JPS6148519B2

JPS6148519B2 -

Info

Publication number: JPS6148519B2
Application number: JP53038766A
Authority: JP
Inventors: Aoi Kunishima; Mitsuo Nozaki; Hiroyuki Hayashi; Tetsuo Hiraoka; Junichi Nakazawa
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd; Sankyo Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd; Sankyo Co Ltd
Priority date: 1978-04-04
Filing date: 1978-04-04
Publication date: 1986-10-24
Also published as: JPS54141794A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＮ−アシルセフアマイシンＣ及びその
有機塩基塩の製造法に関し、より詳しくは粗セフ
アマイシンＣ、すなわち、７β−（5′−カルボキ
シ−5′−アミノバレルアミド）−７α−メトキシ
−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフエム
−４−カルボン酸をアシル化してＮ−アシルセフ
アマイシンＣに誘導したのち、マクロポーラス非
イオン性吸着樹脂で処理して、該樹脂にＮ−アシ
ルセフアマイシンＣを吸着させ、次いで溶出して
Ｎ−アシルセフアマイシンＣを採取し、必要に応
じてこれを有機塩基の塩とすることを特徴とする
Ｎ−アシルセフアマイシンＣ又はその有機塩基塩
の製造法に関するものである。

セフアマイシンＣは種々な微生物の発酵によつ
て生産される抗生物質で、各種の有用なセフアロ
スポリン誘導体の原料としても重要な物質であ
る。

従来、発酵液からセフアマイシンＣを抽出、精
製する種々な方法が知られているが、それらの
内、活性炭による吸着溶出法は工業的には、操作
上及び能率上に種々な難点があり経済的ではな
い。又、セフアロスポリンＣ及びセフアマイシン
Ａ及びＢなどにおいてはマクロポーラス非イオン
性吸着用樹脂に吸脱着させて抽出精製する方法が
知られているが（アメリカ特許第3725400号及び
特開昭46−3286参照）、セフアマイシンＣはその
ような樹脂に吸着させることはできない。又、セ
フアマイシンＣを含有する発酵液にアシル化剤を
作用させてセフアマイシンＣのアシル誘導体とな
し、これを例えば酢酸エチルなどの有機溶媒で抽
出したのち、さらに種々な方法で精製し、セフア
マイシンＣのアシル誘導体を採取する方法が知ら
れているが（特開昭49−30593参照）、このような
希薄で大量な水性溶液から有機溶媒で直接抽出す
る方法は比較的多量の有機溶媒の消耗を伴ない、
しかも発酵によつて副生する有機酸類やその他の
物質及び過剰なアシル化剤などを同時に抽出して
しまうので、精製度は高くなく、満足すべき方法
ではない。

そこで本発明者らは精製されたセフアマイシン
Ｃの新規な採取法について種々検討した結果、粗
セフアマイシンＣ好ましくはその水性溶液にアシ
ル化剤を作用させ、得られるＮ−アシルセフアマ
イシンＣの溶液をマクロポーラス非イオン性吸着
樹脂で処理すると、前記の如く、セフアマイシン
Ｃは該樹脂に吸着しないのに反し、Ｎ−アシルセ
フアマイシンＣは高密度に吸着され、かつ又、溶
離剤によつて容易に溶出され、極めて高い精製度
と収率でＮ−アシルセフアマイシンＣが得られる
ことを見出した。

本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。

本発明において原料として使用する粗セフアマ
イシンＣの水性溶液としては、セフアマイシンＣ
を含有する培養液でも、又は該培養液を活性
炭又は陰イオン交換樹脂などで処理して、セフア
マイシンＣをそれらに吸脱着するなど公知の方法
によつて一部精製濃縮された粗セフアマイシンＣ
の水性溶液でも、その他如何なるものでもよい。

本発明において使用するアシル化剤としては、
例えば脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、複
素環カルボン酸又はそれぞれのスルホン酸、炭酸
エステル、カルバミン酸又はそれらのチオ酸又は
上記のような酸の反応性誘導体など各種公知の化
合物があげられる。反応性誘導体としては酸クロ
リド、酸無水物、活性アミド、活性エステル、イ
ソシアネート、チオイソシアネートなどがある。

