａｓｐ −Ｇ １ｙ−Ｐｈｅ
−Ｈｉ ｓ −Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−９ｅｒ７Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ
−Ｍｅ七−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ＝Ｌｅｕ−
Ｃｙ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ −Ｖａ
１−Ａｓｐ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｐｈｅ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｓ ｒ−５ｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−７１１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ １ｕ−Ｖａ Ｌ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙ ５−５ｅｒ−Ａｌａ
〔９〕
融合５９Ｖａ ］ −１０Ｆ−１の”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１への変換および５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の単離： こうして得た融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ ＋は、保護ペ
プチドの脱離反応によって５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉに変
換できる。 この脱離反応は、ペプチド化学の領域で用いられる常法
に従って実施できる。融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のタイ
プに応じて適当な脱離反応を選択することができる。 この脱離反応で使用される適当な反応剤には、臭化シア
ンが包含されうる。 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
し７た”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１からの蛋白ペプチドの脱ｉ
Ｊ： 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いた脱離
反応によって、”Ｖａｌ−ＩＣ＋Ｆ−■に変換できる。 この反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない恨用の溶
媒中、緩和な条件下で行われる。 反応温度はとくに限定されず、通常は、冷却ないし加温
のもとて反応を行う。 融合”Ｖａｌ−ＩＯＦ−］を、６６０％蟻酸中２５°で
３時間臭化シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣ヲ、５
０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含存する８Ｍ尿素
溶液に溶解させ、透析して、還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ
−１の粗混合物を得た。この混合物をカチオン交換クロ
マトグラフィ （ＣＭ５２）によって精製し、ＲＩＡで
検知された活性画分を集めて、透析した。透析後の両分
を高速液体クロマトグラフィにかけて、純粋な還元型″
′■ａｔ−ＩＣＦ−１を得た。この還元”Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−１を、通嘱の再生法（ｒｅ４ｏ１ｄｉｎｇ）によっ
て酸化型”Ｖａ’１−ＩＧＦ−１に変換した。精製され
た５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、ポリアクリルアミドゲル
電気法ｖＪ（ＰＡＧＥ）に際して単一のバンドを示し、
またその”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、ＩＩＰＬＯにおいて
、Ｈｕｍｂｅｌ博士から贈られた紐キキ年コＩＧＦ−１
の標品と重なった。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸配
列を、エドマン法とカルボキシペプチダーゼ法とを組合
“Ｖて、決定した・その”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＢＡＬ
Ｂ／ｃ ３Ｔ３マウス細胞によるＭｌｌ）−チミジン
取込みアッセイにおいて生物活性を示した。 （１０）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１の放射免疫測定：矢
内原〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８
３） ）が確立した方法に従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１のＲＩＡを行った。上記の試料または標準試料（ＩＧ
Ｆ−１断片（２６−４６））の０．１ｍβを、試料用緩
衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ中、０．５％ＢＳＡ （ｐＨ７，４） （０，４ｍ
ｊり 〕、”Ｖａ １−ＩＧＦ−１（２６−４６）に対
するウサギの抗血清（０，１ｍ＃）および”’ＩＩＧＩ
”−１（２６−４６）（０，１ｍ１）と混合した。混合
物を４ ’Ｃに４８時間放置し、つぎに、ウサギ血ｉ’
）ｆ（０，１ｍβ）、ウサギγ−グロブリン抗血清（０
，１ｍｌ）および５％ＰＥ０６０００ （０，９ｍｌを
加えた。４°Ｃでさらに２時間放置したのち、遠心分離
（３ｋｒｐｍ、４°Ｃ１３０分間）によってペレットを
集め、γ−カウシターで放射活性を測定した。この放射
活性から”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の含量を算出した。 （１１） ５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１の生物学的アッ
セイ； ＢΔＬＢ／ｃ ３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クロー
ンＡ３１）をトリプシン処理し、５％のウシ胎児血清と
２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン￥Ｊ、（Ｈｌ、ＰＥ５）を含
有するダルベツコーフォークトの改変イーグル培地中に
、１０５細胞／ｍｊ２の濃度に再Ｑ、 ｆ５した。１０
０μβづつをＱ、３ｃｎ！のウェル（９６ウエルのマイ
クロタイクープレート、コスタ−社製）に入れた。均一
な単層細胞が形成されてから（最初のプレーＦ ｉ１Ｍ
製から５〜７日後）３〜４日後に、培地を除去し、培養
物を３回洗い、つぎに、０．２μＣｉ／ウエルの（”Ｈ
）チミジン（０，６７Ｃｉ／ｍｍｏ ＋）および被検試
料を加えた。２４時間のインキュベーションののち、培
地を除去し、細胞をＰＢＳで洗い、放射能測定のためト
リプシン処理した。細胞を半自動のマルチプルセルハー
ヘスタ（ＬＡＶＯ，ＭＡＳＨ。 ラボ・サイエンス）を使用して、ガラスフィルターに捕
捉した。取込まれたＣ Ｈ）チミジンを、アクタゾール
２ にュー・イングランド・ニュクリアー）８ｍｊ！中
で、パソカード・トライ−カーフ’ｆａ体シンチレーシ
ョンカウンタを用いて、カラ△ ントした。 以下、実施例を示し、この発明を説明する。 去隻±上 ＨＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐ Ａ
ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ
ｌ）の合成（１１ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ
ｏＧ”ｐ ｏＡｅＵｐｏ−セルロースの合成： ｉ ） ＨＯＧ′８ｐ ｏ ＡｃＵ ｐ ｏ−セ／（／
ロース（Ｄ調製：ＤＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−
セルロース（１３０，４ｍｇ、 ４．５９ μｍｏｌｅ
”） （Ｒ，Ｃｒｅａの方法１１により製造）のメタノ
ール／クロロホルム（１：９Ｖ／Ｖ、 ５ＪＯｍＩｌ）
懸？ｉ液にＴＣＡ／りａｏボルム（２：８ Ｗ／Ｖ、
５．Ｏｍｊりを冷却下に加え、０°Ｃで１０分間攪拌
する。クロロホルム（２ｍ／）およびメタノール（６，
０ｍ１）で洗浄後、濾紙上のセルロース付加物（ＨＯＧ
”ｐ ｏ”Ｕｐ ｏ −セルｅ＋−ス）を乾燥させた。 この際、水はピリジン（２ｍｌ）との共沸混合物として
分離した。 ＊この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５０７ｎｍで
測定して算出した。 １） Ｒ，Ｃｒｅａ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、。 ■、２３３１ （１９８０） ｉｉ）ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡＩｌｚｐ ｏＴｐ ｏ−の
調Ｍ ：ＤＭＴ ｒ ＯＴｐ ｏ Ａ”ｐ ｏ Ｔ ｐ
ｏ−ＣＥ （３９，９ｍｇ、 ２３．０μｍｏｌｅ）
をトリエヂルアミンーアセトニトリＪＬｉ （ＩＩＩ
Ｖ／Ｖ、 ５ｍ ｌ）を室温で１時間処理して得られた
ホスホジエステルトリマー（ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ
ｏＴｐ ｏ−）を乾燥させた。水はピリジンとの共沸
混合物（０，５ｍｊ！ 、 ２ Ｘｌｍｊｌりとして
分離した。 ｉｉｉ ）カップリング トリマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡ”ｐｏＴｐｏ−）セルロ
ース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃＴＪ ｐ ｏ −（！
ルコースンと１０ｍ１容丸底フラスコ中で混合した。 混合物を乾燥させ（水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ
１ｍ４）として分離ン、無水ピリジン（１ｍｌ）に再懸
澗させた。 メンチレンスルボニルニトコトリアヅリド（ＭＳＮＴ）
（６８，０ｍｇ、 ２３０．ｌｊｍｏｌｅ）をこの
：Ｖ、 ンＢ ？（ｌに加え、室温で１時間撹拌した。 次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース付加物を
遠心分離（３０００ｒｐｍ、 ２分間）により回収した
。 ｉｖ）未反応５′ヒドロキシル基のアセチル化：前記セ
ルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：１ν
／Ｖ、 ５．５＋ｎＡ）にセ、濁し、室温で３０分間攪
拌した。ピリジン（５ｔｔ＃！ン中で反復遠心分離（３
０００ｒｐｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍ ｌ
）で洗浄、室温で３０分間真空乾燥することにより、
セルロース生成物（１１３，９ｍｇ）を得た。このセル
ロース付加物（ＤＭＴ ｒ ＯＴ ｐ ｏ ＡＩＩＩｐ
ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ ＣＵ ｐ ｏ−セ
ルロース）は次のカンプリング工程に使用できる。 （２） ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＱ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐ。 ＡＢｚｐ ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＡｃＵ ｐ ｏ
−セ／Ｌ／Ｃ１−ス（７）合成： ＤＭＴｒＯＧＩＢｐ ｏＧ”ｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏ
Ａ”ｐｏＴｐｏＧ”ｐｏ”Ｕｐｏ−セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ
Ｏ−セルロース（１１３，９ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ０Ｇ
ｌｌＩｐ 。 Ｑ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ −ＣＥ （４３，７ｍｇ）か
ら前記と同様の条件により合成した。 （３１ＤＭＴｒＯＡｌ１２ｐｏＣＢ２ｐｏｃ”ｐｏＧ”
ｐｏＧ”ｐ ｏＣＩｌｌｌｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ
ｐ ｏＧ”ｐｏ Ａ ＣＵ Ｉ） Ｏ−セルロースの合
成：ＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃｇ＋ｐ
ｏ Ｇ”ｐ 。 Ｇ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ ｐ ｏ
Ｇ”ｐ 。 ＾Ｃ［Ｊ ｐ ｏ−セルロース（１０５，８ｍｇ）はＤ
ＭＴ ｒ ＯＧ”ｐ ｏＧＩＢｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ
ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＱｌ ＋＋ ｐ ｏ Ａｃ Ｕｐ
ｏ−セルロース（１０９，５ｍｇ）とＤＭＴｒ ０Ａ
Ｉｌｌｌｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ −ＣＥ
（４４，０ｍｇ）から同様の条件により合成した。 ｔ４１ ＤＭＴｒＯＣＩｌｔｐｏＣ”ｐｏＧＩＢｐｏ
Ａ”ｐｏ Ｃｌ１１ｐ ｏ ＣＢｆｆｉｐ ｏ Ｇ”ｐ
ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ｃ口ｐｏＴｐ ｏＡｌ１２ｐ ｏＴ
ｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＩＪｐ ｏ−セルロースの合成： ＤＭＴ ｒ ＯＣｌｚｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ
ＡＵｐ。 Ｃ”ｐ ｏＣＲ＋ｐ ｏＧ”ｐ ｏＧＩＢｐ ｏＣＢｚ
ｐ ｏＴｐＯＡ口ｐｏＴｐ ｏＧＩＢｐ ｏＡｅＵｐ
ｏ−セルロース（９４，５ｍｇ）はＤＭＴ ｒ ＯＡ”
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ ＣＵｐ。 ＧＩｌｌｐ ｏＧＩＩＩｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”
ｐ ｏＴｐ 。 Ｇ′ＢｐＯＡｃＵｐＱ−セルロース（１０５，８ｍｇ）
とＤＭＴ ｒ Ｏ’Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ
ｏ −ＣＥ （４３，５ｍｇ）から同様の条件により合
成した。 ｆ５１ ＤＭＴｒＯＡＢ！ｐｏＡ”ｐｏ八へ２ｐｏｃ
ｉｚｐｏＣ”ｐ ｏＧＩＩｌｐ ｏＡ”ｐ ｏＣ”ｐ
ｏＣ”ｐ ｏＧＩＲｐ ｏ ＧＩＩＩｐ ｏ ＣＩＩｚ
ｐ ｏＴｐ ｏ Ａ”ｐ ｏＴｐ ｏ Ｇ′Ｂｐ ｏＡ
ｃＵｐ ｏ−セルロースの合成：ＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ
ｏ Ａ”ｐ ｏ Ａ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。 Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ ＡＢｚｐ ｏ
Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ
ｏＣＩＩｚｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐｏ
Ａｃ Ｕ ｐ ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）は、
ＤＭＴｒＱＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ”
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ
Ｃ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ 。 Ｔ ｐ ｏ Ｇ″′ｐ ｏＡｃＵ ｐ ｏ−セルロース
（９４、５ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ０ＡＢｔｐ ｏ ＡＩ
ＩＩｐ ｏ ＡＢｚｐ ｏ−ＣＥ（４５，１ｍｇ）から
同様の条件下で合成した。この１８％段階では未反応５
′−ヒドロキシ基はアセチル基で保護する必要はなかっ
た。 （６１ＨＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ
ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈの合成：ＤＭＴ ｒ ０Ａｌｌ！ｐ’ ｏ Ａ”ｐ
ｏ Ａ３ｆｆ１ｐ ｏ Ｇ”ｐ 。 Ｃ５ｚｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ ＡＩＩＩｐ ｏ Ｃｌ１１
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ｃ１ｌ″
ｐ ｏＴｐ ｏＡｌｌ″ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐｏ”Ｕｐ
ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）を０．５Ｍ Ｎ。 Ｎ、Ｎ゛、Ｎ’−テトラメチルグアニジニウムピリジン
２−アルドキシマート〔ジオキサン−水（１：１ ｖ／
ｖ、 １ｍ り中〕と封管中、２０℃で２０時間処理し
た。 反応混合物に２８％（會ハ）アンモニア水（１２ｍ ｊ
！ ）を加え、６０℃で２時間加熱した。固形セルロー
スを濾別し、水（１０ｍ ｌ！ ）で洗浄した。濾液と
洗液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５ｍ
ｌ）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残渣を０
．１Ｍ炭酸トリエチル アンモニウム緩衝液（ｐｌ！？
、５．２５ｍ ｊ！ ）に溶かし、ジエチルエーテル（
３×２５ｍ ｊ！ ）で洗浄した。水層を蒸 発乾固し
、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（
ｐｉ（７，５，２ｍｊりに溶解し、）８液中に粗ＨＯＡ
ｐ Ａ ｐＡｐｃｐｃｐｃｐＡｐｃｐｃｐｃｐｃｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨを得た。 ＋７１ １（ＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＧＯＨの精製：ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムクロ
マトグラフィー（バイオゲルＰ ２２４ Ｘ ２．６ｃ
ｍ ｌ Ｄ）により行った。最初の溶出ピークに相当
する画分（５０ｍＭ Ｎｌ１４０Ａ ｃ、 ０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴ八、１ｍｊ！／分）を取り、凍結乾燥し最
初の精製物を得た。 ｉｉ ）最初の精製物の２回目の精製はＨＰ Ｌ Ｃ（
ＣＤ Ｒ１０，２５ｃｍＸ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）になり
１Ｍ酢酸アンモニウム−１Ｂ％（Ｖ／Ｖ）水性エタノー
ルから４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水
性エタノールまでの直線勾配（８０分間、（ｍ１７分。 １ｉｉ）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬ
Ｃ（Ｒｐ １Ｂ ５μ（Ｘ７７）、１５ｃｍＸ４ｍ
ｍｌＤ）により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１
Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間、 １．５ｍｌ／分、
室温）を用いて行い、最終精製物（ＩＩ ＯＡ（１）オ
