JPS61268174A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な微生物に関する。更に詳しくは２本発明
はストレプトミセス・オガノネンシス（Ｓ　ｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｏｇａｎｏｎｅｎｓｉ　ｓ　）に属し、
スルホカイネ［従来技術］ 本発明に係る微生物は、オガノマイシンＢ及びセファマ
イシンＢを有利に産生ずる。これらの化合物はいずれも
抗菌活性に優れ抗菌剤として有用である他、そのセファ
ロスポリン核の３位の置換基が他の置換基と容易に交換
しうる特性を有しているので、他の７α−メトキシセフ
ァロスポリン系抗生物質の製造中間体としても重要であ
る。

オガノマイシンＢは、化学名が７β−（５−アミノ−５
−カルボキシバレラミド）−３−（ｐ−ヒドロキシシン
ナモイルオキシメチル）−７α−メトキシ−Δ３−セフ
ェムー４−カルボン酸であシ［以下、オガノマイシンＢ
を化合物（Ｉ）というコ、特開昭５３−１５３８７１号
（特公昭５９−３１５１７号）公報によシ既に公知であ
る。

また、セファマイシンＢは、化学名が７β−（５−アミ
ノ−５−カルボキシバレラミド）−３−（α−メトキシ
−ｐ−ヒドロキシシンナモイルオキシメチル）−７α−
メトキシ−Δ３−セフェムー４−カルボン酸であシ［以
下、セファマイシンＢを化合物（ＩＦ）という］、特開
昭４６−３２８６号公報に開示された化合物である。

化合物（Ｉ）は専ら前記特開昭５３−１５３８７１号公
報記載の方法、すなわちストレプトミセス・オガノネン
シスＹ−Ｇ１９Ｚ株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｇ
ａｎｏｎｅ−ｎｓｉｓ　５ａｉｔｏ　ｅｔ　０ｓｏｎｏ
　Ｙ−Ｇ　１９２株、微工研菌寄第２７２５号、　　Ａ
ＴＣＣ７１６３１１６７号）を無添加培養するか。

又は４−ヒドロキシケイヒ酸の存在下に培養し。

得られた発酵生産物［オガノマイシンＡ：化学名７β−
（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−７α−メ
トキシ−ａ−（ｐ−スルホキシシンナモイルオキシメチ
ル）−Δ３−セフェムー４−カルボン酸。以下オガノマ
イシンＡを化合物（ＩＩＩ）というコを含水アセトンで
処理する方法によって製造していた。

一方、特開昭４６−３２８６号公報には、ストレプトミ
セス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉ
ｃｅｕｓ　）を好気的条件下に培養すると、セファマイ
シンＡ［化学名７β−（５−アミノ−５−カルボキシバ
レラミド）−７α−メトキシ−３−（α−メトキシ−ｐ
−スルホキシシンナモイルオキシメチル）−Δ３−セフ
ェムー４−カルボン酸。以下化合物（ＩＶ）というコと
共に、化合物（ＩＩ）を産生ずることが示されている。

また、化合物（ＩＩ）は。

種々のストレプトミセス属に属する微生物、ストレプト
ミセス・ピリドクロモゲネス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙ−
ｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）ｓス
トレプトミセス・フインプリアタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　）、ストレプトミセ
スΦハルステップ４　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈ
ａｌｓｔｅｄｉｉ　）　。

ｍｙｃｅｓ　ｃｈａｒｔｒｅｕｓｆｓ　）を好気的条件
下に培養することによりても生産されることが知られて
いる（ベルギー特許第７６４．１６０号）。

［発明が解決しようとする問題点コ これらの公知技術は、その後ストレプトミセス・オガノ
ネンシスＹ−Ｇ１９Ｚ改良株の発酵生産物中に化合物（
ＩＩＩ）の他に化合物（ＩＶ）も含まれており、かつ化
合物（Ｉ）及び（ＩＩ）も産生じていることが明らかに
されたこともあって、化合物（Ｉ）あるいは化合物（ｎ
）の生産において化合物（ｍ）あるいは化合物（ＩＶ）
が同時産生ずるという点において密接な関連をもつこと
が見出された。

しかしながら、化合物（Ｉ）、　　（ｎ）の直接製造法
、あるいは化合物（Ｉ）、　　（Ｉｔ）を中間体とする
他の７α−メトキシセファロスポリン系抗生物質の生産
方法においても、化合物（■）、化合物（ＩＶ）の分解
産物の蓄積は、利用する微生物の生育及び二次代謝物生
成に悪影響を及ぼし、化合物（ＩＩＩ）、（ＩＶ）が発
酵中に生成することは、その発酵効率を増大させる観点
から好ましくなかった。

