JPS6140797A - Ｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
Ｌ−トリプトフアンの製造法Info
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- JPS6140797A JPS6140797A JP16121784A JP16121784A JPS6140797A JP S6140797 A JPS6140797 A JP S6140797A JP 16121784 A JP16121784 A JP 16121784A JP 16121784 A JP16121784 A JP 16121784A JP S6140797 A JPS6140797 A JP S6140797A
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、組換えＤＮＡ技術によって育成されｔコリ
ネ型細菌を用いるＬ−）リプトファンの製造法に関する
。
ネ型細菌を用いるＬ−）リプトファンの製造法に関する
。
従来の技術
微生物を用いるＬ−）リプトファンの製造法として、グ
ルコース等の炭水化物を原料としてＬ−トリプトファン
ｔａ造しようとする場合には、野性味は殆んど菌体外に
Ｌ −） リプトファンを生産しないので、野性味に人
工的に突然変異を生起せしめてＬ−）リグドアアン生産
能を付与する方法がとられている。
ルコース等の炭水化物を原料としてＬ−トリプトファン
ｔａ造しようとする場合には、野性味は殆んど菌体外に
Ｌ −） リプトファンを生産しないので、野性味に人
工的に突然変異を生起せしめてＬ−）リグドアアン生産
能を付与する方法がとられている。
従来知られているＬ−）リグドアアン生産能を有する人
工変異株としては、ブレビバクテリウム、ミクロバクテ
リウム又はコリネバクテリウム属の５−メチルトリプト
ファンに耐性を有する変異株（米国特許３７００５３９
）、＝ｚｌＪネパクテリウム属のチロシンとフェニルア
ラニンｔ”！！求Ｌ、フェニルアラニンアンタゴニスト
に耐性を有する変異株（特公昭５ ］ −１９０３７）
、バチルス属の５−フルオロトリプトファンに耐性を有
する変異株（特開昭４９−８５２３９ ）、ブレビバク
テリウム属の５−メチルトリプトファン及びｍ−フルオ
ロトリプトファンに耐性を有する変異株（特開昭５０−
４２０９１ ）等が知られている。
工変異株としては、ブレビバクテリウム、ミクロバクテ
リウム又はコリネバクテリウム属の５−メチルトリプト
ファンに耐性を有する変異株（米国特許３７００５３９
）、＝ｚｌＪネパクテリウム属のチロシンとフェニルア
ラニンｔ”！！求Ｌ、フェニルアラニンアンタゴニスト
に耐性を有する変異株（特公昭５ ］ −１９０３７）
、バチルス属の５−フルオロトリプトファンに耐性を有
する変異株（特開昭４９−８５２３９ ）、ブレビバク
テリウム属の５−メチルトリプトファン及びｍ−フルオ
ロトリプトファンに耐性を有する変異株（特開昭５０−
４２０９１ ）等が知られている。
一方、最近上述のような人工変異による育種と異なると
ころの組換えＤＮＡ技術をＬ−トリプトファン生産菌の
育種に利用する試みもいくつか報告されている。例えば
、ＡｐｐＬ Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＊
３８、 （２）、 １８］−１９０，（１９７９）
にはエシェリヒア・コリのｔｒｐ Ｅ４７２ 遺伝子を
もつプラスミドを含有するエシェリヒア・コリの特定の
変異株が、約１．３ｆｉ／ｌのＬ−トリプトファンを生
産したことが記載されている。又、「日本発酵工学会
昭和５５年度大会講演要旨集１７０頁（３９８０）Ｊに
もやはカエシェリヒア・コリのトリプト７アンオベロン
を組み込んだグラスミドを含有するエシェリヒア・コリ
の変異株が３６０１Ｅ／／Ｉｆ）Ｌ−）リプドアテンを
生産したことが記載されている。
ころの組換えＤＮＡ技術をＬ−トリプトファン生産菌の
育種に利用する試みもいくつか報告されている。例えば
、ＡｐｐＬ Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＊
３８、 （２）、 １８］−１９０，（１９７９）
にはエシェリヒア・コリのｔｒｐ Ｅ４７２ 遺伝子を
もつプラスミドを含有するエシェリヒア・コリの特定の
変異株が、約１．３ｆｉ／ｌのＬ−トリプトファンを生
産したことが記載されている。又、「日本発酵工学会
昭和５５年度大会講演要旨集１７０頁（３９８０）Ｊに
もやはカエシェリヒア・コリのトリプト７アンオベロン
を組み込んだグラスミドを含有するエシェリヒア・コリ
の変異株が３６０１Ｅ／／Ｉｆ）Ｌ−）リプドアテンを
生産したことが記載されている。
更に特開昭５７−２０８９９４には、組換えＤＮＡ技術
によって育成されたバチルス属の微生物を用いてＬ−）
リプドアアンを生産することが記載されている。
によって育成されたバチルス属の微生物を用いてＬ−）
リプドアアンを生産することが記載されている。
一方、インドール又はアンスラニルｅＩ！？原料トいる
。（例えば特公昭４３−２０７１１ 、特公昭４６−１
６９５５、特公昭４７−４６３４８、特公昭４７−２９
５８４、特開昭４８−８０７８５、特開昭４８−８７０
８５、特開昭５０−９５４８４等）。
。（例えば特公昭４３−２０７１１ 、特公昭４６−１
６９５５、特公昭４７−４６３４８、特公昭４７−２９
５８４、特開昭４８−８０７８５、特開昭４８−８７０
８５、特開昭５０−９５４８４等）。
また、組換えＤＮＡ技術を用いて育成されたノ４チルス
属の細菌によジインドール又はアンスラニル酸よｆｉｔ
、−）リプドアアンを製造する方法も知られている（特
開昭５８−８９１９４）。
属の細菌によジインドール又はアンスラニル酸よｆｉｔ
、−）リプドアアンを製造する方法も知られている（特
開昭５８−８９１９４）。
発明が解決しようとする問題点
本発明は、これらの従来の技術に比べよシ効率のよいＬ
−） ＋７プドフアンの製造法を見い出すことを目的
とするものである。
−） ＋７プドフアンの製造法を見い出すことを目的
とするものである。
問題点ｔ−解決する九めの手段
本発明者らは、トリプトファンシンセターゼ（Ｌ −ｔ
ｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５ｙｎｔｈｅｔａｓａ （４，２
，１，２０）。
ｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５ｙｎｔｈｅｔａｓａ （４，２
，１，２０）。
以下ｒＴｓＪと記す）をコードする遺伝子がコリネ型細
菌内で増殖し得るシラスミドベクターに接続されている
組換えＤＮＡ ’ｔ”有するコリネ゛型細菌を育成する
ことに成功し、かつこのようなコリネ型細菌を用いてｔ
炭水化物、アンスラニル酸又はインドールよ、！ｌ）Ｉ
、−）リプドアアンを効率よく生産するプロセスを開発
することに成功した。
菌内で増殖し得るシラスミドベクターに接続されている
組換えＤＮＡ ’ｔ”有するコリネ゛型細菌を育成する
ことに成功し、かつこのようなコリネ型細菌を用いてｔ
炭水化物、アンスラニル酸又はインドールよ、！ｌ）Ｉ
、−）リプドアアンを効率よく生産するプロセスを開発
することに成功した。
本発明でいうコリネ型細菌は、パーデース・マニュアル
・オツ・、デターミネイティブパクテリオロジ−ｇｓ版
５９９頁（１９７４）に記載されているところの好気性
、非抗酸性、グラム陽性桿菌である。その内特に以下に
例示するようなＬ−グルタミン酸を大１−ＩＣ生産する
ものが知られている。
・オツ・、デターミネイティブパクテリオロジ−ｇｓ版
５９９頁（１９７４）に記載されているところの好気性
、非抗酸性、グラム陽性桿菌である。その内特に以下に
例示するようなＬ−グルタミン酸を大１−ＩＣ生産する
ものが知られている。
これらの菌株はいずれも同−属に属するものと考えられ
る。
る。
ブレビバクテリウム・ｒイパリカタム ＡＴ
ＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・す、カロリティク
ム ＡＴＣＣ１４０６６フレヒハクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６Ｂブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９７”
Ｌ’ ｋ’バクテリウム・ロゼラム “ 、 、
ＡＴＣＣ１３８２５ブレヒハクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム
・テオダニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ，１３８
