JPS60221092A - 新規生理活性ポリペプチドのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有する
ポリデオキシリが核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。

本発明は又、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮＡ及び
該複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物または
細胞に関し、更に又、該ＤＮＡが有する遺伝情報を発現
して得られる新規生理活性ポリペプチド及びその製造方
法に関する。

更に詳しくは、組換ＤＮＡ技術を用いてＴＮＦ（Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ）のＤＮＡ配列
及びそれから演桿されるＴＮＦのアミノ酸配列、またこ
のＤＮＡを用いるＴＮＦの製造法、また、この製法によ
シ得る産生される産生物の用途に関するものである・本
明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ　）で採用された略記法
によシ表示され、例えば下記の略号が使用される。なお
、アミノ酸などに関し光学異性体があシ得る場合は、特
に明示しなければ５体を示すものとする・ Ｃｙｓ　ニジスティン残基 Ｇｔｎ　：グルタミン残基 Ａｓｐ　：アスノ臂うギン酸残基 Ｐｒｏ　：デロリン残基 Ｔｙｒ　：チロシン残基 Ｖａｔ　：バリン残基 Ｌｙｓ　：リジン残基 ＧＬｕ　：グルタミン酸残基 Ａｔａ　：アラニン残基 Ａｉｎ　：アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 Ｐｈｅ　：フェニルアラニン残基 ａｔｙ　ニゲリシン残基 Ｈｌｓ　：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ　：セリン残基 Ｔｈｒ　：スレオニン残基 Ｉｔｅ　：イソロイシン残基 Ｔｒｐ　：　）リゾトファン残基 Ａｒｇ　：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 また、本明細書中においてＤＮＡのＩリマーまたはオリ
ゴマーは下記の如き略号の配列によシ表記する。

Ａ：２７−デオキシアデニル酸 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸 Ｔ：チミジル酸 特にことわらない限シ、配列の左から右への方向は５知
ら３′への方向を示すものとする。

網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンによシ誘導され、抗腫瘍細
胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばＣａｒｓｗｅｌｌらは、ＣＤ−Ｉ　５
ｗ１５ｍ　マウスにＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕ＊ｒｉｎ　（ＢＣＧ）を投与し、その２週間後
にエンドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの
血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有すること・
およびＭｏｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａで担癌させた（　
ＢＡＬＢ／ｅ　ＸＣ５７ＢＶ６　）　Ｆ、マウスの腫瘍
を出血性壊死に至らしめる現象を見出し一、ＴＮＦ　（
Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅａｒｏｓｌｓ　Ｆｏｏｔ）と名づけた
Ｃ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａａａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ
ＳＡ　７２巻（Ａ９）３６６６〜３６７０頁（１９７５
年）〕。その後、Ｒｕｆｆら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔ
　、　１２５巻（Ａ４）　１６７１〜１６７７頁（１９
８０年）〕およびＭａｔｔｈｅｗｓら（Ｂｒ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　４２巻４１６〜４２２頁（１９８０年）
〕は、前記Ｃａｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製した
ウサギ血清からＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血清
に比べて約２０００倍および約１０００倍精製されたも
のを得ている。しかし、いずれの場合にも精製されたも
のに関しては動物集験において抗腫瘍効果を確認してい
ない。

特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上を哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエン２トキシンを注射することによって、または哺
乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系に
グラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることにより
て誘発される制癌作用を有する蛋白性生理活性物質な単
離精製した、と開示している。更に、その物質の分子量
は、グルシ過法および８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法では３９，０００±５，０００、等電点はＰ
ｔｔ　ａ、　９±０．３（等電点電気泳動法）である、
と開示しているが、その詳細な構造は開示されていない
。

一方Ｍａｔｔｈａｗｓ　［Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４
４巻（３）４１８〜４２４頁（１９８１年）〕はＢＣＧ
を投与し２週間を経過したウサギの各種組織から得た単
核寅食細胞がその細胞培養液へエンドトキシンを添加す
ることによｆｉＬ細胞障害性物質を生産することを示し
ている。しかし、この物質の詳細な構造は示されておら
ず、また血清中に見出されるＴＮＦと同一の物質である
という証拠も示されていない。

る物質を投与されたウサギから・細菌のエンドトキシン
による刺徴にてＬ細胞障害活性を産生ずる細胞を取得し
、該り細胞障害活性が、ウサギ血清から得るＴＮＦと分
子量的、血清学的に同一であることを証明することに成
功した。

一方遺伝子操作技術の進歩に伴いアミノ酸配列が知られ
ていない蛋白であっても、その遺伝子を単離することが
できれば、その構造の解明から蛋白の構造を解明し、ま
たこの遺伝子を用いることにより、微生物または細胞培
養で該蛋白を製造することが可能となった。

本発明者は、このような遺伝子操作技術を上記り細胞障
害活性産生細胞に応用して研究を続けた結果、ＴＮＦ遺
伝子の単離に成功し、その遺伝子構造及び蛋白構造を決
定するに至シ、またこの遺伝子を用いるＴＮＦの製造に
成功し、本発明を完成するに至−）た。

すなわち、本発明はＴＮＦが次の如きアミノ酸配列を有
するポリペプチドであることを開示する０８ｅｒ　ＡＡ
ａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ８ｐ
　ＬｙｌＩＰｒ。

Ｌｅｕ　Ａｔａ　Ｊ（ｉｓ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ａｔａ　
Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　ＶａｔＧｌｕ　Ｇｔｙ　Ｇｔ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｔｎ　Ｔｒｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ
　ＡｒｇＡｔａ　Ａｓｎ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ
ｔａ　Ａｓｎ　Ｇｔ７　Ｍｅｔ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｔｈｒ
　Ａ＋Ｉｐ　Ａｓｎ　Ｇｔｎ　Ｌａｕ　ＶａＡ　ＶａＡ
　Ｐｒｏ　ＡｔａＡｓｐ　Ｇｔｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ　ＶａｔＬａｕ
　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｔｙ　Ｇｔｎ　Ｇｔｙ　Ｃｙｓ　
Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＶａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　ＶａｔＳａｒ　Ａｒｇ　ＰｈｅＡ
ｔａ　ＶａｔＳａｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ
　Ｖａｔ　Ａｇｎ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｔａ　１
ｔｅ　Ｌｙｉ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒ
ｇＧｔｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｇｔｕ　Ａｔａ　
Ｇｔｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ＡｔａＴｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｔ
ｕ　Ｐｒｏ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ
　Ｖ＆ｔＰｈｅ　Ｇｔｎ　Ｌｅｕ　Ｇｔｕ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｔｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　５ｅｒＴｈｒ　Ｇｌｕ
　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｔｎ　Ｐｒｏ　ＧＡｕ　Ｔｙｒ　
Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ａｔａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｎ　’Ｖａｔ、　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧｔｙＩｔ
ｅ　Ｉｔｅ　Ａｔａ　Ｌｅｕ 上記Ｉリベゾチドはまた成熟ＴＮＦとも称される。