リゴヌクレオチドの分析 （Ｈ○ＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＣＯＨ） ｉ）ホスホジェステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯｌ（（５μｇ、 ６１．７μｋ）
０．２ Ｍ ＭＨＣｊ！ｚ（１０μＩり、０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ Ｈ８，５）（１０μｌ）お
よび ０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液（１３，３μ
ｍ）の混合物をホスホジェステラーゼ（５車位、５μｌ
）で室温にて２０分間処理し、続いて１００“Ｃで２分
間加熱した。 １ｉ）ｉ（ＰＬＯ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドは１１ Ｐ Ｌ Ｃ
（ＣＤＲ１０，２５ｃｍｘ ４．５ｍｍ Ｉ Ｄ）によ
り水〜２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直線
勾配（４０分間、 １．５ｍρ／分、６０°Ｃ）を用い
て行った。標準品の面積を比較することにより、各ピー
ク面積からそのヌクレオチド組成を決定した。 計算値： ｐ Ｃｏ１１５．０００．ｐＡＯＨ４，００
０゜ｐＴｏｏ ２，０００． ｐＧｏｌ＋４，０００
実測値： ｐＣｏｏ ４．７６７、 ｐ Ａｏｕ ４
，１２７゜ｐＴｏｎ ２，０５４．ｐＧｏｏ ４，０５
２入■凱ｌ オリゴヌクレオチド（ＡＩ、Ａ２．Ｂ１．Ｂ２゜ＣＬ、
Ｃ２，Ｄｌ、Ｄ２． Ｅｌ、Ｂ２．Ｆｌ、Ｆ２゜Ｇ２
．Ｈｌ、Ｎ２． ＩＩ、 １２． Ｊｌ、 Ｊ
２．Ｋｌ。 Ｋ２．Ｌｌ、Ｌ２．ＭＩ Ｎ２．Ｎｌ、Ｎ２，０１お
よび０２）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の０１と同様
の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ（Ａｌｌ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１（３１
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｂｌｌ（４１ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＴ（（Ｂ２
）（５１ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１）＋６） ＨＯＡｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｃ２１（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｄ
Ｉ）（８１ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｃ２１（９） ＨＯＧｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｅｌｌ（１０） ＨＯＴＰＡＰＧＰＡＰＡＰ
ＡＰＣＰＣＩ）ＡＰＣＰＧＰＡＰＴＰＣＰＡＯＨｆＥ２
）（１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＧＯ＋Ｉ （Ｆ２１（１３１ＨＯＧｐＣｐＴ
ｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｇ２）（１４１ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１５１
ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｎ２１ｆ１６１ ＨＯＧｐＣｐＧ
ｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯ
Ｈ（ＩＩ）（１７１ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐ、ＴｐＧＯＨＩＩ２）（
１８１ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌｌ（１９１ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｊ２１（２０１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌ）（
２１１ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｘ２１（２２１ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴ
ＯＨ（Ｌｌｌ（２３１ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ＜Ｌ２’１
（２４） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯ）Ｉ ｔＭ１’）（
２５） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ（）１２）（２７） Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＡＯＨ（Ｎｌｌ（２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐ
ＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ
（Ｎ２）（２９１ＨＯ八へＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（０１１（３０）
ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ（０２）五１１州ｌ オリゴヌクレオチド（ａ ｌ ａ ２． ａ ３．
ａ ４゜Ｇ５．Ｇ６．ｂｌ、ｂ２．ｂ３．ｂ４．ｂ
５．ｂ６゜ｃｌ； Ｇ２．Ｇ３．Ｇ４．Ｇ５．Ｇ６．
ｄｉ、’ｄ２゜ｄ３．ｄ４．ｄ５．ｄ６．ｅｌ、Ｇ２．
Ｇ３．Ｇ４゜Ｇ５，１１．１２および１３）の合成：下
記オリゴヌクレオチドを実施例１記載のＧ１と同様の方
法で製造した。 （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ＜ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ＋ａ２）
（３１ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３１（４１ＨＯＴｐＧｐＧ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｇ４１（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ＋ａ５１（６１Ｈ
ＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｇ６１（７１ＨＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯ
Ｈ（ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２１（９１Ｈ
ＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐ
ＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（Ｌｏ） ＨＯ八へＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
’ｏ４）＋１１３１（ＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５）（１２）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐ
ＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３１ＨＯＴｐＡｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＣＯ＋Ｉ （ｃ １１（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐ
ＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｇ
２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐ’ＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３）（１６１
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ４１！１７１ ＨＯＴｐＣｐＣ
ｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｇ５）（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｇ６１（１
９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｄｌｌ（２０） ＨＯＡｐ
ＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐＴＯＨ（ｄ２１（２１１ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ３）（２２
／） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４）＋２３１ ＨＯＡ
ＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＣＩ）ＡＰＡＰＴＰＴＰＴＰＧ
ＰＧＯＨｆｄ５１（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｄ６１
（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ａｌｌ（２６１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＡＯＨ（Ｇ２１＋２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３
１（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｇ４）＋２９１ Ｈ
ＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴｐ
ＣｐＡｐＴＯＨ（Ｇ５１（３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１１
（３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）（３２１１１０ＧｐＡｐＴ
ｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１去Ｊｌ
羨を 下記オリゴヌクレオチド（ｍｌおよびｍ２）を実施例１
と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍｌ）（２
１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｍ２）去旌貞盈 オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ。 Ｇ、Ｈ，Ｈ，Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 ＋１） ｌｌ０ＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴ
ｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ＋Ｋ）（１２１ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１４）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｎ）ＳＥ、ＳＦ、ＳＧおよびＳＨ）の合成：＋１１
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴＯ
Ｈ（ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）（３
１ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｓ（ｊ＋４１ ＨＣＩＣｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨｆ
ｓＤｌ＋５１ ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯ）Ｉ （ＳＥＩ（６１Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐ
ＣＯ！（（ＳＦＩ＋７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧＩ
（８１ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）天」ｕ」Ｌ 下記オリゴヌクレオチド（Ａ’−Ｎ’）を実施例１と同
様の方法で製造した。 （４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１
ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６１ ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｆ’１（７） ＨＯＧｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｇ’
）（Ｅｌ） ＨＯＧｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯ）！ ＋１１’）（９
１ＨＯＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（工１）（１０） ＨＯＧＰＣ
ＰＣＰＴＰＴＰＴＰＡＰＡＩ）ＴＰＴＰＧＰＡＰＴＰＴ
ｐＣＰＧＯＨ（Ｊ’）＋ｉｌｌ ＨＯＧｐＣｐＣｐＴ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｋ’１（
１２１ＨＯＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｌ’１（１３７ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＧＯＨ（Ｍ’１（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ス］ｌ壓Ｊ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ｌ遺伝子の製造： 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション各オリゴ
ヌクレオチド（Ａ Ｉ −０１） （０，４ｎＭ）の一
部を、７４ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（１（ｐ Ｈ７
，６）。 Ｌ ＯｍＭ ＤＴＴ、 １．６ｍＭメルカプトエタ
ノール＋’ １０ｍＭ ＭｇＣｆｚおよび０．５ｍＭ
ＡＴＰを含存する溶液１００μ！中でＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼＣＢＲＬ製）を用い３７゛Ｃで２０分間リ
ン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００
℃で５分間インキュベートし不活性化した。 りを得、最終的にはクローニング用の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子を得る。ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（７単位）を用い、１００ｍＭＡＴＰ（０，５μｌ
）含有溶液中にて４°Ｃで２３時間（標準条件）行った
。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーション
生成物は、トリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％グラ
ジェントＰＡＧＥで臭化エチジウム染色により同定した
。 実施狙工 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子のクローニング：プラスミ
ドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化した。 反応を、６５゛Ｃで５分間加熱して終了させ、断片を０
．５％アガロースゲル電気泳動により分離した。 ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを回収し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと工２°Ｃで１８時間ライゲートさ
せ、２２４ｂｐ”Ｖａ ｌ−ＩＣ；Ｆ−■遺伝子を得た
。ライゲーション混合物を用いてクソシュナー法により
、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｉ［Ｂ １０１を形質転換し、ア
ンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン（２５ｐ
ｇ／ｍｌを含有するプレート上で選択した。アンピシリ
ンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す５クローン
の１つから分離したプラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩおよ
びＢａた。このプラスミドは”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝
子の完全ヌクレオチド配列によって特徴づけられ、ｐＳ
ｄＶ２と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 叉星凱土亙 プラスミドｐｓｄＶ２中”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の
配列決定： ”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＣＦ −１遺伝子の配列を調べるた
め、プラスミドｐｓｄｖ２をＥｃｏＲＩで消化し、次い
でα−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化
学工業ｈａより購入）を用い３７°Ｃで３０分間処理し
た。３２ｐで標識された線状プラスミドをＢ ａ ｍ
ＨＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｌ）、 ４．Ｏｂ
ｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は分取用ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により回収し、マキ与ムーギ
ルバート法の手順に従フて配列決定した。 一方、プラスミドｐＳｄＶ２はまずＢａｍＨＩで消化し
、次に前述のように３１ｐで標識した。線状プラスミド
をＥＣ０ＲＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｐ、４．
０ ｋｂｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は前述
のようにマキサム−ギルバート法により分析した。”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の両側からの配列決定の結果は
、設計した”Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝子と一致した
。 大流思上上 蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子の調製： （０，４ｎＭ）を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓｉｌ ＣＲ（
ｐ １１７．６）。 ２０ｍＭ ＤＴＴ、５０．Ｌ１ｇ／ｍｊ！ ＢＳＡ
、ｌｒｎＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣｊ！ｚおよ
び２ｍＭＡＴＰを含有する溶液４０μβ中で２．５単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い３７℃で３時間
