JPS6140791A - グルコースの異性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化酵素技術分野に関する。より詳しくは
、本発明は、連続的な変換を行いながら所望の酵素活性
を維持する方法を提供するものである。

タンパク質固定化の例は１９２０年代前半から見られる
（ネルソン、ジエイ・エム（Ｎｅｌｓｏｎ、　Ｊ、Ｍ、
）およびディー・アイ・ヒヅチコックス（Ｄ。

１　、　Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋｓ）、ザ・ジャーナル・オ
ブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ、Ａｍ
ｅｒ。

Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、）４６：１９５６（１９２１））。

ところが、この現象に強く興味が持たれたのは、明きら
かに今Ｉ紀最後の四半世紀からである。固定化技術は、
以下の４組に分類することができる：（り包括法、（２
）架橋法、（３）共有結合法および（４）吸着法。

包括法は、通例架橋したゲル内への取り込み、中空ファ
イバ、リポソームマイクロカプセルなどによるカプセル
化による。架橋法は、いわゆる二官能性−または多官能
性架橋剤の添加による酵素の修飾によるものであって、
しばしば吸着またはカプセル化を伴う。共有結合法は最
も広く研究された方法であり、酵素の生物学的活性に本
質的ではない官能基による酵素と担体の共有結合による
ものである。吸着法は、単に酵素を吸着剤と接触させ、
酵素−吸着剤間の比較的弱い結合力の相互作用で固定さ
せることによって達成される。

本発明が最も直接に関係するのは、この最後の固定化法
である。よって、吸着原理を以下に十分に記述する。包
括、架橋および共有結合法に関する包括的な見解は、例
えば、ライ−クル、エッチ−ニー）ヂ（Ｗｃｃｔａｌ、
　Ｈ，Ｈ，）著、「固定化酵素、−抗原、抗体およびペ
プチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　　Ｅｎ−ｚｙｒａｅ
ｓ、　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊエム・デツカ−（Ｍ、　Ｄ
ｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、（１９７５）、またはザ
ボルスキー、オー・アール（Ｚａｂｏｒｓｋｙ、　Ｏ，
Ｒ，）ｒ固定化酵素（Ｉｍｉｏｂｉｌ　１ｚｅｄＥ　ｎ
ｚｙｍｅｓ）Ｊシー・アール・シー・プレス（ＣＲＣＰ
　ｒｅｓｓ）、クリーブランド、（１９７３）に記載さ
れている。

吸着に関する初期の研究は、吸着によって酵素の一部ま
たは全部が不活性化されることがあることを示しノこ。

従って、本発明の実施に使用する適当な吸着剤が、酵素
に比較的高い親和性を持ちながら、不活性化は最小限で
あることは価値がある。

吸着固定化を行う担体としては、アルミナ、ベントナイ
ト、炭酸カルシウム、セルロース、コラ−ゲン、イオン
交換樹脂、カオリナイト、セファデックス、シリカゲル
およびチタン被覆ステンレ〜　　ススチールが知られて
いる。

以下に記述するように、本発明は広範囲の吸着酵素系に
適用し得るが、過程を有利にするには固定化したグルコ
ースイソメラーゼの使用が特に適当である。

大部分のフルクトースは、固定化グルコースイソメラー
ゼ床をデキストロース溶液が通過する反応器内で、デキ
ストロース（デンプン由来）をフルクトースに異性化す
ることによって商業的に製造される。生成した液体中の
フルクトース含量は、反応器内の流速の調節によって、
通例一定のレベル（すなわち４０〜４４％）に保たれる
。固定化酵素は、熱および化学的不活性化によって自然
に失活するので、流速を定期的に遅くする。流速か、さ
らに還元可能な流速を下回ると、固定化酵素床を新しい
ものと取り換える。寿命に達していない（使用可能な）
カラムの流速は、たとえば５０〜５ＧＰＭの間で変わり
得るので、はとんど一定の製造速度を得るために、多く
のカラムを適所に使用しなければならない。

