JPS61282076A - 耐熱性トリプトファナーゼおよびその製法 - Google Patents

耐熱性トリプトファナーゼおよびその製法

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JPS61282076A JP60124546A JP12454685A JPS61282076A JP S61282076 A JPS61282076 A JP S61282076A JP 60124546 A JP60124546 A JP 60124546A JP 12454685 A JP12454685 A JP 12454685A JP S61282076 A JPS61282076 A JP S61282076A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａ
ｎ）の工業的合成などの用途に有用な従来公知文献未記
載の耐熱性トリプトファナーゼ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
α−８−）、その醗酵法による製法及びその製法に利用
する従来公知文献未記載の耐熱性トリプトファナーゼ生
産性微生物に関する。
更に詳しくは、本発明は、その耐熱性特性において従来
公知のトリプトファナーゼと明瞭に区別される耐熱性ト
リプトファナーゼ、特に、約７０℃（ｐＨ＝８．０）に
作用至適温度を有し且つ約６５℃（ｐＨ＝＆ｏ、保持時
間４０分）までは熱失活しない耐熱特性を有することを
特徴とする新規な耐熱性トリプトファナーゼに関する。
本発明はまた、この新規耐熱性トリプトファナーゼの醗
酵法による製法及びこの製法の実施に使用するのに適し
た新規な耐熱性トリプトファナーゼ生産性微生物にも関
し、とくに、トリプトファン含有合成培地において単独
では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃ
ｉｌｌｗｓ）ｓｐ、　５ｔｒａｉｔｘＳ）との共生によ
り生育する従来完全に未知の耐熱性トリプトファナーゼ
生産性桿菌、及び該桿菌を培養し培養物から耐熱性トリ
プトファナーゼを採取することを特徴とする耐熱性トリ
プトファナーゼの製法にも関する。
従来、トリプトファナーゼは、ピリドキサールリン酸Ｃ
ＰＬＰ＞の関与のもとに、Ｌ−トリプトファンからピル
ビン酸、インドール、アンモニアを生成するα、β脱離
反応を触媒する反応の他に、たとえばインドールとＬ−
セリンからＬ−）リプトファンを合成する反応、すなわ
ち上記反応とは逆反応のβ置換反応も触媒する酵素とし
て知られており、たとえばエシェリキア・コリａ胚江二
紅ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、アイ買モナス・リクイファ
シェンス（Ａｔｔｒｏｍｏｎａｓ　ＬｉｑｌＬｅｆａｃ
ｔｅｎｓ）、プロテウｘ−レトゲリ（ｐｒｏｔｅｕｓ　
ｒｅｔｔｇｅｒｉ）などの如き腸内細菌群を中心とする
微生物から見出されている公知酵素である。
このような従来公知のトリプトファナーゼは、約３３〜
３５℃（ｐＨ＝＆ｏ）付近に作用至適温度を有し且つ約
４０℃（ｐ　Ｈ＝　＆　Ｏ、保持時間４０分）以上では
実質的に熱失活する酵素特性を有する酵素であるため、
その利用に際し、反応温度、熱安定性などの耐熱性の点
で著るしい制約を受けるという技術的難点があった。
本楯明者等は、上述の技術的難点を克服したトリプトフ
ァナーゼを創製すぺ研究を行ってきた。
その結果、本発明者等の試験したかぎシ、天然培地及び
トリプトファン含有合成培地のいずれにおいても単独で
は生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｅａｃｔ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、５ｔｒａｉｎ　Ｓ　）との共生により
生育する従来完全に未知で且つ如何なる公知文献にも未
記載の特異な生育特性を有するトリプトファナーゼ生産
性桿菌を土壌試料より分離採取することに成功し、且つ
該新規桿菌が約７０’Ｃ（ｐＨ＝＆ｏ）に作用至適温度
を有し且つ約６５℃（ｐＨ＝ｌＬｏ、保持時間４０分）
までは熱失活しない熱安定性を示す点で、公知トリプト
ファナーゼとは全く別異の新規酵素である本発明に称す
る耐熱性トリプトファナーゼを産生ずることを発見した
。
本発明者等の研究によれば、本発明において耐熱性トリ
プトファナーゼと呼称する該新規トリプトファナーゼを
生産する新桿菌は、本発明者等の試みたかぎり、公知の
如何なる微生物用培地においても単独では生育しないが
、上記バチルス・エスピー、Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、５ｔｒａｉ？Ｓ５　）との共存下に、例えば、リ