本発明はまた、前記ポリペプチドのＮ末焔にメチオニン
残基がペプチド結合しているポリペプチドをも包含する
。

本発明はまた、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＴＧ
ＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧ
ＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧ
ＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴＣ
ＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣ
ＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴ
ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣ
ＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣ
ＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣＣＣ
ＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡ
の塩基配列で示されるＤＮＡから導かれるアミノ酸配列
で示されるペプチドのＣ−末端を含む一部また全部のペ
プチドが前記成熟ＴＮＦのＮ−末端側に結合している中
間体をも包含する。

自然の変異によりまたは人工的変異によシ、主たる活性
に変化を与えることなく、蛋白質の構造の一部を変異せ
しめることが可能であるが、本発明は、前記すべてのポ
リペプチドの相同変異に相当する構造を有するポリペプ
チドをも包含する。

更に本発明はＴＮＦ遺伝子が５′よシ次の如き塩基配列
を有するものであることを開示する。

ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
Ｔ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＣＴＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＴＧＧＡ
Ｇ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ
ＧＣＣＡＧ　ＣＧＴＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ　ＣＴ
Ｇ　ＧＣＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡＧＣＴＣＡＣＧ　
ＧＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ
　ＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＯＧＧＴ　
ＣＡＡ　ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＴ
ＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＧＴＣＡＧＣＣＧＣＴ
ＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡＧ　
ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ
　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＧ　ＡＣＣＣＣ
ＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＧ　Ｇ
ＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ
　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　
ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧ
ＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣＣ
ＴＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧＡ’ｆ’Ｇ　ＡＴＴ
　ＧＣＣＣＴＧ 本発明は成熟ＴＮＦを微生物もしくは細胞の培養によル
産生せしめるために、前記塩基配列の５′端にＡＴＧを
付加した構造を有する塩基配列をも包含する。

本発明はまた、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＴＧ
ＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧ
ＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧ
ＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴＣ
ＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣ
ＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴ
ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣ
ＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣ
ＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣＣＣ
ＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡ
　の塩基配列で示されるＤＮＡの３′−末端を含む一部
または全部のＤＮＡが前記ＴＮＦ遺伝子の５７−末端側
に結合している遺伝子も包含する。

自然の変みによシまたは人工的変異によシ、主たる活性
に変化を与えることなく、？リペゾチド構造の一部を変
異せしめることが可能であるが、本発明は前記したポリ
ペプチドの相同変異に相当する構造を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列をも包含する。

更に本発明は形質転換された微生物又は細胞中で、ＴＮ
Ｆのアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る複製
可能な組換ＤＮＡに係る。

このような組換ＤＮＡとしては、例えばｐＴＮＦ−ｔａ
ｃ−１１、ｐＴＮＦ−ｔａａＵＶ５−１１からなるグル
ープから選択される組換ＤＮＡが挙げられる。

更に本発明は、ＴＮＦのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを発現し得る複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された
微生物または細胞に係る。

このような微生物または細胞として、大腸菌、枯草菌、
酵母、高等動物細胞が挙げられる。

更に本発明は、ＴＮＦ遺伝子をコードする遺伝子を、微
生物又は細胞中で発現させることからなるＴＮＦの製造
方法に係る。

詳しくは複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された微生物
又拡細胞を増殖させ、ＴＮＦのアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを産生させ、該ポリペプチドを回収することか
らなる該ポリペプチドの製造方法に係る。即ち、本発明
の他の態様によれば、前述の本発明の４リゾオキシＩＪ
　／核酸を複製可能なベクターに組入れて該ポリデオキ
シリが核酸を有する複製可能な組換ＤＮＡを得、得られ
た該組換ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて該
組換ＤＮＡを含有する形質転換体を得、得られた該形質
転換体を培養して該ポリデオキシリポ核酸の有する遺伝
情報を発現させることからなる新規生理活性ポリペプチ
ドの製造方法が提供される。

更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主細胞から
分泌されるＴＮＦの製造に係る。このような方法として
、例えば、シグナルペプチドとして知られる１５〜３０
アξノ酸よ〕なる微生物または高等生物由来のアミノ酸
配列を、成熟ＴＮＦのアミノ端に結合するべく遺伝子配
列を構成することによυ達成される。

刺檄した。

２．前記ウサギを５〜１５日間飼育した後、グラム陰性
餉のエンドトキシンで処理し、その血清を取得した。こ
の血清はＬ細胞障害活性及び抗腫瘍活性を示した（この
活性を示す物質を血清ＴＮＦたウサギを５〜１５日間飼
育した後、気管切開によシ肺胞洗浄細胞を得た。

４、肺胞洗浄細胞を、グラム陰性菌よシ得たエンドトキ
シンと共に培養した。

５、前記細胞培養の上清中にＬｍ胞障害活性をシ消去さ
れた。エンドトキシン會共存させない細胞培養土消中に
Ｌ細胞障害活性は認められなかりた０ ６、　前記細胞培養中に放射性メチオニンを共存させて
得られる上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析することによシ、分子量１７５００±２０００の
蛋白の生成を認めた。エンドトキシンを共存させない細
胞培養上清にはこの蛋白の生成は、認められなかった。

７、　前記細胞培養の上清をＳＤＳポリアクリルアミド
ダル電気泳動によル分画したとζろ、分子量１７５００
±２０００の位置にＬ細胞障害活性を認めた・血清ＴＮ
Ｆ　ｆ）　ＳＤＳ　／　リアクリル７ミドダル電気泳動
分析もこれに一致した。

８、　前記細胞培養から細胞を集め、リサヌクレアーヤ
阻害剤の存在下に、細胞質ＲＮＡ　（以下、リポヌクレ
イン酸をＲＮＡと略す）を抽出した。

９゜　細胞質ＲＮＡから、′オリゴｄＴカラムに対する
吸着性画分〔以下ｍＲＮＡ　（メツセンジャーＲＮＡ　
）と略す〕を得た。

１０、上記ｍＲＮＡをシ田糖密匿勾配遠心によシ分画し
た。

１１、上記分ｉ［ｌＩｉをアフリカッメガエル卵母細胞
に江スし、培養し、培地および卵母細胞中にＬ細胞障害
活性を示す分画を集めた。

１２、上記アフリカッメガエル卵母細胞中に生成するＬ
細胞障害活性は、抗ＴＮＦ抗体によシ消去された。

１３、分画されたｍＲＮＡを、これに相補的な一重鎖Ｄ
ＮＡに転換し、これから更に二重鎖ＤＮＡを調製した。

この３′末端にデオキシシチジル酸のオリプマーを付加
せしめ、１つ又は複数の表現型マーカーを有するグラス
ミドのようなベクターの中に挿入した。

１４、このように調製されたベクター管使用して大ＭＩ
Ｊ菌細胞を形質転換して、ｍｌ囚人に相補的なりＮＡを
含有する１２０００個の大腸菌１２０００株を得た。

１５、血清ＴＮＦを精製し、そのアミノ酸配列を定めた
。

１６、血清ＴＮＦのアミノ酸配列に基きオリプヌクレオ
テドを合成し、これを放射組標識した。

１７．１４で調製したＤＮＡを移しとった口紙と、１６
で得た放射線標識されたＤＮＡ　’（ｉ−ハイツリダイ
ｆ七訃−Ｙ錫７１ルＡち始ｌ曖萼シ訃ス鰺Ｏ佃滲選択し
た。

１８．１７で選択された９個の菌株からプラスミドを単
離し、制限酵素で切断し、共通の大きさの断片を有する
グラスミドを有する菌株を得た。このうち２株はＬ細胞
障害活性を有する物質を生産することが判明した。