特に自゛用なグルコースイソメラーゼの固定化の系は、
米国特許第３，７８８，９４５号：第３．９０９３５４
号：第４．１１０，１６４号；第４，１６８．２５０号
に開示されている。米国特許第３゜９６０．６６３号に
は、固定化グルコースイソメラーゼを含む異性化反応器
へのデキストロース原料液を介して、可溶性グルコース
イソメラーゼを定期的に追加することが開示されている
。グルコースイソメラーゼは、可溶性グルコースイソメ
ラーゼを能カ一杯に担持していた強塩基性陰イオン交換
樹脂に固定される。酵素か失活すると、不活性酵素が担
体から脱落して溶出液中に現れるというように、吸着特
性が変化する。この特許は、担体に全部再担持させるの
に十分な量の新しい（ｆｒｅｓｈ）酵素を担体に接触さ
せることによる脱離酵素の置換を開示している。失活し
た酵素は断続的に吸着〜ｊから脱離するので、混入した
酵素を溶出液から除くためにさらに精製しなければなら
ない。

本発明の応用は、以下（１）〜（４）の点で従来の反応
より著しく有利である。

（１）操作の単純化一定期的に反応器内流量を調節する
必要がなくなる。

（２）低資本投下−流速の変動の除去の故に、少数の大
型の反応器を補助する、より小型の反応器が必要となる
。

（３）改良された製造管理□より多くの可溶性の酵素を
反応器に加えることにより流速を小さくする必要なく高
濃度のフルクトースが得られる。

（４）生成物精製のコスト低下−遅い流速（長い滞留時
間）が解消されるので、有色で無風味の生成物は減少す
る。

本発明は、吸着条件下で、固体担体に、所定の活性を示
し、担体の最大担持能力を越えない量の酵素を吸着させ
ること；および前もって吸着させた酵素の活性が所定の
レベル以下に低下した場合に、所定の活性を維持するた
めに追加ｍの酵素を担体に吸着させることを含んで成る
、反応器内で固定化酵素の一定の活性を維持する方法を
提供するものである。定期的な酵素の追加は、担体の最
大担持能力に達するまで続ける。本発明は、グルコース
からのフルクトースの製造に使用し得るような固定化グ
ルコースイソメラーゼの反応の活性を維持するのに、特
に有用である。

固定化酵素法を評価する主要な要素は、用いる酵素が活
性である期間の長さにある。前記のように、反応を続け
ると酵素は自然に失活する。どのように酵素が失活する
かということを特別な理論で限定するわけではないが、
熱および化学的変性が失活に関与していると思われる。

この問題に対する対処方法の一つは、固定化酵素系の効
率が低下するにつれ、単に反応器内の流Ｂｆ−減少させ
ることであった。しかし、流速はＩＯまたはそれ以上の
要因によって変化し得るので、連続的に生産するために
一連のカラムを設けることが必要である。他の対処方法
は、定期的に系の作動を停止し、消耗した酵素を除去し
て新たに酵素を担持させるか、または米国特許第３，９
６０゜６６３号に開示されているように、消耗した酵素
が溶出されるにつれて定期的に新たな酵素を加えるとい
うものである。

゛　　　本発明は、作動を停止することなく系に新しい
酵素を追加でき、生成物を一定濃度に維持するか、要す
れば増加させることができ、溶出液は本質的に酵素を含
まないような、前述の方法より優れた方法を提供するも
のである。

本発明は、最初に担体（吸着剤）に、その最大担持能力
を越えない量の酵素を加えて固定化酵素系を調製し、す
なわち担体を不完全担体の状態にし、必要に応じて担体
の最大担持能力に達するまで新たに酵素を導入すること
によって生成物濃度を一定に維持する方法を提供するも
のである。

吸着による固定化技術は、酵素−担体間の荷電相互作用
や疎水相互作用などをもたらすので、特別な酵素−担体
の組み合わせの選択は、経験的に行わなければならない
。以下に有用な担体を示す。

１、弱塩基性ポリスチレン樹脂。例：アンバーライトＩ
ＲＡ−９３（ローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ　　＆
　　Ｈａａｓ））、ダイアイオンＷＡ−３０（三菱）、
ダイアイオンＷＡ−１１（同）、アンバーライトＩＲ−
４５（ローム・アンド・ハース）。

２、弱塩基性（−Ｎ（ｒｔ）ｔ）フェノール−ホルムア
ルデヒド樹脂。例：デュオライトＥＡ−５６１（ダイヤ
モンド・ジャムロー）り（Ｄ　ｉａｍｏｎｄ　　Ｓ　ｈ
ａｍｒｏｃｋ）、デュオライトＥＳ−５６２（同）、デ
ュオライトＥＳ−５６８（同）。