７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１５８０６コリネバクテリウム・カルナエ
ＡＴＣＣ３５９９］コリネバクテリウム・グルタミク
ム ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０コリネバクテ
リウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０コリ
ネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９
６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣ
Ｃ１５３５４コリネ型細菌には上記のようなグルタミン
酸生産性を有するものの＃ｌかにグルタミン酸生産性を
失った変異株及び他の変異株も含まれる。
ＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・す、カロリティク
ム ＡＴＣＣ１４０６６フレヒハクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６Ｂブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９７”
Ｌ’ ｋ’バクテリウム・ロゼラム “ 、 、
ＡＴＣＣ１３８２５ブレヒハクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム
・テオダニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ，１３８
７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣ
Ｃ１５８０６コリネバクテリウム・カルナエ
ＡＴＣＣ３５９９］コリネバクテリウム・グルタミク
ム ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０コリネバクテ
リウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０コリ
ネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９
６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣ
Ｃ１５３５４コリネ型細菌には上記のようなグルタミン
酸生産性を有するものの＃ｌかにグルタミン酸生産性を
失った変異株及び他の変異株も含まれる。
ＴＳ遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のＴＳ遺伝
子を有して込る菌株よシまず染色体遺伝子を抽出しく例
えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、ＭｉｕｒａＢｉｏｃ
ｈｅｍ＊ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２．６］９
． （１９６３）に記載されている方法が使用できる）
、これを適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型
細菌で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得らｔ
Ｌｆｃ組換えＤＮＡ ｉ用いてコリネ型細菌のＴＳ欠損
変異株を形質転換せしめ、ＴＳ生成活性全保有するにい
たった菌株を単離し、これよりＴＳ遺伝子を分離できる
。
子を有して込る菌株よシまず染色体遺伝子を抽出しく例
えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、ＭｉｕｒａＢｉｏｃ
ｈｅｍ＊ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２．６］９
． （１９６３）に記載されている方法が使用できる）
、これを適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型
細菌で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得らｔ
Ｌｆｃ組換えＤＮＡ ｉ用いてコリネ型細菌のＴＳ欠損
変異株を形質転換せしめ、ＴＳ生成活性全保有するにい
たった菌株を単離し、これよりＴＳ遺伝子を分離できる
。
染色体遺伝子を切断する比めに、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
本発明にて使用されるコリネ型細菌内で増殖し得るグラ
スミドベクターは、コリネ型細菌細胞内において増殖し
得るものであればどのようなものでも良い。具体的に例
示すれば以下のものがある。
スミドベクターは、コリネ型細菌細胞内において増殖し
得るものであればどのようなものでも良い。具体的に例
示すれば以下のものがある。
（１） ｐ−ＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９
参照（２） ｐＡＭ １５１９特開昭５８−７７８９５
参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９
００参照（４）ｐＡＪ ６１１ 同
上（５）ｐＡＪ １８４４ 同
上（６）ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００
参照（７） ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７
参照（８） ｐｃａ ４ 特開昭５７−１８３７９
９参照（９）ｐＣＧ １１ 同 上
これらはいずれも当然使用可能であろう。
参照（２） ｐＡＭ １５１９特開昭５８−７７８９５
参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９
００参照（４）ｐＡＪ ６１１ 同
上（５）ｐＡＪ １８４４ 同
上（６）ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００
参照（７） ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７
参照（８） ｐｃａ ４ 特開昭５７−１８３７９
９参照（９）ｐＣＧ １１ 同 上
これらはいずれも当然使用可能であろう。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝千金切断し几際に用いら
れた制限酵ＸＫよシ切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダ−９，７反応に付される。
れた制限酵ＸＫよシ切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダ−９，７反応に付される。
このようＫして得られた、染色体ＤＮＡとベクタープラ
スミドとの組換えＤＮＡ ｔ−コリネ型細菌に属する受
容菌へ導入するＫは、エシェリヒア・コリに−１２につ
いて報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
スミドとの組換えＤＮＡ ｔ−コリネ型細菌に属する受
容菌へ導入するＫは、エシェリヒア・コリに−１２につ
いて報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
Ｍ、 ａｎｄ Ｈｌｇａ、 Ａ、、 Ｊ、 Ｍｏ１．、
Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９（１９７０） 受容菌
細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す
方法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されて
いる様に（Ｄｕｎｅａｎ、 Ｃ・Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、
Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、 Ｆ、 Ｅ、、
Ｇｅｎｅ、 ］。
Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９（１９７０） 受容菌
細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す
方法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されて