１９、この菌株からシラスミドを単離し、塩基配列を訣
定した。この塩基配列から演趣されるアミノ酸配列の１
つは、１６で得られたＴＮＦのアミノ酸配列と一致した
。

２０、ＴＮＦのアミノ酸配列を与えるＤＮＡ配列を発現
ベヒクルの下流に接続し、この発現ベヒクルを適当な宿
主細胞を形質転換するために用い、この宿主細胞を培地
中で増殖させ、所望のＴＮＦ　ｉ発現させた。

２１、ここに得られたＴＮＦ活性は、抗ＴＮＦ抗体によ
シ消去された。

以上により、本発明者が、ＴＮＦの遺伝子を取得し、こ
の構造を解明し、この遺伝子を用いるＴＮＦの製造方法
を完成させた過程が示されたが、本発明は以上に限定さ
れるものではない。

ＴＮＦの遺伝情報を直接的に示しているｍＲＮＡ　を含
有する細胞質ＲＮＡは、上記の如くエンドトキシン処理
された肺胞洗浄細胞から取得されたが、ウサギの他の細
胞例えば末梢血中のプラスチック吸着性細胞、また末梢
血や肝臓、牌臓等のエンドトキシン感受性細胞をエンド
トキシン処理することにより、得ることができる。

また、他の動物、例えばマウス、ノ・ムスター、モルモ
ット、ヒト等の同様な細胞をも、　ｍＲＮＡの取得源と
して用いることができる。また、単球系の株化細胞や、
エンドトキシン感受性もしくはＬ細胞障害活性産生細胞
を用いることができる。この様な細胞としては例えばＲ
ＰＭＩ　１．７８８、ＴＨＰ　等の細胞を挙げることが
できる。

ｍＲＮＡ１ｄまた、染色体ＤＮＡを適当なベクターに接
続して動物細胞に導入することにより、得ることができ
る。このような系として、ＳＶ４０をベクターとし、Ｃ
Ｏ８細胞をホストとする組換による方法がよく知られて
いる（例えばＭａｎｔｅｌら、Ｎａｔｕｒへ２８１巻４
０頁、１９７９年、Ｍｅｌｌｏｎら、Ｃｅ１ｌ、２７巻
２７９頁、１９８１年など）。

かくして得られたｍＲＮＡ　′ｆ：ｃＤＮＡに変換し、
グローブを用いるハイツリダイゼーシ冒ンによって選択
されたＤＮＡは、種々の目的に応じて組換えられる。

各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成された
人工のＤＮＡ　Ｉｃ　＃換えることも可能である。

ＴＮＦはまた、細胞内で未成熟形態（プレまたはブレゾ
ロペプチド）で産生され成熟過程（プロセシング）によ
シ中間体を仕出して成熟ＴＮＦとなることが推定される
。ＴＮＦのこのような未成熟形態は、ＴＮＦ遺伝子の塩
基配列から推定することができる。未成熟形態及び中間
体のＴＮＦをコードする遺伝子を含むＴＮＦ遺伝子もま
た、天然のまたは人工的ＤＮＡを用いて組換を行うこと
ができる。

これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入することである。このようにするこ
とにより、適当なゾロモータによって合成されるｍＲＮ
Ａから成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦが産生
される。この様にＮ末端に付加されたメチオニン残基は
宿生によっては自然に除去される。

甘た別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することにより、宿主細；泡の外ま
たはグラム陰性細菌においては、ペリプラズムと呼ばれ
る部分へ、分泌させることも可能である。

また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペゾチドとＴＮＦとの融合ペノチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
そのまま用いることかで真る。

このように得られたＴＮＦ遺伝子を、正しく転写、翻訳
が行われるような配列においてブロモ−ター等の５′領
域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物細胞中で
複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得、この組
換遺伝子によって細菌才たは高等生物細胞を形質転換し
、この形質転換体を増殖せしめ、ＴＮＦ遺伝子を発現せ
しめることによりＴＮＦを得ることができる。

宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ、　ｃｏｉ
ｌ　Ｋ１２株の種々の変異株、例えばＨＢＩＯＩ（ＡＴ
ＣＣ３３６９４）、Ｃ６００Ｋ　（ＡＴＣＣ３３９５５
）、ＤＩ　２１０、ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１３４３’）、
ＭＣ］０６１．　ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３３５７２）、
ＪＭＩ　０１　（ＡＴＣＣ３３８７６）、Ｘ１７７６（
ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられる。

大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵｃ　８、ｐｕ
ｃ　９、ｐＭＢ　９（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ　
８　（ＡＴＣＣ３７０７４）、ｐＫＣ７（ＡＴＴＣ、ｌ
＋７ｏｓ４）等のシラミストあるいはλｇｔ１λＢ、シ
ャロン４人のようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが
用いられる。

大腸菌の菌体中にＴＮＦを産生させるために、大陽閑の
遺伝子またはファージ　遺伝子のプロモーターが使用さ
れる。このようなプロモーターとして、好適にはラクト
ース分解酵素（ＬＡＣ）のプロモーター及びそのＵＶ５
変異、ペニシリナーゼ（ＢＬＡ）、トリットファン合成
酵素（ＴＲＰ）のゾロモーター、λファーゾのＰＬｆロ
モーターあるいはトリシトファン合成酵素と、ラクトー
ス分解酵素の融合プロモーターであるＴＡＣプロモータ
ー等が用いられる。

３３７１２）などが用いられ、ベクターとしてはｐｃ　
］　９４（ＡＴＣＣ３７０３４）、ｐＵＢ］１０（ＡＴ
ＣＣ３７０１５）、ｐｓＡ２１００（ＡＴＣＣ３７０１
４）、ｐＥ１９４　などのノラスミドなどが用いられる
。

枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしてハ、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）やベニシリ
ナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のゾロモータ
ーが用いられる。

酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ｚ　（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ａｓｒａｖｉＩＩ
ｅａｓ）のＲＴ（２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、５
ＨＹＩ株（ＡＴＣＣ４４７６９）、５ＨＹ３株（ＡＴＣ
Ｃ４４７７１）、Ｄ１３１Ａ株、４８３株、８３０株な
どが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ　１３（Ａ
ＴＣＣ３７］１５）、ＹＥｐ　６、ＴＲＰ７、ＹＩｐ　
５などのノラスミドが用いられる。

酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロｌ”ｆ−ゼ（ＡＤＩ−
１１）、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグ
リセレートキナーゼ（ＰＧＫ）　、チトクロームＢ（Ｃ
ＯＢ）　、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いら
れる。

高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ＣＯＳ細胞、マウスＣ］２７細胞（ＡＴＣＣ１６］６）
などが用いられ、そのベクターとしてはＳＶ４０．ウシ
ポリオーマウィルス等を用いることができる。