ン酸塩でｐＨ調節したトリプトファン含有合成液体培地
において、弱い攪拌条件下もしくは静置条件下で約５８
〜約６３℃の温度で活発に増殖生育し、酵素活性の強い
混合培養物を与えることが発見された。
更に又、本発明者等の研究によれば、該バチルス・エス
ピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　　５ｔｒａｉ
ｎ　Ｓ）は、胞子を形成するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属し、一般細菌用培地を用いて純粋培養可能な
新菌株であって、 （４）でインドール生成（−） （ｉｉ）’硝酸還元（−） の生理学的性質を示し、トリプトファン含有合成培地に
おいて、単独でも、また前記耐熱性トリプトファナーゼ
生産性桿菌との共生条件においても、トリプトファナー
ゼ生産能を示さない新菌株であることがわかった。
従って、本発明の目的は新規な耐熱性トリプトファナー
ゼ及びその製法を提供するにある。
本発明の他の目的は上記耐熱性トリプトファナーゼ生産
性桿菌を提供するＶＣ４ある。
本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。
本発明の新桿菌であるトリプトファン含有合成培地にお
いて単独では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　　５ｔｒａｉｎ　Ｓ　）
との共生により生育して、菌体内に耐熱性トリプトファ
ナーゼを生産蓄積する耐熱性トリプトファナーゼ生産性
桿菌は、温泉、堆肥などの高温環境由来の土壌試料から
分離採取された。
以下、その分離採取法について述べる。
リン酸塩でｐＨ調節したトリプトファナーゼ誘導培地で
ある後記するＴｒｐ−ＰＥＰ液体培地に、温泉、堆肥な
ど高温環境由来の土壌試料を入れ、Ｌ型試験管を用いて
約６　ｏ！−ｒ　ｏ℃で振盪培養を行ない、ＫＯυαｃ
’ｓ試薬によるインドール検出によってインドールの生
成が検出された試料培養物をトリプトファナーゼ生産菌
として分離する。斯くて、分離採取できる約６０℃で生
育するトリプトファナーゼ生産菌を、希釈法、更に、バ
シトラシン（Ｅａｃｉｔｒａｃｉｎ）に対する耐性を利
用して純化したトリプトファナーゼ生産菌を得ることが
できる。
得られたトリプトファナーゼ生産菌を、常法に従って、
寒天固体培養によるコロニー分離を試みたが、試験した
すべての種類の寒天固体培地においてコロニー形成は認
められなかった。上記トリプトファナーゼ生産菌の高濃
度の懸濁液（１プレート当たシ１００〜２・ＯＯコ菌体
）を、メンブレン・フィルターをその表面上に貼着した
Ｔｒｐ−ｐＥＰ寒天培地上に塗布し、約６０℃で培養し
て、コロニーを形成させる。形成されたコロニーについ
て、Ｋｏταｃ’ｓ試薬によるインドールの生成を検出
し、インドール生産菌コロニーとインドール非生産菌コ
ロニーとを分離することができる。
該インドール生産菌コロニーは、後に詳しく述べるとお
り、細胞の大きさの異なる二種類の桿菌の混合状態のコ
ロニーとして得られ、インドール非生産菌コロニーは該
二種類の桿菌の一方の桿菌からなるコロニーとして得る
ことができる。
上記のトリプトファン含有合成培地において単独でも混
合状態でも生育するが、それ自身単独ではトリプトファ
ナーゼ生産能を示さない菌株（インドール非生産菌）は
、本発明者等によってバチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎＳ）と命名された。
又、上述のようにして、バチルス・エスピー・５株との
混合菌の状態で分離採取でき、トリプトファン含有合成
培地において単独では生育しないが、上記バチ２ス・エ
スピー・５株との共生により生育して、菌体内に耐熱性
トリプトファナーゼを生産蓄積する耐熱性トリプトファ
ナーゼ生産性桿菌は、本発明者等によって、パクテリウ
ＡＩ７’株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔｒａｉ％Ｔ）と
命名された。
上述のようにして高温環境由来の土壌試料からバチルス
・エスピー・５株との混合菌の状態で分離採取できる本
発明の耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌は、リン酸
塩でｐＨ調節したトリプトファン含有の下記合成液体培
地（Ｔｒｐ−ｐＥｐ液体培地〕で混合菌の状態で植継培
養を続けることができるし、また、Ｌ−乾燥菌体（混合
菌）として保存可能である。
Ｔｒｐ−Ｐ　Ｅ　Ｐ液体培地ニー 培地組成　　　　　　　１００プ中 Ｌ−）リプトファン　　　　　０．２２ポリペプトン　
