JPS6152679B2

JPS6152679B2 -

Info

Publication number: JPS6152679B2
Application number: JP7853583A
Authority: JP
Inventors: Sawao Murao; Eiko Matsumura; Takashi Shin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-05-04
Filing date: 1983-05-04
Publication date: 1986-11-14
Also published as: JPS59203493A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は公知のアミノアシラーゼとは明確に異
なる新規な酵素Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−ア
ルギニンアミドヒドロラーゼおよびその製造法に
関する。アミノアシラーゼはアミノ酸のα−アミノ基が
アシル化されたＮ〓−アシルアミノ酸の酸アミド
結合に作用しアミノ酸とアシル基に相当する脂肪
酸を生成する反応を触媒する酵素である。またヒ
プレートヒドロラーゼ、あるいはヒプリカーゼと
呼称される酵素はアミノアシラーゼの一種であ
り、ヒプリン酸、即ち安息香酸とグリシンが酸ア
ミド結合で脱水縮合した化合物に作用し、安息香
酸とグリシンを生成する反応を触媒する酵素であ
る。一般的に、これら酵素をＮ〓−アシル−DL−
アミノ酸混合物に作用させると選択的にＮ〓−ア
シル−Ｌ−アミノ酸を加水分解することができ
る。この原理に基づき、アシラーゼは光学純度の
高いＬ−アミノ酸の製造工程に実用化されてい
る。微生物により生産されるアミノアシラーゼは
既にいくつか発見され、また実用化されている
が、これら既知のアシラーゼとは異なる新規なア
ミノアシラーゼを提供することは、アミノ酸、ペ
プチド、医薬品原料、試薬等の製造において重要
な課題の一つであり、また酵素化学或いは分析化
学等の見地からも重要視される課題である。従来、Ｌ−アミノ酸のα−アミノ基がアシル化
されたＮ〓−アシルアミノ酸を加水分解する酵素
は哺乳動物の各組識、カビ、細菌、放線菌、各種
の植物種子などに存在することが知られており、
特に豚腎皮質由来のアミノアシラーゼ〔J.Biol.
Chem.，194，455（1952）〕は著名である。微生
物起源ではアスペルギルス（Aspergillus）また
はリゾプス（Rhizopus）属〔Bull.Agr.Chem.
Soc.Jpn.，21，291，296，300，304（1957）〕、コ
リネバクテリウム（Corynebacterium）属〔特公
昭49−13989〕、シユードモナス
（Pseudomonas）属〔特公昭56−43353号〕、ラク
トバシラス（Lactobacillus）属〔J.Biol.Chem.，
235，3193（1960）〕、ストレプトミセス
（Streptomyces）属〔特開昭53−59092〕等が知
られている。これら既知のアミノアシラーゼは
種々なアシルアミノ酸に分解作用を有するが、ア
ミノ酸のα−アミノ基がカルボベンゾキシ基で保
護された化合物、即ちＮ〓−カルボベンゾキシア
ミノ酸には全く作用しない。そこで本発明者は、かかる現況に鑑み、α−カ
ルボベンゾキシアミノ酸に作用する酵素の検索を
目的として広く微生物の培養物を検討した結果、
乳酸菌に属する細菌の培養物にＮ〓−カルボベン
ゾキシアミノ酸に作用する活性を発見した。この
活性因子につき鋭意研究を重ねた結果、従来に報
告例を見ない新規な酵素を見出し、Ｎ〓−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼ
と命名した。本発明はこの発見に基づいて完成さ
れたものである。本発明は、一般式：〔式中、Ｒはカルボベンゾキシ基またはベンゾ
イル基を表わす〕で示される化合物に作用し、ア
ルギニンを生成するＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ
−アルギニンアミドヒドロラーゼおよびその製法
に関する。本発明の新規な酵素であるＮ〓−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼはラク
トバシラス属に属する菌株から生産されることが
わかつた。菌株はＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニンアミドヒドロラーゼ生産能を有する細
菌であればいかなる菌株でもよく、またこれ等の
菌株の変種もしくは変異株でもよい。そしてラク
トバシラス属に属する上記菌株の具体例としてラ
クトバシラス・フアーメンテイ（Lactobacillus
fermenti）が挙げられる。なお本菌株はアメリカ
ン・タイプ・カルチユアー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託さ
れているものであり、ラクトバシラス・フアーメ
ンテイ（Lactobacillus fermenti）ATCC9338で
ある。本発明において、Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ
−アルギニンアミドヒドロラーゼ生産菌を使用し
酵素を製造するにあたつて用いられる培地は、通