これらを使用して公知の方法でアシル化反応を
おこなえばよいが、その場合アミノ基に導入され
るアシル基としては、脂肪族カルボン酸、芳香族
カルボン酸、複素環カルボン酸又は、同様なスル
ホン酸、炭酸エステル、カルバミン酸又はこれ等
のチオ酸等からOHを除いた残基が含まれ、置換
分としてはハロゲン、ニトロ基、アルコキシ基、
アルキルチオ基、アリルオキシ基、アリル基、ア
ルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル
アミノ基、複素環式基等を有するか又は有しない
アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリ
ル等のアルカノイル基、シクロヘキサンカルボニ
ル等のシクロアルカンカルボニル基、ベルゾイ
ル、トルオイル等のアリロイル基、メトキシカル
ボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボ
ニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカル
ボニル、イソブトキシカルボニル等のアルコキシ
カルボニル基、フエニルオキシカルボニル等のア
リルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボ
ニル等のアラルキルオキシカルボニル基、種々の
複素環カルボニル基、アルキルカルバモイル基、
アリルカルバモイル基、アルキルアリルカルバモ
イル基又は同様なチオカルバモイル基などがあげ
られる。アシル化の反応は微酸性ないし弱アルカ
リ性の下でおこなうのがよく、従つて必要に応じ
て、粗セフアマイシンＣの水性溶液のPHをそのよ
うに修正しつつ反応をおこなうのがよい。

かくして得られたＮ−アシルセフアマイシンＣ
を含有する水性溶液は次にマクロポーラス非イオ
ン性吸着樹脂で処理されるが、当該樹脂として
は、スチレンとジビニルベンゼンとの重合体又は
アクリル酸エステルの重合体を母体とする物が望
ましく、前者の具体例としてはアンバーライト
XAD−１、同XAD−２、同XAD−４、同XAD−
５（登録商標、ローム・アンド・ハース社製）及
びダイヤイオンHP−10、同HP−20、同HP−
30、同HP−40、同HP−50（登録商標、三菱化成
株式会社製）等があげられ、後者の具体例として
は、アンバーライトXAD−７、同XAD−８（登
録商標、ローム・アンド・ハース社製）等があげ
られる。

粗Ｎ−アシルセフアマイシンＣを含有する溶液
をマクロポーラス非イオン性吸着用樹脂で処理す
るにはバツチ式でもカラム式でもよいが、一般に
カラム式の方が能率的である。すなわち予め塔に
充填した樹脂に、例えば含水アセトン、含水メタ
ノール、又はそれらに水酸化ナトリウムあるいは
塩酸もしくは硫酸を加えた溶液又は希塩酸、希硫
酸等を通過させて再生したのち、充分水洗してお
き、これに粗Ｎ−アシルセフアマイシンＣの溶液
のPHを7.0以下、好ましくは5.0以下に調節したも
のを、S.V.1〜５、好ましくは２〜３の流速で通
過させればよい。

このようにして樹脂に吸着させたＮ−アシルセ
フアマイシンＣは水洗後、含水メタノール、含水
アセトンのような含水溶媒を用いて溶離される。
溶離用の含水溶媒中のメタノールあるいはアセト
ンの好適な濃度は一般に40〜80％である。

又溶離剤の流下速度は普通S.V.0.5〜３が適当
である。

溶出液のＮ−アシルセフアマイシンＣを含有す
る部分を集め、これより種々な方法を用いてＮ−
アシルセフアマイシンＣを収得することができる
が、例えば上記のＮ−アシルセフアマイシンＣ含
有部分を減圧下に濃縮して有機溶媒を留去し、鉱
酸を加えてPHを1.5〜4.5に調整したのち、非親水
性の有機溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、
メチルイソブチルケトンなどで抽出し、抽出液を
濃縮することによつて収率よく純度の高いＮ−ア
シルセフアマイシンＣを採取することができる。

