JPH0149299B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ａ 産業上の利用分野 本発明は、側鎖に多数のカルボキシル基（又は
その塩）を有すると共に、主鎖の片末端にチオー
ル基を含む活性基を有する、反応性に富んだ重合
体の製造法に関する。そして、本発明の目的とす
るところは、腫瘍細胞等の標的物に結合能を有す
る抗腫瘍抗体等と、制ガン剤等の細胞毒物を結合
して標的指向型制ガン剤（抗腫瘍剤）等を製造す
るに際し、両者を有効かつ効率良く結合させるた
めに用いることができる重合体を提供することに
ある。 ｂ 従来技術 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにｐ−
ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フエニル
アラニン等を結合した複合体（特開昭51−61640
号）、免疫グロブリンにメトトレキセート等を結
合した複合体（特開昭56−65829号）、免疫グロブ
リンにクロラムブシル等を結合した複合体（特開
昭56−65829号）、免疫グロブリンにマイトマイシ
ン−Ｃ等を結合した複合体（特開昭55−92325
号）、免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体（特開昭51−144723号）等が公知であ
る。 更に、特開昭51−126281号には、抗腫瘍免疫グ
ロブリンと、１分子当り制ガン剤を５〜500分子
共有結合している重合体担体（例えば、ポリダル
タミン酸）を、アミド結合によつて結合させて抗
腫瘍剤を得たことが開示されている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、腫
瘍細胞と選択的に結合した腫瘍細胞に毒性を発揮
することが期待されるものであり、非常に興味の
ある薬剤である。しかしながら細胞毒性物質を直
接免疫グロブリンに結合する場合は、免疫グロブ
リンに多数の細胞毒性物質を結合すると、免疫グ
ロブリンの抗原認識活性が低下してしまうので、
かゝる困難を回避するためには、少数の細胞毒性
物質を結合するにとどめざるをえない。 一方、重合体を細胞毒性物質の担体として用い
る場合は、上記の難点を改善することができると
考えられる。しかし、特開昭51−126281号記載の
方法は、重合体担体に多数の細胞毒性物質を結合
する反応と、重合体−制ガン剤結合体に免疫グロ
ブリンを結合する反応が同一な反応のため、多数
の免疫グロブリンが重合体担体に結合してしま
い、そのため得られる複合体が均一なものとなり
得ないのみならず、治療剤として用いるのが不適
当な高分子量物質も含む、といつた問題を生じる
のである。 ｃ 発明の目的 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行つた結果、免疫グロブリンとの
結合反応に供する反応基を１コだけ含有し、か
つ、それとは異なる、細胞毒性物質を結合するた
めの、反応基を多数含む重合体担体を用意し、先
ず多数の反応基によつて多数の細胞毒性物質を該
重合体担体に結合した後に、免疫グロブリンとの
反応基によつて免疫グロブリンと結合する、とい
う手順を踏むことによれば、治療剤として用いる
のが不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の
細胞毒性物質を結合した免疫グロブリン−細胞毒
性物質複合体を製造し得ることを見い出した。そ
して本発明は、かかる抗腫瘍剤あるいは又その他
の標的指向型薬剤を製造する際に最適に使用でき
る、反応性重合体を提供するものである。 ｄ 発明の構成及び作用 本発明は構成単位の60モル％以上が式〔〕で
表わされる構成単位からなり、 〔式〔〕において、Ｚは水素原子又は１価の
陽イオンを表わす。ｍは１−４の整数を表わす。〕 式［］の構成単位が100モル％でないとき、
残りの構成単位は式［′］ 〔式［′］において、Ｒは−Ｈ，−CH₃，