いる様に（Ｄｕｎｅａｎ、 Ｃ・Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、
Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、 Ｆ、 Ｅ、、
Ｇｅｎｅ、 ］。
１５３（１９７７） ）細胞がＤＮＡ ｌ取シ込み得る
様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）Ｋ導入
する方法によシ可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放線菌類および酵母について知られ ゛て
いる様に（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ、
Ｓ、 Ｎ、。
様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）Ｋ導入
する方法によシ可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放線菌類および酵母について知られ ゛て
いる様に（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ、
Ｓ、 Ｎ、。
Ｍｏ１ｅａ、 Ｇｅｎ、、 Ｇｅｎｅｔ、、 １６８．
１１１（１９７９）： Ｂｌｂｂ、 Ｍ。
１１１（１９７９）： Ｂｌｂｂ、 Ｍ。
Ｊ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｍ、 ａｎｄ
Ｈｏｏｗｏｏｄ、 ０． Ａ、、 Ｎａｔｕｒｅ
。
Ｈｏｏｗｏｏｄ、 ０． Ａ、、 Ｎａｔｕｒｅ
。
２７４、 ３９８（１９７８） ； Ｈｉｎｎｅｎ、
Ａ、、 Ｈｉｃｋｓ、 Ｊ、 Ｂ。
Ａ、、 Ｈｉｃｋｓ、 Ｊ、 Ｂ。
ａｎｄ Ｆｉｎｋ、Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｅ１．ＵＳＡ。
ｃａｄ、Ｓｅ１．ＵＳＡ。
７５１９２９（１９７８） ）、ＤＮＡ受容菌を、プラ
スミドＤＮＡを容易に取シ込むプロトプラストまたはス
フェロプラストにしてプラスミドｔ−ＤＮＡ受容菌に導
入することも可能である。
スミドＤＮＡを容易に取シ込むプロトプラストまたはス
フェロプラストにしてプラスミドｔ−ＤＮＡ受容菌に導
入することも可能である。
プロトグラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ｅとシ
込ませる方法も冠然利用できる。ポリエチレングリコー
ルまたはポリビニルアルコールのかわシに、カルゼキシ
メチルセルロース、デキストラン、フィコール、プルロ
ニ、りＦ１ａ（セルパ社）などの添加によってＤＮＡの
とシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ｅとシ
込ませる方法も冠然利用できる。ポリエチレングリコー
ルまたはポリビニルアルコールのかわシに、カルゼキシ
メチルセルロース、デキストラン、フィコール、プルロ
ニ、りＦ１ａ（セルパ社）などの添加によってＤＮＡの
とシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
形質転換の後、ＴＳ生産性を獲得し、ま友は、さらにプ
ラスミドベクターが有しでいるマーカーとしての性質を
発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。この
ような形質転換株は、ＴＳ遺伝子が組み込まれている組
換えＤＮＡ ｔ−有している。組換えＤＮＡを単離する
方法は、例えば菌体をリゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌
させ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを加え
てＤＮＡ ｉ沈澱回収する。
ラスミドベクターが有しでいるマーカーとしての性質を
発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。この
ような形質転換株は、ＴＳ遺伝子が組み込まれている組
換えＤＮＡ ｔ−有している。組換えＤＮＡを単離する
方法は、例えば菌体をリゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌
させ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを加え
てＤＮＡ ｉ沈澱回収する。
得られた組換えＤＮＡ ｔ−有するコリネ型組＠を用い
てＬ −） ＩＪグトファンを製造する方法は大別して
以下のものがある。しかしこれらを分けて説明したのは
、発明の理解をよシ容易にする几めであシ、厳密にいえ
ば、以下のいずれのケースに分類できるのか明確でない
こともあシうる。
てＬ −） ＩＪグトファンを製造する方法は大別して
以下のものがある。しかしこれらを分けて説明したのは
、発明の理解をよシ容易にする几めであシ、厳密にいえ
ば、以下のいずれのケースに分類できるのか明確でない
こともあシうる。
第一の方法は、炭水化物を原料としてＬ −） ＩＪブ
トファンｔ−製造する方法でちる。即ち、培地としては
、炭素源である炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素全含有
する通常のものである。炭水化物としては、グルコース
、シュクロース、フラクトース、ラクトース等及びこれ
らを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いら
れる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水
、アンモニウム塩その他が使用できる。
トファンｔ−製造する方法でちる。即ち、培地としては
、炭素源である炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素全含有
する通常のものである。炭水化物としては、グルコース
、シュクロース、フラクトース、ラクトース等及びこれ
らを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いら
れる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水
、アンモニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のめ及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ −） ＋７グト７アンの生産蓄摂が停
止するまで通常２日ないし４日間行なわれる。かくして
培地中に著量のＬ−）リプドアアンが生成、蓄積される
。
つ、実質的にＬ −） ＋７グト７アンの生産蓄摂が停
止するまで通常２日ないし４日間行なわれる。かくして
培地中に著量のＬ−）リプドアアンが生成、蓄積される
。
第二の方法は、第一の方法における培地に、又は培養の
間の培地に、インドール又はアンスラニル酸を添加する
ものである。この方法は組換えＤＮＡを有するコリネ型
細菌が増殖しうるような条件下でＬ −） ＩＪグト７
アンが生成される点で、第一の方法と共通しているが、
Ｌ−）リプドアアンの原料としてアンスラニル酸又はイ
ンドールが更に使用される点で第一の方法とは異なる。
間の培地に、インドール又はアンスラニル酸を添加する
ものである。この方法は組換えＤＮＡを有するコリネ型
細菌が増殖しうるような条件下でＬ −） ＩＪグト７
アンが生成される点で、第一の方法と共通しているが、
Ｌ−）リプドアアンの原料としてアンスラニル酸又はイ
ンドールが更に使用される点で第一の方法とは異なる。
アンスラニル酸又はインドールは培養開始時よ）培地に
添加しても良いが、培養の間、特にコリネ型細菌の増殖
を阻害しないようコリネ型細菌が充分増殖して後、培地
に添加しても良い。アンスラニル酸又はインドールの培
地への添加量は、コリネ型細菌の増殖を阻害する培地中
の濃度を超えないような量とすることが望ましく、その
ｋめ忙は、アンスラニル酸又はインドールの少量を連続
的に又は数回に分けて培地に添加してもよい。更に培地
には、後述のり、ｙ−ス供与体及びアラニン側鎖供与体
の１又は２以上を添加すれば、よシより結果が得られる
ことがある。
添加しても良いが、培養の間、特にコリネ型細菌の増殖
を阻害しないようコリネ型細菌が充分増殖して後、培地
に添加しても良い。アンスラニル酸又はインドールの培
地への添加量は、コリネ型細菌の増殖を阻害する培地中
の濃度を超えないような量とすることが望ましく、その
ｋめ忙は、アンスラニル酸又はインドールの少量を連続
的に又は数回に分けて培地に添加してもよい。更に培地
