JPS6117467B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は安定なウレアーゼ組成物に関するもの
である。 古くから知られ、又、数多く使用されているウ
レアーゼは現在、臨床検査の分野で益々、その需
要が増すとともに、高度の精製品が必要となつて
来た。しかしながら、高度に精製されたウレアー
ゼは頗る不安定で、種々の安定化の試みが行われ
ている。その試みの一つとして、チオール化合
物、例えばシステイン、メルカプトエタノールな
どを加えること、あるいはEDTA、マレイン酸、
クエン酸塩などを添加することが行なわれてき
た。しかし、これらの化合物をそれぞれ単独で添
加しても満足すべき結果が得られなかつた。また
安定剤としてグルタチオン、EDTA及びクエン酸
塩の混合物を含有する調整物（特開昭52−117488
号公報）などが検討されているが、十分な効果は
発揮されていない。 本発明者らはこのような事情を考慮し、さらに
安定なウレアーゼを得るために種々鋭意研究した
結果、チオール化合物、キレート試薬および二塩
基酸またはその塩の混合物を添加すると、従来の
安定化法に比べて著しく安定化されることを見出
し、本発明に到達した。すなわち本発明はウレア
ーゼ、チオール化合物、キレート試薬および有機
二塩基酸またはその塩の混合物を含有することを
特徴とする安定なウレアーゼ組成物である。 本発明では単独で用いられた個々の安定剤に比
べ、著しく安定化されるばかりでなく、またクエ
ン酸などの三塩基酸などの混合物を用いる方法
（特開昭51−117488号）に比べて、明らかに安定
化効果が優れる。また、得られる酵素粉末の吸湿
性においても三塩基酸を加える方法に比べて、明
らかに優れる。さらに本発明では高価なグルタチ
オンなどの添加量を低く抑え、安定性のよい酵素
粉末が得られるばかりでなく、吸湿性の少ない標
品となり、高純度な酵素製剤が得られる。 本発明におけるウレアーゼとはウレアーゼ溶液
又はウレアーゼ粉末であり、例えば豆類を細砕、
粉砕し、粗酵素液を抽出し、硫安などによる塩
析、有機溶媒などによる溶媒沈澱、イオン交換体
を用いる吸着分画又はゲル過などの方法により
得られた溶液又はその減圧乾燥粉末、凍結乾燥粉
末などがある。 本発明に用いるチオール化合物とは、グルタチ
オン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトー
ル、システイン、メルカプトエタノールなどのチ
オール基を有する還元性物質をいう。特にグルタ
チオン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリト
ールが好ましい。 本発明に用いるキレート試薬とは、例えばエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）及びその塩、ニト
リロ三酢酸及びその塩、シクロヘキサンジアミン
四酢酸及びその塩など広く一般に用いられている
化合物をいう。特にEDTA、ニトリロ三酢酸が好
ましい。 本発明に用いる有機二塩基酸及びその塩とはシ
ユウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸などの
飽和ジカルボン酸及びその塩、リンゴ酸、酒石
酸、イソ酒石酸などのヒドロキシジカルボン酸及
びその塩、マイレン酸、フマル酸、イタコン酸、
グルタコン酸などの不飽和ジカルボン酸及びその
塩などをいう。特にシユウ酸、リンゴ酸、フマル
酸が好ましい。塩としてはアルカリ金属塩、アル
カリ土類金属塩がある。 本発明ではウレアーゼ1.0重量部に、チオール
化合物0.0001〜0.5重量部、キレート化合物0.01〜
5.0重量部、および有機二塩基酸及びその塩0.01
〜100重量部を添加する。特にチオール化合物は
ウレアーゼ1.0重量部に対し、0.02〜0.05重量部が
好ましく、キレート化合物はウレアーゼ1.0重量
部に対し、0.1〜1.0重量部が好ましく、有機二塩
基酸及びその塩はウレアーゼ1.0重量部に対して
0.2〜50重量部が好ましい。 本発明の安定剤、チオール化合物、キレート化
合物および有機二塩基酸及びその塩に加えて、血
清アルブミン、特に牛血清アルブミン（BSA）
を加えると、ウレアーゼの安定化は一段と向上す
る。血清アルブミンの添加量はウレアーゼ1.0重
量部に対し、０〜10重量部、特に0.5〜５重量部
であることが好ましい。 本発明において、ウレアーゼに安定剤を添加す
る方法は特に制限はないが、例えばウレアーゼ溶
液にEDTAを溶解し、PHを7.5に調整した後、グ
ルタチオンを添加し溶解し、さらに二塩基酸又は
その塩および必要により牛血清アルブミンを添加
し溶解して、再びPHを7.5に調整し、得られた液
を凍結乾燥する方法がある。 次に本発明を実施例により説明する。 なお、ウレアーゼ活性測定法はインドフエノー
ル法を用い、0.1M尿素溶液（PH7.0）に30℃にお
いて５分間酵素を作用させた時、５分間当り１mg
のアンモニア態窒素を遊離する酵素力を１単位と
した。 インドフエノール法とは下記試薬を用い、下記
操作により行う方法である。 試 薬 フエノール試薬溶液：フエノール10.0ｇ、ニト
ロプルシドナトリウム50mg／500ml 次亜塩素酸アルカリ溶液：水酸化ナトリウム５
ｇ、次亜塩素酸ナトリウム2.5ml／500ml 0.1M尿素基質溶液：尿素3.0ｇ／0.01Mリン酸
緩衝液（PH）500ml 酵素希釈溶液：0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
にウレアーゼ酵素粉末を希釈する。 操 作 尿素基質溶液２mlを試験管にとり、30℃で５分
間置き、温度が一定になつたところで酵素希釈溶
液を0.5ml添加し反応を開始する。30℃で15分間
反応させた後、フエノール試薬溶液1.0ml、次亜
塩素酸アルカリ溶液1.0mlを加える。30℃で30分
間放置後、吸光度530nmにて測定する。対照は酵
素希釈溶液を、次亜塩素酸アルカリ溶液を加えた
のち、添加したものを使用する。 実施例 １ ウレアーゼ400単位／ml（蛋白含量10mg／ml）
にグルタチオン1mM、EDTA10mMおよび第１表
に示される有機酸20mMを添加して、組成物を調
製し、凍結乾燥した後、50℃におけるウレアーゼ
の残存活性を測定した。その結果を第１表に示
す。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様にして、下記のような組成物を
調整し、凍結乾燥した後、50℃におけるウレアー
ゼ活性の残存性を測定した。その結果を第２表に
示す。 ウレアーゼ 400単位／ml（蛋白含量10mg／ml） グルタチオン 1mM EDTA 10mM BSA ５mg／ml 各有機酸 20mM

【表】 実施例 ３ 実施例２にて調整した酵素粉末100mgを温度25
℃、湿度70％の状態における吸湿速度を検討し
た。吸湿速度は経時的な重量の増加により測定し
た。結果は第３表に示した。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウレアーゼ、チオール化合物、キレート試薬
   および有機二塩基酸またはその塩を含有すること
   を特徴とする安定なウレアーゼ組成物。 ２ ウレアーゼ、チオール化合物、キレート試
   薬、血清アルブミンおよび有機二塩基酸またはそ
   の塩を含有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の安定なウレアーゼ組成物。