本発明の新規生理活性ポリペプチドは生体の正常組織は
傷つけず、腫瘍だけを殺す生体物質である。実際に生体
に適用するにあたっては注射液に調剤して有効量全注射
投与することができる。注射液の調剤にあたっては一般
に用いられる添加剤を加えることができる。本発明で用
いられる添加剤の例を列挙すれば、アルブミン、ゼラチ
ン、グロブリン、プロタミン、プロタミン塩などの安定
化剤、シヨ糖、グリセリン、メチルセルロース。

カルボキシメチルセルロース々どの増粘剤、各種無機塩
の声調整剤などである。また注射投与する代シに、錠剤
として有効量−を経口投与することもできる。錠剤の調
製にあたりても、一般に用いられる添加剤を加えること
ができる。錠剤の調製にあたって用いられる添加剤の例
としては上述の安定化剤、デンプン、乳糖などの賦形剤
を挙げることができる。具体的には、動物実験の結果、
マウスの腫瘍も大半か−、二回の注射投与で完治するこ
とが分った。たとえば、マウスの皮膚に人工の腫瘍（メ
スＡ）を移植、直径６〜７ミリになった段階で本発明の
新規生理活性ポリペプチドをわずか２．０マイクログラ
ム注射したところ、−週間後にかさぶた状にカシ、二週
間後には再び毛が生え始めて完治、その後で妊娠、出産
にも成功することが分った。

以下に実施例によって本発明を詳細に記す。

本発明の実施にあたシ、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断わらないｌ５ＪＩ　Ｊ下記の実
験書に従って実施した。

（１）高木東歌編著　遺伝子操作マニーアル。

講談社 （２）　高木東歌編著　遺伝子操作実験法、講談社（３
）　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｌｉ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔａｃｈ
、　Ｊ、ＳａｍｂｒｏｏｋＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ刊（米国） （４）　Ｒａｙ　Ｗｕら−Ｍｅｔｈｏｄ　ｌｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　１０１巻Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅａ
ａ　（米国）刊参考例Ｉ　Ｌ細胞障害活性評価 り細胞を用いる活性評価は、Ｒｕｆｆ（Ｌｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ　２巻１Ｐｉｅｋ編集＋　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　２３５頁（１９８０年）〕あ
るいは［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．１２６巻２３５頁（１９
８１年）〕の方法に準じ、本発明による生理活性物質が
Ｌ９２９細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、　ＣＣＬ　１　）を殺す効果を測定するもの
である。すなわち、順次培地で希釈した試料０．１　ｊ
ｌｊとｌｏ５コ／ｄの濃度のＬ細胞の培地懸濁液０．１
　ｍｊを９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー
・ラボラトリ−社、米国）に加えた。培地は１　ｖ／ｖ
％のウシ胎児血清及び最終濃度５μｇ／ａｔの７クチノ
マイシンＤを含むイーグルのミニマム・エラ七ンシャル
培ｉ　ｃ　ソの組成は、たとえば、「組織培養」中井準
之助他編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）
を用いた。マイクロプレートを５チの炭酸ガスを含む空
気中、３７℃で２１時間培養した。培養終了後、グルタ
ルアルデヒド２０μｌを加え細胞を固定した。固定後、
マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレ
ンブルー溶液ｔ−０，１１１ｊ加え、生き残った細胞を
染色した。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後
、残ったメチレンツルー’ｉ０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出
し、その６６５　ｎｍにおける吸光度をタイターテ、り
・マルチスキャン（フロー・ラブラトリー社、米国）で
測定した。

この吸光度は、生き残った細胞数に比例する・Ｌ９２９
細胞の５０％を殺すために必費な生理活性ｆｉｔ−１単
位／ｄと定義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％
の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算に
よってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位
／―で表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２巻２４８〜２５４頁（１９７６
年）〕によシ、クーマシー・ブリリアント・ブルー０２
５０を用いる色素結合法から算出した。

実施例１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０ゆ）にホルマリンにて死
菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ａｅ
ｎｓａ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒＶｕ
ｍ＋　ウェルカム社−英国）５０〜を耳静脈よル注射し
た。該ウサギに８日後再度１００μｇのエンドトキシン
（大１１４狛０２６　：Ｂ６由来のりポポリサッカライ
ド、ディフコ社。

米国）を耳静脈よシ注射し、２時間後に心臓よシ全採血
した。採取し＊ｎｎ液に１００ｄ当ｐ１００単位のヘパ
リンナトリウムを加えた後、５，０００ｒｐｍで３０分
間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶固型物を除去
した。４０羽のウサギよシ、血清ＴＮＦ〒３Ｘ１０’単
位／ｄの力価葡有する血漿２．４１が得られた。

実施例２（血？’、￥　ＴＮＦの部分精製）実施例１で
得た血漿２．４ＪＪにセライト２４ｇを加え、１時間攪
拌した後沖過した。Ｆ液に１．２ノの０．０４Ｍ）リス
−塩酸緩衝液（ｐ）１７．８　）を加えた後、Ｏ１ＩＭ
ｍ化ナトリウムを含む０．０４Ｍ）リスー坦酸緩衝液（
ＰＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥセファロース
ＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア社、スウェーデン）のカラ
ムに添加した。０．０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液で洗滌後
、０．１８Ｍｍ化ナトリウムを含ｔｒ０．０４Ｍ　ト！
Ｊス−ｇ＞緩衝液（１”　７．２　）　ｔ−用いて流出
した。Ｌ細胞障害活性を示す両分を、限外濾過にょシ濃
縮した。次いで０．１．５Ｍ壌化ナトリウムを含む５　
ｍＭ　リン酸緩衝液（Ｐ）ｌ　７．４　）で平衡化した
セファクリルＳ−２００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに該濃縮液を添加し、同緩衝液にてグル濾
過全行った。活性区分は限外濾過によル濃縮し３．５Ｘ
１０’単位を回収した。蛋白定量に基く比活性は１８Ｘ
１０　単位／■であったＯ 実施例３（抗ＴＮＦ抗体） 血清よシ得ｆｃＴＮＦを実施例２の如く部分精製しフロ
イントの完全アジュバントを１：１で混合し１２週令の
Ｍ　ＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下に注射した。２週後
、及び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に全採血
し、その血清を取得した。

この血ｆｋをＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度
５００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得た
ＴＮＦ　ＯＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障
害活性は認められなかった。ここに得たマウス血清は、
ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ抗体と称する
）を含むものと結論できたＯ 実施例４　（ＴＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎａｓ　（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｌｕｍ　ｐ＆ｒＶｕｌｌｎ＋ウエルカＡ社、
英国）を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生理
食塩水で洗滌することによシ浮遊性細胞を得た。この細
胞を生理食塩水で洗滌後、１０％牛脂児血清〔フロー・
ラボラトリ−社、米国）を會むＲＰＭ１１６４０（フロ
ー・ラボラトリ−社、米国）を培地とし、炭酸ガス５％
含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーターにて
、３７℃で培養した。培養器を２コに分け、一方には大
腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０２６：Ｂ６由来の
りポポリサッカライド、ディ７コ社。

米国）を１０μｍ１７ｍ１となるように添加し、一方に
は同量の滅菌水を添加した。エンドトキシンを添加した
培養上清にＬ細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達
した。この活性は、抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常
マウス血清では消去されなかっｆＣ。