３、強塩基性（Ｎ（Ｒ）３）ポリスチレン樹脂。

例：ＸＥ−３５２（ローム・アンド・ハース）、アンバ
ーライトＩＲＡ−９００（同）、アンバーライ）ＩＲＡ
−９０４（同）、アンバーライトＩＲＡ９３８（同）、
ＣＩＡ−０１（三菱）、ダイアイオンＰＡ−３０８（同
）、ダイアイオンＰＡ−３０４（同）、ダイアイオン５
Ａ−２１Ａ（同）、住友レジン（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ　　
Ｒｅ５ｉｎ）（住友）。

４、その他の酵素吸着剤。例：ＤＥ′ＡＥ−セファデッ
クス（架橋デキストラン誘導体−フアルマシア（Ｐ　ｂ
ａｒＩＩｌａｃｉａ））、ＤＥＡＥ−グリコフェイズ（
炭水化物で被覆誘導して調整した細孔ガラス−ピアス・
ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＱＡ
Ｅ−グリコフェイズ（前記に対応する強塩基）、ＤＥＡ
Ｂ−バイオゲル（Ｂ　ｉｏｇｅｔ）Ａ　（架橋アガロー
スゲルビーズ誘導体−バイオ・ラド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）
）、セレクタセル（Ｓ　ｅｌｅｃｔａｃｅｌ）Ｄ　Ｅ　
Ａ　Ｅ−セルロース顆粒（ブラウン（Ｂ　ｒｏｗｎ））
、ビステクＤ、およびり。

（ビスコース由来のＤＥＡＥ−セルロース顆粒−一ビス
コース・グループ（Ｖ　１ｓｃｏｓｅ　　Ｇ　ｒｏｕｐ
））、ＤＥＡＥセファセル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロー
スビーズーファルマシア）、ＤＥＡＥ−セルロースビー
ズ（米国特許第４．０９０，０２２号）、ＤＥＡＥ−Ｉ
Ｆルロ−スビーズ（ボリテクナ（Ｐ　ｏｌｙｔｅｃｈｎ
ａ）、チェコスロバキア）、調整細孔ガラス（Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄＰ　ｏｒｅ　　Ｇ　１ａｓｓ）（コーニン
グ・グラス（ＣｏｒｎｉｎｇＧ　１ａｓｓ））、および
調整細孔アルミナ、チタニア、ジルコニア（Ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ　　Ｐｏｒｅ　　ＡｌｕｍｉｎａＳＴ　１ｔ
ａｎｉａＳＺ　１ｒｃｏｎｉａＸコーニング・グラス）
。

弱塩基性陰イオン交換担体を使用するのが好ましい。Ｄ
ＥＡＥセファデックスまたはＤＥＡＥ−セルロース如担
体の使用が最も好ましい。

前記担体に種々の酵素を吸着させることができ、熟練し
た技術者は、過度に実験をしなくても適当な担体を容易
に選択できる。グルコースイソメラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、アミノアシラーゼ、インベルターゼ、β−グルカ
ナーゼ、グルコース−１−オキシダーゼおよびグルコー
ス−２−オキシダーゼのような酵素を使用するのが好ま
しい。

固定化が、単に静電引力によるものであれば、イオン強
度、ｐＨ１または反応温度が変化すると結合が仕切れる
可能性がある。この作用を最小限にするために、担体に
対して高い結合活性を有する酵素を選択することが好ま
しい。その代わりに、ソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）とレ
ヴイン（ｌｅｖｉｎ）がアミノグルコシダーゼについて
行ったように、化学的修飾によってタンパク質の電荷を
増すことも可能である（バイオテクノロジー・アンド・
バイオエン・ジニアリング（Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎ、　Ｂ
　ｉｏｅｎｇ、　）　１６　：　１１６１（１９７４）
参照）。本発明で特に有用な酵素は、グルコースイソメ
ラーゼである。

以下の実施例で、一種の好ましい酵素／担体の組み合わ
せに関して詳細に説明するが、本発明の範囲の限定を意
図するものではない。

実施例１ この実施例は、部分的に精製した可溶性のグルコースイ
ソメラーゼを、部分的に担持した担体を含む固定化反応
器に定期的に添加することによって、さらに１９週間高
レベルで本質的に一定の異性化率を維持したものである
。