　　　　　　　０．５１酵母エキス　　　　　　　　　
　０．１１１ＫｔＨＰＯ４０，３，９ ＫＮ、ＰＯ，０，１Ｆ ＭｇＳＯ４・５Ｈ，００，０５１ ピリドキサール５′リン酸　　　　ｏ、　０５　ｇ培地
ｐＨは６．８〜７．０になる。
更に、上述のようＫして高温環境由来の土壌試料からバ
チルス・エスピー・５株との混合菌の状態で分離採取で
き、混合菌の状態で植継培讐及びＬ−乾燥保存可能な本
発明の耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌バクテリウ
ム・Ｔ株は、たとえば、以下のようにして共生するバチ
ルス・エスピー・５株と分離することが可能である。
（α）バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・Ｓ株
μ、その細胞の大きさの相違を利用して分別遠心分離の
手法を応用して互いに分離可能である。
（ｂ）バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・５株
は、そのリゾチーム感受性が相違し、バチルス・エスピ
ー・５株の方がより感受性が高いので、その差を利用し
て該５株を選択的に溶菌させることができ、それによっ
て混合菌から該Ｔ株を分離可能である。
しかしながら、本発明の耐熱性トリプトファナーゼ生産
性桿菌は、本発明者等の試みたかぎシの如何なる微生物
用天然及び合成培地においても、単独では生育しないた
め、その菌学的性質に関しては、形態上の性質及び生理
学的性質中カタラーゼについての性質以外は試験不可能
である。従って、以下に試験可能な性質について示す。
バクテリウＡｌ１７’株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ　５ｔ
ｒａｉｎ　Ｔ　）α）形態 ■細胞の形及び大きさニー桿菌（太さ０．２５〜０．３
５μ情、長さ １、５〜７　ｐ　ｍ　）　ｏ通 常、単独。
■細胞の多形性の有無ニーなし。
■運動性の有無ニー　　　外し。
■胞子の有無ニー　　　　なし。
■グラム染色性ニー　　　不定。
ｂ）　次の各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養ニー生育せず。
■　肉汁寒天斜面培養ニー生育せず。
■　肉汁液体培養ニー　　生育せず。
■　肉汁ゼラチン穿刺培養ニー生育せず。
■　リドマス・ミルクニー生育せず。
■　トリプトファン含有合成培地（Ｔｒｐ−ＰＥＰ液体
液体培地− ニーでは生育せず。バチルス・エスピー・５株（微工研
条寄第８０９号）との共生条件下に上記培地で生育する
。尚、本発明において、トリプトファン含有合成培地に
おいて単独では生育しないが、バチルス・エスピー・５
株との共生によシ生育して、菌体内に耐熱性トリプトフ
ァナーゼを生産蓄積するというのは、上記Ｔｒｐ−ＰＥ
Ｐ液体培地において単独では生育せず、バチルス・エス
ピー・５株との共生条件下に該培地で生育して、菌体内
に耐熱性トリプトファナーゼを生産蓄積することを意味
するものと定義される。
Ｃ）　生理学的性質 ■硝酸塩の還元ニー試験不能。但し、バチルス・エスピ
ー・５株との共生 条件下においては（ト）。
■脱窒反応、■ＭＲテスト、■ＶＰテストニーいずれも
試験不能。
■インドールの生成ニー試験不能。但し、バチルス拳エ
スピー・５株との 共生条件下においては（ト）。
■硫化水素の生成、■デンプンの加水分解、■クエン酸
の利用、■無機窒素源の利用、［相］色素の生成、■ウ
レアーゼ、■オキシダーゼニーいずれも試験不能。
■カタラーゼニー　（ト）。
■生育の範囲（ｐＨ１温度など）、■酸素に対する態度
（好気性、嫌気性の区別など）、［相］０−Ｆテスト、
■糖類からの酸及びガスの生成の有無ニー　　いずれも
試験不能。
ｄ）　その他 ■ＤＮＡ中のグアニンｅシトシン（Ｇ（’）を量（Ｔｍ
法）が約ｆ３５ｍｏｌａ％。
■前記ｂ）■のトリプトファン含有合成培地において、
弱い攪拌条件下もしくは静置条件下において、温度約５
８Ｌ−６３℃で、バチルス・エスピー・５株との共生条
件下で生育増殖する。
上記性質を持つ桿菌、すなわち、トリプトファン含有合
成培地において単独では生育しないが、バチルス・エス
ピー・５株との共生によシ生育して、菌体内に耐熱性ト
リプトファナーゼを生産蓄積する耐熱性トリプトファナ
ーゼ生産性桿菌は、パージエズ・マニュアルψオブ・デ
タミナテプ・パクテリオロジイ（Ｂｅｒｇａｙ’ａ　Ｍ
ａｎｌＬａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌｏｇｙ、　ｇ　ｔｈｄ）第８版、その他
如何なる公知文献にも完全に未記載の桿菌であって、本