リン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１０
０℃で５分間インキユヘートして不活性化しンは第７図
に示すようにして行い、まず６フラグメントブロソクを
得、最終的にクローニング用の蛋白ペプチドＬＨｉｌｌ
転子（２３６ｂｐ）を得た。 ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位）を用い
、５０ｍＭＡ、ＴＰ含有溶液（１μｎ）中１６°Ｃで５
時間行った。各段階のオリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン生成物はＴｒｉｓ −Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液中２−
１６％グラジェントＰＡＧＥで臭化エヂジウム染色によ
り同定した。 実施史上叉 蛋白ペプチドＬ’Ｈ遺伝子のクローニング：前述のよう
にして合成した蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子（２３６ｂｐ
）を実施例日と同様の方法でｐＢＲ３２２４：挿入した
。Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラ
スミド（ｐＬＨＩ０７）は、制限酵素分析により蛋白ペ
プチドＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかに
なった。 入■炎上主 合成ｔｒｐプロモーター遺伝子ｌの構築ニブロックＩ、
ＩＩおよび■のそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ
）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、前述
のように７４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次いで
このブロック（１−１）と未リン酸化オリゴヌクレオチ
ド（Ａ。 Ｎ）を縮合させた。最後のライゲーション住成物を分取
用１．５％ＰＡ、ＧＥによりｑｆｆ製し、１０７ｂｐの
合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。 去１１引り土 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニング： プラスミドｐＢＲ３２５をＥＣ０ＲＩで消化し、綿状ｐ
ＢＲ３２５を前記合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子とラ
イゲートし°た。このライゲーション混合物による一旦
−１匹旦 ＨＢ １０１の形質転換体を抗生物質含有プ
レート上でスクリーニングし、ＲＡｍｐ’Ｃｍコロニー
４つを得た。この４コロニーから得たプラスミドをそれ
ぞれＨｐａＩで消化した。＋１ ｉ ｎ ｄ ｍおよび
Ｅｃ ｏＲＩ消化によりこれらプラスミドから得た断片
をＩＩ ｉ ｎ ｄ ｌ１１およびＥＣ０ＲＩ消化によ
るｐＢＲ３’２５の断片と比較した。４つのプラスミド
のうちの１つは正しい方向のプロモーター遺伝子（合成
ｔｒｐプロモーターＩｎ伝子転子有し、他のものは逆方
向に挿入されていた。 人妻■［Ｌ晃 ｔｒｐプロモーター■遺伝子の構築； ブロックＩ′、Ｉｔ’、Ｉ［Ｉ’およびＩＶ ′の各オ
リゴヌクレオチド（Ｂ−３Ｏ）をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し、次いで前述のようにＴ４ＤＮＡ
リガー・ゼでライゲートした。これらのブロック （Ｉ
′〜■”）と未リン酸化オリゴヌクレオチド（Ａおよ
びＳＨ）を続いて縮合した。最終ライゲーション生成物
は分取用７．５％ＰＡＧＥで精製し、１６３ｂｐの合成
ｔｒｐプロモーター■遺伝子を得た。 大旌班上１ 合成ｔ ｒ ｐ フロモータ■遺伝子のクローニングニ
実施例１５で構築した合成ｔｒｐプロモークＨ遺伝子を
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲー
トし、次いでＥ、 ｃｏｌｉ ＩＩＢ １０１をライ
ゲーション生成物を用い形質転換させた。 ＲＡｍｐ、 ５Ｔｅｔ形質転換体から得たプラスミド
をｌ１ｐａ＋で消化してバンド（４，１ｋｂｐ）を確認
。 し、次いでＢａ ｍ ＨＩで消化しＰＡＧＥにて９０ｂ
ｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化による５６ｂｐの断片をＰＡＧＥにてサイズマー
カーと比較することにより、確認した。 このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクタ
ーの構築に用いた。 爽施炎上１ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクター（ｐＳｄＶ２−’３
２２Ｌｒｐ）の構築： 合成Ｌｒｐプロモーク■ヘクター（ｐＴｒｐＥＢ△ ７）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
により大きな断片（４，１ｋｂｐ）を得た。 この断片をプラスミドｐＳｄＶ２から製造した”Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１遺伝子とライゲートした。 このライゲーション混合物で旦、並置 ＨＢ １０１を
形質転換し、アンピシリン耐性でテトラサイクリン怒受
性の形質転換体を選択した。得られたプラスミドｐＳｄ
Ｖ２−３２２ Ｌ ｒｐをＥｃｏＲプラスミドｐＳｄＶ
２−３２２ ｔ ｒｐ中％ ９ ｙ ａｌ−ＩＧＦ−１
遺伝子および合成ｔｒｐプロモーク遺伝子の配列決定： △ マキサム−ギルバート法にょる５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１
ｉｆｆ伝子およびｔｒｐプロモーへ遺伝子の配列決定の
ため、プラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、大腸菌アルカリホスポターゼを用い３７゛
ｃで１時間処理した。 フェノール抽出およびエタノール沈澱後、プラスミドを
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ボリヌクレオクドキナ
ーゼを用い３７℃で１時間リン酸化し、最後にＨｉｎｆ
Ｉで消化し、２つの断片（Ｉｌｏｏｂ ｐ、 ４８
０ｂ ｐ）を得た。各断片はマクサム−ギルハート法に
従って配列決定した。得られた５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
および合成Ｌｒｐプロモーへ遺伝子の配列は設計したも
のと一致した。 情夫ｉ（？！１１９ 蛋白ペプチドＬＨ発現ヘクター（ｐＬＨｔｒｐ）の構築
： 実施例１６で製造した合成ｔｒｐプロモーター■ヘクタ
ー（ｐＴｒｐＥＢ？）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
し、分取用アガロースゲル電気法ｖＪにより大きな断片
（４，１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化によりプラスミドｐ Ｌ Ｈ１０７から調製
した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲ
ーション混合物を用い旦０匹旦 ＨＢＩＯＩを形質転換
させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン怒受性を
示す形質転換体を得た。 形質転換体から得たプラスミド （ｐＬＨｔｒｐ）をＥＣ０ＲＩとＢ ａ ｍ ＨＩで消
化し、７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨｉＪｌ転
子（２３６ｂｐ）を確認した。 実施例２０ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクターの構築：実施例４
（１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）を実施例
８に記載したようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化した。このリン酸化オリゴヌクレオチド、実施例
４ （２）で鋼製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）およ
び実施例１０で調製したプラスミドｐＳｄＶ２から調製
した５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂ ｐ
）を混合し、１００ｍＭＡＴＰを含有する溶液中でＴ４
リガーゼを用い４°Ｃで２３時間処理した。ライゲーシ
ョン混合物を分取用ＰＡＣ，Ｅで精製してリンカ−付き
５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝子（２４２ｂｐ）を得
た。この遺伝子を、Ｈ４ｎｄｌＵ−ＢａｍＨＩ消死によ
りｐＬ）（ｔｒｐから得た断片をライゲートし、ライゲ
ーション混合物を用いて基０皿ＨＢＩＯＩを形質転換さ
せた。プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ含有旦９匹旦 Ｈ
ＢＩＯＩを且、並置Ｆ−５と命名し、１９８４年５月２
８日に寄託番号ＦＥＲＭＡ−７６４４の下に、工業技術
院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町
東１丁目、郵便番号３０５）に寄託した。該寄託−はそ
の後１９８５年２月２８日に同所のブタペスト条約に基
づく国際寄託に変更されたく寄託番号ＦＥＲＭ、ｌ’Ｂ
Ｐ−７２８）。形質転換体から得たプラスミド（ｐＬＨ
３ｄＶｔｒｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ （１９８
，２２４ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ （１９Ｂ、
８５９ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌ （２４
２ｂｐ）およびＨｐａｌ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ
）で消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター
、蛋白ペプチドＬ Ｈお”Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝
子の発現ニブラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ含を互
。 ｃｏｌｉをアンピシリン２０μｇ ／ ｍ ｊ！金含有
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）およびビタミンＢ
＋５０．ｃ＋ｇ／ｍｆｆを含有するＭ９培地で、１：２
５の割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を加え
、最終濃度１０μｇ／ｍβとした。この時のＡ６゜。は
０．４であった。次に３時間培養し１、遠心分離（６ｋ
ｒｐｍ、、 ４℃、５分間）により菌体を集めた。菌
体は超音波処理により破壊し遠心分離により残層を取り
除いた。上清を３Ｍ酢酸と混合し、沈澱を遠心分離（２
０ｋｒｐｍ、 ４°Ｃ１１０分間）ＤＴＡおよび０．
５％ＢＳＡ）４ｍＪ！にＨｐ、 ｆ５し、０．ＩＮ Ｎ
ａＯＨ″？：ｐＨ７−８に調製した。不溶性物質を遠心
分離により除去した後、上清を定量を行うまで一２０℃
で保存した。 去鳳皿叢ユ ”Ｖａ Ｉ−ＩＣＦ−１のＲＩＡ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のＲＩＡは矢内原の方法に従って
行った。前記サンプルまたは標準サンプル（ＩＣＦ−１
７ラグメント（２６−４６））０．１ｍｌを、サンプル
緩衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ （ｐ ）１７．４）中０，５％Ｂ Ｓ
Ａ（０，４ｍ１）） 。 １’ＣＦ−１（２，６−４６）のウサギ抗血清（０，ｊ
ｍｐ）および”’Ｉ −Ｉ ＣＦ−１（２６−４６）（
０，１ｍＪ）と混合し、４°Ｃで４８時間放置した後、
ウサギ血清（０，１ｍｊり 、ウザギＴ−グロブリン抗
血？ｆｆ（０，１ｍ７りおよび５％Ｐ Ｅ Ｇ６０００
（０，９ｍ ｌ！ ）を加えた。さらに２時間４７Ｃ
で放置した後、ペレットを遠心分離（３ｋｒｐｍ、
４°Ｃ２３０分間）により集め、γ−カウシターにより
放射活性を測定した。 ５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの含量はこの放射活性から算出
した。 失腹桝１土 Ｅ、ｃｏｌｉＦ−５における蛋白ペプチドＬ）ｉ融合”
Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−５（プラスミド ｐＬＨ３ｄＶ
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、５０μｇ／ｍ７
！ビタミンＢ１および２５．ｃ＋ｇ／ｍ１アンピシリン
含有Ｍ−９培地に１＝２０の割合で希釈した。β−イン
ドールアクリル酸を加え最終濃度１０μｇ ／ ｍ ｊ
！とじた。この時のＡ６゜。は０．５であった。次に、
菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４℃、５
分間）により収集した。 尖舅炭１１ ターミネークーＳ遺伝子のクローニング：各オリゴヌク
レオチド（Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’およびＥ’）をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、実施例８に記載した
ようにＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲーション
混合物と二種のオリゴヌクレオチド（Ａ’およびＦ’）
とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲー
ション生成物を分取用ＰＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨ
Ｉ−３ａｌｌ消化によるｐＢＲ３２２の大きな断片と混
合した。混合物のライゲーションは、標準条件下におい
て７４ＤＮＡリガーゼを用い行った。ライゲーション混
合物を用いてクノシュナー法により、旦、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
をテトラサイクリンを含量するプレート上で選択した。 アンピシリンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す
クローンから分離したプラスミドＤＮＡをＡｖａ ｌで
消化させると断片８１７ｂｐが得られ、Ｂ ａ ｍ Ｈ
１−３ａ Ｉ Ｉで消化させるとターミネータ−遺伝子
（４７ｂｐ）が確認された。このプラスミドをｐ’ｌ”
ｅｒｓ２１と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 爽旌斑叉ｉ クーミネーターＬｉｆｉ転子のクローニング：各オリゴ
ヌクレオチド（Ｃ’、Ｄ’、Ｈ’、Ｉ’Ｊ’、に’、Ｌ
’およびＭ’）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化し、実施例８に記載したようにＴ４ＤＮＡリガーゼ
で処理した。ライゲーション混合物と二種のオリゴヌク
レオチド（Ｇ’およびＮ’）とをン昆合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで処理した。ライゲーション生成物を分取用Ｐ
ＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨＩ−３ａｌｌ消化による
ｐＢＲ３２２の大きな断片（４０８７ｂｐ）とを混合し
た。混合物のライゲーションは、標準条件下においてＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いてクノシュナー法により、Ｅ、
ｃｏｌｔ ＨＢ １０１を形質転換し、アンピシリ
ン耐性形質転換体をテトラサイクリンを含有するプレー
ト上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラサイクリ
ンに感受性を示すクローンから分離したプラスミドＤＮ
ＡをＡＶａ■で消化すると０．８％アガロースゲル電気
泳動および７．５％ＰＡＧＥにて断片３．３２ｋｂｐお
よび８３９ｂｐを示ず。このターミネータ−し遺伝子を
含有するプラスミドをｐＴｅｒＬど命名し、発現ベクタ
ーの構築に使用した。 爽施班１１ ターミネータ−３遺伝子含有”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ベクターの構築： ターミネータ−３遺伝子を含有するｐＴｅｒＳ２１をＰ
ｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロースゲル電
気泳動により大きな断片（３００５ｂｐ）を得た。遺伝
子（３，０５ｂｐ）をＢａｍＨｌ−Ｐｓｔｌ消化により
ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（１２８１ｂｐ
）で標準条件下においてライゲートし、次いでライゲー
ション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形
質転換させた。形質転換で得たアンピシリンに耐性のプ
ラスミド（りＬＨ３ｄＶｔｒｐＳ）をＰｓむｌ−５ａｌ
ｌ （１３３１，２９５８’ｂｐ）およびＨｉｎｄｌ
［［−３ａ Ｉ Ｉ （２８９ｂｐ）で消化し、７．
５％ＰＡＧＥにてターミネータ−３ｉｆｔ伝子を確認し
た。 入施玉１盈 ターミネータ−し遺伝子含有”９Ｖａｌ−ＩＯＦ−１発
現ベクターの構築： クーミネーターＬｉｄ転子を含有するプラスミドｐＴｅ
ｒｌ、をＰｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により大きな断片（３０２７ｂｐ）を
得た。遺伝子（３０２７ｂｐ）をＥ３ａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ｌ消化によりｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（
１２１３１ｂｐ）で標準条件においてライゲートし、次
いでライゲーション混合物を用いてＥ、 ｃｏｌｉ
ＨＢ １０１を形質転換させた。形質転換で得たアンピ
シリンに耐性のプラスミド（ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ）をＰ
ｓｔｌ−３ａｌｌ （１３５３，２９５８ｂｐ）および
１（ｉｎｄｌｌ＋−５ａ１１ （３１１ｂｐ）で消化
し、７．５％ＰＡＧＥにてターミネータ−し遺伝子を確
認した。 叉並■又工 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
発現ベクター（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の構築： シャロン２５フアージＤＮＡ （今井博士供与）をＥｃ
ｏＲＩで消化し４個の断片（１９，９，１０゜７．６．
６および５．７ ｋ ｂ り ）を得た。ラクトースプ
ロモーター、オペレーターおよびＺ遺伝子の大半を含有
する断片（６，６ｋｂｐ）を分取用アガロースゲル電気
泳動により回収した。一方、ｐＳｄＶ２をＥｃｏＲＩで
消化し、次いで大腸菌アルカリホスホターゼ（Ｂ Ａ
Ｐ）で処理した。線状プラスミドを、Ｔ４リガーゼの存
在下に４℃で、前記プロモーター遺伝子（６，６ｋｂｐ
）と等モルでライゲートした。このライゲーション混合
物による旦０匹旦 ＨＢ １０１の形質転換体を、アン
ピシリン耐性菌として、５−プロモー４−クロローイン
ドリルガクトシド（Ｘｇａｌ）培地上で選択した。この
インジケータープレート上では、リプレッサーを滴定す
るｌａｃオペレーターの数の増加によるβ−ガラクトシ
ダーゼが合成されたコロニーがその青い色で識別される
。約１３％のコロニーが青く、テトラサイクリン惑受性
を示した。４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＢ
ａｍＨｌおよびＩＩ ｉ ｎ ｄ ｉｌｌで消化した。 ４プラスミド中１プラスミドが目的とした正しいプロモ
ーター遺伝子を存しているが、他のプラスミドは逆方向
に挿入されていた。得られたプラスミドｐｓｄＶ２−１
ａｃｆｃＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩでン肖化し、７，５％