又Ｎ−アシルセフアマイシンＣはその有機塩基
の塩として採取することもできる。例えば前記の
酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケト
ンなどの抽出液に種々な有機塩基例えばジシクロ
ヘキシルアミン、トリアルキルアミン、キノリ
ン、Ｎ・Ｎ−ジアルキルベンジルアミン、ジフエ
ニルアミン、ベンジルアミン、tert−オクチルア
ミンなどを添加して、それぞれの塩を沈澱せし
め、それを分離することによつて、Ｎ−アシルセ
フアマイシンＣの純度を一層高めることができ、
しかも収率よく収得することができる。

以上のように本発明の方法によつて、純度の高
いＮ−アシルセフアマイシンＣ又はその有機塩基
塩が収率よく収得される。

本物質は種々なセフアマイシンＣ誘導体の原料
として有用である。

次に実施例によつて本発明をさらに具体的に説
明する。

実施例１セフアマイシンＣを含む培養液（セフアマイ
シンＣ・力価、3060μｇ/ml）800mlを陰イオン交
換樹脂IRA411（酢酸型）100mlを充填した塔に
通液してセフアマイシンＣを吸着させた。樹脂を
水で洗浄し、0.2規定のPH5.5酢酸緩衝液で溶離し
てセフアマイシンＣを含む溶出液1250ml（セフア
マイシンC10.3ｇを含む）を得た。この溶出液
250ml（セフアマイシンC2.06ｇを含む。）に２規
定の水酸化ナトリウム溶液を加えてPH8.5に調整
し、室温で撹拌しながらよく粉砕したパラニトロ
ベンゾイルクロリド2.12ｇを添加した。添加後、
２時間室温のまま撹拌した。この間２規定の水酸
化ナトリウム溶液を適時加えてPHを8.0〜8.5に保
持した。反応終了後、撹拌しながら６規定の硫酸
溶液を加えてPHを3.5に調整し、生じた沈澱を
去してＮ−パラニトロベンゾイルセフアマイシン
C2.75ｇを含む溶液310mlを得た。

この溶液を30mlのダイヤイオンHP−20を充
填した塔にS.V.2の流速で通液してＮ−パラニト
ロベンゾイルセフアマイシンＣを吸着させた。水
洗したのち60％メタノール水溶液をS.V.1の流速
で通液して溶離した。

Ｎ−パラニトロベンゾイルセフアマイシンＣを
含む溶出液を濃縮してメタノールを留去したの
ち、６規定の硫酸溶液を加えてPH2.0に調整し、
1/2容量の酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を
合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ムで脱水し、濃縮、乾燥してＮ−パラニトロベン
ゾイルセフアマイシンＣ、すなわち７β−（5′−
カルボキシ−5′−パラニトロベンゾイルアミノバ
レルアミド）−７α−メトキシ−３−カルバモイ
ルオキシメチル−３−セフエム−４−カルボン酸
2.20ｇを得た。高速液体クロマトグラフイー法に
よる純度は83％、収率は66.4％であつた。

本物質の重アセトン中のNMRスペクトルは次
のような特徴を示した。

1.70〜2.20（4H、多重線） 2.30〜2.80（2H、多重線） 3.50（3H、一重線） 3.50（2H、巾広い一重線） 4.87及び5.02（2H、AB−四重線Ｊ＝13H2） 5.13（1H、一重線） 6.06（2H、巾広い一重線） 7.85〜8.52（8H）実施例２実施例１で得たＮ−パラニトロベンゾイルセフ
アマイシンＣ（純度83％）1.88ｇを含む酢酸エチ
ル溶液20mlにジシクロヘキシルアミン650mgを撹
拌しながら加えると白色沈澱が生じた。

さらに30分間撹拌したのち沈澱を取し、酢酸
エチルで洗浄後、乾燥してＮ−パラニトロベンゾ
イルセフアマイシンＣのジシクロヘキシルアミン
塩、すなわち７β−（5′−カルボキシ−5′−パラ
ニトロベンゾイルアミノバレルアミド）−７α−
メトキシ−３−カルバモイルオキシメチル−３−
セフエム−４−カルボン酸のジシクロヘキシルア
ミン塩2.13ｇを得た。高速液体クロマトグラフイ
ー法による純度は90％で収率は95％であつた。