【式】または−CH₂OHで表わされ る基である。〕 で表わされる構成単位からなり、そして主鎖のア
ミノ末端に式［−ａ］で表わされる活性基を有
している、 〔式−ａ］において、Ｗは炭素数１〜４のア
ルキレン基を表わす。 重合度が５〜3000の反応性重合体の製造法であ
る。 本発明の反応重合体は、側鎖に存在する多数の
カルボキシル基（又はその塩）を利用して、これ
に制ガン剤等の細胞毒物を結合することが出来、
また主鎖の片末端に存在する活性基を利用して、
これに抗腫瘍抗体等の免疫グロブリンを結合する
ことが出来るものである。 式〔〕において、Ｚは水素原子又は１価の陽
イオン、例えばNa⁺，K⁺，NH₄ ⁺である。ｍは１
〜４の整数を表わすが、好ましいのはｍが１又は
２の場合である。なお、本発明の反応性重合体中
には、式〔〕で表わされる構成単位のうち、例
えばｍ＝１のものとｍ＝２のものが混在していて
も良い。これらが合計で、全構成単位のうちの60
モル％以上、好ましくは80モル％以上あればよい
のである。 本発明の反応性重合体中には、全構成単位の40
モル％未満の範囲で、式〔〕で表わされる構成
単位以外の構成単位が含まれていてもよい。これ
らの例としては、例えばα位側鎖にカルボキシル
基（又はその塩）を有しないグリシン、アラニ
ン、フエニルアラニン、セリン等のα−アミノ酸
がある。 かかるα−アミノ酸からなる構成単位は、細胞
毒物との結合には何ら関与しないが、反応性重合
体の水溶性や細胞毒物を結合して得られた重合体
の脂溶性や水溶性を調節するのに役立つ場合があ
る。従つて、脂溶性や水溶性の調節が格別に必要
ない場合には、かかるα−アミノ酸からなる構成
単位を含有しないものの方が実用的に有利であ
る。 式〔〕において、Ｘは水素原子又は隣りの硫
黄原子と共に活性ジスルフイド結合を形成しうる
基を表わすが、後者としては、例えば２−ビリジ
ルチオ基

【式】４−ピリジルチオ基

【式】３−カルボキシ−４−ニトロ フエニルチオ基

【式】４−カル ボキシ−２−ピリジルチオ基

【式】Ｎ−オキシ−２−ピ リジルチオ基

【式】２−ニトロフエ ニルチオ基

【式】４−ニトロ−２− ピリジルチオ基

【式】２−ベン ゾチアゾイルチオ基

【式】２− ベンゾイミダゾイルチオ基

【式】及びＮ−フエニルアミノ −N′−フエニルイミノメチルチオ基

【式】がある。 式〔〕においてＷは２価の有機基を表わし、
本発明の反応性重合体を得る過程及びその後の反
応過程で何ら反応に関与しない不活性な基である
限り特に限定されない。これらの基としては、例
えば、２−アミノプロピオン酸残基（−CH₂CH₂
−）の如き直鎖の、あるいはＮ−ペンゾイルシス
テイン残基

【式】やＮ−アチル ホモシステイン残基

【式】やメル カプトコハク酸残基

【式】の如き側 鎖置換基を有するアルキレン基、４−メルカプト
安息香酸残基

【式】の如き置換基を有 しない、あるいは置換基を有するフエニレン基が
挙げられるが、炭素数１〜４のアルキレン基が特
に好ましい。 本発明の反応性重合体のうち、式〔〕におけ
るＸは水素原子であるもの、即ち、主鎖のアミノ
末端に下記式〔−ａ〕 〔式〔−ａ〕において、Ｗの定義は式〔〕
の場合と同じ。〕 で表わされる活性基を有している反応性重合体を
製造する方法について説明する。 その方法は、構成単位の60モル％以上が前記式
〔〕で表わされる構成単位からなり、重合度が
５〜3000の親水性重合体に、式〔〕 R₁S−Ｗ−CO−R₂ …〔〕 〔式中、Ｗの定義は式〔〕の場合と同じであ
る。R₁はチオール基の保護基を表わす。R₂は隣
接するカルボニル基を活性化し得る基を表わす。〕 で表わされる保護されたチオール基を含有するア
シル化剤を反応せしめ、重合体のアミノ末端をア
シル化し、次いで（又は同時に）チオール基の保
護基を除去することにより目的とする反応性重合
体を製造する方法である。 本方法で使用される原料である、構成単位の60
モル％以上が式〔〕で表わされる構成単位から
にり、重合度が５〜3000の親水性重合体とは、例
えば式〔〕においてｍ＝１の場合に相当するポ
リアスパラギン酸、ｍ＝２の場合に相当するポリ
グルタミン酸、さらにアスパラギン酸とグルタミ
ン酸の共重合物や、式〔〕で表わすことができ
ない単位構造を有する成分として、例えばアラニ
ンの構成単位を40モル％以内で含有するアスパラ
ギン酸−アラニン共重合体、グルタミン酸−アラ
ニン共重合体等の親水性重合体である。これらの
重合体は通常の方法、例えば、アミノ酸のＮ−カ
ルボキシ無水物を重合反応に付すことによる方法
で作製されたものを用いることができる。具体例
を挙げれば、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメートを
Ｎ−カルボキシ無水物に導き、重合反応に付した
後にベンジル基を脱離せしめれば、ポリ−Ｌ−グ
ルタミン酸を容易に得ることができる。 本方法で使用されるもう一つの原料である、式
〔〕で表わされる保護されたチオール基を含有
するアシル化剤において、R₁は例えば隣接する
硫黄原子と共にジスルフイドを形成する基であり
得る。例えば、メチルチオ基（CH₃S−）、プチ
ルチオ基（CH₃CH₂CH₂CH₂S−）等のアルキル
チオ基、γ−サクシンイミジルオキシカルボニル
プロピオニルチオ基