ＰＡＧＥにて５９Ｖａ、Ｉ−ＩＣＦ−１遺伝子（２２４
ｂｐ）をｌｉｖｔｇした。プラスミドを含有する旦。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｅ
（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の発現ニブラスミドｐＳｄ
Ｖ２−１ａｃ含有Ｅ、 ｃｏｌｉＨ’Ｂ １０１をアン
ピシリン２０μｇ／ｍｊ！含有Ｉ７ブロース中で一晩培
養し、Ｌブロース中（３００ｍ ｊ！ ）で希釈し、次
いで３７°Ｃで培養した。Ａ６゜。 が０．８の時、イソプロピルチオガラクトシド（■ＰＴ
Ｇ）を加え最終濃度０．１ｍＭとした。さらに２時間培
養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４°Ｃ１５分間）により
菌体を集め、菌体をＢｒＣＮ（１０ｍｇ’／ｍｅ）含有
の７０％ギ酸に懸濁した。混合物を室温で２時間放置し
５、溶媒を真空中で蒸発した。不溶性物質を遠心分離に
より除去した後、上清を定量を行うまで一２０°Ｃで保
存した。 叉盗±主上 β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−れたｐ
ＮＴ４９は、ｐｔ、プロモーター、トリプトファン（ｔ
ｒｐＡ）およびラクトース構造遺伝子を含有するプラス
ミドである。このプラスミドｐＮＴ４９を１３ ａ ｍ
ｌ（１で消化し、次いでＥｃｏＲＩで部分的に消化し、
分収用アガロースゲル電気泳動により約１１ｋｂｐの断
片を回収した。この断片を前記で得た５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１遺伝子（２２４ｂｐ）でライゲートし、ライゲー
ション混合物を用いＥ、 ｃｏｌｉ ＭＭ ２９４を
形質転換しアンピシリン耐性形質転換体を得た。この形
質転換体の一つから得られるプラスミドをＥｃｏＲＩと
Ｂａ ｍ ＨＩで消化し５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子
（２２４ｂｐ）の存在を確認した。 一方、レシピアント菌体旦、 ｃｏｌｔ ＨＩ ２０
１゛−実鳩、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−（１９７２）参照）をｐｓｃｌ
ｏｌに０１８５７遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴ２
０４ （このプラスミド（ｐ ＮＴ ２０４）は今井博
士により提供）により形質転換し、テトラサイクリン耐
性形質転換体を得た。レシピエンドＥ、 ｃｏｌｉ
ＩＩ １２０１９／Ｉ）ＮＴ２０４を上記プラスミドｐ
ＳｄＶ２−ＮＴ４９で形質転換し、アンピシリンおよび
テトラサイクリンに耐性％ＰＡＧＥにより”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１遺伝子（２２４ｂｐ）の存在を確認した。ｐＳ
ｄＶ２−ＮＴ４９含有旦、 ｃｏｌｉ ＨＩ ２０１
９／ｐＮＴ２β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐｓｄＶ２
−ＪＩＴ４９）融合５９Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −Ｉの
発現：（アンピシリン（２５μｇ／ｍｊりおよびテトラ
サイクリン（２５μｇ／ｍｊりを３０°ＣでＬＰブロー
ス〔Ｌブロース＋０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液＋１％
グルコース） （１００ｍｊりに希釈した〕（５ｍｌ
）中で一晩培養した。培養物は３０℃でＡも。。＝ ０
．５−０．６となるまで発育させ、次いで４２°Ｃに移
した。更に４２°Ｃで３時間培養した後、菌体を集め、
ＢｒＣＮ （１０ｍｇ／ｍＡ）含有７０％ギ酸で懸濁し
、室温で２４時間放置した。 溶媒を減圧下に留去し、残渣を３Ｍ酢酸（３ｍｊ２）に
懸濁した。混合物を一晩室温で放置し、滅菌水で３倍に
希釈した。不溶性物質を遠心分離により除去し、上清を
凍結乾燥して分析するまで一２０℃で保存した。 実施■ユニ ５９Ｖａｌ −ＩＧＦ−１の分離および精製＋１１
融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分離および精製温潤細胞ペ
ースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−Ｅ Ｄ Ｔ Ａ
（ｐ Ｈ８，０） １５０ｍ ＩｌにｒＵ、ｆ５し、菌
体を超音波処理により破壊した。菌体残層を１８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化した。得られ
たペレットを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（ｐ Ｈ
８，０）／８Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトール（５
０ｍ６）に溶かし、３５．００Ｏｒｐｍ、 ２５°Ｃで
３０分間遠心分離した。上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ！（ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０．ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリル
３３００ス−バーファインカラム（５，，０Ｘ８６．６
ｃｍ、 １７００ｍｊ！樹脂）にかけた。溶出は４℃で
平衡緩衝液を用い、流速０．６ｍ ｊ！ ／分で行った
。画分１１ｍｊ！を集めた。セファクリル５３００クロ
マトグラフイを行った。定量は全クロマトグラフィ段階
について両分後直ちに行った。活性画分を集め、合わせ
た画分２０４ｍｊｌ！を１Ｍ酢酸水溶液８７！を用い室
温で３時間透析し、次いで新たに１Ｍ酢酸水溶液８７！
を用い一晩透析した。透析画分は凍結乾燥し、所望の成
分を含有する融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１２４ｏｍｇを得
た。 （２ン 臭化シアンによる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１か
らの蛋白ペプチドＬＨの脱離 操作（１２により得た融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１（２４
０ｍｇ）を８０％ギ酸１２ｍｊ＋に溶解した。 臭化シアン（２４０ｍｇ）を加え、２５℃以下で一晩攪
拌下に反応させた。蒸留水１０８ｍｆを加えた後、ギ酸
および臭化シアンを凍結乾燥により除去した。残渣をＩ
Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｉ ＣＩｌ （ｐ１１８．０）／８
Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール６ｍｌに溶
かした。この溶液を２５°Ｃで４時間攪拌し、０．０１
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，６）／８Ｍ尿素−５０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（パンファーＡ）１５０ｒ
ｒ＋ｊ！を用い室温で２時間、２回透析した。 透析溶液はバッファ−Ａで午後ｉ化したカチオン交換樹
脂ＣＭ５２カラム（１，６Ｘ１５．ｏｃ＋ｎ３０ｍ Ｒ
樹脂）にかけた。カラムはバッファーＡ （６０ｍ １
２ ） ヲ用い、室温にて流速０．５ｍ １２／分で洗
浄し、バッファ Ａ（２５０ｍｆ）から０，２Ｍ酢酸
アンモニウム／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール（２５０ｍＡ）までの直線勾配で溶出した６両分
２．７５ｍｊ！を集めた。陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを行った。活性画分を集め、プールした両分を１Ｍ
酢酸水溶液−１０ｍＭ２−メルカプトエタノール４１を
用い室温で４時間、２回透析した。 （３） 高速液体クロマトグラフィ：操作（２）によ
り得たラジオイムノ活性含有透析画分を用いた。 カラム二へツクマンウルトラポアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７
５鶴） 流速：１ｍＩ！、／分 溶 出： Ｏ，ＯＩＭ Ｉ−リフルオロ酢酸中１０％か
ら６０邪までのアセトニトリルの直 線勾配；５０分間 操作は３０回繰返して還元型”Ｖａｌ−ＩＣＦ−■含有
画分を集めた。保持時間２１３．１１８分の主ピークは
還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に相当する。 前述の操作により還元型”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −１
が収率８０％（約７ ｍ ｇ”）で得られた。 この還元型”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−Ｅは通常の再生（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ）法により酸化型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−■に変えた。 大狙班１↓ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳによる蛋白ペプチドＬ
Ｈ融合”Ｖ、１ｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発
現ニ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐｓ含有旦１匹旦ＨＢＩＯ
Ｉをβ−インドールアクリル酸誘導の条件下で実施例２
４と同様の方法により培養した。 集めた菌体を融解し、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を実施
例３３ （１）に記載のように分離した。融合５９Ｖｉ
ｌ−ＩＧＦ−１を臭化シアンで処理し、粗”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１を実施例３３（２）に記載のように精製し、純
粋な”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −１を得た。 去旌■ユ盈 プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＬによる蛋白ペプチｌ−
″ＬＨ融合５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１をコードする遺
伝子の発現ニ プラスミドｐＬ ＨＳ ｄ Ｖ ｔ ｒ ｐ Ｌを用イ
ル５９ｖａｌ−ＩＣＦ−１の発現は実施例２４と同様の
方法で行った。 尖施狙ユニ 還元型”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分析： （１）アミノ酸組成 実施例に３３により調製した物質はウォーターズ社製ア
ミノ酸分析システムを用い分析した。物質のＳ Ｈ基は
文献記載の方法によりカルボキシメデル（ＣＩｔ ｚ
ＣＯＯＨ） Ｍ （ｆｕｎｃＬｉｏｎ）で保護した。 アミノ酸残基の計算は本明細書に示したＤＮＡ配列デー
タに基づき７０と標準に合わせた。 （２１”Ｖａ １−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列分析：こ
のペプチドのＮｌｈ末端のアミノ酸配列はエドマン法Ｃ
ＤＩＢＩＴＣ法）（Ｊ、Ｙ、Ｃｈａｎｇら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 Ｊ、、１５３． ６０７ （１９７６）
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｔｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ
、＋ ５１８． １８８（１９７９））によりベック
マン配列モデル８９ブチダーゼ消化法により決定した。 Ｑ”ｙ＋ｌ’Ｖ、＄＝’ｆＣ，Ｑ ”’Ａ Ｉ−Ｘ（（
Ｆ−１，ｆ） Ｔ 、” ／ １１憧ψ艮 還元型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸組成（値はモ
ル％） アミノ酸 残基数／分子 近似整数 予測値ＣＭ−Ｃｙ
ｓ ５．６ ６ ６Ａｓｐ
５．２ ５ ５Ｔｈｒ
２．６ ３ ３Ｓｅｒ ４
、９ ５ ５Ｇｌｕ ５
、９ ６ ６ＰｆＯ５，４５５ Ｇｌｙ ７ 、４ ７ ７Ａ
ｌａ ５ 、６ ６ ６Ｖａ
ｌ ３．７ ４ ４Ｍｅヒ
Ｑ Ｑ Ｏ工ｌｅ
ｏ、ｓ １ １Ｌｅｕ
５ 、１ ５ ６ＴＹｒ
２．５ ３ ３Ｐｈｅ ３
、６ ４ ４Ｌｙｓ ３．
２ ３ ３Ａｒｇ ８．４
Ｂ ６（３）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ Ａ
Ｇ Ｅ）はスワンクおよびムンクレスの方法に従って
行った。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＰＡＣ；Ｅで約５０００ダルト
ンの位置に単一バンドを示した。〔天然ＩＣＦ−１は文
献（Ｒ，Ｅ、 Ｈｕｍｂｅｌ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、＋ Ｕ Ｓ Ａ、工３，
２３６５−２３６９ （１９７６））＆ではＰ Ａ Ｇ
Ｅ、テ約５０００ダルトンの位置にバンドを示す。〕 貞晦 ２ 図 ５９Ｖａｔ−ＩＧＦ−Ｉ潰イ訃のり０−
二）グ↓ シ吾善ヒ単鮪 ρ５ｄＶ２ 第３ 図 合戊廿Ｐアロ針外 ■遣イ立子の構築合成１
１７６口モーター １潰イ云＋ 納４図 合成ｔｒｐ ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲ１ 合成ｔヒＰアロモーターエ遣４ム÷ アＯモーター ｘ４イ云＋のクローニ）り゛。 ＰＳＴ−１、 ＳＴ−１ ！８ 図 蛋白ペア子ドＬＨｉｉイ云＋のりＯ−二ン
ク°。 １１ヒ卑潰准 ρＬＭ １０７ ｉ自公プ子ドＬＨ遣イ云千 ＠９ 図 絹娘アラス汁ｐｓｄＶ２廿ρの＄葺堵ｐＳｄ
Ｖ２ｔ ｒρ 肖−１２図 Ｓｌａ換′ｚＶ°ラスミＦ ｐＬＨ５ｄ
Ｖｔｒｐ Ｏ＠９ｐＬＨ９ＪＶｔｒｐ’Ｌ’Ｊ有’Ｉ
’＋ Ｌ α市）−ＩＢ１０１１焙普ヒ草劃伽 ｐＬＨ５ｄＶｔｒＰ ？ １３１Ｄ ター三ネイターＳ潰イ立子の構
繁ター三ネイターＳ遣イ２４＋ 第１４図 ツーミネイターＬｉｌ私÷の構替−Σ＝
ニピー エ Ｊ二 Ｊ吐！ターミネ
イターＬ １１六子 図 組換え７゛ラスミドρＬＨ５ｄＶｔｒρＳのＩｌ絆
に づ Ｐｓｔｌ Ｅ’ ！ １６ 図 糸且廃えプラスミド予ＬＨｄｓＶｔ
ｒρＬのゎ１験５ｊ １７ ［ｉ８ 組をトえ）
“ラスミド ρ５ｄＶ２−１ａｃの末島）誼ＰＳｄＶ２
−１ａ（ｔｉ：ｌＡｑる旦９λし、ＨＢ １０１Ｊ ｔ
ｐ４ビ単鮪 ｐｓｄＶ２−ｔａｃ
融合５９Ｖａ ］ −１０Ｆ−１の”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１への変換および５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の単離： こうして得た融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ ＋は、保護ペ
プチドの脱離反応によって５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉに変
換できる。 この脱離反応は、ペプチド化学の領域で用いられる常法
に従って実施できる。融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のタイ
プに応じて適当な脱離反応を選択することができる。 この脱離反応で使用される適当な反応剤には、臭化シア
ンが包含されうる。 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
し７た”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１からの蛋白ペプチドの脱ｉ
Ｊ： 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いた脱離
反応によって、”Ｖａｌ−ＩＣ＋Ｆ−■に変換できる。 この反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない恨用の溶
媒中、緩和な条件下で行われる。 反応温度はとくに限定されず、通常は、冷却ないし加温
のもとて反応を行う。 融合”Ｖａｌ−ＩＯＦ−］を、６６０％蟻酸中２５°で
３時間臭化シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣ヲ、５
０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含存する８Ｍ尿素
溶液に溶解させ、透析して、還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ
−１の粗混合物を得た。この混合物をカチオン交換クロ
マトグラフィ （ＣＭ５２）によって精製し、ＲＩＡで
検知された活性画分を集めて、透析した。透析後の両分
を高速液体クロマトグラフィにかけて、純粋な還元型″
′■ａｔ−ＩＣＦ−１を得た。この還元”Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−１を、通嘱の再生法（ｒｅ４ｏ１ｄｉｎｇ）によっ
て酸化型”Ｖａ’１−ＩＧＦ−１に変換した。精製され
た５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、ポリアクリルアミドゲル
電気法ｖＪ（ＰＡＧＥ）に際して単一のバンドを示し、
またその”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、ＩＩＰＬＯにおいて
、Ｈｕｍｂｅｌ博士から贈られた紐キキ年コＩＧＦ−１
の標品と重なった。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸配
列を、エドマン法とカルボキシペプチダーゼ法とを組合
“Ｖて、決定した・その”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＢＡＬ
Ｂ／ｃ ３Ｔ３マウス細胞によるＭｌｌ）−チミジン
取込みアッセイにおいて生物活性を示した。 （１０）”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１の放射免疫測定：矢
内原〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８
３） ）が確立した方法に従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１のＲＩＡを行った。上記の試料または標準試料（ＩＧ
Ｆ−１断片（２６−４６））の０．１ｍβを、試料用緩
衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ中、０．５％ＢＳＡ （ｐＨ７，４） （０，４ｍ
ｊり 〕、”Ｖａ １−ＩＧＦ−１（２６−４６）に対
するウサギの抗血清（０，１ｍ＃）および”’ＩＩＧＩ
”−１（２６−４６）（０，１ｍ１）と混合した。混合
物を４ ’Ｃに４８時間放置し、つぎに、ウサギ血ｉ’
）ｆ（０，１ｍβ）、ウサギγ−グロブリン抗血清（０
，１ｍｌ）および５％ＰＥ０６０００ （０，９ｍｌを
加えた。４°Ｃでさらに２時間放置したのち、遠心分離
（３ｋｒｐｍ、４°Ｃ１３０分間）によってペレットを
集め、γ−カウシターで放射活性を測定した。この放射
活性から”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の含量を算出した。 （１１） ５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１の生物学的アッ
セイ； ＢΔＬＢ／ｃ ３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クロー
ンＡ３１）をトリプシン処理し、５％のウシ胎児血清と
２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン￥Ｊ、（Ｈｌ、ＰＥ５）を含
有するダルベツコーフォークトの改変イーグル培地中に
、１０５細胞／ｍｊ２の濃度に再Ｑ、 ｆ５した。１０
０μβづつをＱ、３ｃｎ！のウェル（９６ウエルのマイ
クロタイクープレート、コスタ−社製）に入れた。均一
な単層細胞が形成されてから（最初のプレーＦ ｉ１Ｍ
製から５〜７日後）３〜４日後に、培地を除去し、培養
物を３回洗い、つぎに、０．２μＣｉ／ウエルの（”Ｈ
