JPS6136760B2

JPS6136760B2 -

Info

Publication number: JPS6136760B2
Application number: JP54008112A
Authority: JP
Inventors: Garanteino Mauro; De Kasuteiryoone Roberuto
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1978-02-23
Filing date: 1979-01-25
Publication date: 1986-08-20
Also published as: IT1207202B; BE873272A; DE2902015C2; GB2016478A; JPS55100348A; GB2016478B; DE2902015A1; IT7920415A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は治療上有用なデカペプチドであるセル
レチド（米国特許第3472832号参照）およびその
塩類の新規な製造法に関する。

ペプチド化学において慣用の符号を使用する
と、本発明のデカペプチドは次の式（）で表わ
される。

すなわち、ピログルタミル−グルタミニル−ア
スパルチル−チロシル（Ｏ−サルフエート）−ス
レオニル−グルシル−トリプトフイル−メチオニ
ル−アスパルチル−フエニルアラニンアミドであ
る。該ペプチドのチロシン残基のフエノール性水
酸基はサルフエート基でエステル化されており、
そして構成アミノ酸は、グリシンを除いてすべて
Ｌ型である。

以前の合成法は、スレオニン残基の水酸基がア
セチル化された保護されたデカペプチド式
（）：を無水媒体中で硫酸化し、ついで該アセチル基を
鹸化することを含んでいた。この方法は、硫酸化
条件が無水媒体中であることと、そして鹸化工程
のために、他の構造不明の不純物のほかに、数種
の副生物、主としてポリ硫酸化、脱アシドおよび
酸化副生物を与えた。これらすべての不純物は、
必然的に時間と収量をロスする大規模な向流分配
法によつてのみ除去可能であつた。

本発明による新規方法によれば、未保護のデカ
ペプチド式（）：が水性媒体中で硫酸化され、そして最後の鹸化工
程を必要としない。これらより緩和な条件下で、
セルレチドは高収率（95％以上の転換率）で、し
かも高純度（HPLCにより約90％）で得られる。
それ以上の精製は向流分配法によつて行うことが
できる。

未保護デカペプチド（）は、ラセミ化の危険
を避けることばかりでなく、反復する強酸処理に
よつてトリプトフアンの分解の危険を減少する
種々の合成方法によつて得られる。このデカペプ
チドの合成は、保護アミノ酸またはペプチドフラ
グメントの適切な順次縮合よりなる。カツプリン
グは、得られるデカペプチドが所望のアミノ酸10
分子の配列を有するように実施される。ペプチド
化学の分野においてもそれ自体公知の方法によつ
て縮合されるアミノ酸およびペプチドフラグメン
トは、ペプチド連鎖の生成には関与しないがしか
し反応には関与し得るアミノ基およびカルボキシ
ル基を持つているので、これらは加酸分解、鹸化
または加水素分解などによつて除去し得る保護基
でブロツクされる。アミノ基の保護には、例えば
以下の保護基が使用し得る。

カルボベンジロキシ（ベンジルオキシカルボニ
ル）、ターシヤリブトキシ（ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル）、トリチル（トリフエルメチル）、ホル
ミルまたはトリフロルアセチル。

カルボキシル基の保護には、例えば以下の保護
基が使用し得る。

メチル、エチル、ｔ−ブチルまたはベンジル。

１分子のアミノ基と他の１分子のカルボキシル
基との間のペプチド結合の生成は、混合酸無水
物、アシド、ｐ−ニトロフエニル、２，４，５−
トリクロルフエニルもしくはＮ−ヒドロキシスク
シニミジルエステル等のような活性アシル誘導体
により、またはジシクロヘキシルカルボジイミド
もしくは１−シクロヘキシル−３−モルホリニル
カルボジイミドのような縮合剤単独、もしくは１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミド、８−ヒドロキシキノリンなどの
共存下、遊離アミノ基と遊離カルボキシル基との
直接縮合によつて行うことができる。該縮合は
Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルホルムアミド、低級脂肪
族ニトリル、ピリジンまたはテトラヒドロフラン
のような溶媒中で、例えばジメチルホルムアミ
ド、アセトニトリル、ピリジンまたはテトラヒド
ロフラン中で実施することができる。反応温度は
−20℃から室温の範囲である。反応時間は一般に
６乃至120時間である。

硫酸化（本発明の特色工程）は、水性媒体中硫
酸化剤Ｂ：SO₃によつて実施される。Ｂ：は、第
３級塩基であり、例えばピリジン、置換ピリジ
ン、トリメチル−、トリエチルもしくはトリ低級
アルキルアミン、Ｎ−低級アルキルモルホリン、
ジメチルアニリン、イミダゾール、置換イミダゾ
ール、キノリン等である。