【式】 のごとき、置換アルキルチオ基２−ピリジルチオ
基

【式】３−カルボキシ−４−ニト ロフエニルチオ基

【式】等の活 性ジスルフイドを形成し得る基等を挙げることが
できる。R₁は又アセチル基

【式】プロピ オニル基

【式】のごときアシル基や、 ベンジル基

【式】も含む。式 〔〕で表わされるアシル化剤において−R₂は隣
接するカルボニル基を活性化し得る基を表わし、
例えば、サクシンイミジルオキシ基

【式】パラニトロフエノキシ基

【式】などの活性エステルのア ルコール残基、ｔ−ブチルカルボキシ基

【式】イソブチルオキシカルボ キシ基

【式】のごとき酸無水物の カルボン酸残基、アジド基〔−N₃〕等が好まし
く用いられる基である。式〔〕で表わされるア
シル化剤においてＷは式〔〕における説明と同
じである。式〔〕で表わされる保護されたチオ
ール基を含有するアシル化剤の具体例を挙げれ
ば、サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート

【式】

【式】Ｗ＝−CH₂CH₂−，

【式】）、ジチオビス（サクシンイ ミジルプロピオネート

【式】（R₁＝

【式】Ｗ＝−CH₂CH₂−，

【式】，Ｎ−ベンゾイルシスチンパ ラニトロフエニルエステル

【式】

【式】

【式】

【式】等を挙げることがで き、さらに例えば、Ｎ−アセチルホモシステイン
チオラクトン

【式】のごとき、チオ ール基の保護基を表わすR₁、カルボニル基の活
性化基であるR₂が分子内に組み込まれている化
合物も本方法に使用できる。 本方法の反応に用いられる親水性重合体に対し
て用いる保護されたチオール基を含有するアシル
化剤は１倍〜100倍当量、さらに好ましくは５倍
〜100倍当量を用いる。用いる溶媒は緩衡液（PH
５〜８）、DMF等、均一溶液を形成する溶媒が好
ましい。トリエチルアミン、炭酸ソーダ等の塩基
の存在下で反応をより有利に進めることもでき
る。反応温度は０℃〜50℃、好ましくは４℃〜30
℃である。反応時間は１時間〜３日である。 反応終了後、反応液が緩衡液の場合は、塩酸、
硫酸等の酸を加え、反応液PH４以下とし、生成し
た、保護されたチオール基を有するアシル基をア
ミノ末端に結合した親水性重合体の沈澱を生じせ
しめ、これを取する方法により、生成物を精製
する。反応液が水以外の溶媒を使用している場合
は、緩衡液を加えてから、同様の方法により精製
できる。他に、透析やゲル過により精製するこ
ともできる。 しかして得られた、保護されたチオール基を有
するアシル基をアミノ末端に結合した親水性重合
体の、チオール基の保護基を脱離し、よつて目的
物である、主鎖のアミノ末端に式〔−ａ〕で表
わされる活性基を有している反応性重合体を得る
方法について述べる。保護基を脱離する方法は、
保護基の種類によつて異なる。例えば、式〔〕
においてR₁が隣接する硫黄原子と共にジスルフ
イドを形成している場合は、ジスルフイド基を還
元的に切断する方法が好ましく用いられる。例え