）チミジン（０，６７Ｃｉ／ｍｍｏ ＋）および被検試
料を加えた。２４時間のインキュベーションののち、培
地を除去し、細胞をＰＢＳで洗い、放射能測定のためト
リプシン処理した。細胞を半自動のマルチプルセルハー
ヘスタ（ＬＡＶＯ，ＭＡＳＨ。 ラボ・サイエンス）を使用して、ガラスフィルターに捕
捉した。取込まれたＣ Ｈ）チミジンを、アクタゾール
２ にュー・イングランド・ニュクリアー）８ｍｊ！中
で、パソカード・トライ−カーフ’ｆａ体シンチレーシ
ョンカウンタを用いて、カラ△ ントした。 以下、実施例を示し、この発明を説明する。 去隻±上 ＨＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ ｐ Ａ
ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ
ｌ）の合成（１１ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ
ｏＧ”ｐ ｏＡｅＵｐｏ−セルロースの合成： ｉ ） ＨＯＧ′８ｐ ｏ ＡｃＵ ｐ ｏ−セ／（／
ロース（Ｄ調製：ＤＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−
セルロース（１３０，４ｍｇ、 ４．５９ μｍｏｌｅ
”） （Ｒ，Ｃｒｅａの方法１１により製造）のメタノ
ール／クロロホルム（１：９Ｖ／Ｖ、 ５ＪＯｍＩｌ）
懸？ｉ液にＴＣＡ／りａｏボルム（２：８ Ｗ／Ｖ、
５．Ｏｍｊりを冷却下に加え、０°Ｃで１０分間攪拌
する。クロロホルム（２ｍ／）およびメタノール（６，
０ｍ１）で洗浄後、濾紙上のセルロース付加物（ＨＯＧ
”ｐ ｏ”Ｕｐ ｏ −セルｅ＋−ス）を乾燥させた。 この際、水はピリジン（２ｍｌ）との共沸混合物として
分離した。 ＊この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５０７ｎｍで
測定して算出した。 １） Ｒ，Ｃｒｅａ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、。 ■、２３３１ （１９８０） ｉｉ）ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡＩｌｚｐ ｏＴｐ ｏ−の
調Ｍ ：ＤＭＴ ｒ ＯＴｐ ｏ Ａ”ｐ ｏ Ｔ ｐ
ｏ−ＣＥ （３９，９ｍｇ、 ２３．０μｍｏｌｅ）
をトリエヂルアミンーアセトニトリＪＬｉ （ＩＩＩ
Ｖ／Ｖ、 ５ｍ ｌ）を室温で１時間処理して得られた
ホスホジエステルトリマー（ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ
ｏＴｐ ｏ−）を乾燥させた。水はピリジンとの共沸
混合物（０，５ｍｊ！ 、 ２ Ｘｌｍｊｌりとして
分離した。 ｉｉｉ ）カップリング トリマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡ”ｐｏＴｐｏ−）セルロ
ース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃＴＪ ｐ ｏ −（！
ルコースンと１０ｍ１容丸底フラスコ中で混合した。 混合物を乾燥させ（水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ
１ｍ４）として分離ン、無水ピリジン（１ｍｌ）に再懸
澗させた。 メンチレンスルボニルニトコトリアヅリド（ＭＳＮＴ）
（６８，０ｍｇ、 ２３０．ｌｊｍｏｌｅ）をこの
：Ｖ、 ンＢ ？（ｌに加え、室温で１時間撹拌した。 次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース付加物を
遠心分離（３０００ｒｐｍ、 ２分間）により回収した
。 ｉｖ）未反応５′ヒドロキシル基のアセチル化：前記セ
ルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：１ν
／Ｖ、 ５．５＋ｎＡ）にセ、濁し、室温で３０分間攪
拌した。ピリジン（５ｔｔ＃！ン中で反復遠心分離（３
０００ｒｐｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍ ｌ
）で洗浄、室温で３０分間真空乾燥することにより、
セルロース生成物（１１３，９ｍｇ）を得た。このセル
ロース付加物（ＤＭＴ ｒ ＯＴ ｐ ｏ ＡＩＩＩｐ
ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ ＣＵ ｐ ｏ−セ
ルロース）は次のカンプリング工程に使用できる。 （２） ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＱ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐ。 ＡＢｚｐ ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＡｃＵ ｐ ｏ
−セ／Ｌ／Ｃ１−ス（７）合成： ＤＭＴｒＯＧＩＢｐ ｏＧ”ｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏ
Ａ”ｐｏＴｐｏＧ”ｐｏ”Ｕｐｏ−セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ
Ｏ−セルロース（１１３，９ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ０Ｇ
ｌｌＩｐ 。 Ｑ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ −ＣＥ （４３，７ｍｇ）か
ら前記と同様の条件により合成した。 （３１ＤＭＴｒＯＡｌ１２ｐｏＣＢ２ｐｏｃ”ｐｏＧ”
ｐｏＧ”ｐ ｏＣＩｌｌｌｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ
ｐ ｏＧ”ｐｏ Ａ ＣＵ Ｉ） Ｏ−セルロースの合
成：ＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃｇ＋ｐ
ｏ Ｇ”ｐ 。 Ｇ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ ｐ ｏ
Ｇ”ｐ 。 ＾Ｃ［Ｊ ｐ ｏ−セルロース（１０５，８ｍｇ）はＤ
ＭＴ ｒ ＯＧ”ｐ ｏＧＩＢｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ
ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＱｌ ＋＋ ｐ ｏ Ａｃ Ｕｐ
ｏ−セルロース（１０９，５ｍｇ）とＤＭＴｒ ０Ａ
Ｉｌｌｌｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ −ＣＥ
（４４，０ｍｇ）から同様の条件により合成した。 ｔ４１ ＤＭＴｒＯＣＩｌｔｐｏＣ”ｐｏＧＩＢｐｏ
Ａ”ｐｏ Ｃｌ１１ｐ ｏ ＣＢｆｆｉｐ ｏ Ｇ”ｐ
ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ｃ口ｐｏＴｐ ｏＡｌ１２ｐ ｏＴ
ｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＩＪｐ ｏ−セルロースの合成： ＤＭＴ ｒ ＯＣｌｚｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ
ＡＵｐ。 Ｃ”ｐ ｏＣＲ＋ｐ ｏＧ”ｐ ｏＧＩＢｐ ｏＣＢｚ
ｐ ｏＴｐＯＡ口ｐｏＴｐ ｏＧＩＢｐ ｏＡｅＵｐ
ｏ−セルロース（９４，５ｍｇ）はＤＭＴ ｒ ＯＡ”
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ ＣＵｐ。 ＧＩｌｌｐ ｏＧＩＩＩｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”
ｐ ｏＴｐ 。 Ｇ′ＢｐＯＡｃＵｐＱ−セルロース（１０５，８ｍｇ）
とＤＭＴ ｒ Ｏ’Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ
ｏ −ＣＥ （４３，５ｍｇ）から同様の条件により合
成した。 ｆ５１ ＤＭＴｒＯＡＢ！ｐｏＡ”ｐｏ八へ２ｐｏｃ
ｉｚｐｏＣ”ｐ ｏＧＩＩｌｐ ｏＡ”ｐ ｏＣ”ｐ
ｏＣ”ｐ ｏＧＩＲｐ ｏ ＧＩＩＩｐ ｏ ＣＩＩｚ
ｐ ｏＴｐ ｏ Ａ”ｐ ｏＴｐ ｏ Ｇ′Ｂｐ ｏＡ
ｃＵｐ ｏ−セルロースの合成：ＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ
ｏ Ａ”ｐ ｏ Ａ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。 Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ ＡＢｚｐ ｏ
Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ
ｏＣＩＩｚｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐｏ
Ａｃ Ｕ ｐ ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）は、
ＤＭＴｒＱＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ”
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ
Ｃ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ 。 Ｔ ｐ ｏ Ｇ″′ｐ ｏＡｃＵ ｐ ｏ−セルロース
（９４、５ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ０ＡＢｔｐ ｏ ＡＩ
ＩＩｐ ｏ ＡＢｚｐ ｏ−ＣＥ（４５，１ｍｇ）から
同様の条件下で合成した。この１８％段階では未反応５
′−ヒドロキシ基はアセチル基で保護する必要はなかっ
た。 （６１ＨＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ Ｇ
ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈの合成：ＤＭＴ ｒ ０Ａｌｌ！ｐ’ ｏ Ａ”ｐ
ｏ Ａ３ｆｆ１ｐ ｏ Ｇ”ｐ 。 Ｃ５ｚｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ ＡＩＩＩｐ ｏ Ｃｌ１１
ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ｃ１ｌ″
ｐ ｏＴｐ ｏＡｌｌ″ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐｏ”Ｕｐ
ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）を０．５Ｍ Ｎ。 Ｎ、Ｎ゛、Ｎ’−テトラメチルグアニジニウムピリジン
２−アルドキシマート〔ジオキサン−水（１：１ ｖ／
ｖ、 １ｍ り中〕と封管中、２０℃で２０時間処理し
た。 反応混合物に２８％（會ハ）アンモニア水（１２ｍ ｊ
！ ）を加え、６０℃で２時間加熱した。固形セルロー
スを濾別し、水（１０ｍ ｌ！ ）で洗浄した。濾液と
洗液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５ｍ
ｌ）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残渣を０
．１Ｍ炭酸トリエチル アンモニウム緩衝液（ｐｌ！？
、５．２５ｍ ｊ！ ）に溶かし、ジエチルエーテル（
３×２５ｍ ｊ！ ）で洗浄した。水層を蒸 発乾固し
、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（
ｐｉ（７，５，２ｍｊりに溶解し、）８液中に粗ＨＯＡ
ｐ Ａ ｐＡｐｃｐｃｐｃｐＡｐｃｐｃｐｃｐｃｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨを得た。 ＋７１ １（ＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＧＯＨの精製：ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムクロ
マトグラフィー（バイオゲルＰ ２２４ Ｘ ２．６ｃ
ｍ ｌ Ｄ）により行った。最初の溶出ピークに相当
する画分（５０ｍＭ Ｎｌ１４０Ａ ｃ、 ０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴ八、１ｍｊ！／分）を取り、凍結乾燥し最
初の精製物を得た。 ｉｉ ）最初の精製物の２回目の精製はＨＰ Ｌ Ｃ（
ＣＤ Ｒ１０，２５ｃｍＸ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）になり
１Ｍ酢酸アンモニウム−１Ｂ％（Ｖ／Ｖ）水性エタノー
ルから４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水
性エタノールまでの直線勾配（８０分間、（ｍ１７分。 １ｉｉ）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬ
Ｃ（Ｒｐ １Ｂ ５μ（Ｘ７７）、１５ｃｍＸ４ｍ
ｍｌＤ）により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１
Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間、 １．５ｍｌ／分、
室温）を用いて行い、最終精製物（ＩＩ ＯＡ（１）オ
リゴヌクレオチドの分析 （Ｈ○ＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＣＯＨ） ｉ）ホスホジェステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯｌ（（５μｇ、 ６１．７μｋ）
０．２ Ｍ ＭＨＣｊ！ｚ（１０μＩり、０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ Ｈ８，５）（１０μｌ）お
よび ０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液（１３，３μ
ｍ）の混合物をホスホジェステラーゼ（５車位、５μｌ
）で室温にて２０分間処理し、続いて１００“Ｃで２分
間加熱した。 １ｉ）ｉ（ＰＬＯ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドは１１ Ｐ Ｌ Ｃ
（ＣＤＲ１０，２５ｃｍｘ ４．５ｍｍ Ｉ Ｄ）によ
り水〜２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直線
勾配（４０分間、 １．５ｍρ／分、６０°Ｃ）を用い
て行った。標準品の面積を比較することにより、各ピー
ク面積からそのヌクレオチド組成を決定した。 計算値： ｐ Ｃｏ１１５．０００．ｐＡＯＨ４，００
０゜ｐＴｏｏ ２，０００． ｐＧｏｌ＋４，０００
実測値： ｐＣｏｏ ４．７６７、 ｐ Ａｏｕ ４
，１２７゜ｐＴｏｎ ２，０５４．ｐＧｏｏ ４，０５
２入■凱ｌ オリゴヌクレオチド（ＡＩ、Ａ２．Ｂ１．Ｂ２゜ＣＬ、
Ｃ２，Ｄｌ、Ｄ２． Ｅｌ、Ｂ２．Ｆｌ、Ｆ２゜Ｇ２
．Ｈｌ、Ｎ２． ＩＩ、 １２． Ｊｌ、 Ｊ
２．Ｋｌ。 Ｋ２．Ｌｌ、Ｌ２．ＭＩ Ｎ２．Ｎｌ、Ｎ２，０１お
よび０２）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の０１と同様
の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ（Ａｌｌ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１（３１
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｂｌｌ（４１ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＴ（（Ｂ２
）（５１ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１）＋６） ＨＯＡｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｃ２１（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｄ
Ｉ）（８１ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｃ２１（９） ＨＯＧｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｅｌｌ（１０） ＨＯＴＰＡＰＧＰＡＰＡＰ
ＡＰＣＰＣＩ）ＡＰＣＰＧＰＡＰＴＰＣＰＡＯＨｆＥ２
）（１１） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＧＯ＋Ｉ （Ｆ２１（１３１ＨＯＧｐＣｐＴ
ｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｇ２）（１４１ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１５１
ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｎ２１ｆ１６１ ＨＯＧｐＣｐＧ
ｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯ
Ｈ（ＩＩ）（１７１ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐ、ＴｐＧＯＨＩＩ２）（
１８１ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌｌ（１９１ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｊ２１（２０１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌ）（
２１１ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｘ２１（２２１ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴ
ＯＨ（Ｌｌｌ（２３１ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ＜Ｌ２’１
（２４） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯ）Ｉ ｔＭ１’）（
２５） ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ（）１２）（２７） Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＡＯＨ（Ｎｌｌ（２８） ＨＯＧｐＣｐＧｐ
ＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ
（Ｎ２）（２９１ＨＯ八へＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（０１１（３０）
ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ（０２）五１１州ｌ オリゴヌクレオチド（ａ ｌ ａ ２． ａ ３．
ａ ４゜Ｇ５．Ｇ６．ｂｌ、ｂ２．ｂ３．ｂ４．ｂ
５．ｂ６゜ｃｌ； Ｇ２．Ｇ３．Ｇ４．Ｇ５．Ｇ６．
ｄｉ、’ｄ２゜ｄ３．ｄ４．ｄ５．ｄ６．ｅｌ、Ｇ２．
Ｇ３．Ｇ４゜Ｇ５，１１．１２および１３）の合成：下
記オリゴヌクレオチドを実施例１記載のＧ１と同様の方
法で製造した。 （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ＜ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ＋ａ２）
（３１ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３１（４１ＨＯＴｐＧｐＧ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｇ４１（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ＋ａ５１（６１Ｈ
ＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｇ６１（７１ＨＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯ
Ｈ（ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２１（９１Ｈ
ＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐ
ＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（Ｌｏ） ＨＯ八へＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
’ｏ４）＋１１３１（ＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５）（１２）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐ
ＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３１ＨＯＴｐＡｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＣＯ＋Ｉ （ｃ １１（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐ
ＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｇ
２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐ’ＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３）（１６１
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ４１！１７１ ＨＯＴｐＣｐＣ
ｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｇ５）（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｇ６１（１
９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｄｌｌ（２０） ＨＯＡｐ
ＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐＴＯＨ（ｄ２１（２１１ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ３）（２２
／） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４）＋２３１ ＨＯＡ
ＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＣＩ）ＡＰＡＰＴＰＴＰＴＰＧ
ＰＧＯＨｆｄ５１（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｄ６１
（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ａｌｌ（２６１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＡＯＨ（Ｇ２１＋２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３
１（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｇ４）＋２９１ Ｈ
ＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴｐ
ＣｐＡｐＴＯＨ（Ｇ５１（３０） ＨＯＴｐＧｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１１
（３１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）（３２１１１０ＧｐＡｐＴ
ｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１去Ｊｌ
羨を 下記オリゴヌクレオチド（ｍｌおよびｍ２）を実施例１
と同様の方法で製造した。 （１） ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍｌ）（２
１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｍ２）去旌貞盈 オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ。 Ｇ、Ｈ，Ｈ，Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 ＋１） ｌｌ０ＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（１１） ＨＯＴｐＡｐＧｐＴ
ｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ＋Ｋ）（１２１ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１４）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｎ）ＳＥ、ＳＦ、ＳＧおよびＳＨ）の合成：＋１１
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴＯ
Ｈ（ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）（３
１ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｓ（ｊ＋４１ ＨＣＩＣｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨｆ
ｓＤｌ＋５１ ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯ）Ｉ （ＳＥＩ（６１Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐ
ＣＯ！（（ＳＦＩ＋７） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧＩ
（８１ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）天」ｕ」Ｌ 下記オリゴヌクレオチド（Ａ’−Ｎ’）を実施例１と同
様の方法で製造した。 （４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１
ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６１ ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｆ’１（７） ＨＯＧｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｇ’
）（Ｅｌ） ＨＯＧｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯ）！ ＋１１’）（９
１ＨＯＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（工１）（１０） ＨＯＧＰＣ
ＰＣＰＴＰＴＰＴＰＡＰＡＩ）ＴＰＴＰＧＰＡＰＴＰＴ
ｐＣＰＧＯＨ（Ｊ’）＋ｉｌｌ ＨＯＧｐＣｐＣｐＴ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｋ’１（
１２１ＨＯＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｌ’１（１３７ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＧＯＨ（Ｍ’１（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ス］ｌ壓Ｊ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ｌ遺伝子の製造： 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション各オリゴ
ヌクレオチド（Ａ Ｉ −０１） （０，４ｎＭ）の一
部を、７４ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（１（ｐ Ｈ７
，６）。 Ｌ ＯｍＭ ＤＴＴ、 １．６ｍＭメルカプトエタ
ノール＋’ １０ｍＭ ＭｇＣｆｚおよび０．５ｍＭ
ＡＴＰを含存する溶液１００μ！中でＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼＣＢＲＬ製）を用い３７゛Ｃで２０分間リ
ン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００
℃で５分間インキュベートし不活性化した。 りを得、最終的にはクローニング用の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子を得る。ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（７単位）を用い、１００ｍＭＡＴＰ（０，５μｌ
）含有溶液中にて４°Ｃで２３時間（標準条件）行った
。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーション
生成物は、トリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％グラ
ジェントＰＡＧＥで臭化エチジウム染色により同定した
。 実施狙工 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子のクローニング：プラスミ
ドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化した。 反応を、６５゛Ｃで５分間加熱して終了させ、断片を０
．５％アガロースゲル電気泳動により分離した。 ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを回収し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと工２°Ｃで１８時間ライゲートさ
せ、２２４ｂｐ”Ｖａ ｌ−ＩＣ；Ｆ−■遺伝子を得た
。ライゲーション混合物を用いてクソシュナー法により
、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｉ［Ｂ １０１を形質転換し、ア
ンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン（２５ｐ
ｇ／ｍｌを含有するプレート上で選択した。アンピシリ
ンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す５クローン
の１つから分離したプラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩおよ
びＢａた。このプラスミドは”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝
子の完全ヌクレオチド配列によって特徴づけられ、ｐＳ
ｄＶ２と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 叉星凱土亙 プラスミドｐｓｄＶ２中”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の
配列決定： ”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＣＦ −１遺伝子の配列を調べるた
め、プラスミドｐｓｄｖ２をＥｃｏＲＩで消化し、次い
でα−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化
学工業ｈａより購入）を用い３７°Ｃで３０分間処理し
た。３２ｐで標識された線状プラスミドをＢ ａ ｍ
ＨＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｌ）、 ４．Ｏｂ
ｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は分取用ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により回収し、マキ与ムーギ
ルバート法の手順に従フて配列決定した。 一方、プラスミドｐＳｄＶ２はまずＢａｍＨＩで消化し
、次に前述のように３１ｐで標識した。線状プラスミド
をＥＣ０ＲＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｐ、４．
０ ｋｂｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は前述
のようにマキサム−ギルバート法により分析した。”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の両側からの配列決定の結果は
、設計した”Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝子と一致した
。 大流思上上 蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子の調製： （０，４ｎＭ）を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓｉｌ ＣＲ（
ｐ １１７．６）。 ２０ｍＭ ＤＴＴ、５０．Ｌ１ｇ／ｍｊ！ ＢＳＡ
、ｌｒｎＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣｊ！ｚおよ
び２ｍＭＡＴＰを含有する溶液４０μβ中で２．５単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い３７℃で３時間
リン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１０
０℃で５分間インキユヘートして不活性化しンは第７図
に示すようにして行い、まず６フラグメントブロソクを
得、最終的にクローニング用の蛋白ペプチドＬＨｉｌｌ
転子（２３６ｂｐ）を得た。 ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位）を用い
、５０ｍＭＡ、ＴＰ含有溶液（１μｎ）中１６°Ｃで５
時間行った。各段階のオリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン生成物はＴｒｉｓ −Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液中２−
１６％グラジェントＰＡＧＥで臭化エヂジウム染色によ
り同定した。 実施史上叉 蛋白ペプチドＬ’Ｈ遺伝子のクローニング：前述のよう
にして合成した蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子（２３６ｂｐ
）を実施例日と同様の方法でｐＢＲ３２２４：挿入した
。Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラ
スミド（ｐＬＨＩ０７）は、制限酵素分析により蛋白ペ
プチドＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかに
なった。 入■炎上主 合成ｔｒｐプロモーター遺伝子ｌの構築ニブロックＩ、
ＩＩおよび■のそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ
）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、前述
のように７４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次いで
このブロック（１−１）と未リン酸化オリゴヌクレオチ
ド（Ａ。 Ｎ）を縮合させた。最後のライゲーション住成物を分取
用１．５％ＰＡ、ＧＥによりｑｆｆ製し、１０７ｂｐの
合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。 去１１引り土 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニング： プラスミドｐＢＲ３２５をＥＣ０ＲＩで消化し、綿状ｐ
ＢＲ３２５を前記合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子とラ
イゲートし°た。このライゲーション混合物による一旦
−１匹旦 ＨＢ １０１の形質転換体を抗生物質含有プ
レート上でスクリーニングし、ＲＡｍｐ’Ｃｍコロニー
４つを得た。この４コロニーから得たプラスミドをそれ
ぞれＨｐａＩで消化した。＋１ ｉ ｎ ｄ ｍおよび
Ｅｃ ｏＲＩ消化によりこれらプラスミドから得た断片
をＩＩ ｉ ｎ ｄ ｌ１１およびＥＣ０ＲＩ消化によ
るｐＢＲ３’２５の断片と比較した。４つのプラスミド
のうちの１つは正しい方向のプロモーター遺伝子（合成
ｔｒｐプロモーターＩｎ伝子転子有し、他のものは逆方
向に挿入されていた。 人妻■［Ｌ晃 ｔｒｐプロモーター■遺伝子の構築； ブロックＩ′、Ｉｔ’、Ｉ［Ｉ’およびＩＶ ′の各オ
リゴヌクレオチド（Ｂ−３Ｏ）をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し、次いで前述のようにＴ４ＤＮＡ
リガー・ゼでライゲートした。これらのブロック （Ｉ
′〜■”）と未リン酸化オリゴヌクレオチド（Ａおよ
びＳＨ）を続いて縮合した。最終ライゲーション生成物
は分取用７．５％ＰＡＧＥで精製し、１６３ｂｐの合成
ｔｒｐプロモーター■遺伝子を得た。 大旌班上１ 合成ｔ ｒ ｐ フロモータ■遺伝子のクローニングニ
実施例１５で構築した合成ｔｒｐプロモークＨ遺伝子を
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲー
トし、次いでＥ、 ｃｏｌｉ ＩＩＢ １０１をライ
ゲーション生成物を用い形質転換させた。 ＲＡｍｐ、 ５Ｔｅｔ形質転換体から得たプラスミド
をｌ１ｐａ＋で消化してバンド（４，１ｋｂｐ）を確認
。 し、次いでＢａ ｍ ＨＩで消化しＰＡＧＥにて９０ｂ
ｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化による５６ｂｐの断片をＰＡＧＥにてサイズマー
カーと比較することにより、確認した。 このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクタ
ーの構築に用いた。 爽施炎上１ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクター（ｐＳｄＶ２−’３
２２Ｌｒｐ）の構築： 合成Ｌｒｐプロモーク■ヘクター（ｐＴｒｐＥＢ△ ７）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
により大きな断片（４，１ｋｂｐ）を得た。 この断片をプラスミドｐＳｄＶ２から製造した”Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１遺伝子とライゲートした。 このライゲーション混合物で旦、並置 ＨＢ １０１を
形質転換し、アンピシリン耐性でテトラサイクリン怒受
性の形質転換体を選択した。得られたプラスミドｐＳｄ
Ｖ２−３２２ Ｌ ｒｐをＥｃｏＲプラスミドｐＳｄＶ
２−３２２ ｔ ｒｐ中％ ９ ｙ ａｌ−ＩＧＦ−１
遺伝子および合成ｔｒｐプロモーク遺伝子の配列決定： △ マキサム−ギルバート法にょる５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１
ｉｆｆ伝子およびｔｒｐプロモーへ遺伝子の配列決定の
ため、プラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、大腸菌アルカリホスポターゼを用い３７゛
ｃで１時間処理した。 フェノール抽出およびエタノール沈澱後、プラスミドを
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ボリヌクレオクドキナ
ーゼを用い３７℃で１時間リン酸化し、最後にＨｉｎｆ
Ｉで消化し、２つの断片（Ｉｌｏｏｂ ｐ、 ４８
０ｂ ｐ）を得た。各断片はマクサム−ギルハート法に
従って配列決定した。得られた５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
および合成Ｌｒｐプロモーへ遺伝子の配列は設計したも
のと一致した。 情夫ｉ（？！１１９ 蛋白ペプチドＬＨ発現ヘクター（ｐＬＨｔｒｐ）の構築
： 実施例１６で製造した合成ｔｒｐプロモーター■ヘクタ
ー（ｐＴｒｐＥＢ？）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
し、分取用アガロースゲル電気法ｖＪにより大きな断片