には、後述のり、ｙ−ス供与体及びアラニン側鎖供与体
の１又は２以上を添加すれば、よシより結果が得られる
ことがある。
コリネ型細菌の培養は、第一の方法と上記以外の点では
実質的に相違しない方法で行なわれる。
実質的に相違しない方法で行なわれる。
第三の方法と第二の方法は、アンスラニル酸とインドー
ルがＬ−トリプトファンの原料として使用される点で、
両者は良く低比方法であるが、コリネ型細菌の増殖が必
要でないような又はコリネ型細菌が増殖しない条件下で
Ｌ−）リプドアアンが生産される点で、第一の方法とは
異なっている。 ′即ち、第三の方法は、コリネ型細
菌の増殖とＬ−トリプトファンの生産が実質的に分けて
行なわれる点で第−及び第二の方法とは異なる。
ルがＬ−トリプトファンの原料として使用される点で、
両者は良く低比方法であるが、コリネ型細菌の増殖が必
要でないような又はコリネ型細菌が増殖しない条件下で
Ｌ−）リプドアアンが生産される点で、第一の方法とは
異なっている。 ′即ち、第三の方法は、コリネ型細
菌の増殖とＬ−トリプトファンの生産が実質的に分けて
行なわれる点で第−及び第二の方法とは異なる。
コリネ型細菌を増殖せしめる培地は、先に述べた炭素源
、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用でき
る。培地には、少量のアンスラニル酸又はインドールを
添加した方がよシム−トリプトファン生成活性の高い菌
体が得られる場合が多い。培養方法についても先に述べ
ｔような好気的条件下で行うとよい。
、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用でき
る。培地には、少量のアンスラニル酸又はインドールを
添加した方がよシム−トリプトファン生成活性の高い菌
体が得られる場合が多い。培養方法についても先に述べ
ｔような好気的条件下で行うとよい。
培養後、コリネ型細菌菌体を一旦分離する。菌体として
は培養液その＆までもよいが、濾過又は遠心分離等によ
シ培養液よシ分離され比もの、分離された菌体を水、ア
セトン、界面活性剤等で洗浄されたものも用いられる。
は培養液その＆までもよいが、濾過又は遠心分離等によ
シ培養液よシ分離され比もの、分離された菌体を水、ア
セトン、界面活性剤等で洗浄されたものも用いられる。
更Ｋ、上記の菌体を、固定化し九もの、破砕又は摩砕し
友もの又はこれよプ蛋白画分を適宜分離したもの、更に
は、分離されたＴＳ蛋白等の菌体処理物も使用できる。
友もの又はこれよプ蛋白画分を適宜分離したもの、更に
は、分離されたＴＳ蛋白等の菌体処理物も使用できる。
これらの菌体又は菌体処理物は、Ｌ−トリプトファンを
生成させるための水性媒体中にアンスラニル酸又はイン
ドールと共に添加される。菌体又は菌体処理物の使用量
は、菌体量に換算して０．５〜５．ｌｉ’／ｄ（乾物換
算）が良好である。菌体として培養液そのｆ、ｉｔ用い
るときは培養液又は培養液を水等で希釈したもの、一旦
分離された菌体又は菌体処理物を用いるときは燐駿パ、
ファーのようなバッファーでも良いが単に水であっても
良い。
生成させるための水性媒体中にアンスラニル酸又はイン
ドールと共に添加される。菌体又は菌体処理物の使用量
は、菌体量に換算して０．５〜５．ｌｉ’／ｄ（乾物換
算）が良好である。菌体として培養液そのｆ、ｉｔ用い
るときは培養液又は培養液を水等で希釈したもの、一旦
分離された菌体又は菌体処理物を用いるときは燐駿パ、
ファーのようなバッファーでも良いが単に水であっても
良い。
けん濁液には更に亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン
四酢酸、ピリドキサル燐酸あるいはアセトン、エタノー
ル等の有機溶媒、界面活性剤等を添加すれば、よシ好ま
しい結果が得られる場合が多い。また水性媒体にイノシ
ンを添加しておくと、難溶性のトリプトファン・イノシ
ン複合体を形成して、トリプトファンは反応液よシ除か
れるので、反応はＬ−トリプトファンの生成によ）向う
ことになる。
四酢酸、ピリドキサル燐酸あるいはアセトン、エタノー
ル等の有機溶媒、界面活性剤等を添加すれば、よシ好ま
しい結果が得られる場合が多い。また水性媒体にイノシ
ンを添加しておくと、難溶性のトリプトファン・イノシ
ン複合体を形成して、トリプトファンは反応液よシ除か
れるので、反応はＬ−トリプトファンの生成によ）向う
ことになる。
アンスラニル酸又はイ：／ドールの水性媒体中の好まし
い濃度は、アン曹うニル酸は０．１〜５９７ｄｌ 、イ
ンドールのとき０．１〜４．５，９／ｄである。
い濃度は、アン曹うニル酸は０．１〜５９７ｄｌ 、イ
ンドールのとき０．１〜４．５，９／ｄである。
原料としてア・ｆ）−一酸を使用するときは、水性媒体
には更に、リボース、５−ホスホリ＆ −ス、】−ホス
ホリデース又は５−ホスホリ？−スピロリン酸よシ選ば
れるリデース供与体が水性媒体に添加される。添加量は
、何れも０．１〜５．９／ｄｉ ７５ｆ良く、アンスラ
ニル酸が基質として高濃度に添加するときは、それに応
じてこれらの添加物濃度を高めることが望ましい。
には更に、リボース、５−ホスホリ＆ −ス、】−ホス
ホリデース又は５−ホスホリ？−スピロリン酸よシ選ば
れるリデース供与体が水性媒体に添加される。添加量は
、何れも０．１〜５．９／ｄｉ ７５ｆ良く、アンスラ
ニル酸が基質として高濃度に添加するときは、それに応
じてこれらの添加物濃度を高めることが望ましい。
原料としてインドールを使用するときは、アラニン側鎖
供与体又はピルビン酸とアンモニウムイオンが水性媒体
に添加される。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示さ
れるものである。
供与体又はピルビン酸とアンモニウムイオンが水性媒体
に添加される。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示さ
れるものである。
Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）Ｃｏ２Ｈ
（Ｘａヒドロキシル基、ハロダン、アルキルメルカプト
基、メルカプト基、アルコキシ基、ベンジルオキシ基、
又はチオベンジル基である）アラニン側鎖供与体及びピ
ルビン酸の添加量はそれぞれ０．１Ｍ〜１Ｍである。Ｌ
−トリプトファン生成反応は、アンモニウムのときは、
水性媒体を２５〜４５℃、１０〜４８時間振盪反応させ
るとよい＠又、インドールのときは、水性媒体を、２５
〜４５℃、５〜４８時間靜置又装ゆるやかに振盪反応さ
せるのがよい。
基、メルカプト基、アルコキシ基、ベンジルオキシ基、
又はチオベンジル基である）アラニン側鎖供与体及びピ
ルビン酸の添加量はそれぞれ０．１Ｍ〜１Ｍである。Ｌ
−トリプトファン生成反応は、アンモニウムのときは、
水性媒体を２５〜４５℃、１０〜４８時間振盪反応させ
るとよい＠又、インドールのときは、水性媒体を、２５
〜４５℃、５〜４８時間靜置又装ゆるやかに振盪反応さ
せるのがよい。
第一、第二又は第三の方法によシ得られ次項養液又は水
性媒体中に生成されたＬ−トリプトファンは通常の方法
で分離、採取できる。
性媒体中に生成されたＬ−トリプトファンは通常の方法
で分離、採取できる。
実施例】
（１）ＴＳの遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製Ｌ−）リ
グトファンによるフィードバック阻害耐性であるＴＳ遺
伝子金有するブレビバクテリウムＩラクト７アーメンタ
ムＡＪ］２０３０ ＦＥＲＭ−１３ｐ ２７６を】ｌの
ＣＭＧ培地（ペプトン］ ｉ／ｄｌ、酵母エキ、’１．
１，９／ｄｔ、グＡｔ コース０．５１ ／ ａ ｓ及
びＮａｃｔＯ，５７／＃ｔ−含み、ｐＨ７，２にｐｔ整
し友もの）釦植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行な
い、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム
・Ｓｎ２で溶菌させｔのち、通常のフェノール処理法に
よル、染色体ＤＮＡ ｔ−抽出精製し、最終的に３．５
ダのＤＮＡ ｔ−得九・ （２） ベクターＤＮＡ ｆ）調製 ベクターとしてＰＡＪ １８４４ （分子量５．４メガ
ダルトン）ｔ−用い、そのＤＮＡ ｔ−次の様にして調
製した。
グトファンによるフィードバック阻害耐性であるＴＳ遺
伝子金有するブレビバクテリウムＩラクト７アーメンタ
ムＡＪ］２０３０ ＦＥＲＭ−１３ｐ ２７６を】ｌの
ＣＭＧ培地（ペプトン］ ｉ／ｄｌ、酵母エキ、’１．
１，９／ｄｔ、グＡｔ コース０．５１ ／ ａ ｓ及
びＮａｃｔＯ，５７／＃ｔ−含み、ｐＨ７，２にｐｔ整
し友もの）釦植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行な