ば２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ル、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を水溶液
中、該親水性重合体に作用することによつて、こ
れをチオール含有基をアミノ末端に有する反応性
重合体に導くことができる。用いる還元剤の量は
１〜100当量が好ましい。反応温度は０℃〜50℃、
反応時間は１分〜３時間が好ましい。式〔〕に
おいて、R₁がアシル基の場合は、加水分解によ
りこれを脱離する。反応は水溶液中、触媒として
ヒドロキシルアミン、炭酸ナトリウム、水酸化ナ
トリウム等のアルカリを１〜100当量用いておこ
なう。反応温度は０〜50℃、反応時間は10分〜10
時間が好ましい。式〔〕においてR₁がベンジ
ル基の場合は、過剰のトリフルオロ酢酸やメタン
スルホン酸又はそれらの混合液で該親水性重合体
を処理する。反応温度は０℃〜30℃、反応時間は
30分〜10時間である。なお、式〔〕で表わされ
る保護されたチオール基を含有するアシル化剤と
して例えばＮ−アセチルホモシステインチオラク
トンを用いる場合はアシル化反応と同時に脱保護
基反応が進むため、重ねて脱保護基反応を行なう
必要は無い。 かくして得られた、主鎖のアミノ末端に式〔
−ａ〕で表わされる活性基を有している反応性重
合体は、不純物として低分子物質は含有していな
いが、しかし、原料として用いた親水性重合体の
一部を末反応のまま含有している可能性がある。 次に、この未反応の高分子物質の除去すること
とにより、生成物をさらに精製する方法について
述べる。その精製は、例えばチオプロピルセフア
ロース6B （フアルマシア社製）で例示される
様な、チオール基を含有する化合物を結合する樹
脂を用いて緩衡液中クロマトグラフイーを施行す
ることにより成される。即ち、未精製の反応性重
合体を該カラムに通すと、アミノ末端にチオール
含有基を含む反応性重合体はカラムに結合し、不
純物である、チオール含有基を含まない重合体は
溶出される。次いでカラムに２−メルカプトエタ
ノールやジチオスレイトール等の緩衡溶液を通す
と、精製された、チオール含有基を含む反応性重
合体が溶出する。溶出液は、酸性として重合体を
沈澱とするか、又は透析して低分子物質を除く。
凍結乾燥を施して、目的物を得ることもできる。 次に、本発明の反応性重合体のうち、式〔〕
におけるＸが隣りの硫黄原子と共に活性ジスルフ
イド結合を形成しうる基を表わす場合、即ち、主
鎖のアミノ末端に下記式〔−ａ〕 〔式〔−ｂ〕において、Ｗの定義は前記式
〔〕の場合と同じ。X¹は隣りの硫黄原子と共に
活性ジスルフイド結合を形成しうる基を表わす。〕 で表わされる活性基を有している反応性重合体を
製造する方法について説明する。 その方法は、アミノ末端に前記式〔−ａ〕で
表わされる活性基を含有する重合体、即ち、チオ
ール基を含有する重合体と、活性ジスルフイド化
合物を反応させる方法である。活性ジスルフイド
化合物としては、例えば、２−ピリジルジスルフ
イド