（４，１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化によりプラスミドｐ Ｌ Ｈ１０７から調製
した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲ
ーション混合物を用い旦０匹旦 ＨＢＩＯＩを形質転換
させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン怒受性を
示す形質転換体を得た。 形質転換体から得たプラスミド （ｐＬＨｔｒｐ）をＥＣ０ＲＩとＢ ａ ｍ ＨＩで消
化し、７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨｉＪｌ転
子（２３６ｂｐ）を確認した。 実施例２０ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクターの構築：実施例４
（１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）を実施例
８に記載したようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化した。このリン酸化オリゴヌクレオチド、実施例
４ （２）で鋼製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）およ
び実施例１０で調製したプラスミドｐＳｄＶ２から調製
した５９Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂ ｐ
）を混合し、１００ｍＭＡＴＰを含有する溶液中でＴ４
リガーゼを用い４°Ｃで２３時間処理した。ライゲーシ
ョン混合物を分取用ＰＡＣ，Ｅで精製してリンカ−付き
５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝子（２４２ｂｐ）を得
た。この遺伝子を、Ｈ４ｎｄｌＵ−ＢａｍＨＩ消死によ
りｐＬ）（ｔｒｐから得た断片をライゲートし、ライゲ
ーション混合物を用いて基０皿ＨＢＩＯＩを形質転換さ
せた。プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ含有旦９匹旦 Ｈ
ＢＩＯＩを且、並置Ｆ−５と命名し、１９８４年５月２
８日に寄託番号ＦＥＲＭＡ−７６４４の下に、工業技術
院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町
東１丁目、郵便番号３０５）に寄託した。該寄託−はそ
の後１９８５年２月２８日に同所のブタペスト条約に基
づく国際寄託に変更されたく寄託番号ＦＥＲＭ、ｌ’Ｂ
Ｐ−７２８）。形質転換体から得たプラスミド（ｐＬＨ
３ｄＶｔｒｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ （１９８
，２２４ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ （１９Ｂ、
８５９ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌ （２４
２ｂｐ）およびＨｐａｌ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ
）で消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター
、蛋白ペプチドＬ Ｈお”Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１遺伝
子の発現ニブラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ含を互
。 ｃｏｌｉをアンピシリン２０μｇ ／ ｍ ｊ！金含有
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）およびビタミンＢ
＋５０．ｃ＋ｇ／ｍｆｆを含有するＭ９培地で、１：２
５の割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を加え
、最終濃度１０μｇ／ｍβとした。この時のＡ６゜。は
０．４であった。次に３時間培養し１、遠心分離（６ｋ
ｒｐｍ、、 ４℃、５分間）により菌体を集めた。菌
体は超音波処理により破壊し遠心分離により残層を取り
除いた。上清を３Ｍ酢酸と混合し、沈澱を遠心分離（２
０ｋｒｐｍ、 ４°Ｃ１１０分間）ＤＴＡおよび０．
５％ＢＳＡ）４ｍＪ！にＨｐ、 ｆ５し、０．ＩＮ Ｎ
ａＯＨ″？：ｐＨ７−８に調製した。不溶性物質を遠心
分離により除去した後、上清を定量を行うまで一２０℃
で保存した。 去鳳皿叢ユ ”Ｖａ Ｉ−ＩＣＦ−１のＲＩＡ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のＲＩＡは矢内原の方法に従って
行った。前記サンプルまたは標準サンプル（ＩＣＦ−１
７ラグメント（２６−４６））０．１ｍｌを、サンプル
緩衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ （ｐ ）１７．４）中０，５％Ｂ Ｓ
Ａ（０，４ｍ１）） 。 １’ＣＦ−１（２，６−４６）のウサギ抗血清（０，ｊ
ｍｐ）および”’Ｉ −Ｉ ＣＦ−１（２６−４６）（
０，１ｍＪ）と混合し、４°Ｃで４８時間放置した後、
ウサギ血清（０，１ｍｊり 、ウザギＴ−グロブリン抗
血？ｆｆ（０，１ｍ７りおよび５％Ｐ Ｅ Ｇ６０００
（０，９ｍ ｌ！ ）を加えた。さらに２時間４７Ｃ
で放置した後、ペレットを遠心分離（３ｋｒｐｍ、
４°Ｃ２３０分間）により集め、γ−カウシターにより
放射活性を測定した。 ５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの含量はこの放射活性から算出
した。 失腹桝１土 Ｅ、ｃｏｌｉＦ−５における蛋白ペプチドＬ）ｉ融合”
Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−５（プラスミド ｐＬＨ３ｄＶ
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、５０μｇ／ｍ７
！ビタミンＢ１および２５．ｃ＋ｇ／ｍ１アンピシリン
含有Ｍ−９培地に１＝２０の割合で希釈した。β−イン
ドールアクリル酸を加え最終濃度１０μｇ ／ ｍ ｊ
！とじた。この時のＡ６゜。は０．５であった。次に、
菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４℃、５
分間）により収集した。 尖舅炭１１ ターミネークーＳ遺伝子のクローニング：各オリゴヌク
レオチド（Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’およびＥ’）をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、実施例８に記載した
ようにＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲーション
混合物と二種のオリゴヌクレオチド（Ａ’およびＦ’）
とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲー
ション生成物を分取用ＰＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨ
Ｉ−３ａｌｌ消化によるｐＢＲ３２２の大きな断片と混
合した。混合物のライゲーションは、標準条件下におい
て７４ＤＮＡリガーゼを用い行った。ライゲーション混
合物を用いてクノシュナー法により、旦、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
をテトラサイクリンを含量するプレート上で選択した。 アンピシリンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す
クローンから分離したプラスミドＤＮＡをＡｖａ ｌで
消化させると断片８１７ｂｐが得られ、Ｂ ａ ｍ Ｈ
１−３ａ Ｉ Ｉで消化させるとターミネータ−遺伝子
（４７ｂｐ）が確認された。このプラスミドをｐ’ｌ”
ｅｒｓ２１と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 爽旌斑叉ｉ クーミネーターＬｉｆｉ転子のクローニング：各オリゴ
ヌクレオチド（Ｃ’、Ｄ’、Ｈ’、Ｉ’Ｊ’、に’、Ｌ
’およびＭ’）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化し、実施例８に記載したようにＴ４ＤＮＡリガーゼ
で処理した。ライゲーション混合物と二種のオリゴヌク
レオチド（Ｇ’およびＮ’）とをン昆合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで処理した。ライゲーション生成物を分取用Ｐ
ＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨＩ−３ａｌｌ消化による
ｐＢＲ３２２の大きな断片（４０８７ｂｐ）とを混合し
た。混合物のライゲーションは、標準条件下においてＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いてクノシュナー法により、Ｅ、
ｃｏｌｔ ＨＢ １０１を形質転換し、アンピシリ
ン耐性形質転換体をテトラサイクリンを含有するプレー
ト上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラサイクリ
ンに感受性を示すクローンから分離したプラスミドＤＮ
ＡをＡＶａ■で消化すると０．８％アガロースゲル電気
泳動および７．５％ＰＡＧＥにて断片３．３２ｋｂｐお
よび８３９ｂｐを示ず。このターミネータ−し遺伝子を
含有するプラスミドをｐＴｅｒＬど命名し、発現ベクタ
ーの構築に使用した。 爽施班１１ ターミネータ−３遺伝子含有”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ベクターの構築： ターミネータ−３遺伝子を含有するｐＴｅｒＳ２１をＰ
ｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロースゲル電
気泳動により大きな断片（３００５ｂｐ）を得た。遺伝
子（３，０５ｂｐ）をＢａｍＨｌ−Ｐｓｔｌ消化により
ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（１２８１ｂｐ
）で標準条件下においてライゲートし、次いでライゲー
ション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形
質転換させた。形質転換で得たアンピシリンに耐性のプ
ラスミド（りＬＨ３ｄＶｔｒｐＳ）をＰｓむｌ−５ａｌ
ｌ （１３３１，２９５８’ｂｐ）およびＨｉｎｄｌ
［［−３ａ Ｉ Ｉ （２８９ｂｐ）で消化し、７．
５％ＰＡＧＥにてターミネータ−３ｉｆｔ伝子を確認し
た。 入施玉１盈 ターミネータ−し遺伝子含有”９Ｖａｌ−ＩＯＦ−１発
現ベクターの構築： クーミネーターＬｉｄ転子を含有するプラスミドｐＴｅ
ｒｌ、をＰｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により大きな断片（３０２７ｂｐ）を
得た。遺伝子（３０２７ｂｐ）をＥ３ａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ｌ消化によりｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（
１２１３１ｂｐ）で標準条件においてライゲートし、次
いでライゲーション混合物を用いてＥ、 ｃｏｌｉ
ＨＢ １０１を形質転換させた。形質転換で得たアンピ
シリンに耐性のプラスミド（ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ）をＰ
ｓｔｌ−３ａｌｌ （１３５３，２９５８ｂｐ）および
１（ｉｎｄｌｌ＋−５ａ１１ （３１１ｂｐ）で消化
し、７．５％ＰＡＧＥにてターミネータ−し遺伝子を確
認した。 叉並■又工 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
発現ベクター（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の構築： シャロン２５フアージＤＮＡ （今井博士供与）をＥｃ
ｏＲＩで消化し４個の断片（１９，９，１０゜７．６．
６および５．７ ｋ ｂ り ）を得た。ラクトースプ
ロモーター、オペレーターおよびＺ遺伝子の大半を含有
する断片（６，６ｋｂｐ）を分取用アガロースゲル電気
泳動により回収した。一方、ｐＳｄＶ２をＥｃｏＲＩで
消化し、次いで大腸菌アルカリホスホターゼ（Ｂ Ａ
Ｐ）で処理した。線状プラスミドを、Ｔ４リガーゼの存
在下に４℃で、前記プロモーター遺伝子（６，６ｋｂｐ
）と等モルでライゲートした。このライゲーション混合
物による旦０匹旦 ＨＢ １０１の形質転換体を、アン
ピシリン耐性菌として、５−プロモー４−クロローイン
ドリルガクトシド（Ｘｇａｌ）培地上で選択した。この
インジケータープレート上では、リプレッサーを滴定す
るｌａｃオペレーターの数の増加によるβ−ガラクトシ
ダーゼが合成されたコロニーがその青い色で識別される
。約１３％のコロニーが青く、テトラサイクリン惑受性
を示した。４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＢ
ａｍＨｌおよびＩＩ ｉ ｎ ｄ ｉｌｌで消化した。 ４プラスミド中１プラスミドが目的とした正しいプロモ
ーター遺伝子を存しているが、他のプラスミドは逆方向
に挿入されていた。得られたプラスミドｐｓｄＶ２−１
ａｃｆｃＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩでン肖化し、７，５％
ＰＡＧＥにて５９Ｖａ、Ｉ−ＩＣＦ−１遺伝子（２２４
ｂｐ）をｌｉｖｔｇした。プラスミドを含有する旦。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｅ
（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の発現ニブラスミドｐＳｄ
Ｖ２−１ａｃ含有Ｅ、 ｃｏｌｉＨ’Ｂ １０１をアン
ピシリン２０μｇ／ｍｊ！含有Ｉ７ブロース中で一晩培
養し、Ｌブロース中（３００ｍ ｊ！ ）で希釈し、次
いで３７°Ｃで培養した。Ａ６゜。 が０．８の時、イソプロピルチオガラクトシド（■ＰＴ
Ｇ）を加え最終濃度０．１ｍＭとした。さらに２時間培
養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４°Ｃ１５分間）により
菌体を集め、菌体をＢｒＣＮ（１０ｍｇ’／ｍｅ）含有
の７０％ギ酸に懸濁した。混合物を室温で２時間放置し
５、溶媒を真空中で蒸発した。不溶性物質を遠心分離に
より除去した後、上清を定量を行うまで一２０°Ｃで保
存した。 叉盗±主上 β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−れたｐ
ＮＴ４９は、ｐｔ、プロモーター、トリプトファン（ｔ
ｒｐＡ）およびラクトース構造遺伝子を含有するプラス
ミドである。このプラスミドｐＮＴ４９を１３ ａ ｍ
ｌ（１で消化し、次いでＥｃｏＲＩで部分的に消化し、
分収用アガロースゲル電気泳動により約１１ｋｂｐの断
片を回収した。この断片を前記で得た５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１遺伝子（２２４ｂｐ）でライゲートし、ライゲー
ション混合物を用いＥ、 ｃｏｌｉ ＭＭ ２９４を
形質転換しアンピシリン耐性形質転換体を得た。この形
質転換体の一つから得られるプラスミドをＥｃｏＲＩと
Ｂａ ｍ ＨＩで消化し５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子
（２２４ｂｐ）の存在を確認した。 一方、レシピアント菌体旦、 ｃｏｌｔ ＨＩ ２０
１゛−実鳩、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−（１９７２）参照）をｐｓｃｌ
ｏｌに０１８５７遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴ２
０４ （このプラスミド（ｐ ＮＴ ２０４）は今井博
士により提供）により形質転換し、テトラサイクリン耐
性形質転換体を得た。レシピエンドＥ、 ｃｏｌｉ
ＩＩ １２０１９／Ｉ）ＮＴ２０４を上記プラスミドｐ
ＳｄＶ２−ＮＴ４９で形質転換し、アンピシリンおよび
テトラサイクリンに耐性％ＰＡＧＥにより”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１遺伝子（２２４ｂｐ）の存在を確認した。ｐＳ
ｄＶ２−ＮＴ４９含有旦、 ｃｏｌｉ ＨＩ ２０１
９／ｐＮＴ２β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐｓｄＶ２
−ＪＩＴ４９）融合５９Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −Ｉの
発現：（アンピシリン（２５μｇ／ｍｊりおよびテトラ
サイクリン（２５μｇ／ｍｊりを３０°ＣでＬＰブロー
ス〔Ｌブロース＋０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液＋１％
グルコース） （１００ｍｊりに希釈した〕（５ｍｌ
）中で一晩培養した。培養物は３０℃でＡも。。＝ ０
．５−０．６となるまで発育させ、次いで４２°Ｃに移
した。更に４２°Ｃで３時間培養した後、菌体を集め、
ＢｒＣＮ （１０ｍｇ／ｍＡ）含有７０％ギ酸で懸濁し
、室温で２４時間放置した。 溶媒を減圧下に留去し、残渣を３Ｍ酢酸（３ｍｊ２）に
懸濁した。混合物を一晩室温で放置し、滅菌水で３倍に
希釈した。不溶性物質を遠心分離により除去し、上清を
凍結乾燥して分析するまで一２０℃で保存した。 実施■ユニ ５９Ｖａｌ −ＩＧＦ−１の分離および精製＋１１
融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分離および精製温潤細胞ペ
ースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−Ｅ Ｄ Ｔ Ａ
（ｐ Ｈ８，０） １５０ｍ ＩｌにｒＵ、ｆ５し、菌
体を超音波処理により破壊した。菌体残層を１８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化した。得られ
たペレットを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（ｐ Ｈ
８，０）／８Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトール（５
０ｍ６）に溶かし、３５．００Ｏｒｐｍ、 ２５°Ｃで
３０分間遠心分離した。上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ！（ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０．ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリル
３３００ス−バーファインカラム（５，，０Ｘ８６．６
ｃｍ、 １７００ｍｊ！樹脂）にかけた。溶出は４℃で
平衡緩衝液を用い、流速０．６ｍ ｊ！ ／分で行った
。画分１１ｍｊ！を集めた。セファクリル５３００クロ
マトグラフイを行った。定量は全クロマトグラフィ段階
について両分後直ちに行った。活性画分を集め、合わせ
た画分２０４ｍｊｌ！を１Ｍ酢酸水溶液８７！を用い室
温で３時間透析し、次いで新たに１Ｍ酢酸水溶液８７！
を用い一晩透析した。透析画分は凍結乾燥し、所望の成
分を含有する融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１２４ｏｍｇを得
た。 （２ン 臭化シアンによる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１か
らの蛋白ペプチドＬＨの脱離 操作（１２により得た融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１（２４
０ｍｇ）を８０％ギ酸１２ｍｊ＋に溶解した。 臭化シアン（２４０ｍｇ）を加え、２５℃以下で一晩攪
拌下に反応させた。蒸留水１０８ｍｆを加えた後、ギ酸
および臭化シアンを凍結乾燥により除去した。残渣をＩ
Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｉ ＣＩｌ （ｐ１１８．０）／８
Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール６ｍｌに溶
かした。この溶液を２５°Ｃで４時間攪拌し、０．０１
