JPS61282085A - ビフエニル代謝機能を備えた外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ及びこれを保有する新規な微生物 - Google Patents
ビフエニル代謝機能を備えた外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ及びこれを保有する新規な微生物Info
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- JPS61282085A JPS61282085A JP60124555A JP12455585A JPS61282085A JP S61282085 A JPS61282085 A JP S61282085A JP 60124555 A JP60124555 A JP 60124555A JP 12455585 A JP12455585 A JP 12455585A JP S61282085 A JPS61282085 A JP S61282085A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）本発明はビフェニル代謝機能を有するシュウトモ
ナス・シュウ、本遺伝子は、例えば増殖能の高いシュウ
トモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ）やシュウトモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等に組換え形
質転換させた微生物を用いて化合物■２−ハイドロキシ
−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジェノイ
ックアシッド及びその誘導体を製造せしめ、病源菌とし
て知られている例えばスタフィロコッカス属などのグラ
ム陽性菌及び大腸菌などのダラム陰性菌に対する殺菌剤
や生理活性物質の中間体としての生産に寄与できること
が期待されるものである。
ナス・シュウ、本遺伝子は、例えば増殖能の高いシュウ
トモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ）やシュウトモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等に組換え形
質転換させた微生物を用いて化合物■２−ハイドロキシ
−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジェノイ
ックアシッド及びその誘導体を製造せしめ、病源菌とし
て知られている例えばスタフィロコッカス属などのグラ
ム陽性菌及び大腸菌などのダラム陰性菌に対する殺菌剤
や生理活性物質の中間体としての生産に寄与できること
が期待されるものである。
（ロ）従来の技術
従来、ビフェニルを資化する細菌については数種類分離
され、その代謝様式も検討されているが、遺伝子単位で
検討された例は知られていない。
され、その代謝様式も検討されているが、遺伝子単位で
検討された例は知られていない。
また、ビフェニルの特定の中間代謝物については代謝様
式を含めて遺伝子単位で検討された例はない。
式を含めて遺伝子単位で検討された例はない。
そこで、本発明者らはビフェニル代謝機構に関連する遺
伝子について研究を進めた結果、シュウドモナス・シュ
ウドアルカリゲネス由来の遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃをと
り出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
伝子について研究を進めた結果、シュウドモナス・シュ
ウドアルカリゲネス由来の遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃをと
り出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
（ハ）発明の構成
ＫＦ７０７） （ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）を例示
できる。
できる。
なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりである。
ダラム 陰性
桿菌 ０．７Ｘ１．５〜２．０μ極鞭毛
１本 色素産生 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 ４１℃での生育 陽性 最適生育温度 ３５℃ 資化性 グルコース、こはく酸、乳酸、
ピルビン酸以上の菌学的性質からバージイーズ マニュ
アル オブ システィなお、本菌株は、新規な外来遺伝
子ｂｐｈ Ａ−Ｃを保有する点で新規な微性物である
。