【式】４−ピリジル ジスルフイド

【式】５， 5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）

【式】４−カ ルボキシ−２−ピリジルジスルフイド Ｎ−オキシ−２−ピリジルジスルフイド

【式】２−ニトロフエニ ルジスルフイド

【式】４ −ニトロ−２−ピリジルジスルフイド

【式】２−ベ ンゾチアゾイルジスルフイド

【式】２−ベ ンゾイミダゾイルジスルフイド

【式】Ｎ−フ エニルアミノ−N′−フエニルイミノメチルジス
ルフイド を挙げることができる。 両者の反応は、通常、水又はジメチルホルムア
ミドやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を反応
溶媒とする均一反応系で行なわれる。あるいはま
た、重合体の水溶液に活性ジスルフイド化合物又
はそのアセトン溶液又はジオキサン溶液等を添加
混合した反応系で行なうこともできる。反応温度
は−５℃〜70℃、反応時間は１分〜24時間が適当
である。 反応後の精製は、反応液に緩衡液を加えた後、
酸性により重合体を沈澱せしめ、取する方法、
反応液を透析したのち、凍結乾燥を施行する方法
等により、容易に施行することができる。 次に、しかして得られた主鎖のアミノ末端に式
〔−ｂ〕で表わされる活性基を有している反応
性重合体を、主鎖のアミノ末端に式〔−ａ〕で
表わされる活性基を有している反応性重合体に変
換する方法について述べる。その方法は、ジスル
フイド基を還元的に切断する方法が好ましい。用
いられる還元剤は、例えば２−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトール等のチオール類、水素
化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カルシウム等
の水素化ホウ素化合物等が使用される。反応溶媒
は、水、又はジメチルホルムアミドが好ましい。
用いる還元剤の量は１〜100当量が好ましい。反
応温度は０〜50℃、反応時間は１分〜３時間が好
ましい。精製は、通常の酸による沈澱法、ゲル
過法、透析法等によりおこなう。 本発明の反応性重合体は、側鎖に反応性に富ん
だ多数のカルボキシル基（又はその塩）を有し、
分子末端に反応性に富んだチオール基又は活性ジ
スルフイド結合を有しているので、これらの基の
反応性を利用して、例えば以下に述べる如き方法
で免疫グロブリンと細胞毒物を有効かつ効率良く
結合させることができ、得られた結合物は、標的
指向型の薬剤として用いることができる。 側鎖に導入される細胞毒物としては、例えば分
子中にアミノ基又はイミノ基を含む制ガン剤等が
用いられる。そして本発明の反応性重合体と細胞
毒物との反応は、通常、水又はジメチルホルムア
ミドやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を反応
溶媒とする均一反応系で行なわれる。反応に際し
ては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩がジシクロ
ヘキシルカルボジイミドで重合体中のカルボキシ
ル基を活性化してもよく、あるいはカルボキシル
基を混合酸無水物の形に活性化しておいてもよ
い。反応温度は−40℃〜100℃、反応時間は10分
〜10日間が適当である。 ｅ 発明の効果 かくして得られた細胞毒物を側鎖に結合した反
応性重合体は、分子末端になお反応性に富んだチ
オール基又は活性ジスルフイド結合を有している
ので、かかる基又は結合の反応性と、抗腫瘍免疫
グロブリン又はそのフラグメントに発生又は導入
したチオール基、活性ジスルフイド基、マレイミ
ド基等の反応性を利用して両者を結合させ、細胞
毒物の結合した本発明の反応性重合体を毒性部と
する抗腫性を有する複合体を製造することができ
る。具体的に製造法としては、例えば以下の如き
方法がある。 抗腫瘍免疫グロブリンをペプシン処理し、
Fab′の２量体を得、このヒンジ部分のジスル
フイド結合を、例えばチオール試薬により還元
的に切断して分子中にチオール基を有する
Fab′を得る。そしてチオール基を有する
Fab′と、活性ジスルフイド結合を有する本発
明の反応性重合体にさらに細胞毒性物質を結合
した重合体を反応させ、目的とする抗腫瘍性複
合体を得る。 抗腫瘍性免疫グロブリンに、例えばサクシン
イミジルｍ−マレイミドベンゾエートを作用す
ることによりマレイミド基を導入した免疫グロ
ブリンに、チオール基を有する本発明の反応性
重合体にさらに細胞毒性物質を結合した重合体
を反応させ、目的とする抗腫瘍性複合体を得
る。 かくして得られた抗腫瘍剤は、腫瘍細胞と選択
的に結合した腫瘍細胞に毒性を発揮することが期
