JPS6134002A - リガンド不動化担体物質 - Google Patents

リガンド不動化担体物質

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JPS6134002A
JPS6134002A JP13584585A JP13584585A JPS6134002A JP S6134002 A JPS6134002 A JP S6134002A JP 13584585 A JP13584585 A JP 13584585A JP 13584585 A JP13584585 A JP 13584585A JP S6134002 A JPS6134002 A JP S6134002A
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JP
Japan
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polysaccharide
matrix
galactose
carrier material
ligand
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Application number
JP13584585A
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English (en)
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ステイーブン・ベレゼンコ
ロバート・ジエームス・スタージヨン
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Original Assignee
National Research Development Corp UK
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は特に、単に化学親和性クロマトグラフィー分析
にのみ用いられるのではない、リカン）−を不動化する
担体物質（Ｓｕｐｐｏｒｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ）に関す
る。
（従来技術−バートＡ） 化学親和性クロマトグラフィー分析において、担体物質
は精製さ）するべき結合パー１−ナーにたいして化学親
和性を有するリガンドと該リカントに通常共有結合によ
り結合した不溶性７トリノクスから成る。例えば、蛋白
質Ａは不溶性マトリックスに結合したＩｇＧを有するカ
ラムて精製してもよい。
種々のマトリックスが提案されているか、生物分子の精
製のためには、選択は比較的限られている。アガロース
は親水性、多孔質および安定であるためにしばしば用い
られるか、アガロースは高価で、例えば、ＣＮＢｒによ
る活性化が蛋白質の結合に要求される。最近、ノリカッ
ト１ルツクスを有する担体物質が見直されてきた（オー
ルソン（ＳＯｈｌｓｏｎ）およびグラフト（Ｍ　、　Ｇ
　１ａｄ）、「化学親和性クロマトグラフィーと生物学
的認識」、ニド（ｅｄ）・カイケン（ｃｈａｉｋｅｎ）
、ウィルチｘ’）り（Ｗｉｉｃｈｅｋ）およびタリク−
（Ｄａｒｉｋｈ）、アカデミツク・プレス（Ａ、　ｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ）ニューヨーク（ＪＪｅｗＹ
ｏｒｋＸＩ　９８３）、第２４１−２５０頁）。これら
の物質には前記文献の筆者も記載するように種々の欠点
を有する。
「発明の要約」の記載かなければ、上記以外の従来技術
は明らかにはならないのて、従来技術の追加部分（パー
トＢ）は「発明の要約」の後に記載する。
（発明の要約） 本発明はアガロース（そのいくつかの形態のものは大量
に市販されている。）とは全く異なるポリサッカライド
を用い、更にそれが不動化および活性化の両者によりア
ミン含角゛リカノドと極めて容易に反応し得る事実に基
ついてなされた。本発明において、ポリサッカライドは
多くのペンタッドまたは末端（非還元）Ｄ−ガラクトー
ス基を有する。これがＤ−ガラクトースオキノターセ酵
素（ＥＣ１，１，３，９）により活性化されに、アルデ
ヒド基か形成される。このアルデヒド基がアミン含有り
カントと反応し得る。ポリサッカライドを不動化するた
めには、それを架橋してもよく、また、本発明の特に何
州な態様では、ペンタッドまた（」末端Ｄ−ガラクトー
ス基のいくつかは予めｌ〕−ツノラクトースオギノダー
ゼにより酸化さね、次いでアミノ基含有マトリックスど
反応してもよい。使用される酵素の量は意識的に限定さ
Ａ１、遊離の■）−ガラクト−ス基を別の酸化のために
