JPS5934355B2 - 醗酵方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗結核性抗生物質カブレオマイシンの新規の微
生物学的製法に関する。

カブレオマイシンはカブレオマイシンＩＡ。

ＩＢ、ＩＩＡおよびＩＩＢという生物学的に活性な４成
分より成る知られたポリペプチド抗生物質混合物である
。

ストレプトマイセス カブレオラスの醗酵によるカブレ
オマイシンの製造はヘルらの米国特許第３，１４３，４
６８号に記載されている。

カブレオマイシン成分の特徴は記述されているが、（Ｈ
ｅｒｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎ−Ｙ−Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ。

１３５：９４０−９４６（１９６６））その正確な構造
決定は未だなされていない。

カブレオマイシンＩＢはカブレオマイシン混合物の主成
分であるが、この構造はジョンソンらによってＮａｔｕ
ｒｅ２３１ ： ３０１−３０２（１９７１）に提案さ
れている。

カブレオマイシンは多くのグラム−陽性およびグラム−
陰性細菌に対して活性であると報告されているが、最も
興味があるのは抗結核剤としてのその使用法である。

本発明は本明細書中ダクチロスポランジアムバリエスポ
リウムＤ４０９−５株、ＡＴＣＣ３１２０３又はそのカ
ブレオマイシン生成性突然変異体という新機生物を炭素
と窒素の同化性源を含む水性栄養培地中で好気性条件で
培養して上記培養培地中で上記微生物により実質的量の
カブレオマイシンを生成しかつ任意に上記カブレオマイ
シンを培養培地から単離する新規の製法に関する。

本発明はまた上記の醗酵法によりカブレオマイシンを生
成し、培養培地からカブレオマイシン混合物を分離し、
その混合物をクロマトグラフ吸着剤上に吸着させかつ吸
着剤から個々の成分を分別溶離することにより成るカブ
レオマイシンＩＡ。