待されるものである。 以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ １−１ アミノ末端（以下Ｎ−末端と省略）に保
護されたチオール基を含むアシル基を導入され
たポリ−Ｌ−グルタミン酸の製造。 ポリ−Ｌ−グルタミン酸のナトリウム塩（平均
分子量21000）226.5mgの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衡液（PH7.5）（15ml）中溶液に、Ｎ−サクシイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（以下SPDPと省略する）68.8mgのエタノール
（６ml）溶液を撹拌下、２度に分けて加え、1.5時
間室温下に反応させた。反応液をセロフアン透析
チユーブに入れ、0.01Mリン酸緩衡液（PH7.5）
に対して４℃で２日間透析して低分子物質を除去
すると、ポリ−Ｌ−グルタミン酸分子のアミノ末
端に３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基
がアミド結合により導入されて生成したジスルフ
イド結合を有するポリ−Ｌ−グルタミン酸を含有
する溶液50mlが得られた。 １−２ Ｎ−末端にチオール基を有するポリ−Ｌ
−グルタミン酸の製造。 １−１）によつて得られた、アミノ末端に３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基を導入し
た、ジスルフイド結合を有するポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸を含有する溶液50mlに、ジチオスレイトー
ル17mgの0.1Mリン酸ナトリウム（PH6.0）緩衡液
2.0ml中溶液を加え、室温下に80分間反応させた。
次いで塩酸酸性とし、生じた沈澱を遠心分離し
た。得られたポリ−Ｌ−グルタミン酸の、沈澱物
（末端にチオール基を有するポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸と有しないポリ−Ｌ−グルタミン酸を含む。）
は、0.01NHClで洗浄した。 一方、チオプロピルセフアロース6Bゲル
（Thiopropyl Sepharse 6B、フアルマシア社
製）15mlを0.1Mリン酸ナトリウム（PH6.0）−
1mMエチレンジアミンテトラ酢酸（以後EDTA
と省略する）（PH6.0）緩衝液40mlに分散し、得ら
れた分散溶液に、前記で得られたポリ−Ｌ−グル
タミン酸を同一緩衡液10mlに溶解して得られる溶
液を加え、室温下、窒素雰囲気中でゆるやかに１
夜撹拌した。これで末端にチオール基を有するポ
リ−Ｌ−グルタミン酸が樹脂に結合する。次いで
樹脂をロ別し、0.01Mリン酸緩衡液PH7.5で充分
洗浄した。 かくして得られた樹脂を0.1Mトリス−塩酸−
1m MEDEA（PH8.5）緩衡液50mlに分散し２−メ
ルカプトエタノール1.17ｇを加え、室温下窒素雰
囲気中で10時間ゆるやかに撹拌した。これで末端
がチオール基のポリ−Ｌ−グルタミン酸が樹脂か
ら遊離する。 樹脂を濾別し、0.01Mトリス−塩酸−0.1m
MEDTA（PH8.5）緩衡液でよく洗浄し、次いで、
濾液と洗液を氷冷下塩酸でPH1.8とし、生じた末
端にチオール基を有するポリ−Ｌ−グルタミン酸
の沈澱を遠心分離した。 １−３ Ｎ−末端に活性ジスルフイド基を有する
ポリ−Ｌ−グルタミン酸の製造。 １−２）で得られた末端にチオール基を有する
ポリ−Ｌ−グルタミン酸の沈澱を、再び0.4Mリ
ン酸ナトリウム−1mMEDTA（PH7.5）緩衡液１
mlに溶解し、得られた溶液を２−ピリジルジスル
フイド（以下２−PDSと省略する）23mgのエタ
ノール（４ml）溶液を0.1Mリン酸ナトリウム−
1m MEDTA（PH6.0）10mlに加えて得られた溶液
に加え、室温下で30分間反応させた後、（ポリ−
Ｌ−グルタミン酸の末端が活性ジスルフイド基と
なる）反応液をセロフアンチユーブに入れ、
0.01Mリン酸ナトリウム（PH7.5）緩衡液に対し
て６時間、純れに対して、１日透析した。回収液
を減圧で30mlに減少し、凍結乾燥すると、末端に
２−ピリジルジチオ基が導入されたポリ−Ｌ−グ
ルタミン酸（ナトリウム塩）の綿状固体35.4mgが
得られた（重量収率15.6％）。実施例１−４）の
結果から、得られる重合体は末端に２−ピリジル
ジチオ基を含有しており分子量は17800である。 １−４ Ｎ−末端にチオール基を有するポリ−Ｌ
−グルタミン酸の製法。 一定量のサンプルを精秤し（1.895mg）、3.00ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衡液（PH7.2）に溶解
し、ジチオスレイトールの小片を加え、遊離した
２−メルカプトピリジンに由来する吸収