実施例３実施例１に記載した方法によつて得たイオン交
換樹脂アンバーライトIRA411の処理液180ml
（セフアマイシンC1.45ｇを含む）に２規定の水
酸化ナトリウム溶液を加えてPHを8.5に調整し、
室温で撹拌しながらパラクロルベンゾイルクロラ
イド1.89ｇを30分間で徐々に添加した。添加後、
２時間室温のまま撹拌しながら、２規定の水酸化
ナトリウム溶液を適時加えてPHを8.0〜8.5の間に
保持した。反応終了後、撹拌しながら６規定の硫
酸溶液を加えてPHを3.5に調整し、生じた沈澱を
去した。この液を30mlのダイヤイオンHP−
40を充填した塔にS.V.2の流速で通液してＮ−
パラクロルベンゾイルセフアマイシンＣを吸着さ
せた。

次いで樹脂を水洗し、70％メタノール水溶液を
S.V.1の流速で通して溶離を行なつた。Ｎ−パラ
クロルベンゾイルセフアマイシンＣを含む溶出液
を濃縮してメタノールを留去したのち、６規定の
硫酸溶液を加えてPH2.0に調整し、1/2容量の酢酸
エチルで抽出した。抽出液を合わせて飽和食塩水
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水したのち、
Ｎ・Ｎ−ジエチルベンジルアミン420mgを撹拌し
ながら加えると白色の沈澱が生じた。

さらに30分間撹拌したのち、沈澱を取し、酢
酸エチルで洗浄し、乾燥してＮ−パラクロルベン
ゾイルセフアマイシンＣのＮ・Ｎ−ジエチルベン
ジルアミン塩、すなわち７β−（5′−カルボキシ
−5′−パラクロルベンゾイルアミノバレルアミ
ド）−７α−メトキシ−３−カルバモイルオキシ
メチル−３−セフエム−４−カルボン酸のＮ・Ｎ
−ジエチルベンジルアミン塩1.69ｇを得た。高速
液体クロマトグラフイー法による純度は90％、収
率は62.2％であつた。

実施例４実施例１に記載した方法によつて得たイオン交
換樹脂アンバーライトIRA411の処理液280ml
（セフアマイシンC2.34ｇを含む）にアセトン400
mlを添加し、２規定の水酸化ナトリウム溶液を加
えてPHを8.5とした。１時間かけて3.45ｇのパラ
トルエンスルホニルクロライドを20mlのアセトン
に溶解した溶液を撹拌しながら添加した。添加
後、２時間室温のまま撹拌しながら２規定の水酸
化ナトリウム溶液を適時加えてPHを8.0〜8.5の間
に保持した。次ぎにPHを7.0とし、30℃で減圧下
にアセトンを蒸発させた。この溶液に６規定の硫
酸溶液を加えてPHを3.5に調整し、生じた沈澱を
去し、40mlのダイヤイオンHP−20を充填し
た塔にS.V.3の流速で通液してＮ−パラトルエン
スルホニルセフアマイシンＣを吸着させ、水洗
後、60％メタノール水溶液をS.V.1の流速で通し
て溶離を行なつた。Ｎ−パラトルエンスルホニル
セフアマイシンＣを含む溶出液からメタノールを
留去したのち、６規定の硫酸溶液を加えてPH2.0
に調整し、1/2容量の酢酸エチルで３回抽出し
た。抽出液を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで脱水したのち、キノリン530mg
を撹拌しながら加えると沈澱が生じた。沈澱を
取し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥してＮ−パラト
ルエンスルホニルセフアマイシンＣのキノリン
塩、すなわち７β−（5′−カルボキシ−5′−パラ
トルエンスルホニルアミノバレルアミド）−７α
−メトキシ−３−カルバモイルオキシメチル−３
−セフエム−４−カルボン酸のキノリン塩2.92ｇ
を得た。高速液体クロマトグラフイー法による純
度は87％、収率は66.1％であつた。

