JPS6130558B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はサキントトリシンの新規な製造法に
関するものである。 キサントトリシンは例えばストレプトマイセ
ス・アルプスに属する菌が産生するグラム陽性菌
およびグラム陰性菌に対し抗菌力を有する抗生物
質として知られている（例えばアンテイバイオテ
イクス・アンド・ケモテラピー、第４巻、第３
号、第259〜261頁参照）。 この発明者等はキサントトリシンの製造につい
て鋭意研究の結果、発明者等がソ連中央アジアの
土壌から分離したストレプトマイセス属の新亜属
（サブスピーシズ）に属する新菌株がキサントト
リシンを産生するという新知見を得、さらに研究
を続けた結果、この発明を完成した。 この発明で使用するストレプトマイセス・ブル
ネウス・サブスピーシズ・キサントトリシニに属
する菌株のうち、この発明者等が前記の土壌から
新たに分離した菌株は次のような菌学的性質を有
する。 １ 培養および形態上の特徴 胞子体は直生で、単軸（monopodial）かつ単
独に配列されている。胞子は楕円形、細長形、円
筒形で平滑な被膜を有する。胞子嚢および菌核な
し。 (1) サツカロース含有合成培地 気菌糸体はよく発達し、柔毛でおおわれ、色は
白がかつた桃色または淡桃色。コロニーおよび培
地は褐色または暗褐色である。 (2) グルコース・アスパラギン寒天 気菌糸体は発育弱く、ほとんど存在しない。白
がかつた桃色。コロニーおよび培地は淡茶褐色で
ある。 (3) グリセリン・アスパラギン培地 コロニーおよび培地は褐色であり、気菌糸体は
発育弱く、ビロード状で茶褐色を帯びた桃色であ
る。 (4) 澱粉寒天 気菌糸体は白がかつた桃色で、でんぷん質であ
る。コロニーおよび培地は淡褐黄色である。 (5) チロシン含有寒天 気菌糸体は発育弱く、でんぷん質で、白がかつ
た桃色。コロニーおよび培地は無色である。 (6) 肉エキス、ペプトン含有寒天 気菌糸体なし。コロニーは暗褐色であり、培地
中へ暗褐色の色素が拡散する。 (7) 酵母麦芽培地 気菌糸体は発育弱く、白がかつた桃色である。
コロニーおよび培地は淡褐色をおびた赤茶色であ
る。 (8) オートミル寒天 気菌糸体は発育弱く、茶褐色である。コロニー
および培地は暗褐色に着色。 生理学的特徴 ゼラチンを液化し、牛乳をペプトンン化し、サ
ツカラーゼを転化し、澱粉を加水分解し、繊維素
上では生育弱く、硝酸塩を還元し硫化水素を生成
せず、チロシナーゼを産生せず、合成培地中褐色
の可溶性色素を形成する。培養は好気性である。 炭素源の同化作用 ・グルコース ＋＋ ・アラビノース ＋＋ ・キシロース ＋ ・サツカロース ＋＋ ・ラフイノース ＋＋ ・ラムノース ＋ ・フルクトース − ・イノシツト − ・マンニツト − 菌株自体の抗菌性 なし 以上のような菌学的性質を有する菌株ついて、
N.A.クラシーリニコフ氏著、「レイジアント・フ
アンジ」（ナウカ出版社発行、1970）、G.F.ガウ
ゼ氏著、「プロブレムス・オブ・クラシフイケイ
シヨン・オブ・アクチノマイセテス―アンタゴニ
スツ」（メジツツ出版社発行、1957年）、S.ワクス
マンおよびH.レシエヴアリエ氏著、「ガイド・ト
ウ・ザ・クラシフイケイシヨン・アンド・アイデ
ンテイフイケイシヨン・オブ・ザ・アクチノマイ
セテス・アンド・ゼア・アンチバイオテイクス」
（1953年）およびS.ワクスマン氏著、「ザ・アクチ
ノマイセテス」第V.11巻等の文献をもとに分類
検索を行つた。 培養および形態上の特徴および若干の生化学的
特性からすれば、本菌株はストレプトマイセス・
ブルネウス種に包含されることができる。（クラ
シーリニコフ氏著、「レイジアント・フアンジ」
（1970年）参照）が、一連の生化学的特性および
抗菌特性の点では同種とは異なつている。たとえ
ば、クラシーリニコフ氏のデータによれば、スト
レプトマイセス・ブルネウスの菌株はバチルス・
イドサス（Bacillus idosus）およびバチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）に対して抗菌作
用を有し、またいんげん豆の根粒バクテリヤアゾ
トバクター・クロオコカカム（Azotobacter
chroococcum）およびアゾトバクター・ビネラン
デイ（Azotobacter vinelandii）を抑制するのに
対して、本菌株は上記の微生物に対し拮抗特性を
示さない。 上記両培養すなわち本菌株およびストレプトマ
イセス・ブルネウスの菌株の生理学的特徴の対比
結果を次表に示す。

【表】

【表】 以上のような観察結果から、本菌株とストレプ
トマイセス・ブルネウスとは上記のような点で相
違することおよび本菌株がキサントトリシンを産
生するのに対してストレプトマイセス・ブルネウ
スはこれを産生しないという相違点を考慮して本
菌株をストレプトマイセス・ブルネウスの変異株