（343nm、分子吸光係数ε＝8080）を測定した
（Ａ＝0.286）。精秤されたサンプル中の末端基量
は0.1062μmole、従つて、同サンプル中の末端活
性ジスルフイド含有ポリ−Ｌ−グルタミン酸分子
の分子量は17800、又、同分子中のグルタミン酸
（ナトリウム塩）のユニツト数は、１ユニツトの
質量数が151であることにより、118と計算され
た。 反応後をセフアデツクスＧ−25（1.0×40cm、
0.01Mリン酸緩衡液−1m MEDTA（PH6.0））に通
して低分子物質を除去すると、Ｎ−末端にチオー
ル基を有するポリ−Ｌ−グルタミン酸の溶液が得
られた。 実施例 ２ ２−１ Ｎ−末端に保護されたチオール基を含む
アシル基を導入されたグルタミン酸とアラニン
共重合体の製造。 Ｌ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共重合体の
ナトリウム（平均分子量17200、グルタミン酸−
アラニン構成当量比30.3：１）、172mgのトリス−
塩酸緩衡液（PH8.2）（10ml）中溶液に、Ｎ−アセ
チルホモシステインチオラクトン48mgのエタノー
ル（４ml）溶液を２度にわけて加え、温度下で10
時間撹拌した。反応液をセロフアン透析チユーブ
に入れ、1m MEDTA−0.01Mリン酸緩衡液（PH
6.0）に対して４℃で２日間透析し、低分子物質
を除くと、Ｌ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共
重合体のアミノ末端に、Ｎ−アセチルホモシステ
インがアミド結合により導入されて生成した、チ
オール基を有する重合体を含有する溶液16mlが得
られた。 実施例１−２）で示したと同じ方法、即ち、チ
オプロピルセフアロース6Bゲルにチオール基が
導入された重合体をいつたん結合し、チオール基
が導入されなかつた、未反応重合体を除き、次い
でチオール基が導入された重合体をゲルから溶出
する方法によつてチオール基を有する重合体の精
製品を得た（沈澱物）。 ２−２ Ｎ−末端に活性ジスルフイド基を有する
Ｌ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共重合体の
製造。 ２−１）で得られた、末端にチオール基を有す
るＬ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共重合体の
沈澱に、再び0.4Mリン酸緩衡液−1m MEDTA
（PH7.5）２mlを加えて溶解し、得られた溶液に、
実施例１−２）と同様に２−PDSを加えて反応
せしめ、さらに透析、凍結乾燥の処理工程を施し
て、目的物である、末端に２−ピリジルジチオ基
が導入されたＬ−グルタミン酸とＬ−アラニンの
共重合体（ナトリウム塩）の綿状固体を22.4mgを
得た（重量収率13％）。実施例２−３）の結果か
ら、得られた重合体は末端に２−ピリジルジチオ
基を含有しており、分子量は13900である。 ２−３ Ｎ−末端にチオール基を有するＬ−グル
タミン酸とＬ−アラニンの共重合体の製造。 2.2）で得られた末端に２−ピリジルジチオ基
を含有する重合体1.154mgを精秤し、実施例１−
４）と同様に、ジチオスレイトールと反応せしめ
た。遊離した２−メルカプトピリジンに由来する
吸収を測定して、同サンプル中の末端活性基量、
重合体の分子量を算出した。末端活性基量
0.083μmole、分子量13900。 反応液を0.01Mリン酸緩衡液−1m MEDTA
（PH6.0）に透析して、低分子物質を除くと、Ｎ−
末端にチオール基を有するＬ−グルタミン酸とＬ
−アラニンの共重合体の溶液が得られた。 実施例 ３ ３−１ Ｎ−末端にチオール基を含むポリ−Ｌ−
グルタミン酸の製造。 ポリ−Ｌ−グルタミン酸のナトリウム塩（平均
分子量17000）170mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩
衡液（PH7.3）５mlに溶解し、Ｓ−アセチルメル
カプト無水コハク酸346mgをジメチルホルムアミ
ド2.0mlに溶解したものを２回にわけて加え、PH
を7.0〜7.5の間に保ちつつ、室温下に２時間撹拌
した。次いで反応液をセロフアン透析チユーブに
入れ、0.01Mリン酸緩衡液（PH7.5）に対して４
℃で充分透析した。回収液8.5ml。0.5Mヒドロキ
シルアミン溶液2.5mlを加え、30℃にて30分間反
応せしめ、チオール基を保護しているアセチル基
を脱離せしめた。０℃にて反応液に1NHClを加
えてPHを2.0とし、２時間放置したのち、生じた
沈澱を遠心分離すると、Ｎ−末端にチオール基が
導入されたポリ−Ｌ−グルタミン酸の沈澱が得ら
れた。 さらに１−２）で示したと同じ方法、即ちチオ
プロピルセフアロース6Bゲルにチオール基が導
入された重合体をいつたん結合し、チオール基が