常の乳酸菌の培養に用いられる培地が挙げられ
る。即ち、Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニ
ンアミドヒドロラーゼ生産菌が資化しうる炭素
源、窒素源および無機塩、更に必要ならば微量栄
養を含有するものであればよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクト
ース、ラクトース、シユークロース、デキストリ
ン、澱粉加水分解物、麦芽エキス、廃糖密等の炭
水化物、クエン酸、コハク酸、フマール酸、酢酸
等の有機酸類およびマンニトール、グリセリン等
のアルコール類が用いられる。培地の窒素源とし
ては資化しうる窒素化合物またはそれを含有する
ものであればよく、例えばポリペプトン、肉エキ
ス、大豆等の蛋白質の加水分解物、各種アミノ酸
類、アンモニウム塩、硝酸塩等が用いられる。そ
の他、無機塩としては、例えばマンガン、リン
酸、カリウム、マグネシウム等の無機塩類が適宜
用いられ、または有機微量栄養素としてアミノ
酸、ビタミン、プリン塩基およびこれらを含有す
るペプトン、酵母エキス等が適宜用いることがで
きる。菌の培養は静置培養で行なう。大量培養などの
工業的生産には撹拌深部培養が好適であるが、通
気撹拌培養、浸透培養等の好気的条件下に培養す
ることもできる。培養温度は30〜40℃、好ましく
は37℃付近であり、培地PHは８〜５、好ましくは
7.0付近である。培養時間は培養形態によつても
異なるが、通常９〜12時間である。本発明のＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギ
ニンアミドヒドロラーゼはＮ〓−カルボベンゾキ
シ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼ生産菌の
培養液中および菌体内に存在するが、その大部分
は菌体内中に存在する。培養時間を長くすること
により自己消化を引起しＮ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼを培養液中
に遊離させることもできる。本発明のＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギ
ニンアミドヒドロラーゼを培養物から抽出、精製
するには通常の酵素蛋白質抽出、精製法を適用す
ることができる。例えば、遠心分離法などの適当な操作により培
養物から菌体を集めた後、その菌体をガラスビー
ズなどの適当な摩耗剤とともに機械的に破砕する
方法、超音波照射によつて破砕する方法、フレン
チプレスを用いて破砕する方法、リゾチーム等の
溶菌酵素を用いる方法、またはオスモテイツクシ
ヨツクを起用する方法等により菌体を破砕する
か、または水あるいは生理食塩水もとくは緩衝液
中に菌体を懸濁し、トルエン等の存在下で放置も
しくは浸透して抽出した後、該溶液を遠心分離法
などの適当な操作により不溶物を除去し、これを
そのまま粗酵素液として得る。また通常の蛋白質
濃縮方法、例えば粗酵素液を凍結乾燥する方法、
あるいはエタノール、アセトン、イソプロパノー
ル等の有機溶媒を用いる分別沈澱による方法、も
しくは硫酸アンモニウム等の塩類を用いる塩析を
行なつた後限外濾過膜あるいは中空糸膜もしくは
コロジオン膜等を用いる透析操作を行なう方法、
等を適宜選択して実施することにより粗酵素粉末
を得ることができる。上記の粗酵素液もしくは粗酵素粉末より精製酵
素を分取するには、イオン交換、ゲル濾過、吸
着、電気泳動、アフイニテイクロマトグラフイー
等を適宜組合せて行なう。例えば、ジエチルアミノエチル−セフアデツク
スなどのイオン交換体を用いるイオン交換クロマ
トグラフイー法、アミノヘキシル−セフアロース
もしくはヒドロキシアパタイト等の吸着体を用い
る吸着クロマトグラフイー法、セフアデツクスあ
るいはセフアロースもしくはセフアクリルなどの
親水性担体を用いるゲル濾過法、ポリアクリルア
ミドゲルあるいはキヤリア−アンフオライトなど
を用いる電気泳動法、適当なリガンド化合物を化
学結合させた親水性担体を用いるアフイニテイー
クロマトグラフイー法、分子篩膜あるいは中空糸
膜等を用いる分子量分画法、等を適宜選択し、こ
れらの方法を組み合わせて行なうことにより、精
製された本酵素を得ることができる。本発明新規酵素の典型的な製法およびその採取
方法は、例えばラクトバシラス属のＮ〓−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼ
生産能を有する菌体、例えばラクトバシラス・フ
アーメンテイを培養し、培養菌株を集めて中性PH
の緩衝液中で破壊し、破壊抽出液を塩析し、沈澱
物を中性PHの緩衝液の溶解後、同緩衝液で透析す
ることによつて、該酵素抽出液を得る。この抽出
液は必要により以下の方法で精製してもよい。例
えば、上記抽出液をアニオン交換能を有するデキ
ストリンまたはセルロース誘導体等で充填したカ
ラムを用い、液体クロマトグラフイーにかけ、そ
の活性画分を採取する。さらに吸着クロマトグラ
フイーで処理し、その濃縮液を採取してもよい。
必要ならば上記濃縮液をアニオン交換液体クロマ
トグラフイーにかけ、その活性画分を適当な方
法、例えば適当な有機溶媒を用いて分別沈澱さ
せ、濃縮してもよい。さらに精製を要するとき
は、これをゲル濾過クロマトグラフイーで分別