い、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム
・Ｓｎ２で溶菌させｔのち、通常のフェノール処理法に
よル、染色体ＤＮＡ ｔ−抽出精製し、最終的に３．５
ダのＤＮＡ ｔ−得九・ （２） ベクターＤＮＡ ｆ）調製 ベクターとしてＰＡＪ １８４４ （分子量５．４メガ
ダルトン）ｔ−用い、そのＤＮＡ ｔ−次の様にして調
製した。
ｔ ｆ ｐＡＪ ３８４４ ｔ’プラスミードして保有
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ
１２０３７（ＦＥＲＭ−Ｐγ２３４）を１００ＩＩＬｌ
のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培
養し友のち、リゾチームＳＯ８処理により溶菌させ、３
０，０００ｘｙ ３０分の超遠心によシ上清を得た。フ
ェノール処理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ
ｌ沈澱回収し比。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍ
Ｍ）リス塩酸塩、２０ｍＭ ＮａＣｊ 、 １ ｍＭ
ＥＤＴＡ （ｐ！（８，０）Ｋ溶解後、アガロースゲル
電気泳動Ｋかけ分離後、切シ出してｐＡＪ １８４４ア
ラニンドＤＮＡ約１２μｇを得た・ （３） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得几染色体ＤＮＡ２０μｙと（２）で得たアラニン）
’ ＤＮＡ ］ ＯμＩとを制限エンドヌクレアーゼ
ＰｓｔＩでそれぞれｔ−３７℃、１時間処理し、完全に
切断した。６５℃】０分の熱処理後、両反応液を混合し
、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下％ Ｔ４７アー
ジ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行り几。６５℃５分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮ
Ａ ｔ−沈澱採取し比。
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ
１２０３７（ＦＥＲＭ−Ｐγ２３４）を１００ＩＩＬｌ
のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培
養し友のち、リゾチームＳＯ８処理により溶菌させ、３
０，０００ｘｙ ３０分の超遠心によシ上清を得た。フ
ェノール処理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ
ｌ沈澱回収し比。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍ
Ｍ）リス塩酸塩、２０ｍＭ ＮａＣｊ 、 １ ｍＭ
ＥＤＴＡ （ｐ！（８，０）Ｋ溶解後、アガロースゲル
電気泳動Ｋかけ分離後、切シ出してｐＡＪ １８４４ア
ラニンドＤＮＡ約１２μｇを得た・ （３） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得几染色体ＤＮＡ２０μｙと（２）で得たアラニン）
’ ＤＮＡ ］ ＯμＩとを制限エンドヌクレアーゼ
ＰｓｔＩでそれぞれｔ−３７℃、１時間処理し、完全に
切断した。６５℃】０分の熱処理後、両反応液を混合し
、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下％ Ｔ４７アー
ジ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行り几。６５℃５分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮ
Ａ ｔ−沈澱採取し比。
（４）ＴＳ遺伝子のクローニング
ＴＳのαサブ二二、ト（以下ＴＳＡと略す）の遺伝子が
欠損したブレビバクテリウム・ラクト７アーメンタムＮ
ｏ２１株を受容菌として用いた。
欠損したブレビバクテリウム・ラクト７アーメンタムＮ
ｏ２１株を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーシ、ン法を用いた。まず１菌株を５ｄのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧ
ｉ ０．６ユニツト／ｄ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離によシ菌株を集め、菌体ｔ−０，５Ｍ
’ｙ、−クロース、２０ ｍＭ−ｅレイン酸、２０ｆ
ｎＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイプロス（Ｄ
ｌｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（声６．５）Ｑ、５
ｍｌで洗浄した。次いで１０１１９／Ｉｄのリゾチー
ムを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロト
プラスト化を図り友。６０００ ）５１．１０分間遠心
分離後、プロトプラス） ｔ−ＳＭＶＰで洗浄し０．５
ｄのＳＭＶＰ Ｉｃ再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトゲラストと（３）で調製し７ｔＤＮＡ］ＯＡｇ
ｔ”５ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が３０％ｌＣなる様に添加した後、Ｄ
ＮＡ’ｔプロトプラストに取シ込ませる為に室温に２分
間７ｉ［シた。このプロトプラスト’６８ＭＩＩＩＩＰ
培地］ｄで洗浄後、ＳＭＶＰ培地３ ｍｌに再懸濁し、
形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養液′
ｆｒｐＨ７，０のゾロドプラスト再生培地上に塗布し友
。プロトフラスト再生培地は蒸留水１１あ７１）リス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ｇ、ｖ、ｃｔ Ｏ
，５１゜グルコース】Ｏｇ、ＭｇＣｌ２”６Ｈ２０８，
１１１％ＣａＣｌ２−２Ｈ２０２，２Ｉｉ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カブミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）
１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０，２ｇ、コハク酸ナトリウム１３
５Ｊ’ｓ寒天８ｇ及びクロラムフェニコール３μｍ１／
ＩＩＬｌｔ−含む。
ーメーシ、ン法を用いた。まず１菌株を５ｄのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧ
ｉ ０．６ユニツト／ｄ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離によシ菌株を集め、菌体ｔ−０，５Ｍ
’ｙ、−クロース、２０ ｍＭ−ｅレイン酸、２０ｆ
ｎＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイプロス（Ｄ
ｌｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（声６．５）Ｑ、５
ｍｌで洗浄した。次いで１０１１９／Ｉｄのリゾチー
ムを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロト
プラスト化を図り友。６０００ ）５１．１０分間遠心
分離後、プロトプラス） ｔ−ＳＭＶＰで洗浄し０．５
ｄのＳＭＶＰ Ｉｃ再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトゲラストと（３）で調製し７ｔＤＮＡ］ＯＡｇ
ｔ”５ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が３０％ｌＣなる様に添加した後、Ｄ
ＮＡ’ｔプロトプラストに取シ込ませる為に室温に２分
間７ｉ［シた。このプロトプラスト’６８ＭＩＩＩＩＰ
培地］ｄで洗浄後、ＳＭＶＰ培地３ ｍｌに再懸濁し、
形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養液′
ｆｒｐＨ７，０のゾロドプラスト再生培地上に塗布し友
。プロトフラスト再生培地は蒸留水１１あ７１）リス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ｇ、ｖ、ｃｔ Ｏ