残し、それらをリガンドとの反応のために活性化する。
１つの観点において、本発明は一般式 ％式％ ［式中、ＧはＤ−ガラクトース残基を表わし、Ｌ　Ｉ　
Ｇはリガント残糸を表わし、Ｒは水素原子を表わす（但
し、Ｌ　Ｉ　ＧおよびＲは共に同一のリガント分子の残
基を示す）］ て表わされるペンダント基または末端基を有する不動化
ポリサッカライドを含有する担体物質を提供する。
好ましいポリサッカライドはＤ−ガラクト−Ｄ−マンナ
ンであって、［グアラン（ｇｕａｒａｎ）、１としてグ
アーカムおよび後に記載する他の自然物質から入手でき
る。
別の観点ては、本発明Ｌｌ：（ａ）ペンダントまたは末
端非還元−Ｄ−カラクトース残基を有するポリサッカラ
イドを不動化し、 （ｂ）　Ｄ−ガラクトースオキシダーゼによりＤ−ガラ
クトース残基中に存在する一ＣＩ−Ｉ　、ＯＨ基を酸化
することにより不動化ポリサッカライドを活性化し、そ
して （ｃ）該活性化不動化ポリサッカライドを第１級または
第２級アミノ基を有するリガントと反応して、ノソフ塩
基（アル上′−イミンまたはアルド−イミニウムイオン
）を形成し、次いで還元剤によりノソフ塩基を還元する
ことからなる上記担体物質の製造方法を提供する。
３番目に、本発明は」−記担体物質の化学親和性クロマ
トグラフィー分析における用途を提供する。
これは化学親和性クロマトグラフィーによる分析方法と
して表現され、該担体物質−にでリガント用の結合パー
トナ−をクロマトグラフィー分析することよりなる。
（従来技術の追加（バートＢ）） 本発明において新規かつ進歩的なこと（Ｊ、アガロース
法から脱却し、その様な脱却か異なる種の水溶性ポリサ
ッカライドを不動化し、それにリカンド基を付加するこ
とによりどのようになされるのかという考えに基づいて
いる。使用される化学反応は公知あるいは公知方法に類
似する方法である。カーポハイドレート・リザーチ（ｃ
ａｒｂｏｈｙ−ｄｒａＬｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ）　８１
、ＣＩ　０−ＣＩ　２（＋　９８０）にホール（Ｌ、Ｄ
：Ｈａｌｌ）およびヤルパニ（ＭＹａｌｐａｎｉ）には
Ｄ−ガラクト−Ｄ−マンナンの化学的誘導法を示した。
このポリサッカライドはアルデヒド基をペンダントＤ−
ガラクトース残基に導入するためにＤ−ガラクトースオ
キノダーセ（ＥＣ］、１．３．９）により酸化される。
次いで得られたアルデヒド基をアミノ遊離ラジカル、４
−アミノ−２，２，６，６−チトラメヂルーピペリジノ
ー１−オギンルおよびノアノホウ水ナトリウムと反応し
、それによりアミンがアルデヒドのＣ−原子に共有結合
ずろ。その機構を以下に示す。
ＯＩ この方法によりニド【Ｊキノトラノカル基かカラクトマ
ンナンにイ」加され、それによＩＪ電子スピン共鳴によ
る分子実験のためにラベル化を行なう。
この文献の執筆者はこの方法を特定選択（アルデヒドと
反応するためのアミンの選択）の置換基の導入に用いら
れることは潜在的に記載しているか、彼等はそうケるこ
とによる実際的な目的は何ら開示しなかった。架橋する
ことにより［）−カラン１〜マンナンを不溶化すること
は、ロンクレノ（ＪＬｏｎｎｇｒｅｎ）、ゴールドスタ
イン（１、、Ｉ　、ＧｏｌｄｓＬ−ｅｉ　ｎ）およびパ
イウォータ・−（Ｒ、Ｂ　ｙｗａＬｅｒ）による、フェ
ツス・レター（Ｆ　ｅｂｓ　Ｌ　ｅｔｔｅｒｓ）、６８
、第３１〜３４頁（１９７６）ににり公知てあり、彼等
は化学親和性クロマトグラフィーによるある種のレクチ
ンの精製に架橋ククアランを用いた（ペクチンおよびα
−Ｄ−カラクトーピラノンル塙はロック−アント−キー
結合相互反応を示す）。酵素を不動化するために不溶性
マトリックスとしてのアミノプロピルガラスの使用がウ
ィートオール−（ＩＩＨ、ＷｅｅＬａｌ　ｌ）により、
メソッド・イン・エノザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　４４、第１３４〜１４
Ｂ頁に提案されているが、この文献には、このガラスと
ポリサンカライドとの反応は何ら示唆されていない。
多孔性ガラスをグリセリル残基ンで被覆し、該グリセリ
ル残基の近接する一〇Ｈ基を過沃素酸ナトリウムで酸化
し、該酸化担体を酵素、例えば、トリプシンで反応し、
次いで、得られたンッフ塩基をホウ水素化ナトリウムま
たはンアノポウ水素塩で還元することは公知であるＬロ
ジャー（Ｇ、Ｐ。
Ｒｏｙｅｒ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏ−
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　
Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ−ｃａｔｉｏｎｓ）　
