JPS626560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、レニン（renin）活性測定用の螢光
性基質として使用できる新規ペプチド誘導体に関
する。 血圧の調節や水、電解質の代謝に腎中の酵素レ
ニンが重要な役割を演じていることが知られてお
り、この酵素を定量することによりこの酵素が関
与している病気の診断が可能となる。 現在レニン活性はタンパク性基質アンジオテン
シノーゲン（angio tensinogen）を基質とし、生
成するアンジオテンシン−（angioten sin−
）をラジオイムノアツセイ法で測定している。
まだ、β−ナフチルアミンを含むペプチド基質を
用いる方法も知られている。しかし、いずれも測
定感度安全性又は簡便さのすべてを満足する方法
ではない。 本発明者らは、測定感度、安全性、簡便性のす
べてを満足する測定方法を開発すべく研究を行い
構造式： で示される新規ペプチド誘導体の合成に成功し、
この新規化合物がレニン活性の簡便で高感度の測
定を可能とする螢光性基質となることを見出し、
本発明を完成するに至つた。 本発明のペプチド誘導体は酸付加塩の形を含
む。 本発明の目的化合物を得るには、例えばＮ・Ｏ
−保護−チロシンと７−アミノ−４−メチルクマ
リン（AMC）とを脱水縮合反応させることによ
り製造される７−（Ｎ・Ｏ−保護−チロシル）−ア
ミノ−４−メチルクマリンのＮ−保護基を脱離し
た後、通常のペプチド合成に用いられる方法によ
りバリン、ロイシン、ロイシンを順次縮合し７−
（Ｎ−保護−ロイシル−ロイシル−バリル−０−
保護−チロシル）−アミノ−４−メチルクマリン
を得る。次いで、Ｎ−保護基を通常のペプチド合
成に用いられる方法で脱離した後Ｎ〓・Ｎ^G−保
護−アルギニル−ブロリル−フエニルアラニル−
ヒスチジン−アジドを反応させることにより、７
−（Ｎ〓・Ｎ^G−保護−アルギニル−プロリル−フ
エニルアラニル−ヒスチジル−ロイシル−ロイシ
ル−バリル−Ｏ−保護−チロシル）−アミノ−４
−メチルクマリンを得る。次いで、無水弗化水素
中０℃40分反応させることにより保護基を除去す
ることができる。 前述の如くＮ〓・Ｎ^G、水酸基の保護基には通
常のペプチド合成に用いられる保護基より選択し
て用いることができる。 本発明のペプチド誘導体を用いて液体中含有す
るレニン活性を測定するにはレニンを含有する液
体と一般式 で示されるペプチド誘導体とを接触せしめ、次い
で遊離生成する７−（ロイシル−バリル−チロシ
ル）−アミノ−４−メチルクマリンに、アミノペ
プチダーゼＭ等前記遊離生成したペプチド誘導体
に作用してAMCを遊離生成せしめる酵素を接触
せしめた後、遊離生成したAMCを定量すること
により液体中のレニン活性を高感度に測定でき
る。以下、参考例及び実施例により本発明を詳細
に説明する。 参考例 １ Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−０−２・６
−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシン22ｇ（50ミリ
モル）をテトラヒドロフラン200mlにとかし冷却
下かきまぜながらジシクロヘキシルカルボジイミ
ド5.2ｇ（25ミリモル）を加えた。 １時間後析出したジシクロヘキシルウレアを濾
去し、濾液を冷却下かきまぜながらAMC4.4ｇ
（25ミリモ）のジメチルホルムアミド（DMF）15
ml溶液を滴加した。そのまま、20℃１日かきまぜ
た後、溶媒を溜去し、残渣に酢酸エチル100mlを
加えてとかし、１規定塩酸100mlと共に振りまぜ
洗浄した。有機層はつづいて５％重そう水、次い
で水、各100mlにて洗浄した後、無水硫酸マグネ
シウムで乾燥後、酢酸エチルを溜去した。残渣を
メチルアルコール100mlより再結晶し、７−（Ｎ−
ｔ−ブチルオキシカルボニル−０−２・６−ジク
ロロベンジル−Ｌ−チロシル）−アミノ−４−メ
チルクマリン9.8ｇ（収率65.3％）を得た。 融 点 234〜235℃（分解）。 〔α〕^２７ _Ｄ＝＋57.7゜（Ｃ＝2.13、DMF） 元素分析： 測定値 C62.23％、H5.01％、N4.54％ C₃₁H₃₀N₂O₆Cl₂としての計算値、
C62.31％、H5.06％、N4.69％ 参考例 ２ ７−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−０−
２・６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシル）−ア
ミノ−４−メチルクマリン1.79ｇ（３ミリモル）
にトリフロロ酢酸10mlを加え20℃ 20分かきまぜ
た後、トリフロロ酢酸を溜去し残留物にエーテル
100mlを加え生じた。 ７−（０−２・６−ジクロロベンジル−Ｌ−チ
ロシル）−アミノ−４−メチルクママリントリフ
ロロ酢酸塩を濾取した。 これをDMF10mlにとかし、Ｎ〓−ｔ−ブチル
オキシカルボニル−Ｌ−バリン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル1.13ｇ（3.6ミリモル）
を加え、トリエチルアミンを加えPHを７とした後
室温にて１夜かきまぜた。 溶媒を溜去し、クロロホルム100mlとメタノー
ル５mlにとかし0.5規定塩酸100ml次いで水100ml
にて洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥した溶媒を溜去し残渣をメタノール５mlと