発明者等によって、バクテリウムΦτ株（Ｅａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｇｔｒａイｎＴ）と命名された。
本発明者等により初めて分離された該桿菌は、バチルス
・エスピー・５株との混合菌の状態で、工業技術院微生
物工業技術研究所に、微工研条寄第８１０号（ＦＥＲＮ
　　ＢＰ−ｓｌｏ）として寄託されている。
更に、本発明の耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌が
、それとの共生条件下でトリプトファン含有合成培地で
生育するバチルス・エスピー・５株は、胞子を形成する
ＢａＣ１１ｌａｓ属に属する新菌株であって、一般細菌
用培地を用いて純粋培養が可能である。その菌学的性質
を以下に記載する。
バチＡ／ス１１　！スビー１１Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、　５ｔｒａイｎ互」 α）形態 ■細胞の形及び大きさニー桿菌（太さ０．６〜α９μ常
、長さ２５ 〜６．０μｍ）。通常、 単独。
■細胞の多形性の有無ニー表し。
■運動性の有無ニー　　　（ト）。周鞭毛。
■胞子の有無ニー　　　　有り。だ円、１．１×２０μ
ｍ１細胞の一 端に内生。
■グラム染色性ニー　　　陽性。
ｂ）　次の各培地における生育状態 Ｌ　肉汁寒天培地 円滑、無色半透明、光沢あり。
λ　肉汁液体培地 表面発育、白色菌膜を形成。
Ｃ）　生理学的性質 Ｌ　硝酸塩の還元ニー（ト）。
２、　　ＭＲテストニー　（ト）。
ｌ　　Ｖｐテストニー（−）。
瓜　インドールの生成ニー（−）。
５、０．０２　％　Ｎａｐ、耐性ニー（ト）。
＆　カタラーゼニー　（ト）。
７、’５Ｊ食塩存在下での生育ニー（−）。
＆　生育の範囲ニーｐＨｓ、ｒでの生育（ト）。
生育温度６６℃（上限）、 ４０℃（下限）。
９、酸素に対する態度ニー嫌気性生育（ト）。
１０、デンプン発酵性ニー（ト）。
１１、　　アラビノース、キシロース発酵性：　−（−
）。
１λ　マンニトール発酵性ニー（−）。
１＆　グルコース発酵性ニー（ト）。ガス生成（＝）。
６５℃で生育するところから、バチルス・ステアロテル
モフィル、ｘ、　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｔｎｏｐｈｉ−１ｕｓ）に類似するが、上記９．
嫌気性生育（ト）、＆０、０２　％　Ｎａｐ、耐性（ト
）及び＆　ｐ　Ｈ５，７での生育（ト）の各試験結果が
一致せず、バージエズ・マニュアルφオプ・デタミナテ
ブ・バクテリオロジイ第８版により該当する菌株がない
。従って、新菌株と同定され、本発明者等により、バチ
ルス・エスピー・５株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　５
ｔｒａｉ７ＬＳ）と命名された。本発明者等により初め
て分離された該菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第８０９号（ＦＥＲＮ　　ｌ’−８０９
）として寄託されている。
本発明によれば、上に詳しくのべた微生物、すなわち、
トリプトファン含有合成培地において単独では生育しな
いが、バチルス・エスピー・５株との共生により生育す
る耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌を培養し、培養
物から耐熱性トリプトファナーゼを採取することからな
る耐熱性トリプトファナーゼの製法が提供できる。
培養は、適当な炭素源、窒素源、ミネラル類を含有する
培地において、例えば、バチルス・エスピー・５株との
共生条件下に耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌を接
種して行なうことができる。
利用する炭素源の例としては、グルコース、デンプン、
マルトース、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど
の如き炭素源を例示でき、また窒素の例としては、ＮＨ
，Ｃ１，（ＮＨ４，５０いカザミノ酸、ペプトン、酵母
エキスなどの如き有機もしくは無機窒素源を例示するこ
とができる。更に、ミオジル類の例としては、ＫｔＨＰ
Ｏ４，ＫＨ，ＰＯ４、Ｍｇ５Ｏ，＊ＴＨ，０，ＦｔＣ１
＠、ビＪＸミ７類などを例示することができる。
培養は、たとえば、上記例示の如き炭素源、窒素源、さ
らにはミネラル及びビタミン類のほかに、Ｌ−）リプト
ファンを含有する液体培地を用いて、好気的に行なうこ
とができる。培養方式も適宜に選択できるが、たとえば
静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などの培養方式を採