し、活性画分を採取してもよい。上記の製法は最も好ましい方法であるが、本発
明方法はこれに限定されるものではなく、適当な
変更、例えば工程の一部を他の方法で代替する
か、工程の一部を省略してもよい。工程の代替、
付加および削除は、菌株の培養条件、種類、副生
成物、要請される純度等に応じて適宜選定すれば
よい。上記の方法で得られたＮ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼは下記に記
載される特徴を有し、微生物、哺乳動物の組識ま
たは植物種子から得られる公知のアミノアシラー
ゼとは明確に異なつた性質を有する。すなわち公
知のアミノアシラーゼはアミノ酸のα−アミノ基
がアシル化されたＮ〓−アシルアミノ酸に作用
し、そのアシル基に相当する脂肪酸とアミノ酸を
精製する反応を触媒するが、アミノ酸のα−アミ
ノ基がカルボベンゾキシ基で保護されたＮ〓−カ
ルボベンゾキシアミノ酸類には全く作用しない。
これに反して、本発明のＮ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼはＮ〓−ア
セチルアミノ酸にも作用するが、それと同時にＮ
〓−カルボベンゾキシアミノ酸に極めて高い分解
作用を示す。以上の知見より本発明のＮ〓−カル
ボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラー
ゼは公知のいずれのアミノアシラーゼとも明確に
区別される特徴を有し、新規な酵素と認められ
る。以下に本発明のＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニンアミドヒドロラーゼの理化学的性質を
記載する。 (1) 作用本発明の酵素Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニンアミドヒドロラーゼはＮ〓−カルボ
ベンゾキシ−Ｌ−アルギニン、Ｎ〓−ベンゾイ
ル−Ｌ−アルギニンあるいはＮ〓−アセチル−
Ｌ−アルギニンに作用し、アルギニンを生成す
る反応を触媒する。 (2) 基質特異性本発明の酵素はＬ−アルギニンのα−アミノ
基がカルボベンゾキシ基、核置換基を有するカ
ルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、またはアセ
チル基もしくはＮ〓−ベンゾイルグリシン残基
で保護された化合物に分解作用を示す。Ｄ−アルギニンのα−アミノ基がカルボベン
ゾキシ基、ベンゾイル基、またはアセチル基で
保護された化合物に全く分解作用を示さず、本
酵素は基質化合物中のアルギニン残基の光学対
掌性を認識し、その分解作用がＬ体化合物に特
異的であることを示す。Ｌ−アルギニンのα−アミノ基がカルボベン
ゾキシ基または核置換基を有するカルボベンゾ
キシ基で保護された化合物であり、そのアルギ
ニン残基のグアニジノ基〔−NH−Ｃ−NH₂
（＝NH）〕がニトロ基、トシル基等で保護され
た化合物、例えばＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｎ
〓−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｎ〓−カルボベ
ンゾキシ−Ｎ〓−トシル−Ｌ−アルギニンある
いはＮ〓−メトキシカルボベンゾキシ−Ｎ〓−
ニトロ−Ｌ−アルギニン等に全く分解作用を示
さず、本酵素の作用を受ける化合物としてその
グアニジノ基が遊離状態にあることが必要であ
る。Ｌ−アルギニンのα−アミノ基がベンゾイル
基で保護された化合物であり、そのアルギニン
残基のα−カルボキシル基がアミド化、エステ
ル化、またはアニリド化された化合物、例えば
Ｎ〓−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンアミド、Ｎ
〓−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステ
ル、Ｎ〓−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−
ニトロアニリド、またはＮ〓−ベンゾイル−Ｌ
−アルギニン−β−ナフチルアミド等に全く分
解作用を示さず、本酵素の作用を受ける化合物
としてそのＬ−アルギニン残基のα−カルボキ
シル基が遊離状態にあることが必要である。Ｌ−アルギニン以外の天然型アミノ酸のα
−、ε−、またはδ−アミノ基がカルボベンゾ
キシ基で保護された化合物には全く分解作用を
示さない。本酵素の種々な基質に対する活性を第１表に
示す。なお、第１表中の相対活性はＮ〓−カル
ボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンに対する分解活
性を100とした時の活性比で示したものであ
る。

【表】

【表】 (3) 力価の測定法酵素活性の測定法は以下に示すごとくであ
る。 0.02M CoCl₂0.05mlと酵素0.05mlに0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH6.5）を加え、全容を0.95mlと
する。これに0.01M Ｎ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニン0.05mlを加え、34℃で10〜30
分間反応せしめた後、生成したアルギニンをニ
ンヒドリン比色法〔E.W.Yemm＆E.C.Coking.