クロロホルム50mlにとかしエーテルを加えること
により再結晶し、７−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル）−アミノ
−４−メチルクマリン1.9ｇ（収率91％）を得
た。 融 点 214〜215℃（分解）。 〔α〕^２７ _Ｄ＝＋33.7゜（Ｃ＝1.07、DMF） 元素分析： 実測値 C61.79％、H5.55％、N5.88％ C₃₆H₃₉N₃O₇Cl₂として計算値
C62.07％、H5.64％、N6.03％ 参考例 ３ ７−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリ
ル−０−２・６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシ
ル）−アミノ−４−メチルクマリン1.4ｇ（２ミリ
モル）にジクロロメタン10mlと酢酸５mlを加えて
とかし、トルエンスルホン酸１水和物1.15ｇ（６
ミリモル）を加え20℃にてジククロロメタンを溜
去した。その後20℃１時間かきまぜた後エーテル
100mlを加え生じた７−（Ｌ−バリル−０−２・６
−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシル）−アミノ−
４−メチルクマリン トルエンスルホン酸塩の沈
澱を濾取した。 これをDMF10mlにとかしトリエチルアミンで
PH７に調節した後Ｎ〓−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル788mg（2.4ミリモル）を加え室温に
て１夜かきまぜた。溶媒を溜去し水50mlを加え生
じた沈殿を濾取し、メチルアルコール５mlとクロ
ロホルム50mlにとかし不溶物を濾去した後、濾液
にエーテルを加え再結晶することにより７−（ｔ
−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
バリル−０−２・６−ジクロロベンジル−Ｌ−チ
ロシル）−アミノ−４−メチルクマリン700mg（収
率43％）を得た。 融 点 240〜241℃（分解）。 〔α〕^２７ _Ｄ＝＋25.9゜（Ｃ＝1.85、DMF） 元素分析： 実測値 C62.28％、H6.13％、N6.78％ C₄₂H₅₀N₄O₈Cl₂として計算値
C62.29％、H6.22％、N6.92％ 参考例 ４ ７−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−バリル−０−２・６−ジクロロベンジ
ル−Ｌ−チロシル）−アミノ−４−メチルクマリ
ン647mg（0.8ミリモル）にジクロロメタン10mlと
酢酸３mlを加えとかし、トルエンスルホン酸１水
和物458mg（2.4ミリモル）を加え、20℃にてジク
ロロメタンを溜去した後20℃にて１時間かきまぜ
た。次いでエーテル100mlを加え生じた７−（Ｌ−
ロイシル−Ｌ−バリル−０−２・６−ジクロロベ
ンジル−Ｌ−チロシル）−アミノ−４−メチルク
マリン トルエンスルホン酸塩の沈澱を濾取し
た。 これをDMF5mlにとかしトリエチルアミンでPH
を７に調節した後、Ｎ〓−ｔ−ブチルオキシカル
ボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル328mg（１ミリモル）を加え室温
にて１夜かきまぜた。次いで溶媒を溜去し水50ml
を加え生じる沈澱を濾取し、メチルアルコール５
mlとクロロホルム30mlにとかし不溶物を濾去した
後エーテルを加えることにより再結晶し、７−
（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−０−２・６−ジ
クロロベンジル−Ｌ−チロシン）−アミノ−４−
メチルクマリン560mg（収率76％）を得た。 融 点 245〜247℃（分解）。 〔α〕^２７ _Ｄ＝＋1.4（Ｃ＝1.60、DMF） 元素分析： 実測値 C62.63％、H6.51％、N7.55％ C₄₈H₆₁N₅O₉Cl₂としての計算値
C62.46％、H6.66％、N7.59％ 参考例 ５ Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ^G−ト
シル−Ｌ−アルギニン−66.6ｇ（0.15モル）とＬ
−プロリンベンジルエステル塩酸塩40.2ｇ
（0.165モル）をジクロロメタン500mlにとかし、
Ｎ・Ｎ−ジメチルアミノプロピル−N′−エチル
カルボジイミド25.4ｇ（0.164モル）を滴加し
た。１夜室温にてかきまぜた後、溶媒を溜去、残
溜物を酢酸エチル500mlにとかし１規定塩酸500ml
とともに振りまぜ洗浄した。つづいて、水500
ml、５％重そう水500ml、水500mlと順次振りませ
洗浄した後有機層は硫酸マグネシウムで乾燥した
溶媒を溜去し、残渣をメチルアルコールにとかし
エーテルを加えることにより再結晶しＮ〓−ｔ−
アミルオキシカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−ア
ルギニル−Ｌ−プロリンベンジルエステル52ｇ
（収率55％）を得た。 融 点 166℃〜167.5℃ 〔α〕^２３ _Ｄ−34.5゜（Ｃ＝1.0、DMF） 元素分析： 実測値 C58.58％、H6.94％、N11.26％ C₃₁H₄₃O₇N₅Sとしての計算値