用して行なうことができる。培養条件としては、ｐＨ約
６〜約８の如きｐＨ条件下、約５５〜約６５℃の温度条
件において、約１〜約３日の如き条件を例示することが
できる。
培養終了後、例えば、遠心分離、戸別などによって菌体
を採取し、たとえば、菌体を破砕たとえばアルミナ摩砕
などによって破砕して、得られる菌体抽出液から、たと
えば硫安分画法により分画して耐熱性トリプトファナー
ゼ含有分画を採取することにより、目的とする耐熱性ト
リプトファナーゼを分離取得することができる。更に、
たとえばイオン交換、ゲル濾過、カラムクロマトグラフ
ィーの如き適当な精製手法を用いて精製することができ
る。
上述のようにして製造できる本発明の耐熱性トリプトフ
ァナーゼは、約７０℃（ｐＨ＝＆ｏ）に作用至適温度を
有し、且つ約６５℃（ｐＨ＝＆ｏ、保持時間４０分）ま
では熱失活しない耐熱特性を有するトリプトファナーゼ
である点で、従来公知のトリプトファナーゼと明確に区
別できる新規酵素である。
以下に、本発明耐熱性トリプトファナーゼの性質を示す
。
Ｌ　作用ニー ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−トリプトフ
ァンからピルビン酸、インドール及びアンモニアを生成
する。
λ　基質特異性ニー トリプトファン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｌ−シ
ステイン及び５−メチル−Ｌ−）リプトファンを分解す
る。
λ　至適ｐＨ及び安定ｐＨニー 至適ｐ　Ｈ＝　７．０〜７．５（６５℃）〔第１図参照
〕安定ｐＨ＝６〜１０（２５℃、２日間〔第２図参照〕 添付図面第１図は、（０５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝
液（図中、−（）−ｑつ−）、（２）　１０　ｍ　Ｍの
ＫＣＩを含有する５０ｍＭのグリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ緩
衝液（図中、−口−［ト）、（３）　５　ｍ　Ｍの（Ｎ
Ｈ，）、Ｓｏ、を含有する５０ｍＭのグリシン−Ｎ　ａ
　ＯＨ緩衝液（図中、べ）＜コ臼及び（４）　５０　ｔ
ｎＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（図中、−Δ−△−）
の各々を用い、各ｐＨ（６５℃におけるｐＨ）条件下に
、本発明酵素のトリプトファナーゼ活性を測定した結果
を示す図である。至適ｐＨは上記（１）、（２）及び（
３）の結果から７、０〜７．５（６５℃）と決定される
。
添付図面第２図は、１ｏｍＭのＫＣＩ及び１０μＭのピ
リドキサール５′−リン酸を含有する５０ｍＭの各種緩
衝液（図中、クエン酸−Ａ’　ａＪＩＰ　０４緩衝液４
−１置に、ＨｐＯ４−ＫＨ，ｐＯ，緩衝液−Δ−Δ−；
７ｒｉａ−ＨＣＩ緩衝液Ｈ］→コー；グリシ７−ＮａＯ
Ｈ緩衝液−Ａ　−Ａ−；ＮａＨＣＯＢ−ＮａＯＨ緩衝液
１−Ｗ−）のそれぞれを用い、各ｐＨ（２５℃における
ｐＨ）条件下に、２５℃で２日間、本発明酵素を処理し
た後の残存トリプトファナーゼ活性を測定した結果を示
す図であるーこの結果から安定ｐＨ範囲６〜１０（２５
℃、２日間）と決定される。
ｔ　力価の測定法ニー 山田ら（京大）の方法に準じた。すなわち、Ｌ−トリプ
トファン１０μｍｏｌｅ、　　ピリドキサール、リン酸
（ｐＬＰ）Ｏ１４ｔｔ　ｍｏ　ｌ　ｅ、　Ｋ、ＨＰＯ＋
−ＫＨｔＰＯ４（ｐＨｓ、ｏ　）２０　ｏ　μｍｏｌｅ
及び酵素を含む反応液４．０コを用い、６５℃で１０分
間反応後、３（１％）リクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液１
．０−を加えて反応を停止する。反応系中に生成したイ
ンドールを、マクエボイーボーエ（Ｅ、ＭｃＥＶＯＹ−
Ｂ　□ＦＥ）法〔アナリスト（Ｔｈｅ　ＡＮＡＬＹＳＴ
、　Ｖｏｌ。
８８、ｐ、８９３〜８９４　（１９６３））により定量
決定する。活性は１分間に生成するインドールのｐｍｏ
ｌｅ数をＩ　Ｕ　（ｐ　ｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ／ｍ１ｎ）と
して表わす。
５、作用適温の範囲ニー トリプトファン分解活性の至適温度（作用至適温度）は
、約７０℃（ｐＨ＝　８．０　）である〔第３図参照〕
。
添付図面第３図は、各測定温度におけるｐＨを＆０とな
るように調製した５０ｍＭの１ｒｔＨｐＯ，−ＫＨ，Ｐ
　Ｏ，緩衝液（ｐｆｆ＆０）中で、１０分間酵素反応を
行わせることにより、トリプトファナーゼ活性を求めた
結果を示す図である。この結果から至適温度約７０℃（
ｐＨ＝＆ｏ）と決定される。
６、　　ｐＨ１温度などによる失活の条件ニー約６５℃