可溶性酵素の精製 ストレプトマイセス・ルビジノサス（Ｓ　ｔｒｅＰｔｏ
−ｓｙｃｅｓ　　ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）発酵液のバ
ッチ１４６０ＪＩ１２を濾過し、その細胞を脱イオン水
７３０ｘＱに再懸濁させ濾過した（×２回）。細胞を脱
イオン水１４６０ｍｇに再懸濁させてスラリーとした。

スラリーの９）（を希塩酸で６．５に調節し、リゾチー
ム１ＯＪ１９およびヴアリクアット（Ｖ　ａｒｉｑｕａ
ｔ）（ジメチルアルキルベンジルアンモニウムクロライ
ド）１７００　ｐｐｍを添加した。可溶性イソメラーゼ
を細胞から抽出するために、穏やかに上部を攪拌しなが
ら４０℃で３．６時間インキュベートした。可溶性酵素
を濾過によって細胞片から分離し、１８１ＧＩＵ／ｊｌ
Ｑで検定した。ロイド、エヌ・イー（Ｌ　１ｏｙｄ。

Ｎ、Ｅ、）、カリールディン、ケイ（Ｋ　ｈａｌｅｅｌ
ｕｄｄｉｎ。

Ｋ、）、ラム、ダブりニー・アール（Ｌａｍｍ、　Ｗ。

Ｒ，）（１９７２）、シリアル・ケミストリー（Ｃｅｒ
ｅａｌ　Ｃｈｅｗ、　）４９．５４４に、検定法につい
ての記載がある。国際グルコースイソメラーゼ単位（ｌ
ｎＬｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｇｌｕｃｏｓｅ　　１ｓ
ｏＩｌｌｅｒａｓｅ　　Ｕｎｉｔ）は、特殊な条件（ｐ
Ｈ７、０，６０℃、２．０Ｍグルコース、０．２ＭＭｇ
″“、０．００１ＭＧｏ”、０゜２Ｍマレイン酸ナトリ
ウム緩衝液）下、１マイクロモル／分の速度でＤ−グル
コースからＤ−フルクトースへの変換を触媒する酵素の
量として定義されている。

固定化に使用する担体 可溶性グルコースイソメラーゼの固定に使用した弱塩基
性担体は、ＤＥＡＥ−セルロース顆粒（ＧＤＣ）であっ
た。粉砕セルロースと増量剤をプラスチックと共に凝集
させ、次いでそのセルロースをジエチルアミノエチルク
ロライドで変性して弱塩基性を与えるという一般的ｔＬ
調製法は、ナビスコプランド（Ｎａｂｉｓｃｏ　　Ｂｒ
ａｎｄｓ、　　Ｉｎｃ、　）に譲渡された米国特許第４
，３５５，１１７号に開示されている。

特に、Ｃ−１００粉砕セルロース（インターナショナル
・フィラー（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｐ　Ｈ
ｌｅｒＣｏｒｐ、　）３６ボンドと焼成アルミナ（レイ
ノルズ−ＲＣ−２０（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　　ＲＣ−２０
）２４ボンドを、耐衝撃性ポリスチレン（ハモンド・プ
ラスチックス（Ｈａｕ＋ｏｎｄ　　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）
６０ボンドと共に、ロールミル中２００℃でプラスチッ
クが溶けて混合物が均質となるまで混合した。セルロー
ス混合顆粒を冷却し、ハンマーミルに複数回通して粉砕
し、スクリーンで分級して米国標準メッシュフラクシジ
ン４０〜８０の粉体を得た５分級した物質（３６ポンド
）を、硫酸ナトリウム３７ボンド、水酸化ナトリウム４
．８ボンドおよび水１４．１ガロンから成る硫酸アルカ
リ溶液に入れてスラリーとした。スラリーを４０℃に加
熱し、塩酸ジメチルアミノエチルクロライドの５０％水
溶液１４゜■５ポンドを１１５ｆｆｉｆ／分の速度で攪
拌しながらスラリーに加えた（添加時間約１時間）。ス
ラリーをさらに３０分間攪拌し、５０％ＮａＯＨ７，２
ボンドを加え、さらに５０％塩酸ジエチルアミノエチル
クロライド１４．１５ポンドを前記と同様に加えた。ス
ラリーを６０℃に加熱し、水！５ガロンで希釈し、ＨＣ
ｌ２でｐＨ４，５に調節して６０メツシユのシュイカ−
スクリーン上で洗った。ＧＤＣを再びスラリーとし、ｐ
Ｈ７，０〜７．５に調節して、６０メツシユのスクリー
ン上で脱水した。