１本 色素産生 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 ４１℃での生育 陽性 最適生育温度 ３５℃ 資化性 グルコース、こはく酸、乳酸、
ピルビン酸以上の菌学的性質からバージイーズ マニュ
アル オブ システィなお、本菌株は、新規な外来遺伝
子ｂｐｈ Ａ−Ｃを保有する点で新規な微性物である
。
本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記菌株を例えばＬ
培地（バクトリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食
塩５ｇ、蒸溜水ｉｔ）に−晩増殖させ、リゾチーム−３
ＤＳ法により溶菌し染色体ＤＮＡを調製し、次いで、染
色体ＤＮＡ （１μｇ）を制限酵素ＸｈｏＴで切断する
ことにより、本遺伝子を得ることができる。
培地（バクトリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食
塩５ｇ、蒸溜水ｉｔ）に−晩増殖させ、リゾチーム−３
ＤＳ法により溶菌し染色体ＤＮＡを調製し、次いで、染
色体ＤＮＡ （１μｇ）を制限酵素ＸｈｏＴで切断する
ことにより、本遺伝子を得ることができる。
本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表に示すと
おりである。
おりである。
（＞゛ＡＴ−酪臼）
第１表
また、本遺伝子の断片の制限酵素地図は第１図に示され
るとおりである。
るとおりである。
次に、本遺伝子のビフェニル代謝様式と遺伝子群との関
係は次に示すとおりである。
係は次に示すとおりである。
！ ■ ■
■Ｐ ｉＰ＆ 八 ｋｋ６ ６１１
（？上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る酵素
を示し、Ａはビフェニル オキシゲナーゼ、Ｂはジヒド
ロキシジオール デヒドロゲナー九〇はフェニルカテコ
ール オキシゲナーゼを各々示している。
■Ｐ ｉＰ＆ 八 ｋｋ６ ６１１
（？上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る酵素
を示し、Ａはビフェニル オキシゲナーゼ、Ｂはジヒド
ロキシジオール デヒドロゲナー九〇はフェニルカテコ
ール オキシゲナーゼを各々示している。
また、これらの酵素に対応する遺伝子として、ｂｐｈＡ
、ｂｐｈＢ。
、ｂｐｈＢ。
ｂｐｈＣが存在しこれらの遺伝子はオペロンを形成して
いる。またＰはプロモーターを示す。
いる。またＰはプロモーターを示す。
本遺伝子の利用にあたっては、例えば、大腸菌エシェリ
ヒア・コリ’ＫＦ６３７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＫＦ６３７）’（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９
６）由来のｐＫＦ３３０を常法により該菌株より取り出
した後、制限酵素Ｘｈｏｌで切断後Ｔ４リガーゼで結合
さく１− マイ°シン耐性遺伝子部位にはＸｈｏｌなどの挿入失活
部位ををしており、またカナマイシンのプロモーターを
利用できる。
ヒア・コリ’ＫＦ６３７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＫＦ６３７）’（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９
６）由来のｐＫＦ３３０を常法により該菌株より取り出
した後、制限酵素Ｘｈｏｌで切断後Ｔ４リガーゼで結合
さく１− マイ°シン耐性遺伝子部位にはＸｈｏｌなどの挿入失活
部位ををしており、またカナマイシンのプロモーターを
利用できる。
次に宿主株として増殖能の高いシュウトモナス・プチダ
ＫＦ１０７（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ＫＦ１０７）（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９４）やシュウト
モナス・エルギノーザＫＦ２０４ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＫＦ２０４）など
を例示できる。形質転換方法及び形質転換体の選択にあ
たっては、該菌株等を対数増殖期（５Ｘ１０” 細胞
／ ｍ Ｉ！ ）まで培養し、集菌、洗浄後、冷バッフ
ァー （１０ｍＭ ＭＯＰＳ−１０ｍＭ ＲｂＣｆ
−１００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、ｐＨ７，０）に懸濁し
、次いで遠心後、冷バッフｙ−ＩＩ（１００ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ−１０ｍＭ ＲｂＣ１−１００ｍＭ ＣａＣ
１ｚ 、ｐＨ６，５）に再懸濁し０℃、３０分インキエ