（ｐ　Ｈ＝　８．０、保持時間４０分）までは熱失活し
逢い〔添付第４図の（４−１図）〜（４−４図）参照〕
。
約７０℃（ｐＨ＝８．０．保持時間１０分）で約２０％
の残存活性を示す〔添付第４図の（４−５図）参照〕。
７、　阻害、活性化及び安定化ニー に＋及びＮＨすにより活性化が認められる。例えば、グ
リシン−ＮαＯＨ緩衝液にこれらのイオンを加えると活
性化する〔第１図参照〕。
＆　精製方法ニー トリプトファナーゼ誘導培地で培養した菌体をアルミナ
磨砕し、ＰＬＰ１０μＭ、　　２−メルカプトエタノー
ル１常Ｍを含むＫＪｐ０４−ＫＨ，ｐＯ，５０ｍＭの緩
衝液（ｐＨ８，０）で、５０％飽和硫安溶液を用いて分
画し、沈殿を懸濁、透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール、ケ
ル濾過ウルトロゲルＡｃＡ３“４及びハイトロキシルア
パタイトＨＴを用いて精製する。
９、分子量 約４４０００〜約４５，０００（ＳＤＳゲル電気泳動に
よる）。
本発明の耐熱性トリプトファナーゼは、従来公知のトリ
プトファナーゼとは異って、優れた耐熱特性を有するた
め、公知トリプトファナーゼがその利用に際して反応温
度や熱安定性などの面での利用に著るしい制約を受けた
技術的難点が克服でき、工業的に有利に利用することが
できる。
以下、実施例により本発明の数態様について更に詳しく
説明する。
実施例Ｌ〔耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌バクテ
リウム・Ｔ株の分離採取。〕 （１−１）　　堆肥試料ＩＩｉをＴｒｐ−ｐＥｐ液体培
地ＩＱｉｊに添加し、Ｌ型試験管中で約６０℃において
１日間振盪培養した。ＫｏυαＣ’Ｓ試薬によりインド
ール生成を確認した後、その一部０．１　ｍＪを新たな
Ｔｒｐ−ＰＥＰ液体培地１０ｍ１に接種ビて同様な培養
を繰り返すことにより、インドール生成苗群が充分に生
育した培養物を得た。この培養物Ｑ、　ｌ　ａｔをバシ
トラシン１■／ｌを含有するＴｒｐ−ＰＥＰ液体培地１
．　ｏ　ｍｊに接種して、さらに上記と同様な培養を行
った。
斯くして得られた培養液を滅菌生理食塩水を用いて約ｌ
Ｏ万倍に希釈したのち、その０．１−をメンプラン・フ
ィルター（Ｔｏｙｏ　　ＴＭ−２）を貼着したＴｒｐ−
ｐＥｐ寒天培地（寒天１５％添加）に塗布することによ
り、バクテリウム・Ｔ株〔以下において、Ｔ株と略記す
ることがある〕及びバチルス・エスピー・Ｓ株〔以下に
おいて、Ｓ株と略記することがある〕が混合状態で生育
しているコロニーとＳ株の単独よりなるコロニーを分離
採収した。
（１−２）　　上記（１−１）により得られたＴ株とＳ
株の混合したコロニーより得られた混合培養物１ｄを、
トリプトファン含有合成培地（Ｔｒｐ−ＰＥＰ液体培地
）２ＱＱ＋＋Ｌｔに接種し、６０℃で約３０時間培養を
行うと、約４時間後にまずＳ株の活発々増殖が起こシ、
次いで、Ｓ株の増殖停止とほぼ同時に、１株増殖が始ま
シ、それと同時にＳ株は急速に死滅し、最終的には菌数
の９９チ以上がＴ株である培養を得ることができた。さ
らにＳ株の混入率を低下させ、実質的なＴ株の純粋培養
物を作るためには、Ｔ株とＳ株の細胞壁分野酵素（リゾ
チーム）に対する耐性の差を利用する方法、または分別
遠心分離法を用いて、培養のどの段階でもＴ株を分離す
ることが可能であった。
■　細胞壁分解酵素（リゾチーム）を用いる方法。
上記のＴ株とＳ株の混合培養を１８時間行い、下記の条
件でリゾチームを作用させると、その時点で約２５チ存
在したＳ株が選択的に溶菌して全菌数の子分の一以下に
減少し、Ｔ株の純粋培養を得ることができた。
条件ニー １００ｍ＆のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中
、 卵白リヂチーム　　　３００μｇ／ゴ ＥＤＴＡ　　　　　　　２００μｇ／凱ｌクエン酸ナト
リウム　　３０ｆｆｉｐ、／＋＋ｊの反応液を用い３５
℃で１５分間反応させる。
■　分別遠心分離による方法。
上記のＴ株とＳ株の混合培養を２０時間行った培養物を
、１，０００　　．１５分間の条件で遠心分離すること
によりＳ株を選択的に沈殿させ、改Ｚ（７ めて、１４，０００　　．２０分間の条件で遠心分離す
ることによりＴ株のみを沈降分離できた。
実施例ｚ（Ｔ株の単独培養が不可能であることの例証。
〕 （２−１）　　Ｔ株とＳ株の混合培養から実施例１の（
１−２）に示した方法で分離したＴ株を、下記液体培地
に植菌し、６０℃で培養を行ったが、いずれの培地でも
Ｔ株の生育は全く認められなかった。
ｔ　　Ｔｒｐ−ＰＥＰ液体培地 λ　普通ブイヨン培地 λ　ハートイン７ユージヨンブイヨン ４、牛血清＋ハートインクニージョンブイヨン５、　　