担体の吸着能力は、次のように測定した。可溶性酵素１
００ｘ＋２に、乾燥重量２．６ｉの担体を加えた。叶■
７．０に調節し、スラリーを５時間穏やかに攪拌した。

吸着に続いて、時間間隔を置いて部分量を濾過し、可溶
性イソメラーゼ活性を測定した。

すなわち、測定した担体の可溶性イソメラーゼ活性は乾
燥品１ｘ当たり５８４ＩＧＩＵであった。

ＧＤＣへの最初の酵素の固定化 以下のように、ＧＤＣ担体に、担持能力の約２５％の可
溶性イソメラーゼを担持させた。ＧＤＣ（乾燥重量１４
．８ｇ）を脱イオン水に入れてスラリーとし、ｐ）Ｉ　
７　、０〜７．１に調節した。水流ポンプによる減圧下
、室温で６０分間スラリーを脱気し、直径１インチ、長
さ１２インチのエース・ガラス・アジャスタクロム（Ａ
ｃｅ　　Ｇ　１ａｓｓ　　Ａｄ−ｊｕｓ　ｔａｃｈｒｏ
ｍ）　（商標）でジャケットされ、底が溶融ガラスのカ
ラムに注入した。床を深さ３．５４インチに詰めた。む
ら無く液体を流すために、′ガラスピーズを床の上（４
インチ）に置いた。室温で１ＭＱ１分の速度で可溶性イ
ソメラーゼ１４５ｘ＆（２６００１Ｇ　Ｉ　Ｕ）を上か
らポンプで流してＧＤＣ’に担持させた。床を通過した
液体には、測定し得る活性は無かった。

固定化イソメラーゼ活性の検定 カラムの水ジャケットを６１’Ｃに調節した。５ｍＭＭ
ｇ５Ｏａおよび５／ＩＩＭＮａＨＳＯ３を含有する結晶
デキストロース５０％溶液（ｐＨ７、８）を、流速０　
、４　ｒ：ｔＱ／分で固定化イソメラーゼ床の上から流
した。カラムを夏６時間運転した。

溶出液のサンプルを分析し、次の式（１）によって固定
化活性を計算した。

Ｅ【−全固定化活性（Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ｕ）Ｒ＝流速（１７
時） Ｃ＝モノサブカライド濃度＜９／ＩＩ（１）Ｋｒ＝６１
”Ｃにおける反応速度定数 （０，０１９９／Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ｕ／時）■＝溶出液の異
性化度 フルクトース濃度 モノサッカライド濃度 １ｏ＝＝注入液の異性化度（結晶デキストロースについ
ては０） Ｉｅ−平衡時の異性化度＝０．５１０（６１’Ｃ）　　
　−異性化度Ｉは、以下のように偏光分析的に測定した
。カラムの注入液および溶出液のサンプルを脱イオン水
で２０倍に希釈し、旋光が平衡に達するよう１時間放置
した。旋光度測定には、２５℃、水銀灯からの波長５７
６ｎｉの光で、エルマー２４１型（Ｅ　１ｍｅｒ　　Ｍ
ｏｄｅｌ　　２４１　）旋光針を使用した。

セルに水を入れて旋光針のゼロ点調節を行った後、希釈
した注入液および溶出液の旋光度を測定した。

×ファクター　　　　　　（２） ΔＩ＝ｒ−１゜ ファクター＝□ Ｌ（（αｄ〕−〔α「〕） Ｄ＝希釈度（５ｘ＆−１００ｘ（１）＝　２０し＝旋光
針のセル長＝１ｄｍ 〔αｄ〕−〔αｒ〕は、純粋なデキストロースを純粋な
フルクトースに転化する際の比旋光度の変化であり、水
銀灯による測定値は１６７．３３であった。

ファクターは０．１１９５であった。

この検定法により測定した固定化酵素の活性は１５４８
１ＧＩＵであり、これは、担体に担持させた可溶性の活
性酵素２６００１ＧＩＵのうちの６０％が固定化酵素活
性を示したことを表す。