導入されなかつた未反応の重合体を除き、次いで
チオール基が導入された重合体をゲルより溶出せ
しめる方法により、チオール基を有する重合体の
精製品を得、塩酸酸性により沈澱物として得た。 ３−２ Ｎ−末端に活性ジスルフイド基を有する
ポリ−Ｌ−グルタミン酸の製造。 ３−１）で得られた、末端にチオール基を有す
るポリ−Ｌ−グルタミン酸の沈澱を、再び0.4M
リン酸ナトリウム−1m MEDTA緩衡液（PH7.6）
２mlにとかし、これに５，5′−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）39.6mgを加えて溶解し、30分間
反応せしめた。反応液にセロフアンチユーブに入
れ、４℃にて水に対して充分透析した。回収液を
凍結乾燥すると、目的物である、４−ニトロ−３
−カルボキシフエニルジチオ基を主鎖にＮ−末端
に含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム
塩）の綿状固体29.6mgが得られた（重量収率17.4
％）。実施例3.3）の結果から、得られた重合体
は、末端に４−ニトロ−３−カルボキシフエニル
ジチオ基を含有しており、分子量は14900である。 ３−３ Ｎ−末端にチオール基を有するポリ−Ｌ
−グルタミン酸の製造。 ３−２）で得られた、末端に４−ニトロ−３−
カルボキシフエニルジチオ基を含有している重合
体2.208mgを精秤し、0.1Mリン酸緩衡液3.00mlに
溶解した。10mM2−メルカプトエタノール0.10
mlを加え、30分間放置した後、遊離した５−メル
カプト−２−ニトロ安息香酸に由来する412nmに
おける吸収（ε＝12000）を測定し、末端活性基
量を定量し、重合体の分子量を算出した。末端活
性基量0.148μmole、分子量14900。 反応液を0.01Mリン酸緩衡液−1m MEDTA
（PH5.8）に透析して、低分子物質を除くと、Ｎ−
末端にチオール基を有するポリ−Ｌ−グルタミン
酸の溶液が得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構成単位の60モル％以上が式［］で表わさ
   れる構成単位からなり、 〔式［］において、Ｚは水素原子又は１価の
   陽イオンを表わす。ｍは１〜４の整数を表わす。〕 式［］の構成単位が100モル％でないとき、
   残りの構成単位は、式［′］ 〔式［′］において、Ｒは−Ｈ，−CH₃，
   【式】または−CH₂OHで表わされ る基である。〕 で表わされる構成単位からなり、重合度が５〜
   3000の親水性重合体に、式［］ R₁S−Ｗ−CO−R₂ …〔〕 〔式中、Ｗは炭素数１〜４のアルキレン基を表
   わす。R₁はチオール基の保護基を表わす。R₂は
   隣接するカルボニル基を活性化し得る基を表わ
   す。〕 で表わされる、保護されたチオール基を含有する
   アシル化剤を反応せしめ、次いでチオール基の保
   護基を除去することを特徴とする、構成単位の60
   モル％以上が式［］で表わされる構成単位から
   なり、 〔式［］において、Ｚは水素原子又は１価の
   陽イオンを表わす。ｍは１〜４の整数を表わす。〕 式［］の構成単位が100モル％でないとき、
   残りの構成単位は、式［′］ 〔式［′］において、Ｒは−Ｈ，−CH₃，
   【式】または−CH₂OHで表わされ る基である。〕 で表わされる構成単位からなり、そして主鎖のア
   ミノ末端に式〔−ａ〕で表わされる活性基を有
   している、 〔式［−ａ］において、Ｗの定義は前記式
   ［］の場合と同じ。〕 重合度が５〜3000の反応性重合体の製造法。 ２ 構成単位の60モル％以上が式［］で表わさ
   れる構成単位からなり、 〔式［］において、Ｚは水素原子又は１価の
   陽イオンを表わす。ｍは１−４の整数を表わす。〕 式［］の構成単位が100モル％でないとき、
   残りの構成単位は、式［′］ 〔式［′］において、Ｒは−Ｈ，−CH₃，
   【式】または−CH₂OHで表わされ る基である。〕 で表わされる構成単位からなり、そして主鎖のカ
   ルボキシル末端に式［−ｂ］で表わされる活性
   基を有している、 〔式［−ｂ］において、Ｗは炭素数１〜４の
   アルキレン基を表わす。X¹は隣りの硫黄原子と
   共に活性ジスルフイド結合を形成しうる基を表わ
   す。〕 で表わされる活性基を有している、重合度が５〜
   3000の反応性重合体のジスルフイド結合を還元的
   に切断することを特徴とする、構成単位の60モル
   ％以上が式［］で表わされる構成単位からな
   り、主鎖のアミノ末端に式〔−ａ〕で表わされ
   る活性基を有している、重合度が５〜3000の反応
   性重合体の製造法。 〔式［−ａ］において、Ｗの定義は前記式
   ［−ｂ］の場合と同じ。〕