JPS6126560B2 - - Google Patents
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- JPS6126560B2 JPS6126560B2 JP52077976A JP7797677A JPS6126560B2 JP S6126560 B2 JPS6126560 B2 JP S6126560B2 JP 52077976 A JP52077976 A JP 52077976A JP 7797677 A JP7797677 A JP 7797677A JP S6126560 B2 JPS6126560 B2 JP S6126560B2
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- nacl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
- A23K10/32—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from hydrolysates of wood or straw
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
- C07K14/625—Extraction from natural sources
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、会合性高分子インシユリンを酸性ま
たは塩基性イオン交換樹脂における緩衝化された
水性溶媒中でのイオン交換クロマトグラフイーに
より精製する方法に関し、その特徴とするところ
は前記緩衝化された溶媒中に非イオン性洗浄剤を
溶解させるにある。
たは塩基性イオン交換樹脂における緩衝化された
水性溶媒中でのイオン交換クロマトグラフイーに
より精製する方法に関し、その特徴とするところ
は前記緩衝化された溶媒中に非イオン性洗浄剤を
溶解させるにある。
塩基性または酸性を異にしている同一または類
似の分子量のペプチドをイオン交換樹脂で分離し
得ることは既に知られている。しかしながら、こ
の方法は、異なつたペプチドが相互に、イオン交
換クロマトグラフイーの際に保持されたまま残留
するコンプレツクスを形成する場合にはうまくい
かない。この難点を回避するためには溶出媒中で
解離させる条件を選択しなければならない。従
来、この目的には、溶出に用いられる緩衝液に例
えば尿素または尿素誘導体を高濃度（5M〜9M）
に溶解したり、あるいは水と混和し得る溶媒中で
操作が行われてきた。例えばインシユリンはイオ
ン交換樹脂Amberlite IRC50において5M〜8M尿
素を含むホスフエート緩衝液中でクロマトグラフ
イーにかけられた（J.Biol.Chem.第235巻第2294
頁（1960）参照）。英国特許第881855号明細書に
は、水と混和し得る有機溶媒、例えばエタノール
を使用する方法が記載されている。同じく解離作
用を示す極端なPH値は、かかる条件に対するペプ
チドの感受性によつては応用できる。しかしなが
ら、これまで知られている方法には様々な欠点が
ある。すなわち、尿素含有緩衝液からの物質単離
は困難であり、かつ時間がかかる。更に、尿素中
にはインシユリンのようなペプチドと反応する不
純物が含有されていることもあり得る。有機溶媒
としてエタノールを用いた場合にはイオン交換樹
脂を再利用することは困難となり、更にそのイオ
ン交換クロマトグラフイーには大量のペプチド
（例えばインシユリン）損失を伴なう。更にまた
有機溶媒中では高分子ペプチドの変性の危険が伴
ない、例えばインシユリンの場合にはPH７の60％
アルコール中で変性の危険のあることが知られて
いる。
似の分子量のペプチドをイオン交換樹脂で分離し
得ることは既に知られている。しかしながら、こ
の方法は、異なつたペプチドが相互に、イオン交
換クロマトグラフイーの際に保持されたまま残留
するコンプレツクスを形成する場合にはうまくい
かない。この難点を回避するためには溶出媒中で
解離させる条件を選択しなければならない。従
来、この目的には、溶出に用いられる緩衝液に例
えば尿素または尿素誘導体を高濃度（5M〜9M）
に溶解したり、あるいは水と混和し得る溶媒中で
操作が行われてきた。例えばインシユリンはイオ
ン交換樹脂Amberlite IRC50において5M〜8M尿
素を含むホスフエート緩衝液中でクロマトグラフ
イーにかけられた（J.Biol.Chem.第235巻第2294
頁（1960）参照）。英国特許第881855号明細書に
は、水と混和し得る有機溶媒、例えばエタノール
を使用する方法が記載されている。同じく解離作
用を示す極端なPH値は、かかる条件に対するペプ
チドの感受性によつては応用できる。しかしなが
ら、これまで知られている方法には様々な欠点が
ある。すなわち、尿素含有緩衝液からの物質単離
は困難であり、かつ時間がかかる。更に、尿素中
にはインシユリンのようなペプチドと反応する不
純物が含有されていることもあり得る。有機溶媒
としてエタノールを用いた場合にはイオン交換樹
脂を再利用することは困難となり、更にそのイオ
ン交換クロマトグラフイーには大量のペプチド
（例えばインシユリン）損失を伴なう。更にまた
有機溶媒中では高分子ペプチドの変性の危険が伴
ない、例えばインシユリンの場合にはPH７の60％
アルコール中で変性の危険のあることが知られて
いる。
驚ろくべきことに、本発明者は今般、非イオン
性洗浄剤をインシユリン解離に用いることにより
この難点を回避できることを見出した。