６４、第４７８〜４８４頁（１９７５）参照］。米国特
許第４．４３０，３４８号には同様の方法（こよりグル
コアミラーゼをセラミック担体に付加することが開示さ
れている。
アガロースを酵素ミニオイノシトボールオキノゲナーゼ
、即ち、種々のオリゴマー状態で存在する鉄含有酵素の
化学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性する
試みがなされてきた。ジャーナル・オブ・クロマトグラ
フィー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ）　２８３１第１９１〜＋９７頁（１９８４）に
、コラ−およびコラ−（Ｆ　、Ｋｏｌｌｌｅｒａｎｄ　
Ｅ、Ｋｏｌｌｅｒ）は、アガロースを部分的に酸加水分
解し、得られた生成物をパーオキシダーゼおよびガラク
トースオキノターゼの混合物で酸化し、次いで酵素のク
ロマトグラフィーに用いることを開示している。このク
ロマトグラフィーはＦｅ’“イオンの添加により十分に
作動する。しかしながら、リガントとアルデヒド基との
共有結合は何ら示唆されていない。
発明者により既知の上記文献は、本発明の幾つかの特徴
はそれ自体公知である旨を示唆するか、それは最初に本
発明のアイデアがあったから認識し得るものである。言
わば、従来技術の遡及的結合である。本発明者らの知識
によれば、り浦ｆｉにガラクトマンナンを不動化し、化
学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性するこ
とは誰によっても示唆されていない。
（好ましい実施例の開示） 簡単のために、ポリサッカライドとしてＤ−ガラクト−
Ｄ−マンナン（以下、単に「ガラクトマンナン」と言う
）を用いて本発明を説明する。しかしながら、（１−位
Ｏ−原子を通して他のノユガー残基と結合するものと異
なり）末端１−炭素原子と共に５−ＣＨ２０Ｈが存在す
る遊離カラクトース基を有する他のポリサッカライドに
し本発明反応が適応されると理解されるへきである。
他のその様なポリサッカライドの例としては、（１−４
）−β−グルカン骨格上にガラクトノルギノロノル側鎖
を宵するグルカンである「アミロイド］が挙げ、られ、
「エノサイクロピディア・オブ・プラント・フィジオロ
ノー（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆＰ　１ａｎｔ　
Ｐ　ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）ｊ、ニューンリーズ、第１３
Ａ巻、ローウス（Ｆ　、　Ａ　、　Ｌ　ｏｅｗｕｓ）お
よびタナ−（ＷＴ　ａｎｎｅｒ）による「プラント・カ
ーボハイドレイツ・１」、ストリンノヤー−バーラグ（
Ｓ　ｔｒｊｎｇｅｒ　−ｖ　ｅｒｌａｇ）、１９８２、
第４３０〜４３１頁に記載されている。
ガラクトマンナンは通常、レグミノースアエ（Ｌ　ｅｇ
ｕｍｉｎｏｓｅａｅ）種の種、特にファーカムから得ら
れる。またガラクトマンナンはｉ　ｉｉ二物からも得ら
れるか、水溶性の植物性ガラクトマンナンか好ましい。
種々のガラクトマンナンとその原料はプアー（１、Ｃ，
Ｍ、Ｄｅａ）およびモリリン（Δ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）
による「アトバノノズ・イノ・カーボハイトレイト・ケ
ミストリー・アンド・バイオケミストリーＡ（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ　３
１巻、第２４１−３１２頁（１９７５）に記載されてい
る。ガラクト・マンナンはマンノース鎖を有し、該マン
ノース鎖の半分の残基に対しガラクトース基がマンノー
スの６−Ｃ−原子とガラクトースのＩ−Ｃ−原子を通し
て結合している。
ガラクトマンナンの酵素酸化は式 ％式％ に従って室温で容易に進行する。上記酸化で生成する過
酸化水素は禁止的な濃度の形成を防止するために除去さ
れることを要する。一般に除去はカタラーゼまたはペル
オキシダーゼの如き酵素によって行なってもよいが、電
気化学的に除去してもよい。酵素の変性に注意すれば、
所望により高温を用いて反応を行なってもよい。Ｄ−ガ
ラクトースオキシダーゼの里またはインキュヘーノヨン
の時間および温度はアルデヒド基か所望の割合で生成す
るよう調整される。
使用し得るリガンドアミンは適当なりガツト残基をイ」
加する手段を提供し得る如何なる第１級ま′たは第２級
アミンであってもよい。従って、酸化されたガラクトマ
ンナンは式ＬＩＧ−ＮＨ２または、 ＬＩＧ−Ｎ−Ｈ ［式中、ＬＩＧおよびＲは前記の通り。］を有する第１
級または第２級アミンであるリガンドと反応させる。上