実施例５実施例１に記載した方法で得たイオン交換樹脂
アンバーライトIRA411の処理液290ml（セフア
マイシンC2.38ｇを含む）にアセトン100mlを添
加した。２規定の水酸化ナトリウム溶液を加えて
PHを8.5とし、１時間かけて1.41ｇのベンゾイル
クロライドを20mlのアセトンに溶解した溶液を撹
拌しながら添加した。

添加後、30分間室温のまま撹拌しながら２規定
の水酸化ナトリウム溶液を適時加えてPHを8.0〜
8.5の間に保持した。次ぎにPHを7.0とし、30℃で
減圧下にアセトンを留去し、６規定の硫酸溶液を
加えてPHを3.5にし、生じた沈澱を去し、30ml
のダイヤイオンHP−40を充填した塔にS.V.2の
流速で通液してＮ−ベンゾイルセフアマイシンＣ
を吸着させた。次いで樹脂を水洗し、70％メタノ
ール水溶液をS.V.1の流速で通して溶離を行な
い、Ｎ−ベンゾイルセフアマイシンＣを含む溶出
液からメタノールを留去したのち、６規定の硫酸
溶液を加えてPH2.0に調整し、1/2容量の酢酸エチ
ルで３回抽出した。抽出液を合わせて飽和食塩水
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水したのち、
tert−オクチルアミン540mgを撹拌しながら加え
ると沈澱が生じた。沈澱を取し、酢酸エチルで
洗浄、乾燥してＮ−ベンゾイルセフアマイシンＣ
のtert−オクチルアミン塩、すなわち７β−
（5′−カルボキシ−5′−ベンゾイルアミノバレル
アミド）−７α−メトキシ−３−カルバモイルオ
キシメチル−３−セフエム−４−カルボン酸の
tert−オクチルアミン塩2.67ｇを得た。高速液体
クロマトグラフイー法による純度は86％、収率は
63％であつた。

実施例６セフアマイシンＣの含量が４mg/mlである粗溶
液500mlに450mlのアセトンを加え、２規定の水酸
化ナトリウム溶液を加えてPHを8.5に調整し、液
温を５℃に保ち撹拌しながら、４ｇのイソブトキ
シカルボニルクロリドを含む50mlのアセトン溶液
を30分かけて滴下し、引き続き５℃において、２
規定水酸化ナトリウム溶液を加えてPHを8.0〜8.5
に調整しつつ１時間撹拌した。次ぎに６規定硫酸
でPHを7.0に修正したのち、減圧下に30℃でアセ
トンを留去し、得られた水溶液のPHを６規定硫酸
で3.5に修正し、生じた沈澱を去した。得られ
た水溶液を、40mlのダイヤイオンHP−20を充
填した塔にS.V.3の流速で通して、Ｎ−イソブト
キシセフアマイシンＣを吸着させ、水洗したの
ち、60％メタノール水溶液をS.V.1の流速で通し
て溶離を行つた。Ｎ−イソブトキシセフアマイシ
ンＣを含む溶出液を減圧下に蒸留して、メタノー
ルを除去したのち、６規定の硫酸でPHを2.0に修
正し、1/2容の酢酸エチルで３回抽出した。抽出
液を合わせて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで脱水し、減圧下に蒸留して濃縮液と
し、それに多量のイソプロピルエーテルを加え、
生じた沈澱を取し、乾燥してＮ−イソブトキシ
セフアマイシンＣ、すなわち７β−（5′−カルボ
キシ−5′−イソブトキシカルボニルアミノバレル
アミド）−７α−メトキシ−３−カルバモイルオ
キシメチル−３−セフエム−４−カルボン酸の粉
末1.53ｇを得た。

この粉末の重アセトン中におけるNMRスペク
トルは次ぎの通りであつた。

0.90ppm（6H、二重線、Ｊ＝7.0Hz） 2.20〜2.70ppm（2H、多重線） 3.50ppm（2H、巾広い一重線） 3.50ppm（3H、一重線） 3.83ppm（2H、二重線、Ｊ＝7.0Hz） 4.15〜4.40ppm（1H、多重線） 4.87及び5.03ppm（2H、AB−四重線、Ｊ＝13
Hz） 5.11ppm（1H、一重線） 6.06ppm（2H、巾広い一重線） 6.38ppm（1H、二重線、Ｊ＝８Hz） 8.26ppm（1H、巾広い一重線） 8.97ppm（2H、巾広い一重線）又赤外吸収スペクトル（ヌジヨール）は1770cm
^-1、1710cm^-1に吸収を示した。