性洗浄剤をインシユリン解離に用いることにより
この難点を回避できることを見出した。
この場合、イオン交換樹脂の再利用は全く困難
を伴わない。インシユリンの変性はみられず、そ
の単離は容易であり、インシユリンを適当な沈殿
剤で沈殿させそして場合により引き続き結晶化を
行うことにより行われる。収率は解離剤として有
機溶媒を用いた場合よりも明らかに大きい。
を伴わない。インシユリンの変性はみられず、そ
の単離は容易であり、インシユリンを適当な沈殿
剤で沈殿させそして場合により引き続き結晶化を
行うことにより行われる。収率は解離剤として有
機溶媒を用いた場合よりも明らかに大きい。
本発明方法は、天然のものまたは合成によるも
のとを問わず、それ自体あるいは他の（類似の）
化合物と会合する傾向を示すあらゆる高分子イン
シユリンに適用できる。このインシユリンとして
は例えばあらゆる種類のインシユリン、ヒトイン
シユリン、インシユリン類縁化合物例えばデス−
Phe−B1−インシユリン、インシユリン誘導体例
えばインシユリン−Ｂ鎖スルホネート、天然副腎
皮質刺激ホルモン、生長ホルモン、グルカゴン、
下垂体前葉の糖蛋白体ホルモン、例えば甲丈腺刺
激ホルモン、卵巣黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホ
ルモンなどが挙げられる。
のとを問わず、それ自体あるいは他の（類似の）
化合物と会合する傾向を示すあらゆる高分子イン
シユリンに適用できる。このインシユリンとして
は例えばあらゆる種類のインシユリン、ヒトイン
シユリン、インシユリン類縁化合物例えばデス−
Phe−B1−インシユリン、インシユリン誘導体例
えばインシユリン−Ｂ鎖スルホネート、天然副腎
皮質刺激ホルモン、生長ホルモン、グルカゴン、
下垂体前葉の糖蛋白体ホルモン、例えば甲丈腺刺
激ホルモン、卵巣黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホ
ルモンなどが挙げられる。
これらの化合物は、比較的純粋でない状態で用
いることができるのみならず、（例えばゲルクロ
マトグラフイーにより）予め精製した形で用いる
こともできる。インシユリンは数回結晶化した後
またゲルクロマトグラフイーを行つた後もなお分
子量の酷似したインシユリンに類似の同伴物質を
不純物として含有しており、そしてそれら同伴物
質は適切に選択されたPHにおいて相互にそしてイ
ンシユリンとも荷電状態を異にするがインシユリ
ンとコンプレツクスを形成する。このような物質
として例えばデスアミドインシユリン、アルギニ
ンインシユリン、ジアルギニンインシユリン、イ
ンシユリン−エチルエステルなどが挙げられる。
それらはゲルクロマトグラフイーによつても、そ
してまた解離作用のない溶出剤中でのイオン交換
クロマトグラフイーによつてもインシユリンから
分離できない。
いることができるのみならず、（例えばゲルクロ
マトグラフイーにより）予め精製した形で用いる
こともできる。インシユリンは数回結晶化した後
またゲルクロマトグラフイーを行つた後もなお分
子量の酷似したインシユリンに類似の同伴物質を
不純物として含有しており、そしてそれら同伴物
質は適切に選択されたPHにおいて相互にそしてイ
ンシユリンとも荷電状態を異にするがインシユリ
ンとコンプレツクスを形成する。このような物質
として例えばデスアミドインシユリン、アルギニ
ンインシユリン、ジアルギニンインシユリン、イ
ンシユリン−エチルエステルなどが挙げられる。
それらはゲルクロマトグラフイーによつても、そ
してまた解離作用のない溶出剤中でのイオン交換
クロマトグラフイーによつてもインシユリンから
分離できない。
前述のインシユリンおよびインシユリン類縁体
の精製に適したイオン交換樹脂としては例えば
Dowex1.QAE−Sephadex、Biogel DM、DEAE
−Sephadex、Amberlyst A21およびA29、
DEAE−SepharoseCL6B、DEAE−セルロー
ス、Dowex50、CM−Sephadex、Sp−
Sephadex、CM−Sepharose CL6B、セルロース
ホスフエート、Biogel CM、AmberliteCG50、
CM−セルロース、アルギン酸などが挙げられ
る。インシユリン、インシユリン類縁体およびイ
ンシユリン誘導体の精製に適しているのはデキス
トラン系の塩基性イオン交換樹脂、例えばDEAE
−SephadexまたはQAE−Sephadexなどである。
の精製に適したイオン交換樹脂としては例えば
Dowex1.QAE−Sephadex、Biogel DM、DEAE
−Sephadex、Amberlyst A21およびA29、
DEAE−SepharoseCL6B、DEAE−セルロー
ス、Dowex50、CM−Sephadex、Sp−
Sephadex、CM−Sepharose CL6B、セルロース
ホスフエート、Biogel CM、AmberliteCG50、
CM−セルロース、アルギン酸などが挙げられ
る。インシユリン、インシユリン類縁体およびイ
ンシユリン誘導体の精製に適しているのはデキス
トラン系の塩基性イオン交換樹脂、例えばDEAE
−SephadexまたはQAE−Sephadexなどである。
イオン交換プロセスは、非イオン性洗浄剤を溶
解した緩衝化された水性溶媒中で行われる。
解した緩衝化された水性溶媒中で行われる。
このような洗浄剤としては例えば、パルミチル
ソルンポリエチレングリコールエーテル、ステア
リルソルビタンポリエチレングリコールエーテ
ル、オレイルソルピタンポリエチレングリコール