異性化および定期的な酵素の追加 乾燥固体としてのデキストロース９５％、５ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４および５　ｍＭ　Ｎ　ａ　ＨＳ　０３を含有する
コーンスターチ加水分解物５０％溶液をｐＨ７，８に調
節し、６１’Ｃで固定化したイソメラーゼ床の上から流
した。カラムの最初の流量について式（１）で計算し、
約４４％のフルクトース転化が起こるよう調節した。固
定化酵素活性の検定時を除いては、この流量を１７３１
７２／時で一定に保った。

溶出液中のフルクトース含量は、異性化度測定によって
本質的に測定される。

フルクトース（％）＝１００Ｉｄ （ｄ＝溶出液中の全乾燥固体としてのモノサブカライド
含量〕 フルクトース濃度は、しだいに低下して１６日後には約
４０％になったので、可溶性酵素の第１回目の追加を行
った。固定化酵素活性の検定の結果、失活分を補充して
フルクトース転化率を４４％に高めるために、約８００
１ＧＩＵ必要であることがわかった。従って、前述の塩
を含有する５０％結晶デキストロース溶液１２６ｘ＆に
、酵素４０１！（７２０１（、ｒＵ）を加えた。カラム
への原料供給を酵素含有デキストロース溶液に切り換え
、０　、３　ｙｔＱ１分の速さで全量を流した。酵素吸
着中のカラムからの溶出液からは、可溶性イソメラーゼ
は検出されなかった（溶出液を６１’Ｃで１６時間イン
キュベートし、フルクトース含量の増加を測定した）。

次いで追加の固定化酵素活性を検定するために、結晶デ
キストロース溶液の注入を続けた。原料をコーンスター
チ加水分解物に戻すと、溶出液のフルクトース濃度は４
４％に回復した。

溶出液中のフルクトース濃度が次第に低下して約４０％
になる一固定化酵素活性を検定するために、結晶デキス
トロース溶液に原料を切り換える一デギストロース溶液
に可溶性酵素を加えて注入する一追加した固定化酵素活
性を検定する一コーンスターチ加水分解物原料に戻す、
という手順を１７週間続けた。次の１０週間は、酵素追
加面後の固定化酵素活性の検定を省略して、この手順を
行なった。それ以降は、一定量の可溶性酵素を定期的に
追加した。この間、流速は一定に保たれ、フルクトース
濃度は自然に４０〜４４％の範囲内に入っていた。もち
ろん、可溶性酵素をより頻繁に追加すれば、フルクトー
スの濃度範囲をより狭めることができる。

７．５週間の運転後、酵素活性は２倍になっており、４
０〜４４％のフルクトースを得るために流速を高める以
外特に影響は無かった。１３週間の運転後、コーンスタ
ーチ加水分解物原料中の塩濃度を、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４に
ついては５ｓＭから１ｍＭに、Ｎ　ａ　ＨＳ　Ｏ３につ
いては５ａＭから２ａ＋Ｍに低めた。

２０週間後、酵素吸着中の溶出液検定の結果、可溶性の
活性酵素がいくぶん漏出したことがわかつ　−た。漏出
が起こる前の最後の酵素の追加によって吸着した酵素の
全量は、６４９　Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ｕ／９または最初に測定
した担持能力６８４　Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ｕ／ｆに近い値とな
っていた。その後の吸着操作中に漏出は増加したが、新
たな酵素は十分吸着されており、４０％のフルクトース
転化率は維持された。最初に測定した担持能力を超過し
た後にも酵素が吸着されるという事実は、失活酵素が脱
着するということを示した。

第１表は、２７週間のフルクトースの製造および酵素の
追加についてまとめたものである。製造されたフルクト
ース量は、乾燥品としてフルクトースシロップの４３重
量％であった。各週のフルクトース製造量も４３％に正
規化できた。

実施例２ この実施例は、カラムにおける酵素の固定化に゛　関す
るものであり、最初に担体に担持させ、後に追加する可
溶性グルコースイソメラーゼは、純度の高いものである
。カラム操作は実施例１と同様であり、コーンスターチ
加水分解物原料の流速を一定に保ち、結晶デキストロー
ス溶液に入れた可溶性酵素の追加は原料液を介して行っ
た。こうして、１４週間フルクトース転化率を４０〜４
４％に維持した。精製したコーンスターチ加水分解物の
４５％原料液は、デキストロース約９５％、■。