デカペプチド（）は有機もしくは無機塩基、
または両者の添加によつてPH9.5乃至10.5におい
て水に溶解される。有機塩基は前出のものであ
り、無機塩基はNaOH，KOH，Na₂CO₃，K₂CO₃
等である。硫酸化剤はそのまゝで、またはジメチ
ルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル等の
水混和性有機溶媒にとかして添加される。反応液
のPHは、上述の塩基の添加によつてPH8.5乃至
12.5の範囲に保たれる。反応時間は一般に２乃至
120時間である。

この合成は、実施例４に記載するようにデカペ
プチド（）の硫酸化および後処理を含む。該デ
カペプチド（）は、実施例３に記載するように
アジド法によつてヘキサペプチド（）とテトラ
ペプチド（）とをカツプリングして得られる。
中間体（）および（）の両者は、それぞれ実
施例１および２による段階的伸長によつて合成さ
れる。

上述の合成法は、ペプチド化学慣用の符号を使
用して次のように表わすことができる。

以下の実施例は本発明を例証するものであつ
て、制限するものではない。

実施例１中間体（）の製造。

Ｈ−Glu−Gln−Asp−Tyr−Thr−Gly−
NHNH₂・HCl無水テトラヒドロフラン300ml中
Boc−Gly−OH17.5gの溶液へ、Ｎ−メチルモル
ホリン10.99mlとクロルギ酸エチルエステル9.60
mlとを−15℃において順次加える。

この温度で２分間かきまぜた後、Ｎ−メチルモ
ルホリン10.99mlを含む無水ジメチルホルムアミ
ド200ml中20.3gのNH₂−NHZ（Ｚ＝ベンジルオキ
シカルボニル）を加える。反応混合物を−10℃で
２時間かきまぜ、その後温度を−10℃から０℃へ
２時間で昇温させる。溶媒を減圧留去し、残渣を
酢酸エチルへ取り、０℃でIN HCl，５％
NaHCO₃水溶液、次いで中性になるまでNaCl飽
和水溶液で順次洗う。溶媒を留去し、残渣を石油
エーテルから結晶するとBoc−Gly−NH−NH−
Ｚ（）29.1g（収率90％）が得られる。m.p.84
−87℃ Boc−Gly−NH−NH−Ｚ（）29.1gを99％ギ
酸300mlに溶解し、室温で６時間放置する。溶媒
を30℃で減圧留去し、油状残渣をジエチルエーテ
ルから結晶化すると、Ｈ−Gly−NH−NH−Ｚ・
HCOOH（）23.0g（収率95％）が得られる。
m.p.135−136℃ Boc−Thr−OH18.75gとエトキシギ酸無水物を
経て、化合物（）の製造について記載したよう
にＨ−Gly−NH−NH−Ｚ・HCOOH（）23.0g
と縮合し、Boc−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ（）
32.3g（収率89％）を得る。m.p.70−73℃〔α〕^２０ _Ｄ
＝−3.6゜（Cl，DMF） Boc−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ（）32.3gを
トリフロル酢酸350mlで０℃において30分間処理
する。溶媒を０℃で減圧留去し、油状残渣をエー
テルから結晶化するとＨ−Thr−Gly−NH−
NHZ・CF₃COOH（）33.0g（収率99％）が得
られる。

m.p.140−145℃〔α〕^２０ _Ｄ＝＋8.9゜（C₁，
MeOH） Boc−Tyr−OH21.2gをエトキシギ酸無水物を
経て、化合物（）の製造について記載したよう
にＨ−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ・CF₃COOH
（）33gと縮合する。酢酸エチル−石油エーテ
ルから結晶し、Boc−Tyr−Thr−Gly−NH−NH
−Ｚ（）39.0g（収率88％）を得る。

m.p.138−142℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝−2.3゜（C₁，
DMF） Boc−Tyr−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ（）
39.0を化合物（）の製造について記載したよ
うにトリフロル酢酸で加酸分解すると、Ｈ−Tyr
−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ・CF₃COOH（XI）
39.9g（収率100％）が得られる。

m.p.145−150℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝＋11.8゜（C₁，
DMF） Boc−Asp（OB₂l）−OH15.5gをエトキシギ酸
無水物を経て常法でＨ−Tyr−Thr−Gly−NH−
NH−Ｚ・CF₃COOH（XI）39.9gと縮合する。酢
酸エチルから結晶化すると、Boc−Asp（OB₂l）
−Tyr−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ（XII）48.9g
（収率93％）が得られる。