，Analyst.，80，209（1955）〕で定量した。上記反応系でアルギニン1mMを１時間で生
成する酵素活性を１単位（unit）とした。また
比活性は上記の方法により測定した酵素活性の
酵素蛋白１mg当りの酵素単位で表示した。なお
蛋白の定量は紫外部の吸光度を特定することに
よつて行なつた。 (4) 作用至適PHおよび作用適温の範囲第１図に示されるように作用至適PHの範囲は
6.0〜6.8にあり、作用最適PHは6.5である。第２図に示されるように作用適温の範囲は25
〜40℃であり、作用適温温度は34℃である。 (5) 安定PHおよび安定温度範囲安定PH範囲は5.5〜6.0にあり、第３図に示さ
れるようにPH6.0、４℃、20時間後の活性残存
率は100％である。安定温度範囲は20℃までであり、第４図に示
されるようにPH6.5、25℃、１時間後の活性残
存率は59％である。 (6) 酵素活性に及ぼす各種金属イオンの影響各種金属イオンを最終濃度が第２表に示す濃
度を与えるように酵素溶液に添加し、34℃、10
分間反応せしめた後、酵素活性を測定した結果
を第２表に示す。なお第２表中の相対活性はCoCl₂1mM存在下
での酵素活性を100とし、その活性比で示した
ものである。

【表】 (7) 酵素活性に及ぼす金属キレート化合物、SH
試薬、または蛋白修飾試薬の影響各種の金属キレート化合物、SH試薬、有機
水銀化合物、または蛋白修飾試薬を最終濃度が
第３表に示す濃度になるように酵素溶液
（1mM CoCl₂を含有）に添加し、34℃、10分間
反応せしめた後、残存酵素活性を測定した結果
を第３表に示す。なお第３表中の相対活性は上記の薬剤を添加
しないで測定した時の酵素活性を100とし、そ
の活性比で示したものである。

【表】 (8) 0.1M NaClを含有する0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.8）で平衡化したセフアロース6B（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製）を用いたゲ
ル濾過クロマトグラフイーにより分子量を測定
した。標準蛋白質としてはチログロブリン、カ
タラーゼ、アルドラーゼを用いた。その結果本
酵素の分子量は200000であることが解つた。 (9) 等電点ポリアクリルアミドゲル等電点分離法により
等電点を測定した。その結果、本酵素の等電点
は5.0であることが解つた。 (10) デイスク電気泳動ポリアクリルアミドを担体とし7.0％ゲル濃
度、PH8.0のトリス−バルビタール緩衝液を用
いデイスク電気泳動を行なつた。カラム１本あ
たり3mA電流を通じ４℃で１時間泳動を行な
つた後、クマシブリリアントブルーＲ−250で
染色した。その結果、マーカー（ブロムフエノ
ールブルー）に対する本酵素の比泳動距離
Rm_BPB＝0.43であつた。本発明の新規な酵素Ｎ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロセーゼは以上の
性質を有する酵素である。以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより制限されるものではな
い。実施例１水１につきDL−アラニン0.2ｇ、Ｚ−Ｌ−ア
ルギニン0.3ｇ、Ｌ−アスパラギン酸0.2ｇ、Ｌ−
システイン0.1ｇ、Ｌ−グルタミン酸0.5ｇ、グリ
シン0.1ｇ、Ｌ−ヒスチヂン塩酸塩0.1ｇ、DL−
イソロイシン0.2ｇ、DL−ロイシン0.2ｇ、Ｌ−
リジン塩酸塩0.2ｇ、DL−メチオニン0.2ｇ、DL
−フエニルアラニン0.2ｇ、Ｌ−プロリン0.1ｇ、
DL−セリン0.1ｇ、DL−スレオニン0.2ｇ、DL−
トリプトフアン0.1ｇ、Ｌ−チロシン0.1ｇ、DL
−バリン0.2ｇ、アデニン硫酸塩10mg、ウラシル
10mg、グアニン塩酸塩10mg、グルコース20ｇ、チ
アミン塩酸塩１mg、リポフラビン１mg、ピリドキ
シン１mg、ピリドキサール１mg、パントテン酸カ
ルシウム１mg、ニコチン酸１mg、ｐ−アミノ安息
香酸0.2mg、ビオチン0.01mg、葉酸0.01mg、酢酸ナ
トリウム20ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、K₂HPO₄0.5ｇ、塩