記定義中、ｒＬＩＧＪは化学親和性クロマトグラフィー
に有用な方法でそのＬＩＧ残基と相互作用する他の分子
に対し特定の結合作用を有する分子残基を意味する。活
性化されたガラクトマンナン」二に所望の結合作用は有
するか必要とするアミン基の欠如した分子を導入するに
は、まず該分子をアミン爪を提供する基と反応すると理
解される。例えば、その様な基を何する分子をアルキレ
ンジアミンと反応させることにより、アミン末端基を提
供する。得られたアミノ−末端分子を式’ＬＩＧ−ＮＨ
２または ＬＩＧ−ＮＨ と見なされる。
ＬＩＧおよびＲ基か共にリガンドの残基である場合、そ
れらは全く独立の残基であってらよく、また両残暴によ
り環を形成してもよＬ）。
好ましくはリガントは酸化されたガラクトマンナンのア
ルデヒド基に対してアミノ基かモル過剰に用いられる。
好ましくはリガントは、生物学的分子、例えば、抗原、
抗体、イムノグロブリン、メタホライト、酵素血清蛋白
、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオヂドか挙げられる。使用
し得る酵素の例としてはラクテートデバイトロゲナーゼ
、インバーターゼおよびβ−グルコンダーセか挙げられ
る。２またはそれ以上の異なるリガンドを１つのガラク
トマンナン分子に加えてムよい。ソノダル−ストランデ
イノ１”　Ｄ　Ｎ　Ａはアデニンヘースの６−アミノ基
により結合され得る。
アルデヒド基とアミンとの反応により、シッフ塩基、好
ましくは部分式 ％式％ を有するシッフ塩基が生しる。いずれにしても、反応生
成物は還元剤、例えば、ソアノポウ水素ナトリウムによ
る還元を必要とし、結果として所望の生成物に好ましい
反応平行になる。
化学親和性クロマトグラフィーに用いられる結合パート
ナ−は適当に選択される。例えば活性化ガラクトマンナ
ン上でアくンセロトニンを不動化し、ノイラミン酸また
はその誘導体の精製に用いられる。また蛋白Ａを不動化
し、ＩｇＧの精製に用いてしよい（逆に用いてもよい）
。不動化抗原はその抗体−の精製に有用であり、また逆
に用いてもよい。種々の酵素をカラン）・マンナノに結
合（ｃｏｎコｕｇａｔｅ）　してもよい。
結合したパートナ−（リケード）を常套のケルフィルト
レーノヨンを含む種々の方法により固定リヵンドから回
収してもよい。
ガラクトマンナンを固体マトリックスに対し物理的、化
学的（好ましくは、化学的）または一部分物理的／一部
分化学的に接触する接触子あるいは、ガラクトマンナン
のマトリックスを形成することにより不動化してもよい
。本発明の一態様においては、ガラクトマンナンをＤ−
ガラクトースオキシダーゼと反応して、有効な−ＣＨ２
０Ｒ基の一部分だ１プを酸化し、これを用いてガラクト
マンナンをペンダント第１級または第２級アミノ基、例
えばアミノプロピル、　（ｃＨ２）３ＮＩ−１２基を有
するマトリックス物質に結合してもよい。ノリヶート、
例えば、アミツブ〔７ビル基を有するコントロールボア
ークラスまたは多孔質珪藻土を用いてもよい。カップリ
ングの結果としてシッフ塩基が生成し、これを好ましく
は、例えばンアノホウ水素ナトリウムで還元し、ｌ）Ｈ
の変化に対しより高い安定性を有する結合を提供する。
少なくとも力ラクトース残基上の残存−ＣＨ７ＯＨのい
くつかをＤ−ガラクトースオキノターセで反応し、」−
述の如きリカンドに対しカップリンクするためアルデヒ
ド基を形成する。
上記反応は逆に行なってもよく、即ち、リカントに対す
るカップリングを最初に行ない、次いでガラクトマンナ
ンを酸化し、マトリックスに対し生成物をカップリング
または架橋してもよい。
アミノ基か基本的なマトリックス物質上に与えられる必
要は必ずしもない。例えばアクリルポリマーに存在する
如き、カルホキシル基を含有する基本マトリックスをア
ミン官能基を提供する反応試薬と反応してもよい。無機
酸化物、例えば、珪素、アルミニウムおよびチタンの酸
化物または水酸化物である基本マトリックスをそれ自体
公知の方法により変性して、ペンダントアミノ基、例え
ばアミノプロピル基を導入してしよい。また、゛基本マ
トリックスにアミノ基を含有オろ補助物質に物理的に吸
着または吸収させろことにより導入し、次いでガラクト
マンナンを補助物質のアミノ基に化学的に結合してもよ
い。好ましくは補助物質は蛋白質、特にＢＳΔである。
また、ガラクトマンナンをアミンと反応し、マトリック
スに付加するための官能基を導入してもよい。いすノ１
の場合においても、本明細書の定義の目的において、反
応残基は７１〜リノクス残暴の一部であると見ｔＪ−さ
れる。従って便宜的には、ボリザノ力ライト：Ｊ式％式
％ ［式中、Ｇ′はポリザノカライト」二の別のペンダント
または末端Ｄ−カラクトース残基を示し、ＭＡＴはマト
リックス残基を示し、Ｒは水素原子を示す（但し、ＭＡ