一方、エンドトキシンを添加しなかつた細胞培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められなかった。

実施例５　（ＴＮＦの分子量） 実施例４における細胞培養においてエンドトキシンと共
に放射性Ｌ−（３５ｓ）メチオニン（１３００Ｃ１／ｍ
ｍｏｔ、アマージャム社、英国）’ｔ　１　ｍｃｉ／Ｗ
Ｌｌとなるように添加して培養を行った。培養上−？１
！ヲＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ　、Ｕ、に
、　（１９７０年）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ　）　
２２７巻６８０〜６８５頁〕に従ってＳＤＳ　ｓｔオリ
クリルアミドグル電気泳動によル解析した。ｒル濃度は
１２．５％となるように調製した。

泳動彼エンハンスにュー・イングランド・ヌクレアー社
、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ線フィルム（フジＲ
Ｘ、富士写真フィルム）に密着露光せしめた。エンドト
キシン存在下に培養した培養上清に、分子量約１７５０
０の物質の生成が認められた。

ま７’（実施例４における細胞培養の上清を、上記と同
様にＳＤＳポリアクリルアミドｒル電気泳動に付した後
、２．５％ＮＰ４０　（カルビオクム社、米国）で１時
間、水中で２時間振とり後、各泳動レーンを切断分離し
、泳動方向に直角に２１１ＩＩ巾にスライスした。各ス
ライス断片ｔＬ細胞と共に培養することによル、Ｌ細胞
阻害性ｋｍべた。゛エンドトキシン存在下に培養上清を
展開したレーンの分子量約１７５００の位置にＬＭ胞障
害性が認められ、その他の位置には活性は認められなか
りた。

冥施例５　（ｍＲＮＡの取得） 実施例４と同様な細胞培養においてエンドトキ質ＲＮＡ
およびその中からのｍＲＮＡの抽出は下記の如（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎらの条件（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、ｅｔ
　ａｌ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８巻５２９４
頁（１９７９年）〕に従りて行りた。細胞３×１０８個
に対し、４ゴの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加
え、ホモジナイザー（ＡＭ−７，日本ＩＦ１４機製作所
）にて破砕した。残渣を遠心除去後、２．４Ｉの塩化セ
シウムを溶解し、あらかじめ２．５ｄの５．７Ｍ塩化セ
シウム、０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｕ　７．５　）釜
砿を入れであるポリアロマ−チューブへ静かに重層した
。

ペックマンＳＷ４１０−ター（ベックマン社。

米国）全屈いて２０℃３００００回転にて１２時間、超
遠心分離全行った後、上滑を除き、ペレットを１０　ｍ
Ｍ　）リス、−埴酸緩衝液（５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１
　％　８ＤＳを含有する）１１Ｌｌにて溶解した。この
溶液ｙ１ｍ／のクロロホルム−１−ブタノール（４：１
）混液で抽出し、水層に０．０５容積の２Ｍ酢酸ナトリ
ウムと、２．５容私のエタノールを加え、−２０℃で２
時間以上放置してＲＮＡ　’４５沈澱させた。遠心にて
沈澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μノに溶解し
て、細胞質ＲＮＡ溶液を得た。

上記細胞質ＲＮＡ溶液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００μノの２濃度度の１０　ｍＭ　）リスＥＤＴＡ緩
衝液ｐ”　７．４　（１ｒｎｙｉＥＤＴＡ％　０．１％
ＳＤＳ及び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２０
０ｍ９のオリが（ａＴ）−セルロース（ペセスダ・リサ
ーチ・ラボブトリース・インク社、米国、以下ＢＲＬ社
と略す）カラムに展開、１濃度度の上記バッファー１０
−で洗浄、溶出緩衝液（１０ｍＭ）リス−・塩酸ｐｌ−
１７，４、１ｍｌうＥＤＴＡ、　０．１チＳＤＳを含む
）２ｍｌで溶出した・溶出液に０．０５容積の酢酸ナト
リウム、２．５容積のエタノールを加えて一２０℃冷却
にて沈澱せしめた。沈澱を遠心にて集め、Ｐ＋度同様に
オリゴ（ｄＴ　）セルロースカラムに吸着する両分全集
めた。

紫外吸収スペクトル分析によシ、８５μｇのｍＲＮＡを
回収した。

５Ａ　施９１７　（ｍＲＮＡのサイズ分画）実施例６と
同様にして得たｍＲＮＡ８８０μｇを２５０μノの水に
溶解し、５−２５％直線ショ砧密度勾配置０１ｎｌに重
層した。７つ糖督度勾配は、５および２５チのシＭ糖を
各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸ｐｌ（７，
２，２ｍＭＥＤＴＡ　ｘ　１　％　Ｓｎ２　ｋ含有する
）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエンター（イスコ社、
米国）によシ作製した。

ペックマン５Ｗ４１Ｔｉを用い、４℃４００００回転、
１２時間の超遠心を行ったのち、分画回収装置（ベック
マン社、米国）により各４００μｌの分画を回収した。

部分ｉＩ！ｉｌはエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶
解した◇ 実施例８　（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験書（例えば寺岡宏、五木幹男、日中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８
１年）に依−３だ。アフリカッメガエルは、浜松生物教
Ｉよシ得た。実施例５で得た分画ｍＲＮＡを　１μｇ／
μｌになるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり
、５０ｎｌずつを１ａ弼、注入し、１１ｎｆ／／１ｎｌ
の牛血清アルブミンを含有するＢａｒｔｈ溶液（７，５
ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１ｍＭｊ
Ｊ化カリ、０．３３ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１ｒｒ
Ｍ　ｇ化カルシウム、０．８２ｍＭ硫酸マグネシウム、
２．４圃重炭酸ナトリウム、１８Ｕ／７１１Ｊペニシリ
ンＧ、１８μｇ／−ストレプトマイシンを含有する）中
で２４時間垢養した。培養液の−１，ま卵母細胞をつぶ
し、遠心後、上清のし細胞障害性を測定した。

沈降定数１６８付近において、Ｌ細胞障害活性が最高値
を与えた。またこの活性は実施例３で得た抗ＴＮＦ抗体
により消去されたが正常マウス血清では消去されなかっ
た。

実施例９（形質転換体の取得） 実施例５で得た分画ｍＲＮＡを５μｓ用い、実験書（１
１９７頁以陰に従って、二重鎖ＤＮＡを調整した。

逆転写酵素はライフサイエンス社（米国）のものを使用
した。二重鎖ＤＮＡを、３，５％グル濃度のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００〜２
０００塩基対（以下塩基対をｂｐと略す）の画分３３０
　ｎＪを得た。この両分７ｎ９を用イ同上の実験１に従
い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（ＢＲＬ社）ヲ用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様
にＰａｔ　１部位にデオキシＧ鎖をつないだプラスミド
ｐＢＲ３２２５６ｎＪｉ’とアニールせしめた。アニー
ル後の泪合物を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌＩ　Ｋ−１２株
（ＨＢｌｏｌ、ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換し、１
２０００株の形質転換体を得た。