ベートする。次に遠心後、菌株を１／１０量の冷バッフ
ァー■に懸濁する。この０． ２ｍｊ！コンピテントセ
ルに組換えプラスミド（０，５、′− 地上でｐＫＦ３３０及び組換えプラスミドを保有する形
質転換体を１次スクリーニングする。ビフェニル遺伝子
を保存する目的とする形質ｉ喚体（組換え微生物）は２
．３−ジヒドロキシビフェニル溶液（’４ｍｇ／ｍｌ）
を−次スクリーニングで生じたコロニーに噴霧すること
により黄変するコロニーを選択する。ビフェニル代謝遺
伝子を含むクローンはビフェニル及びビフェニル関連化
合物より黄色物質を蓄積させ、黄色物質を酸性下（ｐＨ
１〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリチルシリル化して
ＧＣ−ＭＳによる分析を行いこれが化合物■（図４）及
びその誘導体であることを確認する。
ＫＦ１０７（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ＫＦ１０７）（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９４）やシュウト
モナス・エルギノーザＫＦ２０４ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＫＦ２０４）など
を例示できる。形質転換方法及び形質転換体の選択にあ
たっては、該菌株等を対数増殖期（５Ｘ１０” 細胞
／ ｍ Ｉ！ ）まで培養し、集菌、洗浄後、冷バッフ
ァー （１０ｍＭ ＭＯＰＳ−１０ｍＭ ＲｂＣｆ
−１００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、ｐＨ７，０）に懸濁し
、次いで遠心後、冷バッフｙ−ＩＩ（１００ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ−１０ｍＭ ＲｂＣ１−１００ｍＭ ＣａＣ
１ｚ 、ｐＨ６，５）に再懸濁し０℃、３０分インキエ
ベートする。次に遠心後、菌株を１／１０量の冷バッフ
ァー■に懸濁する。この０． ２ｍｊ！コンピテントセ
ルに組換えプラスミド（０，５、′− 地上でｐＫＦ３３０及び組換えプラスミドを保有する形
質転換体を１次スクリーニングする。ビフェニル遺伝子
を保存する目的とする形質ｉ喚体（組換え微生物）は２
．３−ジヒドロキシビフェニル溶液（’４ｍｇ／ｍｌ）
を−次スクリーニングで生じたコロニーに噴霧すること
により黄変するコロニーを選択する。ビフェニル代謝遺
伝子を含むクローンはビフェニル及びビフェニル関連化
合物より黄色物質を蓄積させ、黄色物質を酸性下（ｐＨ
１〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリチルシリル化して
ＧＣ−ＭＳによる分析を行いこれが化合物■（図４）及
びその誘導体であることを確認する。
（ニ）実施例
実施例１
ビフェニル資化性菌シュウトモナス・シェウドアルカリ
ゲネスＫＦ７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）をＬ
培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、０．１Ｍトリス（ｐ
Ｈ７，９） 、１ｍＭ ＥＤＴＡ バッファーに懸
濁する０次にリゾチームを最Ｐ−濃度２μｇ ／ ｍ
１２になるよう（−加え、室温で５分間インキュベート
し、１０％ＳＤＳを５０μ４１７ ｍ ｌになるように
加え溶菌した。
ゲネスＫＦ７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）をＬ
培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、０．１Ｍトリス（ｐ
Ｈ７，９） 、１ｍＭ ＥＤＴＡ バッファーに懸
濁する０次にリゾチームを最Ｐ−濃度２μｇ ／ ｍ
１２になるよう（−加え、室温で５分間インキュベート
し、１０％ＳＤＳを５０μ４１７ ｍ ｌになるように
加え溶菌した。
次いでプロナーゼ、ＲＮａ ｓ ｅ処理をしたのちフェ
ノール抽出を行い、エーテルでフェノールを除去した。
ノール抽出を行い、エーテルでフェノールを除去した。
このようにして調製したＤＮＡは１０ｍＭトリス、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ バッファーに透析した。
Ｍ ＥＤＴＡ バッファーに透析した。
一方、プラスミドｐＫＦ３３０を有するエシェリヒア・
コリＫＦ６した。次いで組換えプラスミドを宿主株であ
るシュウトモナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥ
ＲＭ Ｐ−８２９５）に導入した。すなわち、対数増
殖期（約４Ｘ１０’セル／ ｍ ｊ！ ）のＫＦ２０４