実施例７実施例６のイソブトキシカルボニルクロリドの
代りにイソプロポキシカルボニルクロリドを使用
し、全く同様に操作して、Ｎ−イソプロポキシセ
フアマイシンＣすなわち７β−（5′−カルボキシ
−5′−イソプロポキシカルボニルアミノバレルア
ミド）−７α−メトキシ−３−カルバモイルオキ
シメチル−３−セフエム−４−カルボン酸の粉末
1.4ｇを得た。赤外吸収スペクトル（ヌジヨー
ル）は1770cm^-1、1715cm^-1に吸収を示した。

実施例８セフアマイシンＣの５mg/mlを含む溶液560mlに
アセトン500mlを加え、５℃に冷却した。次いで
この溶液に２規定水酸化ナトリウム溶液を加え
て、PHを8.0〜8.5に保ちながら、クロロ炭酸エチ
ル５ｇをアセトン50mlに溶解した溶液を滴下し
た。

滴下終了後、氷冷下にPHを8.0〜8.5に調整しな
がら２時間撹拌を続けた。

この反応液のPHを６規定硫酸で7.0に修正した
のち、減圧下、30℃でアセトンを留去して水溶液
とした。この水溶液のPHを６規定の硫酸で3.5に
修正し、生じた沈澱を過して除いたのち、70ml
のダイヤイオンHP−20を充填した塔に流速S.
V.2で通過させた。樹脂に吸着されたＮ−エトキ
シカルボニルセフアマイシンＣを60％メタノール
水溶液で、流速S.V.1で溶出した。次にＮ−エト
キシカルボニルセフアマイシンＣを含む溶出液を
減圧下に蒸留してメタノールを除去し、得られた
水溶液のPHを６規定硫酸で2.0に修正し、1/2容の
酢酸エチルで３回抽出した。抽出液を合わせ、飽
和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し
たのち、減圧下で蒸発乾固して、Ｎ−エトキシカ
ルボニルセフアマイシンＣ、すなわち７β−
（5′−カルボキシ−5′−エトキシカルボニルアミ
ノバレルアミド）−７α−メトキシ−３−カルバ
モイルオキシメチル−３−セフエム−４−カルボ
ン酸１ｇを得た。本物質の重ジメチルホルムアミ
ド中のNMRスペクトルは次のような特徴を示し
た。

1.20ppm（3H、三重線、Ｊ＝７Hz）１，28〜1.98ppm（2H、多重線） 2.08〜2.68ppm（2H、多重線） 3.48ppm（3H、一重線） 3.48ppm（2H、一重線） 4.08ppm（2H、四重線、Ｊ＝７Hz） 4.08〜4.43ppm（1H、多重線） 4.79及び4.97ppm（2H、AB−四重線、Ｊ＝13
Hz） 5.11ppm（1H、一重線） 6.54ppm（2H、巾広い一重線） 7.00ppm（1H、二重線、Ｊ＝７Hz） 7.48〜7.88ppm（巾広い一重線） 9.03ppm（1H、巾広い一重線）又赤外吸収スペクトル（ヌジヨール）は、1770
cm^-1、1715cm^-1に吸収を示した。

Claims

【特許請求の範囲】

１粗セフアマイシンＣをアシル化して、Ｎ−ア
シルセフアマイシンＣに誘導したのち、マクロポ
ーラス非イオン性吸着樹脂で処理して、該樹脂に
Ｎ−アシルセフアマイシンＣを吸着させ、次いで
溶出してＮ−アシルセフアマイシンＣを採取し、
必要に応じてこれを有機塩基の塩とすることを特
徴とするＮ−アシルセフアマイシンＣ又はその有
機塩基塩の製造法。