上記難点の克服のためには、化合物（Ｉ）、（Ｉｔ）の
みを産生ずる微生物の提供が望まれるが、このような微
生物は従来全く知られていない。

［問題点の解決手段］ かかる事情に鑑み９本発明者らはさらに突然変異株につ
いて鋭意研究した結果、ストレプトミセス・オガノネン
シスに属し、スルホカイネースを欠損した微生物が、化
合物（Ｉ）及び（ＩＩ）のみを選択的に生産し、かつ化
合物（Ｉ）及び（ＩＦ）の分解産物が再び菌体内に再吸
収、再利用され、微生物の生育条件に悪影響を与えるこ
となく、化合物ＣＩ）及び（ＩＩ）の生産量を飛躍的に
増大させることを知見して本発明の完成に到った。

（微生物） 本発明に係る微生物は、セファマイシン系抗生物質の産
生能を有するストレプトミセス・オガノネンシスの突然
変異株である。従来知られているストレプトミセスーオ
ガノネンシスに属する天然分離微生物（以下野生株とい
う）は。

いずれの培養条件や添加剤処理においても化合物（Ｉ）
、　（Ｉｆ）、（２）、（５）の生成が確認される。こ
れに対し２本発明に係る突然変異株はいずれの培養条件
や添加処理においても化合物（２）、＠）の生成は認め
られず化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）のみを特異的に生成す
る。従って９本発明の突然変異株は、スルホカイネース
が欠損したものであると認められ、この点において野性
法と区別される。

このような突然変異株は、野生株に対し周知の突然変異
処理９例えば、紫外線、Ｘ線、γ線の照射、Ｎ−メチル
−シーニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと
略記）、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、エチル
メタンスルホネートなどの突然変異誘起剤などを接触し
た後に選択培地に生育する。

本発明者等は、野生株をマレイン酸バッファー溶液中で
ＮＴＧ処理することにより変異株を得たものであるが、
その創製手段の具体的内容は。

ニドワード、ニー、アデルベルク等（Ｅｄｖｒａｒｄ　
Ａ、Ａｄｅｌｂｅｒｇａｔ、　ａｌ、）バイオケミカル
、バイオフィジカル、リサーチコミュニケーション（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ。

Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｔｏｎ　）　１
８巻、５号、７８８−７９５頁。

１９６５年に報告されているところによった。

化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）高感受性菌で検定し、親株と
異った株を取得することによって目的の突然変異株が取
得出来る。

この菌株は、微生物工業技術研究所に次の番号で寄託さ
れている。

ストレプトミセス・オガノネンシス（Ｓ、　ｏｇａｎｏ
ｎｅｎｓｉｓ）突然変異株４６８２７　　微工研菌寄第
８１４１号なお、親株のストレプトミセス・・オガノネ
ンシスＹ−Ｇ１９Ｚ株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託申請書受理番号第２７２５号として寄
託されており、その菌学的性状は特開昭５２−７９０８
１号に記されている。

本発明に係わる微生物は上記菌株に限られたものではな
く、微生物の突然変異株でストレプトミセス・オガノネ
ンシスに属し、かつスルホカイネースが欠失しているも
のであればよい。

したがって２人工的に得られた突然変異株以外にも土壌
分離菌でセファマイシン系抗生物質を産生しスルホカイ
ネースが欠失しているストレプトミセス・オガノネンシ
スに属する微生物も挙げられる。

次に２本発明に係る突然変異株の菌学的性状を記載する
。

■、形態学的特徴 菌株は天然培地上及び合成培地上でともによく発達した
基底菌糸を形成し発育するがその気菌糸着生は全く見ら
れない。

■、各種培養基上の性状 ｌ５Ｐ−１（）リブトファンーイーストエキストラクト
グロス） 菌株は黄味白色の毛様状菌体を形成する。

可溶性色素、胞子形成は見られない。

ｌ５Ｐ−２（イーストエキストラクト−マルトエキスト
ラクト寒天） 菌株は明茶灰色〜灰味黄茶の旺盛な生育を示す。胞子形
成は見られないが可溶性色素は僅かに黄茶色を認める。