株を集菌し、等量の冷バッフｙ−（１０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ、１０ｍＭ ＲｂＣｊ！。
コリＫＦ６した。次いで組換えプラスミドを宿主株であ
るシュウトモナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥ
ＲＭ Ｐ−８２９５）に導入した。すなわち、対数増
殖期（約４Ｘ１０’セル／ ｍ ｊ！ ）のＫＦ２０４
株を集菌し、等量の冷バッフｙ−（１０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ、１０ｍＭ ＲｂＣｊ！。
１００ｍＭ ＭｇＣ１ｔ 、ｐＨ７，０）で洗浄後、
冷バッフｙ−１１（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ
ＲｂＣｊ！、１００ｍＭ ＣａＣ１ｚ。
冷バッフｙ−１１（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ
ＲｂＣｊ！、１００ｍＭ ＣａＣ１ｚ。
ｐＨ６，５）に再懸濁し、０℃にて３０分間放置した。
次に遠心後、１／１０量の冷バッファー■に再懸濁し、
その０．２ｍｌ細胞懸濁液と精製したｐＭＦＢｌ（０，
５μｇ）と０℃、１時間インキュベートした。４２℃で
２分間、ヒートショックした後、３ｍｌのし培地を加え
３０°Ｃで３時間培養した。ビフェニル代謝遺伝子群（
ｂｐｈ Ａ−Ｃ）の組込まれたｐＭＦＢｌを保有する
形質転換体はストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｆ）
を含むＬ−寒天培地で２，３−ジヒドロキシビフェニル
溶液（１ｍｇ／ｒｒｌ ）を噴霧して黄色となすると７
．９ｋｂのｂｐｈ Ａ−Ｃ遺伝子が切り出された０本
遺伝子は第１図に示す制限酵素切断点を有していた。
その０．２ｍｌ細胞懸濁液と精製したｐＭＦＢｌ（０，
５μｇ）と０℃、１時間インキュベートした。４２℃で
２分間、ヒートショックした後、３ｍｌのし培地を加え
３０°Ｃで３時間培養した。ビフェニル代謝遺伝子群（
ｂｐｈ Ａ−Ｃ）の組込まれたｐＭＦＢｌを保有する
形質転換体はストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｆ）
を含むＬ−寒天培地で２，３−ジヒドロキシビフェニル
溶液（１ｍｇ／ｒｒｌ ）を噴霧して黄色となすると７
．９ｋｂのｂｐｈ Ａ−Ｃ遺伝子が切り出された０本
遺伝子は第１図に示す制限酵素切断点を有していた。
・、）
実施例２
’＋１
、′実施例１で調製した組換えプラスミドｐＭＦＢ１を
用いて、シュウ“ド゛モナス・プチダＫＦ１０７ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−８２９４）を実施例１の方法によって形
質転換した。その結果、ｌＸｌ０’セル／μｇＤＮ炭素
源としてこはく酸（１ｍｇ／ｍｊ！ ）ｉ含むＢＳＭ寒
天培地に塗布（ｔＦＩｌ） Ｌヒフェニル粉末をペトリ
皿のふたにおし〕でビニールテープでシールした。ＫＦ
２５７株の増殖とともにビフェニル蒸気をとり込んだ菌
体は、ビフェニルを化合物■に変化せしめ、培地は鮮や
かに黄変した。
用いて、シュウ“ド゛モナス・プチダＫＦ１０７ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−８２９４）を実施例１の方法によって形
質転換した。その結果、ｌＸｌ０’セル／μｇＤＮ炭素
源としてこはく酸（１ｍｇ／ｍｊ！ ）ｉ含むＢＳＭ寒
天培地に塗布（ｔＦＩｌ） Ｌヒフェニル粉末をペトリ
皿のふたにおし〕でビニールテープでシールした。ＫＦ
２５７株の増殖とともにビフェニル蒸気をとり込んだ菌
体は、ビフェニルを化合物■に変化せしめ、培地は鮮や
かに黄変した。
上記の反応はｐＭＦＢｌを保有しない宿主株シュウトモ
ナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８
２９５＞では全く認められなかった。以上の反応はｐＭ
ＦＢｌを保存するシュウトモナス・プチダＫＦ１３８に
おいても同様に認められた。
ナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８
２９５＞では全く認められなかった。以上の反応はｐＭ
ＦＢｌを保存するシュウトモナス・プチダＫＦ１３８に
おいても同様に認められた。
なお、宿主株及びｐＭＦＢｌを保有するＫＦ２５７株に
ついてダラム染色 陰性 鞭毛 １本 、細胞の大きさ ０．５−０．７Ｘ２．０
最適生育塩度 ３７℃ 青色色素（ビオシアニン） 生成 オキシダーゼ ＋ ＧＣ含量 ６７％ 以上の性質等によりＫＦ２５７株はシュウトモナス・エ
ルギノーザであることを確認した。
ついてダラム染色 陰性 鞭毛 １本 、細胞の大きさ ０．５−０．７Ｘ２．０
最適生育塩度 ３７℃ 青色色素（ビオシアニン） 生成 オキシダーゼ ＋ ＧＣ含量 ６７％ 以上の性質等によりＫＦ２５７株はシュウトモナス・エ