Ｔおよびｒ（は兵にマＩ・リークス残基である）（注：
前出のＲおよびＬ　Ｉ　Ｇ定義に似ているが、Ｒおよび
ＭＡＴか同一の一個の分子の一部である必要はない）］
を有する基によりマトリックスと結合したものと定義さ
れる。従って、マトリックスがアミノプロピル基を有す
る場合、−ＮＲ−基（」アミノプロピル基の−Ｎ　１−
１−残基てあり、−（ｃＨ２）、−結合はマトリックス
残基ＭＡＴの一部である。
便宜」二、酸化されたガラクトマンナンはマトリックス
のアミノ基に対してアルデヒド基か過剰になるように用
いる。
別の態様においては、架橋、例えは、エポキノ架橋がガ
ラクトマンナン中に形成される。エビクロロヒドリンか
架橋を導入する有用な試薬であり、上記文献から公知の
方法により導入される。他の架橋試薬はジビニルスルホ
ンである。
本発明を以下の実施例に基づいて説明する。
寒檄咋 実施例１ り゛アー（ノアモプンステトラゴノし、・＼（す町ｍｏ
ｐｓｉｓ　ＴｅＬｒａｇｏｎｏｌｏｂａ））の市販品を
エタノール沈澱により精製した。力ｌ・の１％（ｗ／ｖ
）溶液を前記グアーを湿潤するのに必要とするエタノー
ルの最も少ない量を添加し、グアーを２時間放置し、次
いで強攪拌子に蒸留水を加えることにより調製した。次
いで、得られた溶液を攪拌下に９０°Ｃで３０分加熱（
７た。冷却後、不溶性物質を１０分間の遠心分離（７０
００ｇ）により除去しノー６．１−澄み液を５０％（Ｗ
／Ｖ）エタノールに添加し、白い沈澱物をハスリンを通
過させることにより回収した。
ｌｉｔ物を９６％エタノールとン」−デルエーテルによ
り洗浄し、室温で乾燥した。
（２）架橋によるガラクトマンナンの不動化段階（１）
から得られた精製グアーカム（１０！／）を激しい攪拌
下に水酸化すトリウノ、（１，４９）を含む２０％（ｖ
／ｖ）プロパン−２−オール（２００ｘＣ）に添加した
。混合物を窒素で１時間還流し、次いでエビクロロヒド
リン（１，５ｙ）を添加した。次いで、グアーガムを振
盪ウォーターハス中で４０℃１６時間インキュベートし
、次いで更に６０°Ｃ８時間インキュベートした。得ら
れた架橋グアーガム（ｃＬ−グアー）を塩酸でｐＨ７に
し、プリンタで計量した１（！中に＠濁した。懸濁およ
び沈澱により巨大粒子と微細粒子を除去した。次いで、
ＣＬ−グアーを凍結乾燥し乾燥状態に保持した。
（３）ＣＬ−ガラクトマンナンの活性化ＣＬ−グアー（
２５９）をｐＨ７、０の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（１２５
靜）中で２５℃　２４時間でカラクト−スオキンターゼ
（５０Ｕ）およびカタラーゼ（１００００ｔＪ）で酸化
した。酸化後、ＣＬ−グアーを２０ｍＭ重炭酸ナトリウ
ム（２Ｏｓ＆）で洗浄し、燐酸ナトリウム緩衝液中で０
．１Ｍにした。
段階（３）からの酸化されたＣＬ−グアーに０゜１Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０（１２，５酎）中でセロ
トニン（５０πｇ）およびシアノホウ水素ナトリウム（
２４ｆｆ＠）を加え、３６時時間光を進行させた。次い
で生成物を段階（３）に記載の如く洗浄した。
段階（４）からのりカント−保持担体をプリンタ、／＜
レル（ｓｙｒｉｎｇｅ　ｂａｒｒｅｌ）に挿入し、約２
戚のヘッド容積を得た。クロマトクラ“フィー分析を６
０ｍＭ燐酸す）・リウム緩衝ｅｃｐｌ−１７，Ｏの出発
緩衝液中で純粋フェツインを用いて実施した。カラムの
結合能は２ｍｇフェツインであった。ＯＤ、ｓ。
か０になるまで溶出を続けた。この際、フェツインは１
Ｍ塩化すｌ・リウムを含む出発緩衝液で溶出した。
カラムに対する蛋白質の非特異的結合を牛の血清アルミ
ン（＋Ｏｚｇ）を用いて測定し、１００７Ｂの量でフェ
ツインで溶出したことか解った。７Ｊツイン含有フラク
ノヨンは２８０ｎｍの吸光度を有し、ノアリン酸呈色を
示した。
実施例２ ０−カスト・ヒーノ（セラトニア・７リクア（ｃｅｒａ
Ｌｏｎｉａ　１環ｌ胆））カムを用いて実施例１の段階
（１）を繰り返した。プロパン−２＝オールの３５０ｚ
ρを２００ｉ（ｊの代わりに用いる以外は段階（２）を
繰り返した。
■凱 タラ（カエスルピニア・スピノザ（ｃａｅｓｕｌｌ）ｉ
ｎｉａｓｐｉｎｏｓａ））カムを出発物質として用いて
実施例２を繰り返した。
害施例４ 実施例Ｉの段階（３）を２倍のスケールで繰り返した。
ヒトノＴ　ｇＧ（５０ｍｇ）ノ０　、１　Ｍ燐酸塩緩衝
液ｐＨ７，０（２５靜）およびシアノホウ水素ナトリウ
ム（４７Ｒｙ）を加え、４８時時間先を実施した。次い
で生成物を実施例１の段階（３）に記載の如く洗浄した
。より好ましい洗浄方法を実施例８に記載する。
純粋な蛋白質Ａ（ングマ５　ｍｇ）を上記のように調製
したｒｇＧカップルド担体のシリンジバレルカラムＣ２