ｌ５Ｐ−３（オートミル寒天） 菌株は明るいオリーブ灰色〜黄味白色の生育を示す。可
溶性色素、胞子形成とも見られない。

ｌ５Ｐ−４（無機塩−澱粉寒天） 菌株は明るいオリーブ灰〜オジーブ灰の生育を示す。可
溶性色素、胞子形成とも見られない。

ｌ５Ｐ−５（グリセロール−アスパラギン寒天）菌株は
旺盛な黄味白色の生育を示す。可溶性色素、胞子形成は
見られない。

ｌ５Ｐ−６（ペプトン−イーストエキストラクト−鉄寒
天） 菌株は透明な薄黄味茶色の旺盛な生育を示す。可溶性色
素、胞子着生は見られない。

ｌ５Ｐ−７（チロシン寒天） 菌株は透明で旺盛な茶味白色の生育を示し。

可溶性色素、胞子着生とも見られない。

■、生理学的性状　　　　　ラー十４突然変異株チロシ
ナーゼ生成反応　　　　　　　陰　性亜硝酸の生成反応
　　　　　陰　性 脱脂乳の凝固反応　　　　　弱陽性 脱脂乳のペプトン化反応　　　　弱陽性澱粉の加水分解
　　　　　　陽　性 ゼラチンの溶暗性　　　　　弱陽性 しフラー凝固血清寒天下の溶解性　　　陰　性線維素の
分解　　　　　　弱陽性 生育温度　　　　１５℃〜４２℃ 生育ｐＨ５，８〜１０ ■、炭素源の同化性（プリートノ・ム・ゴトリーブ寒天
培地） ／１６６８２７菌株 利用する炭素源 ｄ−グルコース、ｌ−アラビノース。

ｄ−キシロース、ｄ−マンニラトール。

ｄ−フルクトース、セルロース 利用しない炭素源 ｉ−イノシトール、サッカロース。

ラムノース、ラフィノース 以上、この菌株は特開昭５２−７９０８１に述べたスト
ブトミセス・オガノネンシスＹ−Ｇ１９Ｚの特徴を失っ
ていないが菌学的性状に相違する点が認められた。第１
表にその相違点を挙げる。

第　　１　　表　　′ Ｗ突然変異株４６８２７を液体培地による深部振盪培養
及び攪拌培養することによって行なうのが有利である。

本発明は同変異株に限定されるものではなくＸ線、γ線
、紫外線等の照射、化学変異剤処理。

化合物質の耐性処理、ファージ接触、形質転換。

形質導入、接合による遺伝子組換え、細胞融合による遺
伝子組換え、プラスミドによる遺伝子導入などにより化
合物（Ｉ）及び（ＩＩ）の生産能が高められた菌株を使
用することができる。

（培養） 培養に用いられる培地としては、ストレプトミセス７、
オガノネンシスに属する本菌株が利用する栄養源を含有
する培地であればよい。すなわち合成培地、半合成培地
あるいは天然培地が用いられ、培地の組成は、たとえば
炭素源としチクルコース、フルクトース、マンニラ）　
−／ｌ／　。

グリセリン、デキストリン、でん粉、植物油などが、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿
実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチープリカー
、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム。

尿素その他の有機まだは無機の窒素源が用いられる。ま
た金属塩としてＮａ、　Ｋ、　Ｍｇ、　Ｃａ、　Ｚｎ、
　Ｆｅなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩
などが必要に応じて添加される。さらに必要に応じて、
メチオニン、システィン、シスチン。

オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤
などの抗生物質生成促進物質又は消泡剤が適宜使用され
る。

培養としては好気的条件下に培養するのが一般的に有利
で、培養温度は１８〜３５℃の範囲が望ましく、好まし
くは約３０℃附近が用いられ。

培地のｐＨは約５〜１０．好ましくは約６〜８の範囲に
保持すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、
温度などによって変動するが。

一般に３〜１０日程度でよく、培養終了時に化合物（Ｉ
）及び（ｎ）が蓄積される。

培養物よシ本発明の目的物を単離採取する場合には通常
の微生物の培養物より抗生物質を単離する方法が適用さ
れる。目的物は主に培養液　。

中に含有されるので、遠心分離または濾過によシ菌体を
除去した後、濾過液から有効物質の抽出をおこなう。す
なわち適当な溶剤に対する溶解性および溶解度の差、溶
液からの析出性および析出速度の差９種々の吸着剤に対
する吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差な
どを利用する一般の抗生物質の製造に用いられる手段に
よって９分離、採取、精製される。この方法は必要に応
じて単独で用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用できる。