酵母エキス＋ハートインフュージョンブイヨン ６．０．５％寒天を含有する上記１−５ｉでの各層。
地 （２−２）　　Ｓ株の菌体生産物または菌体成分がＴ株
の生育を支持する可能性を検証するために、Ｓ菌のみを
Ｔｒｐ−ｐＥｐ液体培地に接種し、６０℃約１２時間培
養した後、その培養上清及び菌体超音波破砕抽出液を調
製し、それらを無菌濾過した後、Ｔデル−ｐＨｐ液体培
地に添加し、これに純粋分離したＴ株を接種したが、Ｔ
株の増殖は全く認められなかった。また、ストレプトマ
イシンにより細胞分裂を止めたＳ採苗体を共存させてＴ
株の培養を試みたが、増殖は全く認められなかつ゛た。
実施例＆〔酵素生産。〕 ５１三角フラスコにトリプトファン含有合成培地ＣＴｒ
ｐ−ＰＥＰ液体培地）を１．５ノ入れ、Ｔ株及びＳ株の
混合培養を５４植菌し、６０℃で３０時間静置培養を行
ったのち、実施例１に示すと同様に処理して７７．６１
ｔの培養液から、１２０ｇのＴ株湿菌体を得た。これを
酸化アルミニウムにより摩砕し、次いで、下記 １０μＭのピリドキサール５′−リン酸ＣＰＬＰ＞、Ｌ
ｍＭの２−メルカプトエタ、ノール、２５０μＭのｐＭ
ｓＦ　（セリンプロテアーゼ阻害剤）、〔フェニルメチ
ルスルホニルフルオライド　（ｐｈｅｎｙｌ　　ｍｅｔ
ｈｙｌ　　ｓｌｗｆｏｎｙｌ　　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）３
５０ｍＭのＪ：＊ＨＰＯ４−ＫＨｚ　Ｐ　Ｏ４緩衝液、
ｐＨ６，ｓ、の組成の精製用緩衝液１６６ｄを添加する
ことにより、可溶画分として粗酵素液を得た。これから
θ〜５０チ飽和硫安分画を集め、得られた粗酵素分画液
をストレプトマイシンによる除核酸処理に賦したのち透
析し、ＤＥＡＥ−トヨパール（東洋曹達工業製品）カラ
ム（Ｚ６ｃＷｔ（径）×１２ｃＷＬ）に吸着させ、０→
４００ｍＭ　ＫＣ１濃度勾配（４００ｍＪ）で溶出処理
して活性画分を集め、次いでウルトロゲルＡｃＡ３４（
ＬＫＢ社製社製力ラム（Ｌ　１　ａｍ　（径）Ｘ８５Ｃ
ＩＫ）でゲル濾過により精製する。さらに、ハイトロキ
シルアパタイトゲルＨＴ（バイオラッド社製品）カラム
（Ｚ６ｃｒＩＬＸ８信）に吸着させ、Ｏ〜３００　ｍＭ
　（ＮＨ，）、　Ｓｏ。
濃度勾配（３００ｍ／）で溶出を行い、活性画分からト
リプトファナーゼ約１００岬を得た。
本酵素は約７０℃（ｐ　Ｈ＝　８．０　）に作用至適温
度を有し且つ約６５℃（ｐＨ＝ｌｌＬｏ、保持時間４０
分）までは熱失活しない耐熱特性を示した。
また、本酵素のトリプトファン分解の比活性は市販品（
３７℃）の８倍以上Ｉ、逆Ｗ’％によるインドール、ピ
ルビン酸、アンモニアよシのトリプトファン合成活性も
検出された。
【図面の簡単な説明】
添付図面第１図は本発明の耐熱性トリプトファナーゼの
至適ｐＨ及び活性化を示すための各種緩衝液におけるト
リプトファナーゼ活性−７）Ｈの関係を示すグラフ、第
２図は本発明の耐熱性トリプトファナーゼの安定ｐＨを
示すための各種緩衝液における残存トリプトファナーゼ
活性−ｐＨの関係を示すグラフ、第３図は本発明の耐熱
性トリプトファナーゼの至適温度を示すグラフ、そして
第４図は本発明の耐熱性トリプトファナーゼの熱失活特
性を示すための５０℃（４−１図）、５５℃（４−２図
）、６０℃（４−３図）、６５°Ｇ（４−４図）及び７
０°Ｇ（４−５図）の各温度における残存トリプト７７
ナーゼ活性一時間（分）の関係を示すグラフである。 ％１図 第２図 第３図 一］屓　　（’Ｃ） 手続補正書 昭和６１年６月２日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１２４５４６号 ２ｏ発明の名称 耐熱性トリプト７７ナーゼ、その製法 およびその生産菌 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 氏名別府輝度 ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正命令の日付　　　　（自　発）６゜補正の対象 明細書の“発明の詳細な説明”の欄 （別　紙） （１）明細書Ｐｔｔｊ１２頁４行に、ｒＭｇｓｏ、・５
Ｈ。 ＯＪとあるを、 ｒａｇｓＯ，・７Ｈ，Ｏ」 と訂正する。 （２）明細書第２６真３行に、［約４５，０ＯＯＪとあ
るを、 「約４６，０ＯＯＪ と訂正する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、約７０℃（ｐＨ＝８．０）に作用至適温度を有し且
    つ約６５℃（ｐＨ＝８．０、保持時間４０分）までは熱
    失活しない耐熱特性を有することを特徴とする耐熱性ト
    リプトファナーゼ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａ−ｎａｓｅ）。 ２、下記性質 （イ）作用 ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−トリプトフ