ＩＢ、ＩＩＢ、ＩＩＡおよびＩＩＢというカブレオマイ
シンの抗生物質成分を個々の物質として製造する方法を
提供するものである。

新規のカブレオマイシン生成微生物、ダクチロスポラン
ジアム バリニスポリウムＤ４０９−５株はインドの土
壌試料から単離された。

微生物の培養菌はワシントン、Ｄ、Ｃ，の米国タイプカ
ルチャーコレクションに委託されその微生物永久コレク
ション中にＡＴＣＣ３１２０３として加えられた。

才た該微生物は昭和５１年８月１０日に工業技術院微生
物工業技術研究所に委託された。

（受理番号：微工研菌寄第３６６９号） 下記する理由によりＤ４０９−５株はダクチロスポラン
ジアム属の新種であると思われる。

Ｄ４０９−５株は栄養菌糸の表面上に１個、１対又は房
状の指形胞子嚢を形成する。

胞子嚢は通常真直ぐであるが時には曲っており胞子のあ
る位置は膨張している。

普通の直状胞子溝の大きさは１．２−１．６Ｘ４−７μ
ｍである。

胞子貴信は胞子嚢の長軸の長さより短かい。

各胞子嚢は中に１列に１乃至５の胞子をもつ。

胞子は球、長楕円体、卵形、洋梨形又は双球菌形の様な
種々の形をもつ。

胞子は運動性があり１本の長い極性鞭毛をもっている。

胞子嚢は酵母エキス−麦芽エキス培養基上で生成された
がザペツク寒天および他の寒天培地上では殆んど生成さ
れなかった。

派生菌糸は一般に生成されないが、生成された場合は発
育不全である。

栄養菌糸は枝分れしており撚れておりまた時には先で単
一コイル状となっている。

コイル状菌糸はやがてもつれてしばしば塊状菌糸に発達
する。

栄養菌糸は分断をしない。それはグラム−陽性である。

大きい球状体又は胞子嚢類似体が培養基中に埋まった栄
養菌糸中に生成される。

培養特性 有機培地およびザペツク寒天を合成培地上の成長は適度
である。

栄養菌糸の集合色はオレンジから淡赤褐色にわたる。

成長のわるい場合色はクリーム色から淡黄オレンジ色と
なる。

赤オレンジ色の拡散性色素が酵母エキス−麦芽エキス寒
天およびザペツクの寒天上で生成される。

Ｄ４０９−５株は菌糸を生成しないか又は発育不全の派
生菌糸を生成する。

集落の表面は粒状、ひだ状又は円鋸歯状である。

栄養菌糸は寒天培地中に浸透する。Ｄ４０９−５株の培
養特性は表１に示している。

Ｄ４０９−５株の自然発生的変種が認められた。

その一つは親株のもつオレンジ色素の生成能力のない非
色素形成変種である。

他はオートミル寒天、チロシン寒天および２種のアスパ
ラギン寒天上に明確な派生菌糸を生成するスキ菌糸形成
変種である。

抗生物質生産性については前の変種は低かったが、後の
変種は親株と殆んど同じであった。

生理学的特性 Ｄ４０９−５株はカゼインとＬ−チロシンを加水分解し
またＬ−システィンから硫化水素を生成する。

リドマスミルクは完全にペプトン化され、また硝酸塩は
亜硝酸塩に還元される。

ゼラチンは液化されない。

この種は純好気性微生物である。

この種の最適成長温度は３２℃乃至３９℃であり適度の
成長は２５℃と４１℃で見られる。

１２℃又は４８℃では成長は見られない。

生理学的特徴と炭水化物利用は表２と３に示している。

細胞壁組成 り４０９−５株の細胞壁はＪ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、。

８９ ：４４４−４５３（１９６５）に記載のＴ。

ヤマグチの方法によって研究された。

Ｄ４０９−５株の細胞壁は主アミノ酸成分としてメゾ−
ジアミノピメリン酸、グルタミン酸、アラニンおよびア
スパラギン酸を含むことがわかった。

ラムノース、マンノースおよびガラクトースは中性糖主
成分とわかった。

Ｄ４０９−５株の細胞壁組成は知られた３種のアクチノ
マイセテス種と比較して表４に示している。

分類法 上記の形態学的、培養的および生理学的特性に基いてＤ
４０９−５株はアクチノプラナセア工科のダクチロスポ
ランジアム属に属すると分類された。

ダクチロスポランジアム属の２種は現在布ダクチロスポ
ランジアム オーランチアキュームおよびダクチロスポ
ランジウム タイランデンス〔パルチモア、ザ ウィリ
アムス アンド ゥイルキンス社のバーゲイのＭａｎｕ
ａ ｌ ｏ ｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ −ｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ８版（１９７４））と報告
されている。

Ｄ４０９−５株はり、オーランチアキュームと２種のア
スパラギン寒天上の増殖色（オレンジ色素形成）：普通
寒天上のその成長不良；そのチロシン加水分解；グリセ
ロール、Ｄ−ＩＪボノースおよびイノシトールの利用の
点で異なる。

またそれは普通寒天上の成長不良、ザペツク寒天七でそ
の適度な増殖、そのゼラチンを液化しない点、その硝酸
塩還元、そのグリセロールとイノシトール利用およびＬ
−ラムノーゼを利用しない点でり、タイランデンスと異
なる。

Ｄ４０９−５と上記ダクチロスポランジアムの２種との
比較はまとめて表５に示している。

Ｄ４０９−５株をＡｎｔｉｍｉｃｒｏ −Ａｇｅｎｔ
ｓａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈ、： ５９６−６０６（１９
６２）に記載のカブレオマイシンを初めに生成したスト
レプトマイセス カブレオラスとも比較した。

Ｓ。カブレオラスは円筒形分生胞子をもつ直線状又は屈
曲した胞子柄を生成するがＤ４０９−５種は少数胞子を
もつ指形胞子嚢を生成する。

Ｓ、カブレオラスの炭水化物利用性はＤ４０９−５株の
それと著しく異なる。

またＤ４０９−５株は特徴的細胞壁成分としてメゾーＤ
ＡＰ、アスパラギン酸、ラムノース、マンノースおよび
ガラクトースを含みそれはＤ４０９−５株がストレプト
マイセタセア工科に属さないアクチノマイセテス種であ
ることを示している。

上記の発見に基づいて、Ｄ４０９−５株がダクチロスポ
ランジアム バリニスポリウムｓｐ、ｎｏｖ。

であると提案する。

いわゆるバリニスポリウムはＤ４０９−５株が指形胞子
嚢中に種々の形の胞子をもつという事実から来る。

本発明によるカブレオマイシン製造について上記の特定
種に限定するつもりはないのである。

本発明の範囲内にＡＴＣＣ３１２０３の特性をもつダク
チロスポランジアム バリニスポリウムの他のカブレオ
マイシン生成性種又はＸ線又は紫外線照射、ナイトロジ
エンマスタードによる処理、フエイジ（ｐｈａｇｅ）感
染等の様な知られた方法で生成されたその突然変異体を
包含することは特に望ましいしまたそのつもりである。

カブレオマイシンの製造 カブレオマイシンは本発明によりダクチロスポランジア
ムバリエスポリウムＡＴＣＣ３１２０３のカブレオマイ
シン生産性株又はそのカブレオマイシン生成性突然変異
体を水性栄養媒質中に浸漬した好気１生条件のもとで培
養して製造出来る。