m.p.134−138℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝−11.2（C₁，
DMF） Boc−Asp（OB₂l）−Tyr−Thr−Gly−NH−
NH−Ｚ（XII）48.9gの常法によつてトリフロル酢
酸での加酸分解は、Ｈ−Asp（OB₂l）−Tyr−
Thr−Gly−NH−NH−Ｚ・CF₃COOH（）
49.2g（収率99％）を与える。m.p.135−138℃
〔α〕^２０ _Ｄ＝＋13.7°（C₁，DMF）エトキシギ酸無水物を経由する同様な方法での
Boc−Gln−OH15.0gとＨ−Asp（OB₂l）−Tyr−
Thr−Gly−NH−NH−Ｚ・CF₃COOH（）
49.2gとの縮合は、メタノールから結晶化後Boc
−Gln−Asp（OB₂l）−Tyr−Thr−Gly−NH−
NH−Ｚ（XI）49.5g（収率88％）を与える。

m.p.200−203℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝−15.8゜（C₁，
DMF）常法によりトリフロル酢酸で処理すると、Boc
−Gln−Asp（OB₂l）−Tyr−Thr−Gly−NH−
NH−Ｚ（XI）49.5gは、Ｈ−Gln−Asp
（OB₂l）−Tyr−Thr−Gly−NH−NH−Ｚ・
CF₃COOH（）50.2g（収率100％）を与え
る。

m.p.160−162℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝＋2.0（C₁，
DMF） 50.2gとのエトキシギ酸無水物を経由する常法に
よる縮合は、メタノールから結晶後、 45.5g（収率91％）を与える。

m.p.220−225℃（分解）〔α〕^２０ _Ｄ＝−13.3゜
（C₁，DMF） 45.5gを２当量のHClを含むジメチルホルムアミ
ド550mlに溶解し、12時間内に一部づつ加えた10
％パラジウム炭14gの存在下、開放容器中で水素
気流で水素化する。

触媒をロ取し、ジメチルホルムアミドで完全に
洗う。油状残渣を無水エタノールから結晶化する
と、 34.1g（収率94％）が得られる。

m.p.145−150℃（分解）〔α〕^２０ _Ｄ＝−21.8゜
（C₁，DMF）実施例２中間体（）の製造Ｈ−Trp−Met−Asp−Phe−NH₂ （） Boc−Asp（OB₂l）−OH23.3gとＨ−Phe−NH₂
20.0gとを化合物（）の製造について記載した
ようにエトキシギ酸無水物を経由して縮合する。
酢酸エチルから結晶化した後、Boc−Asp
（OB₂l）−Phe−NH₂（）39.9g（収率85％）
を得る。

m.p.141−142℃ 〔α〕^２０ _Ｄ＝−32.7゜（C₁，
DMF）ジメチルホルムアミド180mlにとかしたBoc−
Asp（OB₂l）−Phe−NH₂（）39.9gを10％パ
ラジウム炭29gの存在下大気圧で水素化する。イ
ソプロパノールから結晶すると、Boc−Asp−
Phe−NH₂（）29.0g（収率90％）が得られ
る。

m.p.196−198 〔α〕^２０ _Ｄ＝50.0゜（C₁，DMF） Boc−Asp−Phe−NH₂（）29.0gを氷酢
酸中1.33Nの乾燥HCl（HCl／AcOH）300mlに溶
解する。室温で25分後、溶液を減圧留去し、残渣
をエーテルから結晶化すると、Ｈ−Asp−Phe−
NH₂・HCl（XI）24.2g（収率100％）が得られ
る。

m.p.100−150℃（分解）〔α〕^２０ _Ｄ＝＋23.9゜
（C₁，AcOH95％）エトキシギ酸無水物を経由する常法によるBoc
−Met−OH19.1gとＨ−Asp−Phe−NH₂・CHl
（）24.2gの縮合および酢酸エチルからの結晶
化により、Boc−Met−Asp−Phe−NH₂（）
m.p.194−198℃，〔α〕^２０ _Ｄ＝＋5.4゜（C₁，
AcOH95％）36.0g（収率92％）が得られる。

Boc−Met−Asp−Phe−NH₂（）36.0gの
化合物（）の製造について記載したのと同じ
HCl／AcOHによる加酸分解は、Ｈ−Met−Asp
−Phe−NH₂.HCl（XI），m.p.191−192℃，
〔α〕^２０ _Ｄ＝＋5.4゜（C₁，AcOH95％）31.5g（収率
100％）を与える。

常法によりエトキシギ酸無水物を経由して、
Boc−Trp−OH21.5gとＨ−Met−Asp−Phe−
NH₂・CHl（XI）31.5gとを縮合し、酢酸エチ
ルから結晶化後、44.2g（収率90％）のBoc−Trp
−Met−Asp−Phe−NH₂（XII），m.p.199−200
℃，〔α〕^２０ _Ｄ＝−34.5゜（C₁，DMF）を得る。

Boc−Trp−Met−Asp−Phe−NH₂（XII）
44.2gを99％ギ酸450mlにとかす。室温で５時間後
溶媒を30℃で減圧留去し、残渣をイソプロパノー
ルから結晶すると、33.7g（収率89％）のＨ−
Trp−Met−Asp−Phe−NH₂（），m.p.205−
207℃，〔α〕^２０ _Ｄ＝−25.6゜（C₁，DMF−HMPT
１：１）が得られる。