実施例１ｊＯ（Ｔｉ〜Ｆの部分アミノ酸配列）実方山例
２で部分精製したＴＮＦを、実施例５におけると同様に
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した
。一部をクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、分子
量約１７０００の位置にあるバンドをグルから切出し、
１％重炭酸アンモニウムにより抽出した。５　Ｘ　１０
’単位のＴＮＦ　’ｉ使用し、蛋白として約１８０μｇ
を回収した。

このうち１５０μＩを１％重炭酸アンモニウム７５μｓ
に溶解、ＴＰＣＫ　）リプシン（ワーシントン・バイオ
ケミカル社、米国）を３μｇを添加し、３７℃、４時間
インキュベートした。反応液をコスモシール５Ｃ８（牛
丼化学）を担体とする高速液体クロマトグラレイ−によ
部分画し、トリプシン消化断片を得た。

上記の如く高純反に精製しｆｃＴＮＦおよびそのトリプ
シン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラム
で脱塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスアナライ
ザー・モデル４７０Ａ（アプライドバイオシステム社、
米国）を用いＲ，Ｍ、Ｈｅｗｌｃｋらの方法（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６巻７９９０−７９９７Ｊｊ、
１９８１年）に準じて、Ｎ末端よりエドマン分解を行っ
た。各ステップにおいて遊離してくるフェニルチオヒダ
ントインアミノ酸は、高速液体クロマトグラフィーモデ
ル５ｐ８ｔ００（スペクトラフィジックス社、米国）を
用い、ゾルパックス０ＤＳ（デュ・ボン社、米国）をカ
ラムとして、常法によ部分析した。この結果、ＴＮＦの
Ｎ末端側からのアミノ酸配列は下記の通りであった。

Ｂａｒ　ＡＬｈ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｂ
ａｒ　Ａｓｐ　Ｌｙａ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ａｔｍ　Ｒｌｇ　ＶａｔＶａｔＡｔａ　Ａｓｎ
　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　ＶａｔＧＡｕ　Ｇｔｙ　ＧＬｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｔｎまたトリプシン消化断片のうちの１つは、
そのＮ末端よシ下記のアミノ酸配列であった。

Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｇｔｕ　Ａｔａ　Ｇ
ｔｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｔａ実施例１１（オリゴＤＮ
Ａプローブの合成）実施例１゛０で得たＴＮＦのアミノ
酸配列から推定されるｍＲＮＡの塩基配列に対し、相補
的な、オリがＤＮＡを合成した。合成方法は、本発明者
が既に発表している改良リン酸トリエステル法（Ｈ，Ｉ
ｔ。

ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｓｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
１０巻１７５５〜１７６９頁、１９８２年）によシ行っ
た。

アミノ酸配列から推定筋れる１３２ａ類のオリゴＤＮＡ
を５グループに別け、各々１６．１６゜３２．３２．３
２３類の混合物として合成した・嚢１に本発明の新規生
理活性物質のアミノ酸配列の一部と、これに基＜５１ｎ
ｔＪｉの合成オリゴＤＮＡのグローブの塩基配列を示す
。各々を常法に従って脱保饅し、Ｇ−５０（７スルフシ
ア社、スクエーデン）を用いるカラムクロマトグラフィ
ー、７Ｍ尿累を含む２０％ポリアクリルアミドｒル電気
泳動及び、ＤＥ５２（ワットマン社、米国）カラムクロ
マトグラフィーによシｎ′製し、０．１ｍＭトリスＥＤ
ＴＡ緩衝液に対し、透析した。

各々の精製オリゴＤＮＡを常法によフチ４ポリヌクＶオ
テドキナーゼ（バイオラッドラボラトリーズ社、米国）
およびｒ−３２Ｐ−アデノシントリリン酸ヲ用いて放射
性ラベルし、ＤＥ５２カラムによシ精製した。各々、約
３　Ｘ　１０８ｃｐｍ／μｇの放射能が導入された。

実施例１２（オリゴヌクレオチドの検定）実施例６に従
って得たＴＮＦ産生細胞のｍＲＮＡをグリオキザール及
びジメチルスルフオキシドの存在下に５０′ｃ６０分間
処理したのち、１．１％アガロースｒ／Ｉ／電気泳動に
よｐ分画した。分画されたｍＲＮＡｆ、電気泳動式トラ
ンスファーグロッテリング装置（バイオラッドシがラド
リーズ社、米国）を用いて、メーカーのマニュアルに従
い、移動せしめた。次いで、この膜上のｍＲＮＡと、５
ＸＳＳＣ及び１５０μｇ７ｒｎｉの変性サケ精子ＤＮＡ
を含む５×デンハルト溶液で６５℃、２時間処理したの
ち、放射性ａｍしたオリゴＤＮＡ　’ｆｒ　Ｉ　Ｘ　１
０’　ｃｐｍ／ｍｌ、５　Ｘ　ＳＳＣ溶液を含む５×デ
／ハル）Ｗ液で５０℃、２時間処理した。次いでこの膜
上６　Ｘ　ＳＳＣで室温、４０℃、５０℃、６０℃で順
次洗滌し、Ｘ糾フィルムＸＡＲ−５（コダック社、米国
）に対し露光せしめた。この結果、ｍＲＮＡと最も強く
ハイブリダイズするオリがＤＮＡは、ＭＪであって、Ｍ
Ｊ混合物中にｍＲＮＡと完全に相補的な配列１有するオ
リがＤＮＡが含まれていることが判明した。

実施例１３　（ＴＮＦ遺伝子のクローニング）実施例９
で得た形質転換体を実験書（２＋　１６２頁の方法に従
ってニトロセルロースフィルター上に移し、そのＤＮＡ
と、実施例１２で選択された放射性標識オリゴＤＮＡ（
ＭＪ）とを実施例１２と同様の条件でハイブリダイズせ
しめり（コロニー・ハイブリダイゼーション）　−％　
＜ハイブリダイズする株４９個を選び更にフィルター上
に固定して再度コロニーハイブリグイゼーションを実施
し、９個含選んだ。

との９個の株から、実験省（１）６頁の迅速プラスミド
分離法に従って各々約５μＩのプラスミドを取得した。

このプラスミドを制限酵素Ｐａｔ　Ｉ　＊　ＴａｑＬＲ
ｇａ　１．　Ｐｖｕ　Ｉｆ　（いずれもＢＲＬ社）を用
い、メーカーのマニュアルに従って切断し、１％アガロ
ースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長さを
比較した。

この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＰｖｕＩ［とＲ
１！Ｌ　Ｉによる断片を有し、８株がＲｅａｌによる約
２００ｂｐの断片を有し、共通の配列’ａ−［すること
が示唆された。第１図に制限酵素による解析結果を図示
する。

また、このうち７株’ｋｌＯμｍ１７ｍ１のテトラサイ
クリンを含む２ゴのＬ培地中でｊ＠養し、遠心にて集め
た菌体を２１１Ｌｌの生理食塩水中で超音波によ少破砕
し、遠心上清のＬ細胞障害活性を測定したところ、懺２
に示す如く、Ｌ細胞障害活性を示した・またこの活性は
抗ＴＮＦ抗体によシ消去され、正常マウス血清では消去
されなかった。従ってこの９株すべてがＴＮＦ遺伝子を
含むプラスミドを有していることが示された。