C59.12％、H6.88％、N11.12％ 参考例 ６ Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ^G−ト
シル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリン ベンジル
エステル40ｇ（64ミリモル）をエチルアルコール
１にとかし、５％パラジウム炭素触媒を加え、
室温常圧にてかきまぜながら水素ガスを通じ９時
間還元反応を行わせた後触媒を濾去し溶媒を溜去
した。残渣にエーテルとｎ−ヘキサンを加えて固
化させ濾取することによりＮ〓−ｔ−アミルオキ
シカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル−
Ｌ−プロリン34ｇ（収率99％）を得た。この物質
はそのまま精製せずに次の実験に用いた。 参考例 ７ Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ^G−ト
シル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリン5.4ｇ（10
ミリモル）とトリフロロ酢酸−Ｐ−ニトロフエニ
ルエステル4.7ｇ（20ミリモル）を乾燥したピリ
ジン50mlにとかし50℃にて３時間かきまぜた後水
１mlを加え濃縮乾固し、Ｎ〓−ｔ−アミルオキシ
−カルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル−
Ｌ−プロリン−Ｐ−ニトロフエニルエステルを含
む油状物を得た。 一方、Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｌ−ヒスチジンメチルエステル4.5ｇ
（10ミリモル）に25％臭化水素酢酸溶液20mlを加
え、室温にて１時間かきまぜた後エーテル500ml
を加え生じた沈澱を傾瀉により得た。 これをDMF50mlにとかしトリエチルアミンン
でPHを７に調節し上記Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカ
ルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−
プロリン−Ｐ−ニトロフエニルエステルを含む油
状物を加え室温にて１夜かきまぜた後、溶媒を溜
去した。残留物を酢酸エチル100mlにとかし、0.5
規定塩酸100mlと振りまぜ洗浄した。つづいて水
100mlと振りまぜ洗浄した後、有機層を硫酸マグ
ネシウムで乾燥した。溶媒を留去し残渣にエーテ
ル100mlを加えて固化させ、Ｎ〓−ｔ−アミルオ
キシカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−ヒ
スチジンメチルエステルを得た。収量6.8ｇ（収
率81％）。この物質にはシリカゲル薄層クロマト
グラフイー溶媒系クロロホルム：メタノール：酢
酸＝85：10：５にてＰ−ニトロフエノールと考え
られる副生物が含まれていたが、これ以上の精製
をせず次の反応に使用した。 参考例 ８ Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ〓−ト
シル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フエ
ニルアラニル−Ｌ−ヒスチジンメチルエステル
2.5ｇ（３ミリモル）をメチルアルコール50mlに
とかしヒドラジン１水和物5.6ml（約90ミリモ
ル）を加え室温にて１日かきまぜた後、溶媒を溜
去した。残留物に水10mlを加え可溶物を除き、つ
づいて少量のメタノールとエーテル100mlを加え
固化させＮ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ
^G−トシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−フエニルアラニル−Ｌ−ヒスチジンヒドラジド
を得た。収量1.35ｇ（収率54％）。 この物質にはシリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー溶媒系クロロホルム：メタノール：酢酸＝85：
15：５にて２つの副生物が少量ずつ認められたが
これ以上精製することなく次の反応に使用した。 参考例 ９ Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−NG−ト
シル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フエ
ニルアラニル−Ｌ−ヒスチジンヒドラジド269mg
（0.3ミリモル）をDMF4mlにとかし5.4規定塩化水
素ジオキサン溶液を加え−30℃でかきまぜながら
イソアミルナイトライト0.1mlを加えた。−10℃に
て30分かきまぜることによりＮ〓−ｔ−アミルオ
キシカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−ヒ
スチジンアジド溶液〔〕とした。 一方、７−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル
−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−０
−２・６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシル）−