エーテル、ノニルフエノールポリエチレンポリグ
リコールエーテル（ノニルフエノール１モルあた
りエチレンオキシド10〜30モル）、プロピレンオ
キシドとエチレンオキシドとの重合生成物（エチ
レンオキシドの割合10〜80％）、脂肪アルコール
ポリグリコールエーテルおよび合成脂肪アルコー
ルのポリグリコールエーテルなどが挙げられる。
ソルンポリエチレングリコールエーテル、ステア
リルソルビタンポリエチレングリコールエーテ
ル、オレイルソルピタンポリエチレングリコール
エーテル、ノニルフエノールポリエチレンポリグ
リコールエーテル（ノニルフエノール１モルあた
りエチレンオキシド10〜30モル）、プロピレンオ
キシドとエチレンオキシドとの重合生成物（エチ
レンオキシドの割合10〜80％）、脂肪アルコール
ポリグリコールエーテルおよび合成脂肪アルコー
ルのポリグリコールエーテルなどが挙げられる。
特に有利なのは脂肪アルコールポリグリコール
エーテルである。何故ならそれは作用が良好であ
る上取り扱いやすくまた芳香族ペプチドの吸収領
域にUV吸収を全く示さないため溶出液中のペプ
チドの検出が容易になるからである。その上、こ
れらの化合物は生物学的に十分分解できるため、
それらの利用は環境汚染の点からも問題がないと
考えられる。
エーテルである。何故ならそれは作用が良好であ
る上取り扱いやすくまた芳香族ペプチドの吸収領
域にUV吸収を全く示さないため溶出液中のペプ
チドの検出が容易になるからである。その上、こ
れらの化合物は生物学的に十分分解できるため、
それらの利用は環境汚染の点からも問題がないと
考えられる。
前記溶出剤は、該溶出剤のPH値を調整するため
に常に緩衝物質を含有する。操作は一定のPH値で
行うのが好ましい。陽イオン交換樹脂を用いる場
合には、PH値は３〜6.5（酸性ペプチドの場合）
であつてよく、４〜６が好ましい。陰イオン交換
樹脂を用いる場合には、PH値は5.5〜10であつて
よく、６〜９が好ましい。
に常に緩衝物質を含有する。操作は一定のPH値で
行うのが好ましい。陽イオン交換樹脂を用いる場
合には、PH値は３〜6.5（酸性ペプチドの場合）
であつてよく、４〜６が好ましい。陰イオン交換
樹脂を用いる場合には、PH値は5.5〜10であつて
よく、６〜９が好ましい。
適切な緩衝物質は文献に知られている。イオン
交換クロマトグラフイーの温度は一定に保つ必要
があり、０〜50℃、好ましくは15〜30℃とする。
溶出に用いられる溶液には前述の緩衝物質および
洗浄剤のほかに電解質、好ましくはMaClの如き
中性塩を0.01M〜0.5M、好ましくは0.05M〜0.3M
の濃度で含有せしめるか、あるいは電解質濃度勾
配を用いて電解質を含まないほかは同じ組成の溶
出緩衝液に電解質含有緩衝液を連続的に添加混合
しかつその際使用電解質の濃度が溶出量に依存し
て増大し、しかも好ましくは直線的に依存して増
大するようにして溶出を行う。電解質の最終濃度
は0.1M〜1M、好ましくは0.3M〜0.8Mである。
交換クロマトグラフイーの温度は一定に保つ必要
があり、０〜50℃、好ましくは15〜30℃とする。
溶出に用いられる溶液には前述の緩衝物質および
洗浄剤のほかに電解質、好ましくはMaClの如き
中性塩を0.01M〜0.5M、好ましくは0.05M〜0.3M
の濃度で含有せしめるか、あるいは電解質濃度勾
配を用いて電解質を含まないほかは同じ組成の溶
出緩衝液に電解質含有緩衝液を連続的に添加混合
しかつその際使用電解質の濃度が溶出量に依存し
て増大し、しかも好ましくは直線的に依存して増
大するようにして溶出を行う。電解質の最終濃度
は0.1M〜1M、好ましくは0.3M〜0.8Mである。
本発明によるインシユリン精製を次に実施例を
挙げて具体的に説明する。
挙げて具体的に説明する。
実施例 １
次の組成の緩衝液を調製する。
0.1M トリス−（ヒドロキシメチレ）−アミノメ
タン １％ Genapol（商標名）SE150（脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル） （HClでPH値を7.0に調節する） 前記緩衝液に0.5モル／のNaClを添加する。
450ｇのDEAE−Sephadex A25を前記緩衝液中
で膨潤させそしてその懸濁液を次に直径５cmおよ
び長さ100cmのカラムに充填する。そのカラムを
前記緩衝液で平衡にする。
タン １％ Genapol（商標名）SE150（脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル） （HClでPH値を7.0に調節する） 前記緩衝液に0.5モル／のNaClを添加する。
450ｇのDEAE−Sephadex A25を前記緩衝液中
で膨潤させそしてその懸濁液を次に直径５cmおよ
び長さ100cmのカラムに充填する。そのカラムを
前記緩衝液で平衡にする。
クエン酸塩緩衝液から結晶化した５ｇの豚イン
シユリンを75mlの前記緩衝液（NaCl不含）に溶
解する。最終PHは8.3とする。その透明な溶液を
カラムに導入し、そして25℃で速度を320ml／時
として前記緩衝液（PH7.0）で溶出する。その際
直線的NaCl濃度勾配は、溶出液中のNaCl濃度が
5.5の緩衝液流過の間に０から0.33Mまで増大
するように設定する。22mlずつフラクシヨンを集
める。溶出液の278nｍでの紫外吸収を測定し記
録する。豚インシユリンピークの中心部分
（0.1M〜0.24M NaCl）（1540ml）を集めそして70
mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形に沈殿す