ルギノーザであることを確認した。
また、宿主株及びｐＭＦＢＴを保有するＫＦ１３８株に
ついてダラム染色 陰性 鞭毛 〉１ ビオシアニン 生成せず 螢光色素 生成 至適生育温度 ２５−３０℃ オキシダーゼ ＋ ＧＣＣ含量 ６０％ でんぷん加水分解 十 以上の性質等によりＫＦ１３８株はシュウトモナス・プ
チダであるハイドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘ
キサ−２，４−ジェノイックアシッド及びその誘導体を
安価に製造することが可能となる。
ついてダラム染色 陰性 鞭毛 〉１ ビオシアニン 生成せず 螢光色素 生成 至適生育温度 ２５−３０℃ オキシダーゼ ＋ ＧＣＣ含量 ６０％ でんぷん加水分解 十 以上の性質等によりＫＦ１３８株はシュウトモナス・プ
チダであるハイドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘ
キサ−２，４−ジェノイックアシッド及びその誘導体を
安価に製造することが可能となる。
第１図は外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃの制限酵素切断地
図を示す。 第２図はエシエリヒヤ・コリ由来のプラスミドｐＫＦ３
３０の構造を示す。 第３図は組換えプラスミドｐＭＦＢ１の作製手順とその
構造を示す。 特許出願人 工業技術院長 等々力 達ｑ）
［６°Ｌ −一一一一一一一一−−−Ｐｓｔ工 ＥｃｏＲ工 Ｓａｃ工
図を示す。 第２図はエシエリヒヤ・コリ由来のプラスミドｐＫＦ３
３０の構造を示す。 第３図は組換えプラスミドｐＭＦＢ１の作製手順とその
構造を示す。 特許出願人 工業技術院長 等々力 達ｑ）
［６°Ｌ −一一一一一一一一−−−Ｐｓｔ工 ＥｃｏＲ工 Ｓａｃ工
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）シュウドモナス・シュウドアルカリゲネス由来のビ
フェニル代謝機能を有する外来遺伝子であって、分子量
が７．９キロベースであり、次の制限酵素において塩基
の切断数が特徴づけられる外来遺伝子 Ｐｓｔ I ，６個 ＢｇｌII，１ Ｘｈｏ I １ ＥｃｏＲ I ，２ ＢａｍＨ I ，１ Ｘｂａ I ０ Ｓｍａ I ，１ Ｓａｃ I ，１ ＨｉｎｄIII ０ Ｓａｌ I ，０ Ｈｐａ I ，０ ２）シュウドモナス・シュウドアルカリゲネス由来のビ
フェニル代謝機能を有する外来遺伝子であって、分子量
が７．９キロベースであり、次の制限酵素において塩基
の切断数が特徴づけられる外来遺伝子 Ｐｓｔ I ，６個 ＢｇｌII，１ Ｘｈｏ I １ ＥｃｏＲ I ，２ ＢａｍＨ I ，１ Ｘｂａ I ０ Ｓｍａ I ，１ Ｓａｃ I ，１ ＨｉｎｄIII ０ Ｓａｌ I ，０ Ｈｐａ I ，０ を保有する新規な微生物シュウドモナス・シュウドアル
カリゲネスＫＦ７０７株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124555A JPS61282085A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ及びこれを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124555A JPS61282085A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ及びこれを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282085A true JPS61282085A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH0336515B2 JPH0336515B2 (ja) | 1991-05-31 |
Family
ID=14888376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60124555A Granted JPS61282085A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ及びこれを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282085A (ja) |
-
1985
- 1985-06-08 JP JP60124555A patent/JPS61282085A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0336515B2 (ja) | 1991-05-31 |
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