５ｍＭＭｇ５Ｏ４および２．０ｍＭＮａＨ３Ｏ５を含有
していた。ｐＨ７、５の溶出液を得るために、注入液の
ｐＨを約７．８に調節した。固定化酵素床の温度は６０
℃に調節した。

可溶性グルコースイソメラーゼの精製 細胞を発酵液から分離せずに抽出前に洗う以外は、実施
例１と同様に、ストレプトマイセス・ルビジノサスの発
酵液を抽出して、その細胞から可溶性グルコースイソメ
ラーゼを放出させた。濾過した抽出液２３５０ｘＮをＤ
ＥＡＥ−セルロース顆粒カラムに通して精製した。ＤＥ
ＡＥ−セルロース顆粒カラムは、実施例１で用いた酵素
を固定化させる担体と同じ素材である。カラムを調製す
るのに、乾燥重量３００２のＧＤＣを１０ｍＭ）リス緩
衝液に懸濁させ、それをクロマトグラフィーカラム内に
２インチの深さに注入して床とした。カラムを、ＩＯａ
Ｍ）！Ｊス緩衝液２＆でＩＯ，ｗ５／分の流速で、また
は溶出液のｐＨが約７になるまで洗った。

ｆｆ１Ｊ’ＪＩＥＩＥ（２９、３１Ｇ　Ｉ　Ｕ／ｘ（１
）を５　ｘＱ／分の速さでカラムの上から流した。酵素
を流した後、０　、１　ｔａＭＮａｃ；Ｑ　−１０ｍＭ
　）リス緩衝液（ｐＨ７）３゜５Ｑで、流速＊ＯＲＱ／
分でカラムを洗った。溶出液フラクションの酵素含量を
、紫外吸収測定および酵素検定によって監視した。２０
１ＧｆＵ／ｓｌ！以上含有したフラクションは貯留して
おき（９０ＯＪｆ＆）、限外濾過によってさらに精製し
た。貯留したフラクションを、１０ＰＳ　ＩＧＮｔ雰囲
気中、アミコン（Ａ＊１ｃｏｎ）４０７撹拌器内のアミ
コンＸＭ−１００膜で限外濾過した。限外濾過によって
精製した液には、純度的５０％の酵素８００ＩＧプ・） ＩＵ／ＩＱが含まれていた。

厘宸化且使ｍｔ五且化 ＧＤＣ担体（乾燥重量７．７５９）を、実施例１に記載
のガラスカラムに入れた。４０倍希釈した精製酵素１３
６ｚＱ（２７２０ＩＧＩＵ）を含有する５０％結晶デキ
ストロース溶液（ｐＨ７，８，５ｍＭＭｇＳＯ４，５ｍ
Ｍ　Ｎ　ａＨＳ　Ｏ３）を流速０．４〜０．７１１Ｑ／
分でカラムの上からポンプで流し、担体に担持能力の約
２５％の精製酵素を担持させた。゛溶出液からは可溶性
酵素は検出されなかった。結晶デキストロース溶液（ｐ
Ｈ７、８５ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏａ、５＋ａＭ　Ｎ　ａＨＳ
　Ｏ３）の検定を続け、カラムの固定化酵素床の温度が
６０℃となるようにカラムの水ジャケットを加熱した。

固定化酵素活性の検定 実施例１の検定法により測定した固定化酵素活性は１６
８６１ＧＩＵであり、これは吸着させた酵素の６２％が
活性であることを示していた。

異性化および定期的な酵素の追加 コーンスターチ加水分解物を固定化酵素床に流し、フル
クトース転化率が４０〜４４％となるよう（こ流量を調
節した。流速は、約０．３５１１Ｑ／分で一定に保った
。酵素の失活につれてフルクトース濃度が低下するので
、希釈・精製した可溶性イソメラーゼ２０ａ＋１２（４
３４（ＧＩＵ）を結晶セルロース５０％溶液（ｐＨ７、
８，５ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ４，５ｍＭ　ＮａＨＳＯ−）に
加え、それを流速０．４　ｘ（１／分で固定化酵素床に
ポンプで流した。吸着後、コーンスターチ加水分解物原
料！こ戻した。第２表は、異性化および酵素の追加につ
いてまとめたものである。実施例１と同様に、定期的な
可溶性イソメラーゼの追加によって、本質的に一定の流
速で一定のフルクトース転化が維持された。