る豚インシユリンを遠心分離後、自体既知の方法
でアセトン含有クエン酸塩緩衝液から結晶化す
る。純粋な豚インシユリンの収量（収率）は3.76
ｇ（75.2％）である。
シユリンを75mlの前記緩衝液（NaCl不含）に溶
解する。最終PHは8.3とする。その透明な溶液を
カラムに導入し、そして25℃で速度を320ml／時
として前記緩衝液（PH7.0）で溶出する。その際
直線的NaCl濃度勾配は、溶出液中のNaCl濃度が
5.5の緩衝液流過の間に０から0.33Mまで増大
するように設定する。22mlずつフラクシヨンを集
める。溶出液の278nｍでの紫外吸収を測定し記
録する。豚インシユリンピークの中心部分
（0.1M〜0.24M NaCl）（1540ml）を集めそして70
mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形に沈殿す
る豚インシユリンを遠心分離後、自体既知の方法
でアセトン含有クエン酸塩緩衝液から結晶化す
る。純粋な豚インシユリンの収量（収率）は3.76
ｇ（75.2％）である。
実施例 ２
次の組成の緩衝液を調製する。
0.1M トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン 0.12M NaCl １％ Genapol（商標名）ZDM110〔直鎖状合成
脂肪アルコール（平均分子量190）のエチレン
オキシド（脂肪アルコール１モルあたりエチレ
ンオキシド11モル）とのポリグリコールエーテ
ル〕 （HClでPH値を7.0に調節する。） 13ｇのQAE−Sephadex A25を前記緩衝液中で
膨潤させ、そしてその懸濁液を直径1.5cmおよび
長さ30cmのカラムに充填する。そのカラムを前記
緩衝液で平衡にする。結晶化後更にSephadex
G50でのゲルクロマトグラフイーにより自体既知
の方法で高分子成分を更に一段と分離除去してあ
る300mgの豚インシユリンを15mlの前記緩衝液に
溶解する（最終PHは8.2となる）。その透明な溶液
をカラムに載せ、そして25℃で速度を48ml／時と
して前記緩衝液（PH７）で溶出する。７mlずつフ
ラクシヨンを集める。溶出液の278nｍにおける
UV吸収を測定し記録する。豚インシユリンピー
クの中心部分（620ml）を集めそして28mlの１％
ZnCl2溶液を添加する。無定形に沈殿する豚イン
シユリンを遠心分離後自体既知の方法でアセトン
含有クエン酸塩緩衝液から結晶化する。純粋な豚
インシユリンの収量（収率）は185mg（61.6％）
である。
タン 0.12M NaCl １％ Genapol（商標名）ZDM110〔直鎖状合成
脂肪アルコール（平均分子量190）のエチレン
オキシド（脂肪アルコール１モルあたりエチレ
ンオキシド11モル）とのポリグリコールエーテ
ル〕 （HClでPH値を7.0に調節する。） 13ｇのQAE−Sephadex A25を前記緩衝液中で
膨潤させ、そしてその懸濁液を直径1.5cmおよび
長さ30cmのカラムに充填する。そのカラムを前記
緩衝液で平衡にする。結晶化後更にSephadex
G50でのゲルクロマトグラフイーにより自体既知
の方法で高分子成分を更に一段と分離除去してあ
る300mgの豚インシユリンを15mlの前記緩衝液に
溶解する（最終PHは8.2となる）。その透明な溶液
をカラムに載せ、そして25℃で速度を48ml／時と
して前記緩衝液（PH７）で溶出する。７mlずつフ
ラクシヨンを集める。溶出液の278nｍにおける
UV吸収を測定し記録する。豚インシユリンピー
クの中心部分（620ml）を集めそして28mlの１％
ZnCl2溶液を添加する。無定形に沈殿する豚イン
シユリンを遠心分離後自体既知の方法でアセトン
含有クエン酸塩緩衝液から結晶化する。純粋な豚
インシユリンの収量（収率）は185mg（61.6％）
である。
実施例 ３
次に組成の緩衝液を調製する。
0.1M トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン ２％ Genapol（商標名）SE150（実施例１参
照） （HClでPH値を7.0に調節する。） この緩衝液の一部分ずつにそれぞれ0.05モル／
、0.1モル／、2.0モル／および0.3／の
NaClを添加する。
タン ２％ Genapol（商標名）SE150（実施例１参
照） （HClでPH値を7.0に調節する。） この緩衝液の一部分ずつにそれぞれ0.05モル／
、0.1モル／、2.0モル／および0.3／の
NaClを添加する。
450ｇのDEAE−Sephadex A25をNaCl濃度
0.05Mの前記緩衝液中で膨潤させ、そしてその懸
濁液を次に直径５cmおよび長さ100cmのカラムに
充填する。そのカラムを前記緩衝液で平衡とす
る。
0.05Mの前記緩衝液中で膨潤させ、そしてその懸
濁液を次に直径５cmおよび長さ100cmのカラムに
充填する。そのカラムを前記緩衝液で平衡とす
る。
５ｇの豚インシユリン（実施例２参照）を100
mlの前記緩衝液（NaCl濃度0.05M）に溶解し（最
終PHは8.4となる）、前記カラムに載せそして25℃
で速度を290ml／時として溶出する。28mlずつフ
ラクシヨンを集める。1.82の緩衝液（NaCl濃
度度0.05M）が流過後、NaCl濃度0.1Mの緩衝液
4.76、NaCl濃度0.2Mのもの2.24および最後
にNaCl濃度0.3Mのもの5.3を載せる。溶出液の
紫外吸収を連続的に測定し記録する。
mlの前記緩衝液（NaCl濃度0.05M）に溶解し（最
終PHは8.4となる）、前記カラムに載せそして25℃