と認め、ストレプトマイセス・ブルネウス・サブ
スピーシズ・キサントトリシニ（Streptomyces
brunneus subspecies xanthothricini）と命名し
た。 この変異株ストレプトマイセス・ブルネウス・
サブスピーシズ・キサントトリシニはソ連国の全
ソ抗生物質研究所（RIA）に寄託番号第1568号と
して寄託され、また工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第4794号として寄託されてい
る。 この発明で使用されるストレプトマイセス・ブ
ルネウス・サブスピーシズ・キサントトリシニは
例えば、紫外線、Ｘ線等の照射処理、Ｎ―メチル
―N′ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジン（NTG）、
５―ブロモウラシル、２―アミノプリン等の薬剤
による処理、形質転換、形質導入、接合等の通常
用いられる菌株変異処理方法によつて、キサント
トリシンの産生能を高めることができる。 ストレプトマイセス・ブルネウス・サブスピー
シズ・キサントトリシニはグルコース含有合成培
養基中で生育される場合、形態、気菌糸体の有
無、その着色の点ならびにキサントトリシン産生
能の点でも異なる数種の変異株を形成する。この
変異株の培養および形態上の特徴は次のとおりで
ある。 変異株No.１：コロニーは円形でややふくれ上が
り、滑らかで周辺は平らである。気菌糸体は柔毛
におおわれ、桃色である。基質は褐色ないし暗褐
色である。褐色の可溶性色素が形成される。 変異株No.２：コロニーは滑らかで偏平、周辺も
平らで、白がかつた桃色のビロード状の柔かい気
菌糸体でおおわれている。基質は明るい茶褐色な
いし淡褐色である。褐色の可溶性色素を形成す
る。 変異株No.３：コロニーはひだ状で、胞子形成は
微弱。気菌糸体は白がかつた桃色であり、基質は
茶褐色である。 これらの変異株はすべてキサントトリシンを
100μg/mlまで産生することができる。 この発明によるキサントトリシンの製造はスト
レプトマイセス・ブルネウス・サブスピーシズ・
キサントトリシニに属するキサントトリシン産生
菌を培地中で培養することにより行われる。 培養に用いられる培地としては、合成培地、半
合成培地あるいは天然培地が用いられ、培地組成
は炭素源として、例えばグルコース、シユークロ
ース、アラビノース、キシロース、ラフイノー
ス、ラムノース、マルトース、グリセリン、でん
粉、液化でん粉等が用いられ、窒素源として、例
えば肉エキス、カゼイン加水分解物、ペプトン、
グルテンミール、コーンミール、棉実粕、大豆
粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、酵母エキ
ス、尿素、りん酸アンモニウム等が用いられる。
このほか、例えばりん酸水素２ナトリウム、りん
酸２水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸カルシウム等の無機塩も必要に応
じて培地に添加される。 培養温度は20〜40℃前後が適当であり、培養容
量の増大に従つて適宜種培養を行なうと好結果が
得られることが多い。本培養の培養時間は約50〜
100時間が適当であり、培地の濃度厚化に従つて
培養時間をさらに延長してもよい。 以上述べた培養条件は使用されるキサントトリ
シン産生菌株の特性に応じてそれぞれの最適の条
件を選択て適用される。 培養により生成したキサントトリシンは一般抗
生物質の製造に用いられる手段により分離、精製
および採取れる。すなわち、前記培養ブロス中に
生成されたキサントトリシンは減圧濃縮、溶媒抽
出、PH変換、結晶化、再結晶等の手段を任意の順
序に組合せまた反復して使用することにより、前
記培養ブロスから分離、精製および採取される。 このようにして得られるキサントトリシンは前
記のように抗菌作用を有し、医薬として有用であ
るが、さらに次の反応式で示されるように抗がん
作用を有するレウマイシンの製造のための原料と
しても有用である。 この反応はキサントトリシンにアミンを作用さ
せた後、酸で処理することにより行われるが、こ
こで用いられるアミンとしては第１級および第２
級アミンが好ましく、そのような例としては例え
ばモノー（またはジー）低級アルキルアミン（例
えばモノ―またはジ―メチルアミン、モノ―また
はジ―エチルアミン、モノ―またはジ―プロピル
アミン、モノ―またはジ―イソプロピルアミン、
モノ―またはジ―ブチルアミン等）、モノ―また
はジ―低級アルケニルアミン（例えばモノ―また
はジ―アリルアミン等）、モノ―またはジ―アル
（低級）アルキルアミン（例えば、モノ―または
ジ―ベンジルアミン等）、環状アミン（例えばピ
ペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン
等）が挙げられる。さらに、有用なアミンとして
第１級または第２級アミノ基を有する弱塩基性イ