ｍＱヘット容積）でクロマトグラフィー分析した。出発
緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナトリウム−〇、２５Ｍ　ＮａＣ
０，ｐＨｓ、ｏであった。溶出を０Ｄ２８ｏか０になる
まで継続した。この場合、蛋白質Δは０．１Ｍ　グリン
ン緩衝液ｐ）（２、５で溶出された。このカラムの能力
は少なくとし　５Ｍｇ蛋白質Ａである。更に吸収物質を
ｌ　ｌｖｉ塩化ナトリウムで除去し、カラムを再生した
。
牛の血清アルブミンの非特異的結合は検出されなかった
。蛋白質Ａは各フラクノジン中でＩｇＧ中へのロ゛−レ
ルロケソトイムノー電気泳動により探知した。
実施例５ （１）ガラクトマンナンの１１岡− 精製グアーカムを実施例１の段階（１）から得た。
歿佳旭 アミノプロピル−ＣＰＧを３−アミノプロピル−ｌ−リ
エトギンンランおよび７００人孔径（２００〜４００メ
ソツユ）ＣＰＧおよびウイートオール（Ｈ、Ｈ、Ｗｅｅ
ｔａｌ　ｌ）によるメソッド・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、４
４、第１３４〜＋４８頁に記載の水性法を用いて調製し
た。
段階（＋）からの精製ファーガム（０，２９）をガラク
トースオキシダーゼ（５０Ｕ）およびカタラーゼ（１０
０ＯＯＵ）を加えて０．１．Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液１
）８７　、０　（５０ｍ（１）中で４時間２５°Ｃて酸
化した。次いで溶液を５時間１００°Ｃに加熱し、冷却
した。アミノプロピル−Ｃ１）Ｇ（１９）をシアノホウ
水素ナトリウム（ｌｏｆＲｇ）と共に加えた。
還元を２５℃で３６時間継続し、その後ＣＰＧ−ガラク
トマンナン結合体を２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４，５
（５０ｘＣ）、１Ｍ塩化ナトリウム（５０ａＱ）、２０
ｍＭ重炭酸ナトリウム（５０Ｉρ）で洗浄し、０．１Ｍ
燐酸塩緩衝溶液に戻した。生成物を「Ｓｌ−ガラクトマ
ンナン」とした。
（３）Ｓｉ−ガラクトマンナンの活性化前記のごとく調
製した８１−ガラクトマンナンのＯ，１Ｍ燐酸塩緩衝溶
液ｐＨ７，０（５０酎）をガラクトースオキシダーゼ（
５０Ｕ）およびカタラーゼ（１００ＯＯＵ）で２５℃８
時間処理し、実施例１の段階（３）に記載の如く洗浄し
た。
（４）活性化Ｓｔ−ガラクトマノナン）例」又（兜椿企 次いで活性化Ｓ１−ガラクトマンナンをＯＩＭ燐酸塩緩
衝液ｐＩ（７，０（２０ａＱ）中てヒトのＩｇＧ（３０
ｍ９）とシアノホウ水素ナトリウム（３８Ｕｇ）と４８
時間反応し、実施例１の段階（３）に記載の如く洗浄し
た。得られたＩｇＧ−保持担体は実施例１の段階（５）
の方法により蛋白質Ａを精製するのに有用である。
への結合 Ｓｔ−ガラクトマンナン（ｌＩ？）を実施例５の段階（
２）および（３）の如く調製した。次いで、活性化Ｓ１
−ガラクトマンナン（１ｇ）をＯ，１Ｍ燐酸すｌ・リウ
ム緩衝液ｐＨ７，０（２０好）中で４８時間にわたって
β−グルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２１）（３０ｇ
）およびシアノホウ水素ナトリウム（３８ｘｙ）で反応
し、実施例１の段階（３）の如く洗浄した。
全ての洗浄物をプールし、２５ｍＭ酢酸ナトリウムｌ）
Ｈ５、Ｏに対して透析し、β−グルコンダーゼ活性を測
定した。
結合β−グルコンダーゼの活性 ｌユニットの酵素活性＝ＩμＭのｐ−ニトロフェノール
が３７℃で１分間にっきｐ−ニトロフェノール−β−ゲ
ルコツトから放出された。
β−グルコシダーゼ活性を０．２５Ｍ酢酸ナトリウムｐ
Ｉ（５，０（０，ｌ１Ｑ）とｐ−＝トロフェノール−β
−ゲルコントＣ２ｙｎｇ／ｍ（ｌの０　、８　＋ａＱ）
）中で既知量の懸濁液（０゜１ｍｃまて）中の担体を用
いて３７°Ｃて測定した。アリコート（０，１ｍ（りを
３０秒間隔で除去し、０．２５Ｍ　グ’）’ｙンｐｌ（
１０，０（３，９１）に加えると、４００ｎｍの吸収を
示した。
（ａ）全ての洗浄物およびＳｌ−カラクトマンナンへの
結合物中の酵素活性の回復は出発ユニットの８５％であ
った。
（ｂ）出発混合物は１２０Ｕのβ−グルコシダーゼを含
有し、その７　、７　Ｕｈ＜Ｓ　ｉ−ガラクトマンナン
（１ｇ）ニ結合し、９４Ｕが洗浄物中にあることがわか
った。
（ｃ）２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝ｔ＆ｐＨ５，０中で
２０°Ｃ３９日後、Ｓｌ−カラクトマンナンに結合した
β−グルコシダーゼは７２％の活性を保持した。