表２　各種形質転換体によるＩＪ胞障害活性実施例１４
　（ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）プラスミドｐＲ１
１、およびｐＲ１７を含有する大腸菌株を、１０μｍ７
７ｍ１のテトラサイクリンを含有するＭ９培地〔実験書
（３）　４４０貞）ｉｚ中で培養した後、実験（３）　
９０頁の方法に従ってシラスミドを単離し、各々約１５
０μｇを得た。

各々の塩基配列をマキサム−ギルバート法（Ｍｈ：ｘａ
ｍａｔ、　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　＋　５５巻４９０貞１９８０年ｒ　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）に従って決定した＠また、こ
の塩基配列（微工研に寄託のため郵送した贅留郵便番号
第１ＤＯ（１’幻乙号）と実施例９で決定された部分ア
ミノ酸配列の一致によ、９、ＴＮＦｍ白の全構造が解明
された。

実施例１５ ｆ之スミドｐＲ１７の組み変え体を用いてＥ。

ｃｏｌｔ内でｌａｃ　呼汚をブロモ−ターとしてＴＮＦ
を直接発現させることを目的にプラスミドの構築を行っ
た。第２図に示す様に１０μｇの！ラスミドルＲ１２を
ｌＱユニットのＡｐａｌ　（ＢＲＬ社）で３７℃で２時
間消化し、４チのポリアクリルアミドゲルトの電気泳動
で約６３０　ｈｐ断片を単離した。約１μｇの断片がグ
ルから電気泳動浴出した。実施１ｕｌｌ　１０と同様の
方法によって図示の２個のデオキシオリゴヌクレオチド
即ち、５’　−ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡ　ＧＣＴＴＣＴ
ＣＧＧＧＣＣ−３’と５’　−ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡ
ＣＡＴＧ　−３’　（＠　２図）とを合成し、実ｊ検書
（３）　１２２頁に従って約１００ｐ　ｍｏ　ｌ　ｅの
各デオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。反応終了液
をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロフォルム抽
出した後、オリゴマーを０．５μ９の６１０４基対のＡ
ｐａｌ断片と合せてエタノール沈澱した。実験書（１）
３７頁に従がって１０ユニツトのＴ、ＤＮＡ’Ｊガーゼ
で前記の断片を４℃で１夜反応させ結合した。反応終了
液をエタノール沈＃後、２Ｏ−１ＬニツトのＢａｍＨＩ
で３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミド上の
電気泳動にかけ、約６７０　ｂｐの断片を電気泳動浴出
によシ回収した。市販のシラスミドｐＵＣ−８（Ｐ−Ｌ
バイオクミカル社、カタログ番号４９１６．米国）１ゴ
ｇをＢａｍＨＩで消化してフェノール抽出、りｏ（ｙフ
ォルム抽出、エタノール沈澱をして調夷したベクター０
．５４に豹、ｔ、ｆｏ、　ｂ、、、のＴＮＦの全構造遺
伝子をよむ両端がＢａｍＨＩサイトを持った断片をＴ４
、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて結合した。実験書（４）、
２０頁に従がって、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴ
ＣＣ３３８７６）を形質転換してＩＰＴＧ　（イソゾロ
ビルチオガラクトシド）及びｘ−ｇａＬ　（５−ソプロ
モー４−クロロー３−インドリルガラクトシド）を含む
邸天培地が約２００個の白色コロニーを得た。これらの
トランスフォーマント１００個からグラスミドＤＮＡ　
′ｔ−調製し、Ｂ　ａｍｕＩで消化したところ、１５個
が目的Ａ　７０ｂｐのＢ　ａｍＨＩ断片を含んでいた。

さらに、挿入の方向を調べるために、上記１５個のプラ
スミドをそに認識部位がある）を用いて消化し、６％ポ
リアクリルアミドダル電気原動を用いて調べたところ、
７個のグラスミドから目的の約１４０　ｂｐ　（Ｄ断片
が確認され、ｐＵＣ−８上のｔｈｅプロモーターから１
１方向であることが判明した。

塩基配列の解析によシ、この７閏のグラスミドは同一で
、ｔａｅ７’ｏモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ間の
結合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確認さ
れた。

実施例１６ プラスミドｐＲ１７を用いて、Ｅ、ｃｏｉｌ内でｔａｃ
ＵＶ５　ｆロモーターとしてＴＮＦを直接発現させるこ
とを目的にシラスミドの構築を行った。第３図に示す様
に１０μｇのシラスミドｐＲ１７を１０ユニツトのＡｐ
ａｌ　（ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４チのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で約６３０　ｂｐの断片を
単離した。約１μｇの断片がグルから電気泳動溶出した
。実施例１０と同様の方法によって図示の２個のデオキ
シオリゴヌクレオチド即チ、１５’−ＡＡＴＴＣＡＴＧ
ＴＣＡＧＣＴＴＣＴ　ＣＧＧＧＣＣ−３’と５’−ＣＧ
ＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ　−３’とを合成し、実験
書（３）　１２２頁に従って約１００　ｐｍｏｌｅの上
記２ｍのデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。反応
終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにり、ロロフ
ォルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のＡｐａ）消化断
片（約６３０ｂｐ）０．５μｇと合わせてエタノール沈
澱した。実験書（１）３７貞に従って１０ユニツトのＴ
４リガーゼで４℃１夜反応させ、結合せしめた。反応後
、反応液をエタノール沈澱し、２ｏユニツトＯＥｃｏＲ
ｌで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動によシ約６７０　ｂｐの断片を電気泳動
によシ回収した。

シラスミドｐｏｐ　９５−１５は、７ラーの方法（Ｆ。

Ｆｕｌｌｏｒ　＋Ｇｅｎｅ　ｒ　１９巻４２頁）５４頁
、１９８２年）に従って調製した。

ｐｏｐ　９５−１５の１μｇをＥａｏＲＩで消化してフ
ェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱をし
て調製したベクター０．５μ９と、上記の如く合成デオ
キシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦ遺伝子を結合して得
た約６７０　ｂｐの断片を、Ｔ４ＤＮＡ　’）ガーゼを
用いて結合した。実験書（４）、２ｏ貞に従って、Ｅ。

ｃｏｉｌ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質
転換してＩＰＴＧ（イソノロビルチオガラクトシド）及
びｘ−ｇａＬ（５−ジブロモ−４−クロロ−３−インド
リルガラクトシド）を含む寒天培地上に約１５０個の迭
明コロニーを得た。

これらのコロニー１００個からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＥｅｏＲｌで消化したところ１２個が、目的の約６
７０　ｂｐのＥｃｏＲ１断片を有していた。さらに仲人
の方向を調べるために上記１２個のグラスミドをＰｖｕ
！ｌとＰｓｔｌを用いて消化し、１．５％アガロースダ
ル電気泳動を用いて調べたところ、４個のグラスミドか
ら目的の約１２８０　ｂｐ及び２６００ｂｐの断片が確
認され、ｔａａ　ＵＶ５７°ロモーターから順方向にＴ
ＮＦ遺伝子が接続されていることが判明した。

塩基配列の解析によシ、この４個のグラスミドは同一で
、ｔａｅＵＶ５７’ロモーター、合成デオキシオリゴヌ
クレオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていること
が確認されｆｚ　（ｐＴＮＦ−ｔａｅ　ＵＶ５−１１と
命名する）。