この微生物は同化性炭素源、例えば同化性炭水化物を含
む栄養媒質中で成長する。

適当する炭素源の例にはグルコース、ガラクトース、フ
ルクトース、マンノース、蔗糖、リボース、グリセロー
ル、可溶性澱粉、等がある。

利用窒素源はまた例えば魚粉、大豆粉、ペプトン類、ア
ンモニウム塩類、酵母抽出物等の様な同化性窒素源を含
む必要がある。

栄養無機塩類も培養媒質に便利に混合することが出来ま
たこの塩類はナトリウム、カリウム、アンモニウム、カ
ルシウム、燐酸塩、硫酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、
炭酸塩又は同様のイオンを与えうる様な普通のどんな塩
類を含んでもよい。

カブレオマイシンの製造は微生物を充分成長させるどん
な温度、例えば〜２５−４１℃で行なうことが出来るが
約２８−３０°Ｃで行なうのが便利である。

普通最適製造は約５−６日中に達成される。

深部好気性培養条件はカブレオマイシン生成の選択条件
である。

比較的少量の製造にはフラスコ振盪および表面培養が使
用出来るが、大量製造には殺菌タンク内での深部好気性
培養が好ましい。

殺菌タンク中の培地は胞子分裂した懸濁液で接種出来る
が、胞子分裂した懸濁液を接種物として使用した場合成
長遅滞が経験されたので培養の前培養が好ましい。

したがって比較的少量の培地を微生物の胞子型で培養し
て先づ微生物の成長性接種物を生成しまた若い活力ある
成長性接種物が得られていれば犬タンクに無菌状態で成
長性接種物を移すのがよい。

成長性接種物が生成される醗酵媒質はカブレオマイシン
の大規模製造に利用される媒質と同じでも又はらがって
いてもどちらでもよい。

醗酵媒質中のカブレオマイシンの濃度は醗酵期間中カブ
レオマイシンで抑制されると知られている微生物に対す
る培養試料の阻止作用を検べて容易に追及出来る。

この試験菌の一つはよく知られたペーパーディスク平板
検定法に使われるＢ、サブチリスＰＣＩ２１９である。

最適生産力価を得た後歯体と不溶性固体をｐ過又は遠心
分離の様な普通の方法で分離して培養媒質から水溶性カ
ブレオマイシン混合物を回収出来る。

カブレオマイシン混合物は陽イオン性イオン交換樹脂、
好ましくはアンモニウム型のアンバーライトＩＲＣ−５
０型樹脂上に吸着して沢過又は遠心分離機で培養液から
回収される。

次いで樹脂を水洗し適当な溶離剤、例えばｐＨ２の鉱酸
溶液を使って樹脂からカブレオマイシンを溶離する。

この活性分別部分を併せ活性炭に吸着させまたｐＨ２水
性ブタノールで溶離する。

ブタノール層を分離した後水性層をアルカリ性樹脂、例
えば水酸基型のアンバーライトＩＲ−４５で中和して遊
離塩基型のカブレオマイシンを含む流出物を得る。

次いで流出物を真空濃縮し凍結真空乾燥して遊離塩基型
カブレオマイシン固体を得る。

必要ならばカブレオマイシン混合物の成分を例えばカラ
ムクロマトグラフ法によって更に精製して単一抗生物質
として得ることが出来る。

混合物のクロマトグラフ法はシリカゲル、アルミナ、炭
素等の様な種々の普通の吸着剤上をとおして出来る。

好ましい吸着剤はシリカゲルである。次いで成分を１０
％酢酸アンモニウム：アセトン：１０％水酸化アンモニ
ウム（９５：１００：５）溶媒系を使って溶離するのが
好ましい。

活性ある分別部分を捕集し同一成分を含む部分を併せ脱
塩し濃縮し凍結真空乾燥してカブレオマイシンＩＡ。

ＩＢ、ＩＩＡおよびＩＩＢを得る。

必要ならばクロマトグラフ法又は向流分配の様な普通の
方法でこれら成分を更に精製出来る。

カブレオマイシンは米国特許第３，１４３，４６８号に
記載の様な普通の方法で酸付加塩に転化出来る。

本発明の方法によって得たカブレオマイシンは文献に記
載されているとおり知られた抗生物質と同一の特性を示
す。

次の実施例は本発明を例証する目的のみのもので如何な
る点でも本発明を限定するものではない。

６アンバーライビ′はロームアンドバース社の商品名で
ある。

下記アンバーライ１−ＩＲＣ−５０およびＣＧ−５０は
カルボキシリックポリメタアクリル型の弱酸性陽イオン
交換樹脂の商品名である。

アンバーライト■Ｒ−４５はクロロメチル化ポリスチレ
ン−ジビニルベンゼン母体をもつ弱塩基性陰イオン交換
樹脂の商品名である。

実施例 １ ダクチロスポランジアム バリニスポリウムＤ４０９−
５株の培養を次の組成： 麦芽抽出物 ＩＯ％ 酵母抽出物 ０．４ ％グルコー
ス ０．４ ％寒 天
１．６ ％Ｃａ ＣＯ３０，０５
％ より成るｐＨ７，３の斜面培地上で３７°Ｃで微生物を
増殖させた。