    ァンからピルビン酸、インドール及びアンモニアを生成
    する、 （ロ）基質特異性 トリプトファン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｌ−シ
    ステイン及び５−メチル−Ｌ−トリプトファンを分解す
    る、 （ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ＝７．０〜７．５（６５℃）、 安定ｐＨ＝６〜１０（２５℃） を有する特許請求の範囲第１項記載の耐熱性トリプトフ
    ァナーゼ。 ３、トリプトファン含有合成培地において単独では生育
    しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕ
    ｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）との共生により生育する
    耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌を培養し、培養物
    から耐熱性トリプトファナーゼを採取することを特徴と
    する耐熱性トリプトファナーゼの製法。 ４、該耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌がバクテリ
    ウム・Ｔ株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　Ｔ）
    （微工研条寄第８１０号）である特許請求の範囲第３項
    記載の製法。 ５、該バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
    ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）がバチルス・エスピー・Ｓ株
    （微工研条寄第８０９号）である特許請求の範囲第３項
    記載の製法。 ６、トリプトファン含有合成培地において単独では生育
    しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕ
    ｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）との共生により生育して
    、菌体内に耐熱性トリプトファナーゼを生産蓄積する耐
    熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌。 ７、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
    ｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）との混合培養条件下において、
    （ｉ）インドールの生成（＋） （ｉｉ）硝酸塩の還元（＋） の生理学的性質を示す特許請求の範囲第６項記載の耐熱
    性トリプトファナーゼ生産性桿菌。 ８、該桿菌のＤＮＡ中のＧＣ含量（Ｔｍ法）が約６５ｍ
    ｏｌｅ％である特許請求の範囲第６項記載の耐熱性トリ
    プトファナーゼ生産性桿菌。 ９、バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
    ｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）との混合菌の状態にある特許請
    求の範囲第６項記載の耐熱性トリプトファナーゼ生産性
    桿菌。 １０、耐熱性トリプトファナーゼ生産性桿菌がバクテリ
    ウム・Ｔ株（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　Ｔ）
    （微工研条寄第８１０号）である特許請求の範囲第６項
    もしくは第９項記載の耐熱性トリプトファナーゼ生産性
    桿菌。 １１、該バチルス・エスピー・Ｓ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
    　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｓ）がバチルス・エスピー・Ｓ
    株（微工研条寄第８０９号）である特許請求の範囲第６
    項もしくは第９項記載の耐熱性トリプトファナーゼ生産
    性桿菌。
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