で速度を290ml／時として溶出する。28mlずつフ
ラクシヨンを集める。1.82の緩衝液（NaCl濃
度度0.05M）が流過後、NaCl濃度0.1Mの緩衝液
4.76、NaCl濃度0.2Mのもの2.24および最後
にNaCl濃度0.3Mのもの5.3を載せる。溶出液の
紫外吸収を連続的に測定し記録する。
主要量の豚インシユリンはこの場合、NaCl濃
度0.3Mの緩衝液を載せた後に溶出される。豚イ
ンシユリンピークの中心部分を集め（820ml）そ
して37mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形沈
殿を遠心分離した後豚インシユリンを自体既知の
方法でアセトン含有クエン酸塩緩衝液から結晶化
する。純粋な豚インシユリンの収量（収率）は
2.84ｇ（56.8％）である。
度0.3Mの緩衝液を載せた後に溶出される。豚イ
ンシユリンピークの中心部分を集め（820ml）そ
して37mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形沈
殿を遠心分離した後豚インシユリンを自体既知の
方法でアセトン含有クエン酸塩緩衝液から結晶化
する。純粋な豚インシユリンの収量（収率）は
2.84ｇ（56.8％）である。
実施例 ４
次の組成の緩衝液を調製する。
0.1M トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン ５％ Genapol（商標名）SE100（脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル） （HClを用いてPH値を7.0に調節する。） この緩衝液の一部に0.5モル／のNaClを添加
する。
タン ５％ Genapol（商標名）SE100（脂肪アルコー
ルポリグリコールエーテル） （HClを用いてPH値を7.0に調節する。） この緩衝液の一部に0.5モル／のNaClを添加
する。
13ｇのDEAE Sephadex A25を前記緩衝液中
で膨潤させ（NaClは用いない）そしてその懸濁
液を次に直径1.5cmおよび長さ30cmのカラムに充
填する。そのカラムを前記緩衝液で平衡にする。
300mgの豚インシユリン（実施例２参照）を15ml
の前記緩衝液（NaCl不含）に溶解する。（最終PH
は8.3となる）その透明な溶液をカラムに載せそ
して25℃で速度を48ml／時として溶出する。その
際、溶出液中のNaCl濃度が500mlの緩衝液の流過
中に０から0.5Mまで増大するようにNaClの直線
的濃度勾配を設定する。７mlずつフラクシヨンを
集める。溶出液の278nｍにおける紫外線吸収を
連続的に測定し記録する。豚インシユリンピーク
の中心部分（0.09M〜0.22M NaCl）（100ml）を
集め、4.6mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形
に沈殿する豚インシユリンを遠心分離し、次いで
自体既知の方法でアセトン含有クエン酸塩緩衝液
から結晶化させる。純粋な豚インシユリンの収量
（収率）は160mg（53.3％）である。
で膨潤させ（NaClは用いない）そしてその懸濁
液を次に直径1.5cmおよび長さ30cmのカラムに充
填する。そのカラムを前記緩衝液で平衡にする。
300mgの豚インシユリン（実施例２参照）を15ml
の前記緩衝液（NaCl不含）に溶解する。（最終PH
は8.3となる）その透明な溶液をカラムに載せそ
して25℃で速度を48ml／時として溶出する。その
際、溶出液中のNaCl濃度が500mlの緩衝液の流過
中に０から0.5Mまで増大するようにNaClの直線
的濃度勾配を設定する。７mlずつフラクシヨンを
集める。溶出液の278nｍにおける紫外線吸収を
連続的に測定し記録する。豚インシユリンピーク
の中心部分（0.09M〜0.22M NaCl）（100ml）を
集め、4.6mlの１％ZnCl2溶液を添加する。無定形
に沈殿する豚インシユリンを遠心分離し、次いで
自体既知の方法でアセトン含有クエン酸塩緩衝液
から結晶化させる。純粋な豚インシユリンの収量
（収率）は160mg（53.3％）である。
実施例 ５
洗浄剤として１％Arkopal（商標名）N100〔ノ
ニルフエノールポリグリコールエーテル（ノニル
フエノール１モルあたりエチレンオキシド10モル
含有）〕を用いるほかは実施例４と同様にして行
う。
ニルフエノールポリグリコールエーテル（ノニル
フエノール１モルあたりエチレンオキシド10モル
含有）〕を用いるほかは実施例４と同様にして行
う。
連続紫外分析はArkopal N100に固有吸収があ
るため、差異測定として行う必要がある。純粋な
豚インシユリンの収量（収率）は214mg（71.3
％）である。
るため、差異測定として行う必要がある。純粋な
豚インシユリンの収量（収率）は214mg（71.3
％）である。
実施例 ６
洗浄剤としてArkopal（商標名）N300〔ノニル
フエノールポリグリコールエーテル（ノニルフエ
ノール１モルあたりエチレンオキシド30モルを、
そしてイオン交換樹脂としてはQAE−Sephadex
A25を用いるほかは実施例４と同様にして行う。
純粋な豚インシユリンの収量（収率）は156mg
（52％）である。
フエノールポリグリコールエーテル（ノニルフエ
ノール１モルあたりエチレンオキシド30モルを、
そしてイオン交換樹脂としてはQAE−Sephadex
A25を用いるほかは実施例４と同様にして行う。
純粋な豚インシユリンの収量（収率）は156mg