［効　果］ 本発明に係る微生物は、従来公知の菌株に比し、化合物
（Ｉ）、　（ＩＩ）のみを選択的に産生し、かつその産
生量を著しく増大させることができ。

極めて有用である。従って９本発明に係る微生物は、化
合物（Ｉ）、　（静の抗菌剤としての利用あるいは他の
７α−メトキシセファロスポリン系抗生物質の中間体と
しての有用性を顕著に高める。また、この微生物を特開
昭５２−７９０８１号に開示のチオール化合物の存在下
に培養させるときは、３位にチオール化合物の導入され
た７α−メトキシセフアロスポリン系抗生物質の産生を
著しく高めることができる。

このような目的化合物の産生量の増大は、スルホカイネ
ースの作用を受けることなく化合物（Ｉ）及び（ｎ）の
みが特異的に蓄積されることに基づくものと認められる
。特に、化合物（Ｉ）反結合する際に遊離する３位側鎖
のｐ−ヒドロキシシンナモイル残基あるいはα−メトキ
シ−ｐ−ヒドロキシシンナモイル残基が微生物細胞内に
取り込まれ再利用されるためであると認められる。

この再利用等の認定は本発明の微生物を培養して得られ
た化合物の分析や放射性元素のトレースの下記実験例に
よって確認された。

実験例１゜ 澱粉１％、グルコース１％、大豆粉１．５％、イースト
エキストラクト０．５％、リン酸水素ナトリウム０．１
％、硫酸マグネシウム０．０５％９食塩０、３％を含む
培地を５００　ｒｎｌの三角フラスコに７５ｍ１ずつ分
注し１２０℃、２０分間滅菌する。

それにストレプトミセス・オガノネンシス徊＝モー目突
然変異株４６８２７（微工研菌寄第８１４１号）を接種
し２種培養として、３０°Ｃ４０時間培養する。別に、
デキストリンエ５％、大豆粉２％。

グルテンミール２％、硫酸第二鉄０．４％２重炭酸ソー
ダ０．２３％、水酸化ナトリウム０．２３％を含む主醗
酵培地３０　ｒｎｌを１２０℃、３０分間減菌したのち
これに種培養液１　ｍｌを接種し３０℃で１５０時間培
養後、ｐＨ３，０に４Ｎの塩酸で修正したのちｆ過し、
水洗液と合せると３５ｍ１のｒ液が得られた。

これを以下の分析条件で分析して、公知の化合物（１）
及び（ＩＩ）の生成を確認した。化合物（ＩＩ）は９２
０μｇ／ｍｌ得られた。一方、化合物（ＩＩＩ）及び（
ＩＶ）は検出されなかった。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カ　ラ　ム　
：　リクロソルプ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）　ＲＰ−１
８（メルク製）溶　出　液：　０．０１　Ｍ、　ＰＨ＝
４．０．酢酸緩衝液：メタノール＝８０％＝２０％ 流　　　　速：　　１．３　ｔｎｌ　／　ｍｉｎカラム
温度＝３７°Ｃ 検　　　　出：ＵＶ２５４ｎｍ 溶出時間 化合物（１）　：　５分５４秒 （ＩＱ：６分５４秒 実施例２゜ 澱粉１％、グルコース１％、大豆粉１．５％。

イーストエキストラクト０．５％、リン酸水素ナトリウ
ム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％９食塩０．３
％を含む培地を５００　ｍｌの三角フラスコに７５ｍ１
ずつ分注し１２０℃、２０分間滅菌する。

ツレにストレプトミセス・オガノネンシス和式噂←’Ｆ
？突然変異株４６８２７　（微工研菌寄第８１４１号）
を接種し２種培養として、３０℃４０時間培養する。別
に、デキストリン１５％、大豆粉２覧グルテンミール２
％、硫酸第二鉄０．４％９重炭酸ソーダ０．２３％、水
酸化ナトリウム０．２３％を含む主醗酵培地３０ｍ４を
１２０℃、３０分間滅菌したのちこれに種培養液１　ｒ
ｎｌを接種し３０℃で１３０時間培養後、化合物（ＩＩ
）の３位側鎖であるα−メトキシシンナミックアシドの
ラベル体１．５μＣｉを添加し２１時間後の化合物（Ｉ
［）へその２６．１％が取込まれていた。化合物（Ｉ［
Ｉ）及び（ＩＶ）は検出されなかった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトミセス・オガノネンシス（Ｓｔｒｅｐ
   ｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｏｇａｎｏｎｅｎｓｉｓ）に属し、
   スルホカイネースが欠損していることを特徴とする微生
   物
2. （２）ストレプトミセス・オガノネンシス 突然変異株Ｎｏ．６８２７号菌株微工研菌寄第８１４１
   号である特許請求の範囲第（１）項記載の微生物