かくつくった斜面培地を次の組成二 人豆粉 ３ ％ コーンスターチ ２ ９ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，３３％ Ｃａ ＣＯ３１，０％ より成る栄養培地に接種するのに使用した。

２５０ ｒ９”の回転振盪機上で２８℃で２日間栄養培
地で培養した。

培養物の２ｍ１部分を同じ栄養培地組成をもつ５００ｍ
１エルレンマイヤーフラスコ中の醗酵媒質１００１ｒＬ
ｌに移した。

この醗酵進行状況を試験菌としてＢ、サブチリスＰＣＩ
２１９を使ってペーパーディスク平板検定法によって追
及した。

抗生物質生成は５−６日中（ｐＨ８，２）に最大５００
ｍｃｇ／ｒｎｌ；に達した。

収穫した培養液を涙過しＰ液中の生物活性をｐＨ７でア
ンバーライト■ＲＣ−５０（ＮＨ４＋）に吸着させた。

この樹脂を水洗しｐＨ２のＨ（ｌ溶液で溶離した。

活性分別部分を併せ活性炭に吸着させｐＨ２水性ブタノ
ールで溶離した。

ブタノール層を分離し水層をアンバーライトＩ Ｒ−４
５（ＯＨ−）で中和し真空濃縮し凍結乾燥させて淡褐色
固体を得た。

これはカブレオマイシン遊離塩基と決定された。

薄層クロマトグラフ法とバイオオートグラフ法によって
生物活性４成分の存在が認められた。

各成分の分離の為粗固体混合物をシリカ−ゲルクロマト
グラフ法に１０％酢酸アンモニウム：アセトンニｌＯ％
水酸化アンモニウム（９５：１００二５）溶媒系を使っ
て精製した。

第１活性分別部分を集めカーボンクロマトグラフ法によ
って脱塩し真空濃縮しかつ凍結乾燥して最少成分、カブ
レオマイシンＩＩＡとＩＩＢの混合物を得た。

同様に第２活性分別部分から主成分カブレオマイシンＩ
Ｂを得た。

また第３分別部分からカブレオマイシンＩＡを得た。

カブレオマイシンＩＢをｐＨ９の０．６ Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液で飽和したアンバーライトＣＣｒ−５０（
ＮＨ，”）のカラム上でクロマトグラフ法にかけ同じ緩
衝液で溶離して更に精製した。

活性分別部分を集め活性炭吸着によって脱塩しＨ２ＳＯ
４でｐＨ２としたブタノール水溶液で溶離した。

活性溶離液を真空濃縮しメタノールで沈澱させて白色無
定形粉末としてカブレオマイシンＩＢ２硫酸塩を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ダクチロスポランジアムバリエスポリウムと同定命
   名されるＤ−４０９−５株（ＡＴＣＣ３１２０３）又は
   そのカブレオマイシン生成性突然変異体を炭素および窒
   素の同化性源を含む水性栄養培地中で好気性条件で培養
   して上記培養培地中に上記微生物により実質的量のカブ
   レオマイシンを生成しかつ任意に上記カブレオマイシン
   を培養培地から単離することを特徴とするカブレオマイ
   シンの製法。 ２ 微生物がダクチロスポランジアムバリエスポリウム
   ＡＴＣＣ３１２０３である特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３ ダクチロスポランジアムバリエスポリウムと同定命
   名されるＤ４０９−５株（ＡＴＣＣ３１２０３）又はそ
   のカブレオマイシン生成性突然変異体を炭素８よび窒素
   の同化性源を含む水性栄養培地中で好気性条件で培養し
   上記培養培地中に上記微生物により実質的量のカブレオ
   マイシンを生成し培養培地からカブレオマイシン混合物
   を分離しその混合物をクロマトグラフ法吸着剤に吸着さ
   せかつ吸着剤から個々の成分を分別溶離することより成
   ることを特徴とする個々の物質としてのカブレオマイシ
   ンＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、および１１Ｂの製法。