，５１゜グルコース】Ｏｇ、ＭｇＣｌ２”６Ｈ２０８，
１１１％ＣａＣｌ２−２Ｈ２０２，２Ｉｉ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カブミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）
１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０，２ｇ、コハク酸ナトリウム１３
５Ｊ’ｓ寒天８ｇ及びクロラムフェニコール３μｍ１／
ＩＩＬｌｔ−含む。
３０℃で２週間培養後、約１０，０００個のクロラムフ
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをスレ
オニン金倉まない培地（Ｔｈｒ欠培地）（グルコース２
％、硫酸アンモニウム１％、尿ＺＯ，２５％、シん酸二
水素カリウム０．１’ｌ硫酸マグネシウム７水塩０．０
４％、Ｆｅ２Ｏ２−７Ｈ２０１１１＋９／ｄｔ。
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをスレ
オニン金倉まない培地（Ｔｈｒ欠培地）（グルコース２
％、硫酸アンモニウム１％、尿ＺＯ，２５％、シん酸二
水素カリウム０．１’ｌ硫酸マグネシウム７水塩０．０
４％、Ｆｅ２Ｏ２−７Ｈ２０１１１＋９／ｄｔ。
Ｍｎ５Ｏ４・４Ｈ２０］ ”４７／ｄｔｓサイアミン塩
酸塩２００μ９／ｌ 、ビオチン５０μｉ／１１％ｐＨ
７，０、寒天１．８１）ＩＣレプリカし、クロラムフェ
ニコール耐性であってかつトリプトファン要求性が消失
した菌株３株を得た・ （５）形質転換株のプラスミド解析 これらの株より（２）で述べ友方法によシ、溶菌液を調
製し、アがロースグル電気泳動法によシ、グラスミドＤ
ＮＡ ’に検出したところ、ベクターのｐＡＪ１８４４
よシも大きなグラスミドを有する形質転換株１株を
得、本株保有の組換えプラスミド上にＴＳＡ遺伝子が存
在することを確認し友。木様をＡＪ １２］４０ （Ｆ
ＥＲＭ −Ｐ ７７４り）、木組換えプラスミドをｐＡ
Ｊ３１９と命名し友。
酸塩２００μ９／ｌ 、ビオチン５０μｉ／１１％ｐＨ
７，０、寒天１．８１）ＩＣレプリカし、クロラムフェ
ニコール耐性であってかつトリプトファン要求性が消失
した菌株３株を得た・ （５）形質転換株のプラスミド解析 これらの株より（２）で述べ友方法によシ、溶菌液を調
製し、アがロースグル電気泳動法によシ、グラスミドＤ
ＮＡ ’に検出したところ、ベクターのｐＡＪ１８４４
よシも大きなグラスミドを有する形質転換株１株を
得、本株保有の組換えプラスミド上にＴＳＡ遺伝子が存
在することを確認し友。木様をＡＪ １２］４０ （Ｆ
ＥＲＭ −Ｐ ７７４り）、木組換えプラスミドをｐＡ
Ｊ３１９と命名し友。
またｐＡＪ ３１９ ｔ−Ｔ Ｓのβサブユニット（以
下ＴＳＢと略す）欠損のＢ−５株に導入すると上述と同
様に、トリプトファン要求性が消失することより、ｐＡ
Ｊ１８４４のＰｓｔ ｌサイトに挿入された３、０Ｋｂ
７ラグメント上１１Ｃｔｒｐ Ａ及びｔｒｐ Ｂ遺伝子
が存在することが判明し九〇 （６） 形質転換株のＴＳ活性 被検様をＬ −） Ｉ７プトフアン生産培地（＝後述）
２０ ｍｌで培養した菌体よシ、超音波処理により、溶
菌液全調製し、これを３２，０００Ｘ９３０分遠心分離
してよ清を得た。この上清を粗酵素液として用い、］Ｏ
ＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）、０．４ｍＭイ
ンドール、３０ ｍＭ Ｌ−セリン、４０μＭピリドキ
サールー５′−リン酸、１８０ｍＭ食塩から成る酵素反
応液（総量１−）を用い、 ＴＳＢ活性を測定した。反
応は３０℃、３０分で１ Ｎ ＮａＯＨＯ，ｌ ｍｌ添
加し、残存インドールをトルエン抽出後インドール試薬
で発色後分光光度計で測定した。−（５４０ｎｍ）結果
を第１表に示す。
下ＴＳＢと略す）欠損のＢ−５株に導入すると上述と同
様に、トリプトファン要求性が消失することより、ｐＡ
Ｊ１８４４のＰｓｔ ｌサイトに挿入された３、０Ｋｂ
７ラグメント上１１Ｃｔｒｐ Ａ及びｔｒｐ Ｂ遺伝子
が存在することが判明し九〇 （６） 形質転換株のＴＳ活性 被検様をＬ −） Ｉ７プトフアン生産培地（＝後述）
２０ ｍｌで培養した菌体よシ、超音波処理により、溶
菌液全調製し、これを３２，０００Ｘ９３０分遠心分離
してよ清を得た。この上清を粗酵素液として用い、］Ｏ
ＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）、０．４ｍＭイ
ンドール、３０ ｍＭ Ｌ−セリン、４０μＭピリドキ
サールー５′−リン酸、１８０ｍＭ食塩から成る酵素反
応液（総量１−）を用い、 ＴＳＢ活性を測定した。反
応は３０℃、３０分で１ Ｎ ＮａＯＨＯ，ｌ ｍｌ添
加し、残存インドールをトルエン抽出後インドール試薬
で発色後分光光度計で測定した。−（５４０ｎｍ）結果
を第１表に示す。
形質転換株ＡＪ１２１３９株では野生株（ＡＪ １２０
３６ ）のｉｌ１倍の増大が観察され、２０ｍＭ Ｌ
−）リプトファン存在下でも阻害を受けにくくなってい
ることを確認した。
３６ ）のｉｌ１倍の増大が観察され、２０ｍＭ Ｌ
−）リプトファン存在下でも阻害を受けにくくなってい
ることを確認した。
第１表
ＯｍＭ ２０ ｍＭ
（７）形質転換株のＬ −ト１７プトフアン生産能上記
のＡＪ １２１３９株よシｐＡＴ ３１９を（２）の方
法で抽出し、（４）に記載したトランスホーメーション
法により、ＡＪ１２０３６株より５−フルオロトリプト
ファン耐性株として肪導し几、Ｌ−）リデトファン生産
株Ｍ−２７４株に導入し、クロラムフェニコール耐性を
指標に形質転換株を選択した。
のＡＪ １２１３９株よシｐＡＴ ３１９を（２）の方
法で抽出し、（４）に記載したトランスホーメーション
法により、ＡＪ１２０３６株より５−フルオロトリプト
ファン耐性株として肪導し几、Ｌ−）リデトファン生産
株Ｍ−２７４株に導入し、クロラムフェニコール耐性を
指標に形質転換株を選択した。
かくして得られｆｃＡＪ１２］４０及びＭ−２７４ｔ−
培養しＬ−トリプトファン生産能を調べたところ８ｇ２
表に示す結果を得几。培養はグルコース１３０ｇ 、
（ＮＨ４）２Ｓｏ４２５９ 、フマル酸１２ｇ、酢酸３
Ｊ 、 ＫＨ２ＰＯ４１９、ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０８ｍ
９、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０］、Ｌ ビオチン５０μｇ
１サイアミン塩酸塩２０００μｇ％Ｌ−チロシン６５０
ｒｎｇ、ＤＬ−メチオニンＶに分注したものに被検株を
植え３０’Ｃにて７２時間振盪下で行なった。培養後遠
心上清中のＬ−トリプトファンをマイクロパイオア、セ
イにょシ定量し之。結果を第２表に示す。
培養しＬ−トリプトファン生産能を調べたところ８ｇ２
表に示す結果を得几。培養はグルコース１３０ｇ 、
（ＮＨ４）２Ｓｏ４２５９ 、フマル酸１２ｇ、酢酸３
Ｊ 、 ＫＨ２ＰＯ４１９、ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０８ｍ
９、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０］、Ｌ ビオチン５０μｇ
１サイアミン塩酸塩２０００μｇ％Ｌ−チロシン６５０
ｒｎｇ、ＤＬ−メチオニンＶに分注したものに被検株を
植え３０’Ｃにて７２時間振盪下で行なった。培養後遠
心上清中のＬ−トリプトファンをマイクロパイオア、セ
イにょシ定量し之。結果を第２表に示す。
第 ２ 表
ＡＪ １２］４０ ５．０
Ｍ−２７４１・６
導入
ｐＡＪ ３］９ ｆラスミドを、実施例１と同様の方法
でコリネバクテリウム・グルタミヵムの野生株ＡＪ １
１５６０ （ＦＥＲＭ−Ｐ ５４８５ ） Ｋ導入し友
。クロラムフェニコール耐性で選択し形質転換株ＡＪ］
２１４１（ＦＥＲＭ −Ｐ ７７＋を？ ）を得た。本
枕がｐＡ、１Ｔ３１９を有していることをアがロース電
気泳動により確認した。
でコリネバクテリウム・グルタミヵムの野生株ＡＪ １
１５６０ （ＦＥＲＭ−Ｐ ５４８５ ） Ｋ導入し友
。クロラムフェニコール耐性で選択し形質転換株ＡＪ］
２１４１（ＦＥＲＭ −Ｐ ７７＋を？ ）を得た。本
枕がｐＡ、１Ｔ３１９を有していることをアがロース電
気泳動により確認した。
（２） 形質転換株のＬ −） リフトファン生産性
実施例１で行なった培養条件で本形質転換株ＡＪ］２１
４２ を培養した。結果を第３表に示す。尚培地として
は、グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４４０．９