化アンモニウム３ｇ、MgSO₄・7H₂O0.2ｇ、
FeSO₄・7H₂O0.01ｇ、MnSO₄・4H₂O0.01ｇ、
NaCl0.01ｇを含有する培養基をPH6.8に調整後、
100ml容三角フラスコ10本にそれぞれ100mlずつ分
注し、120℃で10分間殺菌した。この殺菌培地に
ラクトバシラス・フエルメンテイATCC9338株の
穿刺培地より、それぞれ３白金耳を接種し、37
℃、24時間静置培養を行なつた。この前培養液200mlを前培養に用いた培地と全
く同条件の培地20の入つた30容ステンレス製
ジヤーフアーメンターに移し、37℃で毎分45回転
の撹拌で培養を行なつた。 10時間で本培養を終了し、培養液を遠心分離
し、菌体を集めた。同様に５度の培養を行ない計
100の培養液から湿重量で175ｇの菌体を得た。このようにして得られた菌体を0.01Mリン酸緩
衝液（PH6.8）約130mlに懸濁し、約1.5Kgの0.1mm
径ガラスビーズを添加した後、ビブローゲン・セ
ルミル（エドムント・ビユーラー社製）を用いて
15分間振盪破壊した後、さらに同じ緩衝液でガラ
スビーズを洗浄した後この洗液を合し、遠心分離
によつて不溶物を除去し、細胞抽出液2140mlを得
た。この酵素液のＮ〓−カルボベンゾキシアルギ
ニンの分解活性は19単位／mlであつた。実施例２実施例１で得られた粗酵素液2140mlに固形硫安
520ｇを氷冷下撹拌しながら少量ずつ添加し、40
％飽和とする。このものは氷室に１時間放置後、
生じた沈澱を遠心分離にて除去し、その上澄液に
更に固形硫安283ｇを氷冷下撹拌しながら少量ず
つ添加し60％飽和の塩析を行なつた。このものは
氷室に１夜放置後、生じた沈澱を遠心分離にて回
収した。得られた硫安沈澱物は0.01Mリン酸緩衝
液（PH6.8）に溶解し、同緩衝液に対して１夜透
析を行ない、312mlの酵素液を得た。この酵素液
の活性は163単位／mlであつた。また、蛋白濃度
は16.3mg／mlであつた。実施例３実施例２で得た酵素液312mlを予め3mM NaN₃
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化し
たDEAE−セフアデツクスＡ−50（フアルマシ
ア・フアインケミカルズ社製）にバツチ法で吸着
させた後、0.1M NaClを含む同緩衝液で十分に洗
浄した。その後、0.3M NaClを含む同緩衝液で酵
素活性画分を溶出し、6.5の酵素液を得た。この酵素液をメンブラン濃縮器（米国アミコン
社、PM−10）で限外濾過を行ない、407mlの酵素
溶液を得た。この溶液の活性は123単位／mlであ
つた。実施例４実施例３で得られた酵素液407mlを予め3mM
NaN₃を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡
化したDEAE−セフアロースCL−6B（フアルマ
シア・フアインケミカルズ社製）の5.5cm×42.5
cmのカラムに注ぎ、カラムを同緩衝液で十分に洗
浄した後、０〜0.8M NaClの直線グラジエント溶
出を行ない、Ｎ〓−カルボベンゾキシアルギニン
分解活性画分140mlを得、これをポリエチレング
リコールで濃縮して88.5mlの酵素液を得た。この
酵素液の活性は813単位／mlであつた。実施例５実施例４で得た酵素液88.5mlを予め3mMNaN₃
を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化し
た。DEAE−セフアデツクスＡ−50（フアルマシ
ア・フアインケミカルズ社製）の５cm×63.5cmの
カラムに注ぎ、カラムを同緩衝液で十分洗浄した
後、同緩衝液を用い０〜0.8M NaClの直線グラジ
エント溶出を行ない、Ｎ〓−ベンジルオキシアル
ギニン分解活性画分153mlを得、これをポリエチ
レングリコールで濃縮して38mlの酵素液を得た。
この酵素液の活性は1409単位／mlであつた。実施例６実施例５で得た酵素液38mlを予め3mM NaN₃
を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化し
たセフアデツクスＧ−150（フアルマシア・フア
インケミカルズ社製）の2.6cm×95cmのカラムに
注ぎ、同緩衝液で溶出を行なつた。Ｎ〓−ベンジ