（52％）である。
連続紫外分析はArkopal N300に固有吸収があ
るため差異測定として行う必要がある。
るため差異測定として行う必要がある。
実施例１〜６において用いられた洗浄剤はヘキ
スト社の商品である。
スト社の商品である。
実施例１〜６において用いられたイオン交換樹
脂はフアルマシア・フアイン・ケミカルズ社の商
品である。
脂はフアルマシア・フアイン・ケミカルズ社の商
品である。
実施例 ７
実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％に代えてGenapolPL44、
すなわちC12／C14脂肪族アルコールへのエチレン
オキシドおよびプロピレンオキシドの付加生成物
１％を使用しそして豚インシユリン300mgをその
緩衝液15ml中に溶解させた。純粋な豚インシユリ
ン230mg（76.7％）が得られた。
GenapolSE100 ５％に代えてGenapolPL44、
すなわちC12／C14脂肪族アルコールへのエチレン
オキシドおよびプロピレンオキシドの付加生成物
１％を使用しそして豚インシユリン300mgをその
緩衝液15ml中に溶解させた。純粋な豚インシユリ
ン230mg（76.7％）が得られた。
実施例 ８
実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにGenaminox KC
、すなわちアルキル−C10〜C18−ジメチルアミ
ンオキシド１％を使用しそしてデス−PheB1−豚
インシユリン300mgを精製した。純粋なデス−
PheB1−豚インシユリン198mg（66.0％）が得られ
た。
GenapolSE100 ５％の代りにGenaminox KC
、すなわちアルキル−C10〜C18−ジメチルアミ
ンオキシド１％を使用しそしてデス−PheB1−豚
インシユリン300mgを精製した。純粋なデス−
PheB1−豚インシユリン198mg（66.0％）が得られ
た。
実施例 ９
実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにGenagen CA 050
、すなわちヤシ脂肪族モノエタノールアミドポ
リエチレングリコールエーテル１％を洗浄剤とし
て使用して豚インシユリンＢ−鎖スルホネート
300mgを精製した。収量176mg（58.7％）。
GenapolSE100 ５％の代りにGenagen CA 050
、すなわちヤシ脂肪族モノエタノールアミドポ
リエチレングリコールエーテル１％を洗浄剤とし
て使用して豚インシユリンＢ−鎖スルホネート
300mgを精製した。収量176mg（58.7％）。
実施例 10
実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにスパン（Span）
60、すなわちソルビタンモノステアレート１％
を洗浄剤として使用して牛インシユリン300mgを
精製した。純粋な牛インシユリンの収量は228mg
（76.0％）であつた。
GenapolSE100 ５％の代りにスパン（Span）
60、すなわちソルビタンモノステアレート１％
を洗浄剤として使用して牛インシユリン300mgを
精製した。純粋な牛インシユリンの収量は228mg
（76.0％）であつた。
実施例 11
実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにトウイーン
（Tween）60、すなわちポリオキシエチレンソ
ルビタンステアレート１％を洗浄剤として使用し
て羊インシユリン300mgを精製した。純粋な羊イ
ンシユリン209mg（69.7％）が得られた。
GenapolSE100 ５％の代りにトウイーン
（Tween）60、すなわちポリオキシエチレンソ
ルビタンステアレート１％を洗浄剤として使用し
て羊インシユリン300mgを精製した。純粋な羊イ
ンシユリン209mg（69.7％）が得られた。
実施例 12
結晶ヒトインシユリン25mgをDEAE−セフアデ
ツクスA25（乾燥重量約1.4ｇ）を充填した直径
0.5cm、長さ30cmのカラム中で精製した。それ以
外は実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにオクチル−β−グ
ルコピラノシド１％を洗浄剤として使用しそし
て直線状のNaCl勾配60mlを適用した。
ツクスA25（乾燥重量約1.4ｇ）を充填した直径
0.5cm、長さ30cmのカラム中で精製した。それ以
外は実施例４におけると同様に操作するが、
GenapolSE100 ５％の代りにオクチル−β−グ
ルコピラノシド１％を洗浄剤として使用しそし
て直線状のNaCl勾配60mlを適用した。
実施例７〜９で使用される洗浄剤は商業製品で
ありそしてヘキスト社の商品名である。実施例10
〜12で使用される洗浄剤は商業製品でありそして
西ドイツ国ハイデルベルグのセルバ・フアインバ
イオケミカ（Serva Feinbiochemica）社から入
手しうる。
ありそしてヘキスト社の商品名である。実施例10
〜12で使用される洗浄剤は商業製品でありそして
西ドイツ国ハイデルベルグのセルバ・フアインバ
イオケミカ（Serva Feinbiochemica）社から入
手しうる。
Claims (1)
- １ 会合性高分子インシユリンを酸性または塩基
性イオン交換樹脂における緩衝化された水性溶媒
中でのイオン交換クロマトグラフイーにより精製
するにあたり、該緩衝化された溶媒に非イオン性
洗浄剤を溶解しておくことを特微とする、会合性