実施例３中間体（）の製造無水ジメチルホルムアミド160ml中21.2gのの溶液へ、テトラヒドロフラン中2.44Nの乾燥
HCl液24mlと、ｎ−ブチルニトリル3.5mlとを−
25℃で順次加える。この温度で25分間かきまぜた
後、Ｎ−メチルモルホリン13.1mlを加え、その後
Ｈ−Trp−Met−Asp−Phe−NH₂（）14.8g
を、Ｎ−メチルモルホリン2.8mlを含む無水ジメ
チルホルムアミド120mlとヘキサメチルホスホル
アミド40mlとの混合物中にとかした溶液として加
える。

反応混合物を−10℃で４時間放置する。減圧下
揮発性溶媒を蒸発し、冷クエン酸水溶液で希釈す
ることによつて生成物を析出させる。この粗製品
は、メタノールから結晶後、25.1g（収率79％）
の m.p.201−206℃（分解）〔α〕^２０ _Ｄ＝−28.9゜（C₁，
DMF）を与える。

実施例４目的化合物（）の製造 12.7gを、IN NaOHをPH10になるまで加えること
によつて水に溶解する。ピリジン三酸化イオウ複
合体5.72gをかきまぜながら５時間で少しづつ加
え、IN NaOHでPHを９乃至11に保つ。アルカリ
性溶液を固体CO₂で中和した後、溶媒を減圧下蒸
発乾固し、残渣をジメチルホルムアミドに取り、
不溶性無機塩をロ過して除去する。ロ液を再び油
状残渣に減圧蒸発する。生成物をジメチルホルム
アミド−水（１：１）混合物400mlに溶解し、か
きまぜながら０℃でDowex 50W（H⁺）で５分間
処理する。混合物をロ過し、ジエチルアミンでア
ルカリ性とする。溶媒を減圧下除去して少量と
し、エーテルを加えて目的物13.5gを析出させ
る。Sephadex G10のカラムを通して脱塩する
と、12.2g（収率79％）のをジメチルアミン塩として与える。〔α〕^２０ _Ｄ＝−22
゜（C₁，DMF）。

Claims

【特許請求の範囲】１式（）：のヘキサプチドと、式（）：Ｈ−Trp−Met−Asp−Phe−NH₂ のテトラペプチドとを常法によつてカツプリング
して得られる式（）：のデカペプチド、すなわちピログルタミル−グル
タミニル−アスパルチル−チロシル−スレオニル
−グリシル−トリプトフイル−メチオニル−アス
パルチル−フエニルアラニンアミド（ただし構成
アミノ酸は、グリシンを除いてすべてＬ型であ
る）を、水性媒体中PH8.5乃至12.5において、式
Ｂ：SO₃（ただしＢ：は、ピリジン、置換ピリジ
ン、トリ低級アルキルアミン、Ｎ−低級アルキル
モルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、イミダ
ゾール、置換イミダゾール、キノリンよりなる群
より選ばれた第３級塩基である）の硫酸化剤と２
乃至120時間反応させ、かくして得られた生成物
を常法により単離することを特徴とする式
（）：のデカペプチドであるセルレチド、すなわちピロ
グルタミル−グルタミニル−アスパルチル−チロ
シル−（Ｏ−サルフエート）−スレオニル−グリシ
ル−トリプトフイル−メチオニル−アスパルチル
−フエニルアラニンアミド（ただし構成アミノ酸
はグリシンを除いてすべてＬ型であり、チロシン
のフエノール性水酸基はサルフエート基によつて
エステル化されている）およびその薬剤学的に許
容し得る塩基との塩類の製造法。２式（）：のデカペプチドを、ピリジン、置換ピリジン、ト
リ低級アルキルアミン、Ｎ−低級アルキルモルホ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、イミダゾー
ル、置換イミダゾール、キノリンよりなる群から
選ばれた有機塩基の添加により、またはアルカリ
金属水酸化物および炭酸塩よりなる群より選ばれ
た無機塩基の添加により、または前記有機および
無機塩基の両者の添加によつてPH9.5乃至10.5に
調節された水に溶解し、これに式Ｂ：SO₃（ただ
しＢ：は前出の意義を有する）の硫酸化剤をその
まままたは双極性非プロトン性溶媒に溶解して加
え、前記塩基の一種を加えて反応液のPHを8.5乃
至12.5の範囲に維持しながら反応させることを特
徴とする特許請求の範囲第１項の方法。３前記の双極性非プロトン性溶媒は、ジメチル
ホルムアミド、アセトンまたはアセトニトリルで
ある特許請求の範囲第２項の方法。