、ＫＨ２ＰＯ４１、！ｉｒ、Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，
４Ｊ 、 Ｍｎ”２ｐｐｍ、ピオチン３００μＩ、サイ
アミン塩酸塩２００μｇ、カブミノ酸Ｉ１１味液１０１
１７、及びＣａＣＯ５５０、Ｓ’を水１１に溶かしｐＨ
７，２に調整したものを使用した。
実施例１で行なった培養条件で本形質転換株ＡＪ］２１
４２ を培養した。結果を第３表に示す。尚培地として
は、グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４４０．９
、ＫＨ２ＰＯ４１、！ｉｒ、Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，
４Ｊ 、 Ｍｎ”２ｐｐｍ、ピオチン３００μＩ、サイ
アミン塩酸塩２００μｇ、カブミノ酸Ｉ１１味液１０１
１７、及びＣａＣＯ５５０、Ｓ’を水１１に溶かしｐＨ
７，２に調整したものを使用した。
第 ３ 表
ＡＪ］２］４］ ０．２
ＡＪ］］５６０ ０
実施例３
実施例１及び２で各々得られたＡＪ１２１４０及びス
ＡＪ］２］４］株をアンーラニル酸あるいはインドール
を添加した培地で培養した結果を第４表に示す。
を添加した培地で培養した結果を第４表に示す。
ス
培養条件は実施列１の（７）と同様にした。アンーラニ
ル酸は培巷開始後４８時間目に０．５ ％添加した。
ル酸は培巷開始後４８時間目に０．５ ％添加した。
他方、インドールは４８〜７２時間のあいだに。
少量ずつフィードし、全量で０．５チ添加した。対照と
して実施列】及び２で使用し友原株Ｍ −２７４及びＡ
Ｊ］］５６０株を同様の条件で発酵を行なっ友。
して実施列】及び２で使用し友原株Ｍ −２７４及びＡ
Ｊ］］５６０株を同様の条件で発酵を行なっ友。
ス
また各々の株を用いて同条件でアンーラニル酸もインド
ールも添加せずに培養した結果も第４表に示し友。
ールも添加せずに培養した結果も第４表に示し友。
第４表
り一トリ１トファン蓄積：ｔｌｔ（ｇ／１Ｊ）ＡＪ］２
１４０ ６．３ ７．０
４．８Ｍ−２４７１，８２，０１，６ ＡＪ１２１４１ ０．４ ０．５
０．２ＡＪ］１５６０ ０．１
０．１ ０実施例４ 第５表に示す各菌株を各々５００Ｉｎｌ容肩付フラスコ
に注入したＣＭＧ培地５０ｍ１に１白金耳接種し、３０
℃にて２０時間培養した。但し形質転換株であるＡＪ１
２］４０及びＡＪ１２］４１株を培養する培地にはクロ
ラムフェニコール（１０μｍ１．／ｒＬｌ ） ｋ 添
加した。培養液１１’を遠心分離して菌体を集め、これ
を、アンスラニル＠２０，９，５−ホスホリゾシルピロ
ホス７エー） ２０．９を含有する０、１チーＮＨＣｔ
−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０）ＩＪに添加し、３７
℃にて２０時間振盪しながら反応させｆｃところ、反応
終了液中に第５表に示すよりなＬ −トリプトファンが
生成した＠ 第５表 ＡＪ１２１４０ ６．０ Ｍ−２４７３，０ ＡＪ１２１４］ １．５ ＡＪＩ ］ ５６０ ０．５ 実施ｆ！ＡＪ５ 第６表に示す各菌株を実施列４と同じ培養条件で培養し
た培養液１！Ｉを遠心分離して菌体を集めこれを第６表
の化合物にＮａｚＳＯｓ ０．１９ ／ｄｌ １ＥＤＴ
ＡＯ，３ｆｌ／ｄｉ、 ピリドキサルリン酸０．０１ｉ
／ｄｉ。
１４０ ６．３ ７．０
４．８Ｍ−２４７１，８２，０１，６ ＡＪ１２１４１ ０．４ ０．５
０．２ＡＪ］１５６０ ０．１
０．１ ０実施例４ 第５表に示す各菌株を各々５００Ｉｎｌ容肩付フラスコ
に注入したＣＭＧ培地５０ｍ１に１白金耳接種し、３０
℃にて２０時間培養した。但し形質転換株であるＡＪ１
２］４０及びＡＪ１２］４１株を培養する培地にはクロ
ラムフェニコール（１０μｍ１．／ｒＬｌ ） ｋ 添
加した。培養液１１’を遠心分離して菌体を集め、これ
を、アンスラニル＠２０，９，５−ホスホリゾシルピロ
ホス７エー） ２０．９を含有する０、１チーＮＨＣｔ
−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０）ＩＪに添加し、３７
℃にて２０時間振盪しながら反応させｆｃところ、反応
終了液中に第５表に示すよりなＬ −トリプトファンが
生成した＠ 第５表 ＡＪ１２１４０ ６．０ Ｍ−２４７３，０ ＡＪ１２１４］ １．５ ＡＪＩ ］ ５６０ ０．５ 実施ｆ！ＡＪ５ 第６表に示す各菌株を実施列４と同じ培養条件で培養し
た培養液１！Ｉを遠心分離して菌体を集めこれを第６表
の化合物にＮａｚＳＯｓ ０．１９ ／ｄｌ １ＥＤＴ
ＡＯ，３ｆｌ／ｄｉ、 ピリドキサルリン酸０．０１ｉ
／ｄｉ。
イノシン５．４ ！ｌ ／ ｃｒｔ （ｐＨａ、 ５
）の組成をもつ反応液１００ Ｍｌｌに懸濁し、３０℃
で４８時間反応を行なった。第６表に結果を示した。
）の組成をもつ反応液１００ Ｍｌｌに懸濁し、３０℃
で４８時間反応を行なった。第６表に結果を示した。
第 ６ 表
基 質 反応液中の濃度（Ｍ）尚、本
発明にベクターとして用いたプラスミドｐＡＪ］８４４
はエシェリヒア・コリＡＪ］１８８３に導入された形で
徹工研に寄託されておｐ （ＦＥＲＭ −Ｐ ６５］９
＝ ＦＥＲＭ−ＢＰ １３７ ”） ＡＪ １１８８３
株を対数増殖後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳ
ＤＳに溶固せしめ３０．０ＯＯＸ、’７で遠心分離して
得られた上７１″ｔにポリエチレングリコールを加え、
沈澱させたＤＮＡ、 ’Ｑ塩化セシウム・エチジウムプ
ロミド平衡密度勾配遠心で分画することによシ精製する
ことができる◎また、実施例】で用い７ｃＮｏ ２１株
はＡＪ１２１３９よ＃）Ｍ−２４７株はＡＪ］２］４０
よシ以下の手法で宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の
複合プラスミドを除去することによシ取得することがで
きる。プラスミドは宿主よシ自然に失なわれることもあ
るし、「除去」操作によって除くこともできる（ Ｂａ
ｃｔ。
発明にベクターとして用いたプラスミドｐＡＪ］８４４
はエシェリヒア・コリＡＪ］１８８３に導入された形で
徹工研に寄託されておｐ （ＦＥＲＭ −Ｐ ６５］９
＝ ＦＥＲＭ−ＢＰ １３７ ”） ＡＪ １１８８３
株を対数増殖後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳ
ＤＳに溶固せしめ３０．０ＯＯＸ、’７で遠心分離して
得られた上７１″ｔにポリエチレングリコールを加え、
沈澱させたＤＮＡ、 ’Ｑ塩化セシウム・エチジウムプ
ロミド平衡密度勾配遠心で分画することによシ精製する
ことができる◎また、実施例】で用い７ｃＮｏ ２１株
はＡＪ１２１３９よ＃）Ｍ−２４７株はＡＪ］２］４０
よシ以下の手法で宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の
複合プラスミドを除去することによシ取得することがで
きる。プラスミドは宿主よシ自然に失なわれることもあ
るし、「除去」操作によって除くこともできる（ Ｂａ
ｃｔ。
Ｒｅｖ、、 ３６． ｐ３６１−４０５（１９７２）
）。除去操作の一例は以下の通シである：宿主の生育を
不完全に阻害する濃度（２−５０μｉ／Ｒ１’）のアク
リジンオレンジを含む培地に、】ａ当）約１０４細胞程
度になる様に少量の菌株を接種し宿主凹の生育を不完全
に阻害してから２７−３５℃で一夜培養する（ Ｊ。
）。除去操作の一例は以下の通シである：宿主の生育を
不完全に阻害する濃度（２−５０μｉ／Ｒ１’）のアク
リジンオレンジを含む培地に、】ａ当）約１０４細胞程
度になる様に少量の菌株を接種し宿主凹の生育を不完全
に阻害してから２７−３５℃で一夜培養する（ Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、８８．２６１（１９６４） ）
。培養液ｙ＆：９Ａ天培地に塗布し、２７−４２℃で一
夜培養する。培地上に出現シたコロニーの内、クロラム
フェニコール耐性を失ったものかプラスミドが除去され
ているものである。
。培養液ｙ＆：９Ａ天培地に塗布し、２７−４２℃で一
夜培養する。培地上に出現シたコロニーの内、クロラム
フェニコール耐性を失ったものかプラスミドが除去され
ているものである。
ま之、Ｎｏ ２１株はＡＪ１２１３９よシ、Ｍ−２４７
株はＡＪ １２］４０よシ、以下の手法で取得すること
ができる。即ち寄託され几各形質転換株ｔ−１ＣＭＧ培
地プレートで数回植え継ぎ、コロニー分離し、各々のコ
ロニーをクロラムフェニコールｉｔ性試Ｍｔ調べる。得
られたクロラムフェニコール感受性株ｈ、（２）で述べ
た方法でグラスミドを調べ、プラスミドを有しないもの
がＮｏ ２１株又はＭ −２４７株である。