高分子インシユリンの精製方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2629568A DE2629568C3 (de) | 1976-07-01 | 1976-07-01 | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS535101A JPS535101A (en) | 1978-01-18 |
| JPS6126560B2 true JPS6126560B2 (ja) | 1986-06-20 |
Family
ID=5981950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7797677A Granted JPS535101A (en) | 1976-07-01 | 1977-07-01 | Purifying method of high molecular peptides |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4129560A (ja) |
| JP (1) | JPS535101A (ja) |
| AT (1) | AT352922B (ja) |
| AU (1) | AU509110B2 (ja) |
| BE (1) | BE856385A (ja) |
| CA (1) | CA1086308A (ja) |
| CH (1) | CH626051A5 (ja) |
| DE (1) | DE2629568C3 (ja) |
| DK (1) | DK149201C (ja) |
| ES (1) | ES460099A1 (ja) |
| FI (1) | FI61490C (ja) |
| FR (1) | FR2356630A1 (ja) |
| GB (1) | GB1582056A (ja) |
| GR (1) | GR78333B (ja) |
| IE (1) | IE44766B1 (ja) |
| IT (1) | IT1080658B (ja) |
| NL (1) | NL188804C (ja) |
| NO (1) | NO145692C (ja) |
| NZ (1) | NZ184516A (ja) |
| PT (1) | PT66751B (ja) |
| SE (1) | SE440507B (ja) |
| ZA (1) | ZA773964B (ja) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4701521A (en) * | 1978-07-17 | 1987-10-20 | The Trustees Of Boston University | Method of effecting cellular uptake of molecules |
| US4783441A (en) * | 1979-04-30 | 1988-11-08 | Hoechst Aktiengesellschaft | Aqueous protein solutions stable to denaturation |
| US4292041A (en) * | 1979-11-02 | 1981-09-29 | Merck & Co., Inc. | Surfactant assay |
| US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
| US4839341A (en) * | 1984-05-29 | 1989-06-13 | Eli Lilly And Company | Stabilized insulin formulations |
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| JPS6230956A (ja) * | 1985-07-31 | 1987-02-09 | Sumitomo Chem Co Ltd | 合成ペプチド類に含有されるイオン類の分析法 |
| DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| JPH07119767B2 (ja) * | 1989-03-07 | 1995-12-20 | 積水化学工業株式会社 | 梅毒検査用試薬及びその製造法 |
| DE4028120C2 (de) * | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| ES2099193T3 (es) * | 1991-12-18 | 1997-05-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de soluciones con contenido en insulina. |
| US6444788B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| US6451987B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of proteins and peptides |
| BRPI0413644A (pt) * | 2003-08-21 | 2006-10-17 | Novo Nordisk As | métodos para separar as duas formas de um polipeptìdeo tendo uma única racemização de aminoácido, e para separar dois polipeptìdeos, produto de polipeptìdeo, e, composição farmacêutica |