実施例１７（大腸函の生産するＴＮＦの精製）実施例１
６で得られたシラスミドを含有する大嚇菌株を１００μ
ｍ１／ＩＩＩのアンピシリンを含有するＬ培地５０ｍ１
．で１夜培養し、５ｔの同上の培地に移して更に３時間
培養した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

米し１）を終濃度１ｍＭになる様に添加し、更に６時間
培命を続けたのち冷却し、遠心分離によシ菌株を果めた
。実施列１３におけると同様に菌体を０．０４Ｍ）リス
ー塩酸緩衝仮（ｐｉ（７，８）５を中で超音波破砕し、
画体蛋白浴液を傅た。この浴液は６．７Ｘ１０’単位／
ｌのＬ細胞障害活性を示した。

この溶液を実施例２と同様に備装を行った結果１．２Ｘ
１０’単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６．９
Ｘ１０７単位／　ｔｎ９テ；ｈ　−ｖ　だ。

実施ｔｅｌ　１８　（ＭｅｔｈＡ　ｓａｒｃｏｍａ担％
−ｒウスを用いる活性評価） ＢＡＬＢ　／　ｃマウスの腹部皮内に２×１０５コのＭ
ｅ　ｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、７１後移
植した腫瘍の大きさが直径７〜８ｗｎとなシ、出血性壊
死がなく良好な血行状態にある頼扁を有するマウスを選
び、尾静脈よ如生理食塩水で希釈した０、　２　ｍｌの
試料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り壊死反
応の判定を行った。

０：変化なし く→：かすかな出血性壊死 （＠：中程度の出血性壊死 （移植軸表面の真中から５０チ以上にわたって壊死） （−）＋１−）：顕著な出血性壊死 （移植舶の中央部が重度に壊死し、周囲の陥組織がわず
かに残った状態） また、試料投与後２０日１に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。

以上の方法によシ測定した、大腸菌の生産するＴＮＦの
活性を表３に示す。

表　３ ２Ｘ１０５　５　００１　４　５１５ 対照 生理食塩水　５５００００１５ 完治率：完全に癌が退縮したマウス奴／実鹸マウス畝

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規生理活性ポリペプチドの遺伝子
を含有するプラスミドの制限酵素切断地図を示す。第２
図は、本発明の組換ＤＮＡであるｐＴＮＦ　−ｔａｃ　
−１１の調製方法を示すフローシートで必）、第３図は
、ｐＴＮＦ　−ｔａｃ　ＵＶ５−１１の、ｉｎ方法を示
すフローシートである。 特許出願人　旭化成工業株式会社 図面の６゛ト書（内容に変更なし 手続補正書（自発） 昭和５９年　５月２’ｆ日 特許庁長官　若杉　和　夫　殿 １、事件の表示 ８ｉｕＬ］５　９４１４許！９ＪＩ＠　７　６　５　８
　４　号２、発明の名称 新規生理活性ポリペプチドのＤＮＡ ３、補正をする者 代表取締役社長　宮崎　輝 ４、補正の対象 手続補正書（自発） 昭和５９年ｇ　月２ｚ日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第７６５８４号 ２、発明の名称 新規生理活性ポリペプチドのＤＮＡ ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号（００３）　旭
化成工業株式会社 代表取締役社長　宮　崎　輝 ４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５、補正の内容

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少くとも次の塩基配列 ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
   Ｔ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＣＴＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
   　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　Ｇ
   ＡＧＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ
   ＧＣＣＡＧ　ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ　Ｃ
   ＴＧ　ＧＣＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣＡＣ
   Ｇ　ＧＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　Ｃ
   ＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　Ｔ！ＡＣＣＴＣＡ
   ＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＧＣ
   ＧＧＴ　ＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ
   　ＣＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＣＧ
   ＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡ
   ＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣＡＡ
   Ｇ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ
   ＣＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＧ
   ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴ
   Ｇ　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ
   　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＣＣ
   ＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣ
   ＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ　
   ＣＡＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＴ　
   ＧＣＣＴＧ およびこれに相補的な配列を含むポリデオキシリポ核酸
   。
2. （２）　特許請求の範囲第（１）項に記載のポリデオキ
   シリボ核酸と、複製可能なベクターとからなる複製可能
   な組換ＤＮＡ　０
3. （３）　！許請求の範囲第（２）項に記載の複製可能な
   組換ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞。
4. （４）少くとも次のアミノ酸配列 Ｓｅｒ　Ａｔａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｔａ　Ｌｅｕ　Ｓ
   ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 Ｌｅｕ　Ａｔａ　Ｈｌａ　Ｖａｔ　ｖａＬ　Ａｔａ　Ａ
   ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｔｎ　Ｖａｔ　ＧｔｕＧＬｙ　Ｇｔｎ
   　Ｌｅｕ　Ｇｔｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ　
   Ａｒｇ　Ａｔａ　ＡｓｎＡｔａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ、
   ／＝ａ　Ａａｎ　ＧＬｙ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｔ
   ｈｒ　ＡｓｐＡｉｎ　Ｇｔｎ　Ｌａｕ　ＶａＡ　ＶａＡ
   　Ｒｒ−ａ　ＡＡａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
   Ｌｅｕ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ　ＶａｔＬｅ
   ｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　ＧｔｎＧＬｙ　Ｃｙａ　
   Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔ
   ｈｒ　Ｈｌｓ　ＴｈｒＶａｔＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　
   Ａｔａ　ＶａｔＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙ
   ｓＶａｔ、Ａａｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｔａ　
   Ｉｔｅ　Ｌｙ、ｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＣｙｓＨｌｓ　Ａ
   ｒｇ　Ｇｔｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｇｔｕ　Ａｔ
   ａ　Ｇｔｕ　Ｐｒｏ　ＭｅｔＡｔａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　
   Ｇｔｕ　Ｐｒｏ　Ｉｔｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｔｙ　Ｇ
   ｔｙ　ｖａＬＰｈｅ　ＧＬｎ　Ｌｅｕ　Ｇｊｕ　Ｌｙｓ
   　Ｇｔｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＧ
   ｔｕ　ＶａｔＡｓｎ　ＧＬｎ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｔｙｒ
   　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡｔａＧｔｕ　Ｓｅｒ　Ｇ
   Ｌｙ　Ｇｔｎ　ＶａｔＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｔｙ　Ｉｔａ
   　Ｉｔｅ　Ａｔａｅｕ を含む特許請求の範囲第（１）項に記載の塩基配列由来
   の新規生理活性ペプチド
5. （５）特許請求の範囲第（１ン項に記載のポリデオキシ
   リが核酸を複製可能なベクターに組入れて該ポリデオキ
   シリポ核酸を含む複製可能な組換ＤＮＡを得、 得られた該組換ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換さ
   せて該組換ＤＮＡを含有する形質転換体を得、得られた
   該形質転換体を培養して該ポリデオキシリポ核酸の有す
   る遺伝情報を発現させることからなる特許請求の範囲（
   ４）の新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 （ｙｌ下余白ン