寒施童］ β〜タルコンタヘセ川用Ｊラフ上／ノナノへの結合 ０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０（１２５ＩＩ
ＩＮりに存在する実施例１の段階（３）から得た酸化Ｃ
Ｌ−ガラクトマンナンに、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３
，２，Ｉ　、２１）（２５１１ｇ）およびシアノホウ水
素ナトリウム（２４Ｒ９）を添加し、還元を４８時時間
待した。次いで生成物を実施例１の段階（３）のように
洗浄し、洗浄物をプールし、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ１＝対して透析し、β−グルコシダーゼ活性を
測定した。
結合β−グルコンダーゼの活泄 （ａ）カップリング結合に使用した条件下でβ−グルコ
シダーゼの照査実験で４８時間にわｊＪって初期の酵素
ｇ性と比べて、ノアノホウ水素ナトリウムの存在または
不存在下に（実施例６の如き測定した）β〜グルコンダ
ーゼ活性の損失はなかった。
（ｂ）洗浄物および担体への結合物中の酵素活性の回復
は最初のユニットの８０％であった。
（ｃ）出発混合物は１７５Ｕのβ−クルコノダーゼを含
有し、その１３４Ｕか洗浄物中に見られ、６ＵかＣＬ−
ガラクトマンナン（２５０Ｉ１ｇ）にカップリングした
。
（ｄ）２５ｍＭ酢酸ナトリウム　ｐＨ５，０中で２０℃
において２４日経過後、ＣＬ−ガラクトマンナンへ結合
したβ−グルコノダーゼは７５％の活性を保持した。
実施例８ （＋）４之りトマンナンの精製 精製グアーマンナンを実施例１の段階（１）から得た。
（２）ガラクトマンナンのコントロールボアーガかへの
共有付力町 この方法は蛋白質（牛の血清アルジミン）のコントロー
ルポアーガラス（ｃＰＧ）への安定吸着および酸化され
たガラクトマンナンを蛋白質−ＣＰＧマトリックスへ結
合するために蛋白質の遊離アミノ基を利用する。
コントロールボアーガラスをカラム中て過剰のＢ　Ｓ　
Ａ（１０ｍ９／ｍσ）を用いてＢＳＡか溶出液中に存在
するまで、すなわち、カラムか飽和されるまで洗浄した
。次いで、ＣＰＧを１ＭＮａｃρて蛋白質が溶出液中に
検知されなくなるまで洗浄した。
このＣＤ　Ｇ　−Ｂ　ＳΔコンプレックスを実施例５の
段階（２）と同様に処理し、ガラクトマンナン−Ｉ３Ｓ
Ａ−ＣＰＧコンプレックスを生成した。ガラクトマンナ
ンはＢＳＡに共有結合的に結合し、略２ｍｇガラクトマ
ンナン／ｇＣＰＧの収率であった。
（３）ガラクトマンナン−Ｂ、５Ａ−ＣＰＧコンプレッ
クスの活性 段階（２）のコンプレックスを実施例５の段階（３）に
記載の如く、ガラクトースオギノダーゼおよびカタラー
ゼで処理した。
（４）インバーターゼの担体物質への結合過剰のインバ
ーターゼ（１００ＯＵ）をＮａＣＮＤＨ＊（９，５１１
ｇ）含有０．１Ｍ酢酸塩緩衝に１ｐＨｓＯ（５ｍｇ）中
の段階（３）からの担体物質に添加した。
室温（２０°Ｃ）で４８時間後、担体を０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１）
Ｈ４０、次いで非緩衝１Ｍ塩化ナトリウム、および０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸酸緩衝液ｐＩ（８
，０で３回洗浄した。洗浄により［ゆるく結合した（ｌ
ｏｏｓθ）」ガラクトマンナン、すなわち、爪木マトリ
ックスに対し共有結合的に結合していないしのを除去す
る。勿論、リガンド、例えばインバーターゼもガラクト
マンナンに結合しているので、「ゆるく結合した」ガラ
クトマンナンに結合したりガントをも除去する。洗浄方
法はまたＩｇＧに用いてもよい。そのことは実施例４お
よび５に記載されている。
インバーターゼをコンプレックス担体物質にカップリン
グし、得られた結合物はＩＩＵのインバーターゼ活性／
ｇを有することがわかった。
Ｘ叛−μ （１）ｔ？クトマンナンの精製 精製グアーガムを実施例１の段階（１）から得た。
ンチン（ポリ−Ｎ−アセチル−グルコースアミン）を水
酸化ナトリウム水溶液で部分的に脱アクリル化し、酸化
ガラクトマンナンの結合に用いられるポリサッカライド
骨格上の遊離アミノ割を生成した。４Ｍ水酸化すトリウ
ム（２０ｕρ）中で１゜０℃で２時間加熱したノヂン（
２ｇ）は実施例５の段階（２）の方法を用いてンチンの
１９につき５ｍｇのガラクトマンナンをカップルするの
に十分なＮ　Ｈ２−基を有した。
（３）ガラクトマンナン−７チン反応生成物の活慨傷 段階（２）からの生成物を実施例５の段階（３）に記載
の如く、ガラクトースオキンダーセおよびカタラーゼで
処理した。
（４）インバ士ゼの担体卿ｊ− インバーターゼを実施例８に記載の如く、段階（３）か
らの担体物質に力・ソプルし、得らイｔた結合物は担体