Ｗｉ７Ｆ出願人　ナビスコ・ブヲンズ拳インコーポレイ
テッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）吸着条件下で、固体担体に、所定の活性を示し
   、担体の最大担持能力を越えない量の酵素を吸着させる
   こと；および ｂ）前もって吸着させた酵素の活性が所定のレベル以下
   に低下した場合に、所定の活性を維持するために追加量
   の酵素を担体に吸着させることを含んで成る、反応器内
   で固定化酵素の一定の活性を維持する方法。 ２、追加量の酵素の吸着に先立って、酵素活性をモニタ
   リングする工程を含む第１項記載の方法。 ３、担体が弱塩基性陰イオン交換吸着剤である第１項ま
   たは第２項記載の方法。 ４、弱塩基性吸着剤が、アンバーライト（Ａｍ−ｂｅｒ
   ｌｉｔｅ）ＩＲＡ−９３、ダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ
   ）ＷＡ−３０、ダイアイオンＷＡ−１１、アンバーライ
   トＩＲ−４５、デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）ＥＳ−
   ５６１、デュオライトＥＳ−５６２、デュオライトＥＳ
   −５６８、ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
   ）、ＤＥＡＥグリコフェイズ（Ｇｌｙｃｏ−ｐｈａｓｅ
   ）、ＱＡＥ−グリコフェイズ、セレクタセル（Ｓｅｌｅ
   ｃｔａｃｅｌ）ＤＥＡＥ−セルロース、ビステク（Ｖｉ
   ｓｔｅｃ）Ｄ２、ビステクＤ、ＤＥＡＥ−セファセル（
   Ｓｅｐｈａｃｅｌ）、またはＤＥＡＥセルロースビーズ
   である第３項記載の方法。 ５、吸着剤がＤＥＡＥセファデックスまたはＤＥＡＥセ
   ルロースである第４項記載の方法。 ６、酵素の量が、担体の最大担持能力の約１〜約９０％
   である第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７、酵素の量が、担体の最大担持能力の約１０〜約５０
   ％である第６項記載の方法。 ８、酵素の量が、担体の最大担持能力の約２５％である
   第７項記載の方法。 ９、酵素の作用による生成物の量を定期的に測定するこ
   とによって酵素活性をモニタリングする第１〜８項のい
   ずれかに記載の方法。 １０、固定化酵素反応の進行中に、追加量の酵素を追加
   する第１〜９項のいずれかに記載の方法。 １１、追加の酵素を原料供給を介して追加する第１０項
   記載の方法。 １２、酵素が、アミノアシラーゼ、インベルターゼ、β
   −グルカナーゼ、グルコース−１−オキシダーゼ、グル
   コース−２−オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、または
   グルコースイソメラーゼである第１〜１１項のいずれか
   に記載の方法。 １３、酵素がグルコースイソメラーゼである第１２項記
   載の方法。 １４、生成物がフルクトースであり、原料がデキストロ
   ースを含む第１３項記載の方法。 １５、酵素が酵素的に活性および不活性のいずれの形態
   でもイオン性吸着剤に保持され得ることでさらに特徴づ
   けられる第１〜１４項のいずれかに記載の方法。 １６、連続的に４０〜４４％のフルクトースを生成する
   ように、固定化したグルコースイソメラーゼがデキスト
   ロース溶液と接触する第１３項または第１４項記載の方
   法。 １７、ａ）吸着条件下で、固体担体に、フルクトースを
   ４０〜４４％含有する生成物を生成可能で、担体の最大
   担持能力の約２５％の量のグルコースイソメラーゼを吸
   着させ； ｂ）フルクトースを４０〜４４％含有する生成物の生成
   をモニタリングし；および ｃ）前もって吸着させたグルコースイソメラーゼによっ
   て生成するフルクトースの割合が４０％以下に低下した
   場合に、フルクトースを４０〜４４％含有する生成物の
   生成を維持するために追加量のグルコースイソメラーゼ
   を担体に吸着させることによって連続的生成を行う第１
   ６項記載の方法。