株はＡＪ １２］４０よシ、以下の手法で取得すること
ができる。即ち寄託され几各形質転換株ｔ−１ＣＭＧ培
地プレートで数回植え継ぎ、コロニー分離し、各々のコ
ロニーをクロラムフェニコールｉｔ性試Ｍｔ調べる。得
られたクロラムフェニコール感受性株ｈ、（２）で述べ
た方法でグラスミドを調べ、プラスミドを有しないもの
がＮｏ ２１株又はＭ −２４７株である。
Claims (2)
- （１）トリプトファンシンセターゼをコードする遺伝子
がコリネ型細菌内で増殖し得るプラスミドベクターに接
続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を培養
することを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法。 - （２）トリプトファンシンセターゼをコードする遺伝子
がコリネ型細菌内で増殖し得るプラスミドベクターに接
続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌の菌体
又はその処理物を水性媒体中でアンスラニル酸又はイン
ドールに接触せしめることを特徴とするＬ−トリプトフ
ァンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59161217A JPH06102029B2 (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
| DE8585109579T DE3585855D1 (de) | 1984-07-31 | 1985-07-30 | Verfahren zur herstellung von l-tryptophan. |
| EP85109579A EP0170257B1 (en) | 1984-07-31 | 1985-07-30 | Process for producing l-tryptophan |
| US07/760,930 US4885245A (en) | 1984-07-31 | 1985-07-31 | Process for producing L-tryptophan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59161217A JPH06102029B2 (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6140797A true JPS6140797A (ja) | 1986-02-27 |
| JPH06102029B2 JPH06102029B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=15730840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59161217A Expired - Fee Related JPH06102029B2 (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4885245A (ja) |
| EP (1) | EP0170257B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06102029B2 (ja) |
| DE (1) | DE3585855D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63295782A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-12-02 | タツタ電線株式会社 | 撚線検査装置 |
| WO1994015963A1 (en) * | 1993-01-13 | 1994-07-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel cell cortex protein |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0213378A (ja) * | 1988-06-30 | 1990-01-17 | Agency Of Ind Science & Technol | 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする高度好熱菌プラスミドベクター |
| US5185262A (en) * | 1988-07-27 | 1993-02-09 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | DNA fragment containing gene which encodes the function of stabilizing plasmid in host microorganism |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4818828B1 (ja) * | 1969-08-28 | 1973-06-08 | ||
| FR2484449A1 (fr) * | 1980-06-17 | 1981-12-18 | Asahi Chemical Ind | Procede de production de l-tryptophane ou ses derives en utilisant des micro-organismes, et cultures biologiquement pures d'aeromonas sp. ast 108-1, aeromonas sp. ast 111-4, klebsiella sp. ast 148-1 et klebsiella sp. ast 151-7 |
| JPS57134500A (en) * | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Plasmid pcg1 |
| JPS5889194A (ja) * | 1981-11-24 | 1983-05-27 | Ajinomoto Co Inc | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| EP0136359B1 (en) * | 1983-02-17 | 1991-04-03 | Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for preparing l-histidine |
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
-
1984
- 1984-07-31 JP JP59161217A patent/JPH06102029B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-07-30 EP EP85109579A patent/EP0170257B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-30 DE DE8585109579T patent/DE3585855D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-31 US US07/760,930 patent/US4885245A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63295782A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-12-02 | タツタ電線株式会社 | 撚線検査装置 |
| WO1994015963A1 (en) * | 1993-01-13 | 1994-07-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel cell cortex protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3585855D1 (de) | 1992-05-21 |
| EP0170257A2 (en) | 1986-02-05 |
| EP0170257A3 (en) | 1987-11-11 |
| EP0170257B1 (en) | 1992-04-15 |
| US4885245A (en) | 1989-12-05 |
| JPH06102029B2 (ja) | 1994-12-14 |
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