| US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
| US20080085298A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-10 | Biodel, Inc. | Rapid Mucosal Gel or Film Insulin Compositions |
| US20080096800A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-24 | Biodel, Inc. | Rapid mucosal gel or film insulin compositions |
| US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US7713929B2 (en) * | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| EP2012817A2 (en) | 2006-04-12 | 2009-01-14 | Biodel, Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
| WO2012104339A1 (en) | 2011-02-01 | 2012-08-09 | Novo Nordisk A/S | Purification of insulin |
| JP6116565B2 (ja) | 2011-08-25 | 2017-04-19 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィー法 |
| CN103827136B (zh) * | 2011-09-30 | 2016-07-06 | 通用电气健康护理生物科学股份公司 | 纯化裂解的胰岛素原的方法 |
| CN103130868B (zh) * | 2013-03-12 | 2014-09-17 | 合肥天麦生物科技发展有限公司 | 一种蛋白质或多肽的纯化方法 |
| US10155799B2 (en) | 2014-07-21 | 2018-12-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of insulin and insulin analogs |
| KR20200080748A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3616235A (en) * | 1968-05-16 | 1971-10-26 | Forsch Die Garungsindustrie En | Process for precipitating enzymes and enzymatic inactive proteins in solution with synthetic tanning materials |
| US3607858A (en) * | 1970-03-31 | 1971-09-21 | American Cyanamid Co | Process for preparing lyophilized human blood proteins such as gamma globulin in the presence of a nonionic surfactant |
| US3683939A (en) * | 1970-05-28 | 1972-08-15 | Wilson Pharm & Chem Corp | Proteinaceous cosmetic material for hair conditioning |
| US3907676A (en) * | 1970-07-28 | 1975-09-23 | Novo Terapeutisk Labor As | Process for purifying insulin |
| JPS5328989B2 (ja) * | 1974-05-27 | 1978-08-17 | ||
| US4076800A (en) * | 1975-01-13 | 1978-02-28 | The Procter & Gamble Company | Protein-containing detergent compositions for protecting keratinous materials |
-
1976
- 1976-07-01 DE DE2629568A patent/DE2629568C3/de not_active Expired
-
1977
- 1977-06-24 NL NLAANVRAGE7707037,A patent/NL188804C/xx not_active IP Right Cessation
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- 1977-06-28 GR GR53823A patent/GR78333B/el unknown
- 1977-06-28 CH CH792577A patent/CH626051A5/de not_active IP Right Cessation
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