ルオキシアルギニン分解活性画分75mlを得た。本
酵素液の活性は752単位／mlで、蛋白量は3.4mg／
mlであつた。上記精製工程における全活性、比活性、収率を
第４表に示す。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図はＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギ
ニンアミドヒドロラーゼの作用最適PHを示す図で
ある。第２図はＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−ア
ルギニンアミドヒドロラーゼの作用温度を示す図
である。第３図はＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−
アルギニンアミドヒドロラーゼの４℃におけるPH
安定性を示す図である。第４図はＮ〓−カルボベ
ンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼの
PH6.5における熱安定性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式：〔式中、Ｒはカルボベンゾキシ基、核置換基を
有するカルボベンゾキシ基、またはベンゾイル基
を表わす〕で示される、α−アミノ基が保護され
たＬ−アルギニンに作用し、アルギニンを生成す
る、以下の特性を有するＮ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼ：基質特異性：上記α−アミノ基が保護されたＬ−アルギニンに
特異的に作用し、同じ保護基で保護されたＤ−ア
ルギニンには作用しない。至適PH：6.0〜6.8 作用適温：25〜40℃ 分子量：約200000 等電点：5.0 活性化：Mn，Co，Cdイオンで活性化阻害：Fe，Cu，Hgで阻害される２ラクトバシラス属から得られる第１項記載の
Ｎ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミド
ヒドロラーゼ。３ DISC電気泳動がRm＝0.43である第１項記載
のＮ〓−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミ
ドヒドロラーゼ。４ラクトバシラス属に属し、一般式：〔式中、Ｒはカルボベンゾキシ基、核置換基を
有するカルボベンゾキシ基、またはベンゾイル基
を表わす〕で示される、α−アミノ基が保護され
たＬ−アルギニンに作用し、アルギニンを生成す
る、以下の特性を有するＮ〓−カルボベンゾキシ
−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラーゼ生産能を有
する菌株を培地に培養し、培養物より新規なＮ〓
−カルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒド
ロラーゼを採取することを特徴とするＮ〓−カル
ボベンゾキシ−Ｌ−アルギニンアミドヒドロラー
ゼの製法：基質特異性：上記α−アミノ基が保護されたＬ−アルギニン
に特異的に作用し、同じ保護基で保護されたＤ−
アルギニンには作用しない。至適PH：6.0〜6.8 作用適温：25〜40℃ 分子量：約200000 等電点：5.0 活性化：Mn，Co，Cdイオンで活性化阻害：Fe，Cu，Hgで阻害される５菌株がラクトバシラス・フアーメンテイであ
る第４項記載の製造法。６菌株を培養し、得られた菌体を中性PHの緩衝
液中で破壊し、破壊物の抽出液を塩析し、沈澱物
を中性PHの緩衝液に溶解後、同緩衝液で透析する
ことにより行う第４項記載の製法。７採取を、第６項記載の透析液をアニオン交換
液体クロマトグラフイーで処理し、その活性画分
を限外濾過し、その濃縮液を採取することにより
行う第４項記載の製法。８採取を、第７項記載の限外濾過濃縮液を吸着
クロマトグラフイーにかけ、その活性画分を所望
により濃縮することにより行う第４項記載の製
法。９採取を、第８項記載の活性画分またはその濃
縮液をアニオン交換液体クロマトグラフイーにか
け、その活性画分を所望により濃縮することによ
り行う第４項記載の製法。１０採取を、第９項記載の活性画分またはその
濃縮液をさらに、ゲル濾過クロマトグラフイーに
かける第９項記載の製法。