オン交換樹脂（例えばアンバーライトIR―45
（OH^-型）（ローム・アンド・ハース社製）およ
びイオン交換樹脂AH―22（OH^-型）（ソ連国化
学工業省製）等が挙げられる。 また酸としては蟻酸、酢酸等の有機酸および塩
酸、硫酸等の無機酸が用いられる。 キサントトリシンにアミンを作用させる反応は
一般にはアルコール、アセトン、水等の溶媒中で
行われ、反応温度は通常20〜25℃、PH８〜12の条
件下で行うのが好しい。 このようにして得られる反応液を上記のような
酸で酸性（例えばPH３〜４）にて後、例えば上記
のメタノール、エタノール等のアルコールのよう
な溶媒を用いてレウマイシンを単離することがで
きる。 次にこの発明を以下の実施例によりさらに説明
する。 実施例 １ 容量750mlの三角フラスコに次の組成の培養基
125mlを入れる。 乾燥重量％ コーンステイープリカー 0.25 炭酸カルシウム 0.5 塩化ナトリウム 0.5 硫酸アンモニウム 0.35 グルコース 1.5 澱粉 2.0 水道水 １ PH 6.9〜7.0 上記の培地を常法により滅菌した後ストレプト
マイセス・ブルネウス・サブスピーシズ・キサン
トトリシニRLA―1568を12日間培養した寒天斜
面を接種する。前記のフラスコを回転速度230〜
240rpmのシエーカーにのせ、26〜29℃で48時間
培養することにより培養物が得られる。別に、そ
れぞれ750ml容三角フラスコに上記と同じ組成の
培地125mlを入れ、常法により滅菌する。この培
地に上記培養物2.5mlを接種し、26〜29℃で72時
間培養する。培養終了後培養液６から過よつ
て気菌糸体を分離し、液を希硫酸でPH5.6〜6.0
に調整しクロロホルムで抽出する。抽出物を無水
燐酸ナトリウムで乾燥し、35℃において真空中で
蒸発させる（20mm）。残留物をイソプロピルアル
コール20mlに溶解し、５℃で６時間放置する。沈
殿したキサントトリシンの結晶を取する。キサ
ントトリシンの第２生成物を液から蒸発および
イソプロピルアルコールからの再結晶によつて回
収する（収量363mg）融点172〜173℃。 実施例 ２ 45容の醗酵容器に、実施例１に記載の組成の
培養基25を入れる。培地を122〜124℃で35分間
滅菌し、ストレプトマイセス・ブルネウス・サブ
スピーシズ・キサントトリシニの培養物を培地に
基づいて２容量％の量で接種する。培養は65〜72
時間、培地１容量に対して毎分空気0.8〜１容量
の割合で通気を行ないながら、消泡剤としてマツ
コウ鯨油を添加して行なわれる。 培養終了後培養液20から菌糸体を分離し、
液をクロロホルムで抽出する。クロロホルム層を
分離した後、水性層をPH5.0とし、酢酸エチルで
抽出する。クロロホルム層と酢酸エチル層とを蒸
発させた後、各残留物をわせて、無水珪酸300g
を充填したカラム（150〜200メツシユ）でクロマ
トグラフイーを行う。酢酸エチルで溶出してRf
＝0.08のフラクシヨン（シリカゲル、酢酸エチ
ル）を集め、そのフラクシヨンからキサントトリ
シン962mgを回収する。融点172〜173℃。 実施例 ３ 実施例１により得られた培養液６から過に
より菌糸体を分離し、液に硫酸アンモニウム
3.6Kgを加える。沈殿を過し、液をクロロホ
ルムで抽出する。その後処理は実施例１と同様に
して行なう。 実施例 ４ ストレプトマイセス・ブルネウス・サブスピー
シズ・キサントトリシニの培養物６を過して
菌糸体を分離し、キサントトリシン90mg/の力
価を有する液を20％硫酸でPH5.8〜6.0の酸性
し、次でクロロホルムで抽出する。抽出物を無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、40℃で蒸発させる。
残留物をPH8.0〜10.5に塩基性化された蒸留水50
mlに溶解する。得られた溶液にアニオン交換体
AH―22（OH^-）を溶液の色が退色するまで添加
する。上記のアニオン交換体をこの混合物から分
離した後、蒸留水で洗浄し５％酢酸で処理するこ
とによりレウマイシンを含有する溶出液が得られ
る。この溶出液を減圧濃縮し、残留物を結晶化さ
せることによりレウマイシン410mgが得られる
（収率76％）。融点242〜243℃。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・ブルネウス・サブスピ
   ーシズ・キサントトリシニに属する菌株を培地中
   で培養し、得られた培養物からキサントトリシン
   を分離・採取することを特徴とするキサントトリ
   シンの製造法。 ２ ストレプトマイセス・ブルネウス・サブスピ
   ーシズ・キサントトリシニがストレプトマイセ
   ス・ブルネウス・サブスピーシズ・キサントトリ
   シニRIA―1568（微工研菌寄第4797号）である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。