アミノ−４−メチルクマリン184.4mg（0.2ミリモ
ル）にジクロロメタン５mlと酢酸１mlを加え、ト
ルエンスルホン酸１水和物191mg（１ミリモル）
を加え20℃にてジクロロメタンを減圧溜去した
後、20℃にて３時間かきまぜた。次いで、エーテ
ル50mlを加え生じる沈澱を濾取しエーテルで洗う
ことにより７−（Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−バリル−０−２・６ジクロロベンジル−Ｌ−
チロシル）−アミノ−４−メチルクマリントルエ
ンスルホン酸塩を得た。これをDMF5mlにとかし
トリエチルアミンでPHを７とする〔〕上記
〔〕を−50℃に冷しトリエチルアミン0.76mlを
加え〔〕を加える。０℃〜２℃にて１日かきま
ぜた後、溶媒を溜去し残渣に水10mlを加え生じた
沈殿を濾取した。 これをメチルアルコール１mlと酢酸エチル10ml
にとかし不溶物を濾去した後エーテル20mlを加え
再沈澱を行い精製し、７−（Ｎ〓−ｔ−アミルオ
キシカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−アルギニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−ヒ
スチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−０−２・
６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシル）−アミノ
−４−メチルクマリン250mg（収率77％）を得
た。 この物質にはシリカゲル薄層クロマト溶媒系ク
ロロホルム：メタノール：酢酸＝85：15：５によ
り３〜４ケの副生物及び未反応物が認められた
が、これ以上の精製は行わなかつた。 実施例 ７−（Ｎ〓−ｔ−アミルオキシカルボニル−Ｎ^G
−トシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−
フエニルアラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−０−２・６ジク
ロロベンジル−Ｌ−チロシル）−アミノ−４−メ
チルクマリン244mg（0.15ミリモル）にアニソー
ル１mlを加え無水弗化水素３mlと共に０℃40分反
応させ、保護基を脱離した後、弗化水素を溜去し
残留物に１モル酢酸20mlとエーテル50mlを加え抽
出した。水層をダウケミカル社製「Dowex」１
イオン交換樹脂（酢酸型）10mlを通過させ、付着
した弗化水素を除いた後、凍結乾燥し粉末を得
た。これを、ゲル濾過用樹脂LH−20のカラムク
ロマトググラフイー（５×160cm）溶媒１モル酢
酸にて精製し目的物７−（Ｌ−アルギニル−Ｌ−
プロリル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−ヒスチジ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−
Ｌ−チロシル）−アミノ−４−メチルクマリン
２酢酸塩、１水和物60mg（収率30％）を得た。 この化合物に含まれているアミノ酸の比率をア
ミノ酸分析機により定量した。

【表】 元素分析値 実測値 C59.17％、H7.04％、N14.95％ C₆₈H₈₄D₁₁N₁₄・2CH₃COOH・H₂Oとしての計算
値 C59.17％、H7.07％、N14.64％ 〔α〕^２２ _Ｄ＝−42.4℃（Ｃ＝0.77 20％CH₃COOH） セルロース薄層クロマトグラフイー 溶媒系 ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：５
Rf＝0.66 ｎ−ブタノール：酢酸：水：ピリジン＝
15：３：12：10 Rf＝0.82 に、坂口試薬、パウリ試薬、ニンヒドリン試薬落
及び螢光にて単一なスポツトを与えた。 本発明のペプチド誘導体がレニン活性測定用の
螢光基質となることを示す実験を行つた。 ７−（Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フ
エニル−アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシル）
−アミノ−４−メチルクマリン ２酢酸塩・１水
和物のDMF溶液（μmoles／ml）25入と0.05Mピ
ロリド酸緩衝液（PH5.6）250入中に純粋レニン
0.6〜2.6μPHを37℃で60分間反応せしめた後、５
分間100℃に加熱して酵素を失活させた。これに
10入のアミノペプチダーゼ（aminopepti−
dase）Ｍ（5U／ml水）を加えて37℃で60分間反
応せしめ得られた反応液について、けい光スペク
トルのEm440nｍ（EX380nｍで励起）の波長を
用いてけい光強度を測定した。各濃度の純粋レニ
ンについての結果を次に示す。

【表】 以上の結果から、本基質はレニン濃度に比例し
てAMCを生成せしめることがわかる。一方、本
基質は反応時間に比例してAMCを生成せしめる
ことも確かめた。 従つて試料溶液に本基質を上記の方法に準じて
作用せしめて生成するAMC量を測定し標準曲線
と比較すれば、試料溶液中のレニン活性量を正確
に測定でき、前述の病気診断に役立つことがわか
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式： で示されるペプチド誘導体。