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，６）／８Ｍ尿素−５０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（パンファーＡ）１５０ｒ
ｒ＋ｊ！を用い室温で２時間、２回透析した。 透析溶液はバッファ−Ａで午後ｉ化したカチオン交換樹
脂ＣＭ５２カラム（１，６Ｘ１５．ｏｃ＋ｎ３０ｍ Ｒ
樹脂）にかけた。カラムはバッファーＡ （６０ｍ １
２ ） ヲ用い、室温にて流速０．５ｍ １２／分で洗
浄し、バッファ Ａ（２５０ｍｆ）から０，２Ｍ酢酸
アンモニウム／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール（２５０ｍＡ）までの直線勾配で溶出した６両分
２．７５ｍｊ！を集めた。陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを行った。活性画分を集め、プールした両分を１Ｍ
酢酸水溶液−１０ｍＭ２−メルカプトエタノール４１を
用い室温で４時間、２回透析した。 （３） 高速液体クロマトグラフィ：操作（２）によ
り得たラジオイムノ活性含有透析画分を用いた。 カラム二へツクマンウルトラポアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７
５鶴） 流速：１ｍＩ！、／分 溶 出： Ｏ，ＯＩＭ Ｉ−リフルオロ酢酸中１０％か
ら６０邪までのアセトニトリルの直 線勾配；５０分間 操作は３０回繰返して還元型”Ｖａｌ−ＩＣＦ−■含有
画分を集めた。保持時間２１３．１１８分の主ピークは
還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に相当する。 前述の操作により還元型”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −１
が収率８０％（約７ ｍ ｇ”）で得られた。 この還元型”Ｖａ Ｉ −ＩＧＦ−Ｅは通常の再生（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ）法により酸化型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−■に変えた。 大狙班１↓ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳによる蛋白ペプチドＬ
Ｈ融合”Ｖ、１ｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発
現ニ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐｓ含有旦１匹旦ＨＢＩＯ
Ｉをβ−インドールアクリル酸誘導の条件下で実施例２
４と同様の方法により培養した。 集めた菌体を融解し、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を実施
例３３ （１）に記載のように分離した。融合５９Ｖｉ
ｌ−ＩＧＦ−１を臭化シアンで処理し、粗”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１を実施例３３（２）に記載のように精製し、純
粋な”Ｖａ Ｉ −Ｉ ＧＦ −１を得た。 去旌■ユ盈 プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＬによる蛋白ペプチｌ−
″ＬＨ融合５９Ｖａ Ｉ −ＩＣＦ−１をコードする遺
伝子の発現ニ プラスミドｐＬ ＨＳ ｄ Ｖ ｔ ｒ ｐ Ｌを用イ
ル５９ｖａｌ−ＩＣＦ−１の発現は実施例２４と同様の
方法で行った。 尖施狙ユニ 還元型”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分析： （１）アミノ酸組成 実施例に３３により調製した物質はウォーターズ社製ア
ミノ酸分析システムを用い分析した。物質のＳ Ｈ基は
文献記載の方法によりカルボキシメデル（ＣＩｔ ｚ
ＣＯＯＨ） Ｍ （ｆｕｎｃＬｉｏｎ）で保護した。 アミノ酸残基の計算は本明細書に示したＤＮＡ配列デー
タに基づき７０と標準に合わせた。 （２１”Ｖａ １−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列分析：こ
のペプチドのＮｌｈ末端のアミノ酸配列はエドマン法Ｃ
ＤＩＢＩＴＣ法）（Ｊ、Ｙ、Ｃｈａｎｇら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 Ｊ、、１５３． ６０７ （１９７６）
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｔｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ
、＋ ５１８． １８８（１９７９））によりベック
マン配列モデル８９ブチダーゼ消化法により決定した。 Ｑ”ｙ＋ｌ’Ｖ、＄＝’ｆＣ，Ｑ ”’Ａ Ｉ−Ｘ（（
Ｆ−１，ｆ） Ｔ 、” ／ １１憧ψ艮 還元型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸組成（値はモ
ル％） アミノ酸 残基数／分子 近似整数 予測値ＣＭ−Ｃｙ
ｓ ５．６ ６ ６Ａｓｐ
５．２ ５ ５Ｔｈｒ
２．６ ３ ３Ｓｅｒ ４
、９ ５ ５Ｇｌｕ ５
、９ ６ ６ＰｆＯ５，４５５ Ｇｌｙ ７ 、４ ７ ７Ａ
ｌａ ５ 、６ ６ ６Ｖａ
ｌ ３．７ ４ ４Ｍｅヒ
Ｑ Ｑ Ｏ工ｌｅ
ｏ、ｓ １ １Ｌｅｕ
５ 、１ ５ ６ＴＹｒ
２．５ ３ ３Ｐｈｅ ３
、６ ４ ４Ｌｙｓ ３．
２ ３ ３Ａｒｇ ８．４
Ｂ ６（３）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ Ａ
Ｇ Ｅ）はスワンクおよびムンクレスの方法に従って
行った。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＰＡＣ；Ｅで約５０００ダルト
ンの位置に単一バンドを示した。〔天然ＩＣＦ−１は文
献（Ｒ，Ｅ、 Ｈｕｍｂｅｌ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、＋ Ｕ Ｓ Ａ、工３，
２３６５−２３６９ （１９７６））＆ではＰ Ａ Ｇ
Ｅ、テ約５０００ダルトンの位置にバンドを示す。〕 貞晦 ２ 図 ５９Ｖａｔ−ＩＧＦ−Ｉ潰イ訃のり０−
二）グ↓ シ吾善ヒ単鮪 ρ５ｄＶ２ 第３ 図 合戊廿Ｐアロ針外 ■遣イ立子の構築合成１
１７６口モーター １潰イ云＋ 納４図 合成ｔｒｐ ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲ１ 合成ｔヒＰアロモーターエ遣４ム÷ アＯモーター ｘ４イ云＋のクローニ）り゛。 ＰＳＴ−１、 ＳＴ−１ ！８ 図 蛋白ペア子ドＬＨｉｉイ云＋のりＯ−二ン
ク°。 １１ヒ卑潰准 ρＬＭ １０７ ｉ自公プ子ドＬＨ遣イ云千 ＠９ 図 絹娘アラス汁ｐｓｄＶ２廿ρの＄葺堵ｐＳｄ
Ｖ２ｔ ｒρ 肖−１２図 Ｓｌａ換′ｚＶ°ラスミＦ ｐＬＨ５ｄ
Ｖｔｒｐ Ｏ＠９ｐＬＨ９ＪＶｔｒｐ’Ｌ’Ｊ有’Ｉ
’＋ Ｌ α市）−ＩＢ１０１１焙普ヒ草劃伽 ｐＬＨ５ｄＶｔｒＰ ？ １３１Ｄ ター三ネイターＳ潰イ立子の構
繁ター三ネイターＳ遣イ２４＋ 第１４図 ツーミネイターＬｉｌ私÷の構替−Σ＝
ニピー エ Ｊ二 Ｊ吐！ターミネ
イターＬ １１六子 図 組換え７゛ラスミドρＬＨ５ｄＶｔｒρＳのＩｌ絆
に づ Ｐｓｔｌ Ｅ’ ！ １６ 図 糸且廃えプラスミド予ＬＨｄｓＶｔ
ｒρＬのゎ１験５ｊ １７ ［ｉ８ 組をトえ）
“ラスミド ρ５ｄＶ２−１ａｃの末島）誼ＰＳｄＶ２
−１ａ（ｔｉ：ｌＡｑる旦９λし、ＨＢ １０１Ｊ ｔ
ｐ４ビ単鮪 ｐｓｄＶ２−ｔａｃ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９バリ
ンインスリン様成長因子Ｉ（以下＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉと略称する）： 【アミノ酸配列があります】 ２、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−インスリン様成長因子Ｉ（以下＾５＾９Ｖａｌ−Ｉ
ＧＦ−Ｉと略称する）の製造法であって、 【アミノ酸配列があります】 （ａ）＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする
合成の＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と該＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、それに隣接して存
在し、構造遺伝子を有さず、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
Ｉ遺伝子の発現をコントロールするプロモーター遺伝子
とを包含するプラスミドを自身の中に含有する生物を培
養すること、および、 （ｂ）培養液から＾５＾９Ｖａ ｌ−ＩＧＦ−Ｉを回収すること を包含することを特徴とする該方法。 ３、（ａ）宿主生物がエシェリキア・コリ（￥Ｅｓｃｈ
ｅ￥−￥ｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥）であり、（ｂ
）＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子が次の配列を包含
し、 コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】そして、 （ｃ）プロモーター遺伝子が次の配列を包含する 【遺伝子配列があります】 ものである特許請求の範囲第２項記載の方 法。 ４、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成遺 伝子またはそのサブユニット： 【遺伝子配列があります】 ５、遺伝子が次の配列またはそのサブユニットを包含す
るところの特許請求の範囲第４項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】６、遺伝子
が次の配列またはそのサブユニットを包含するところの
特許請求の範囲第４〜５項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】７、いくつ
かの数のオリゴヌクレオチドブロックのハイブリッド化
とライゲーションを包含することを特徴とする特許請求
の範囲第４〜６項のいずれかに記載の合成遺伝子の製造
法。 ８、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする合成の＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有するプラスミド： 【アミノ酸配列があります】 ９、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする合成の＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を包含するプラスミドを自身の中
に含有することを特徴とする生物： 【アミノ酸配列があります】 １０、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成の ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの上流にそれに隣接して存在し、構造遺
伝子を有さず＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現
をコントロールするプロモーター遺伝子とを包含してい
ることを特徴とする ＾５＾９ＶａＩ−ＩＣＦ−Ｉ発現プラスミド：【遺伝子
配列があります】 １１、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成の ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にそれに隣接して存在し、
構造遺伝子を有さず、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝
子の発現をコントロールするプロモーター遺伝子とを包
含しているプラスミドを自身の中に含有することを特徴
とする生物： 【遺伝子配列があります】 １２、次の配列を含むところの、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子の発現をコントロールする合成のプロモー
ター遺伝子： 【遺伝子配列があります】 １３、いくつかの数のオリゴヌクレオチドブロックのハ
イブリッド化およびライゲーションを包含することを特
徴とする特許請求の範囲第１２項記載の合成遺伝子の製
造法。 １４、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミド： 【遺伝子配列があります】 １５、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミドを自身の中に含有することを特徴と
する生物： 【遺伝子配列があります】 １６、特許請求の範囲第４〜６項記載の＾５＾９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と特許請求の範囲第１２項記載のプ
ロモーター遺伝子とを適当なプラスミド中へ挿入するこ
とを含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１０項記
載の＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドの製造
法。 １７、適当な生物を特許請求の範囲第１０項記載の＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドで形質転換する
ことを含むことを特徴とする＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
Ｉ生産性生物の製造法。 １８、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉを脱離反応に付すことを特徴とする＾５＾９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−Ｉの製造法。 １９、ｉ）保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該メチオニンを介して ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉと融合しており、ｉｉ）脱
離反応は臭化シアンを用いて行われるところの、特許請
求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉ。 ２１、保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオニン
を有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチドの該
メチオニンを介して＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉと融合
しているところの、特許請求の範囲第２０項記載の保護
ペプチド融合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ。 ２２、次のアミノ酸配列をもつ蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉであるところの、特許請求の範囲第２１項記載
の保護ペプチド融合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ： 【遺伝子配列があります】 ２３、次のアミノ酸配列をもつβ−ガラクトシダーゼ融
合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉであるところの、特許請
求の範囲第２１項記載の保護ペプチド融合＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ： 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 ２４、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉをコードする遺伝子。 ２５、保護ペプチドをコードする遺伝子を＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子に、該 ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子がその下流にターミ
ネーターを有していてももしくは有していなくても該＾
５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、リンカーを
用いて連結することを特徴とする保護ペプチド融合＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の製造法。 ２６、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子とを含有する発
現ベクター。 ２７、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子とをプラスミド
に挿入することを特徴とする発現ベクターの製造法。 ２８、特許請求の範囲第２６項で定義した通りの発現ベ
クターを含有する形質転換体。 ２９、特許請求の範囲第２８項で定義した通りの発現ベ
クターで宿主生物を形質転換することを特徴とする形質
転換体の製造法。 ３０、特許請求の範囲第２８項で定義した通りの形質転
換体を培養することを特徴とする保護ペプチド融合＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの製造法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8408473 | 1984-04-02 | ||
| GB8408473A GB8408473D0 (en) | 1984-04-02 | 1984-04-02 | 59 val-insulin-like growth factor i |
| GB8413989 | 1984-06-01 | ||
| GB8424157 | 1984-09-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611397A true JPS611397A (ja) | 1986-01-07 |
Family
ID=10559045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60069630A Pending JPS611397A (ja) | 1984-04-02 | 1985-04-01 | ５９バリンインスリン様成長因子１およびその製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611397A (ja) |
| GB (1) | GB8408473D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012533622A (ja) * | 2009-07-22 | 2012-12-27 | イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ | ５９位にアミノ酸置換を有するインスリン様増殖因子−１（ｉｇｆ−１）の類似体 |
-
1984
- 1984-04-02 GB GB8408473A patent/GB8408473D0/en active Pending
-
1985
- 1985-04-01 JP JP60069630A patent/JPS611397A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012533622A (ja) * | 2009-07-22 | 2012-12-27 | イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ | ５９位にアミノ酸置換を有するインスリン様増殖因子−１（ｉｇｆ−１）の類似体 |
| JP2014169309A (ja) * | 2009-07-22 | 2014-09-18 | Ipsen Pharma Sas | ５９位にアミノ酸置換を有するインスリン様増殖因子−１（ｉｇｆ−１）の類似体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8408473D0 (en) | 1984-05-10 |
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