の１ｇにつき２６Ｕのインノ＼−ターゼ活性を有するこ
とがわかった。
特許出願人　ナノヨナル・リサーチ・ ディベロノブメント・

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＧはＤ−ガラクトース残基を表わし、ＬＩＧは
    リガンド残基を表わし、Ｒは水素原子を表わす（但し、
    ＬＩＧおよびＲは共に同一のリガンド分子の残基を示す
    ）］ で表わされるペンダント基または末端基を有する不動化
    ポリサッカライドを含有する担体物質。 ２、ポリサッカライドが架橋されたポリサッカライドで
    ある第１項記載の担体物質。 ３、ポリサッカライドがガラスマトリックスに結合する
    第１項記載の担体物質。 ４、ポリサッカライドが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｇ′はポリサッカライド上の別のペンダントま
    たは末端Ｄ−ガラクトース残基を表わし、ＭＡＴはマト
    リックス残基を表わし、Ｒは水素原子を表わす（但し、
    ＭＡＴおよびＲは共にマトリックスの残基を示す）。］ で表わされる基を通してマトリックスに結合される第１
    項記載の担体物質。 ５、マトリックスがアミノプロピル基を有し、第４項記
    載の−ＮＲ−基がアミノプロピル基の−ＮＨ−残基であ
    る第４項記載の担体物質。 ６、ポリサッカライドがＤ−ガラクト−Ｄ−マンナンで
    ある前項いずれかに記載の担体物質。 ７、（ａ）ペンダントまたは末端非還元−Ｄ−ガラクト
    ース残基を有するポリサッカライドを不動化し、 （ｂ）Ｄ−ガラクトースオキシダーゼによりＤ−ガラク
    トース残基中に存在する−ＣＨ＿２ＯＨ基を酸化するこ
    とにより不動化ポリサッカライドを活性化し、そして （ｃ）該活性化された不動化ポリサッカライドを第１級
    または第２級アミノ基を有するリガンドと反応して、シ
    ッフ塩基（アルド−イミンまたはアルド−イミニウムイ
    オン）を形成し、次いで還元剤によりシッフ塩基を還元
    する ことからなる第１項記載の担体物質の製造方法。 ８、不動化がポリサッカライドを架橋することにより実
    施される第７項記載の製法。 ９、不動化がＤ−ガラクトースオキシダーゼにより生成
    した過酸化水素の除去を伴うポリサッカライドの非還元
    Ｄ−ガラクトースを部分酸化し、該酸化ポリサッカライ
    ドの第１級または第２級アミノ基を有するマトリックス
    またはその様なアミノ基およびマトリックスと反応性の
    他の基を有する架橋剤と反応し、次いでマトリックスと
    反応性の基をマトリックスと反応することにより行なわ
    れ、該反応がシッフ塩基の生成、更に所望により該シッ
    フ塩基の還元を実施する第７項記載の製法。 １０、第１〜６項いずれかに記載の担体物質または第７
    〜９項いずれかに記載の方法で製造された担体物質上で
    リガンド用の結合パートナーをクロマトグラフィングに
    より分析する化学親和性クロマトグラフィー分析方法。
JP13584585A 1984-06-20 1985-06-20 リガンド不動化担体物質 Pending JPS6134002A (ja)

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GB8415666 1984-06-20
GB8415666A GB8415666D0 (en) 1984-06-20 1984-06-20 Support material for immobilisation of ligands

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JPS6134002A true JPS6134002A (ja) 1986-02-18

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JP13584585A Pending JPS6134002A (ja) 1984-06-20 1985-06-20 リガンド不動化担体物質

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EP0165800A1 (en) 1985-12-27
GB8515265D0 (en) 1985-07-17
GB2160540A (en) 1985-12-24
GB8415666D0 (en) 1984-07-25
GB2160540B (en) 1987-08-12

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