JPS6156093A - ヒト白血球インタ−フエロンα−２の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は微生物工業に関し、そして特に、抗ウィルス
活性を有しそして相当広範囲のウィルス性疾患の予防及
び治療のための医療的用途ををするヒト白血球インター
フェロンα−２の製造に関する。

〔従来の技術〕

インターフェロンは、ウィルス６Ｄに反応して特定のヒ
ト細胞により合成される蛋白質である。

生産細胞のタイプ、並びにインターフェロンの（１・１
造的及び機能的特徴に依存して、これらＧよ３種類の基
本的タイプ、すなわち白血球により産生されるαインタ
ーフェロン又は白血球インターフェロン、線維芽細胞に
より産生されるβインターフェロン又は線維芽細胞イン
ターフェロン、及びＴ−リンパ球により産生されるＴイ
ンターフェロン又は免疫インターフェロンに分類するこ
とができる。

これらのインターフェロンの抗ウィルス活性のほかに、
インターフェロンはまた抗増殖活性を特徴とし、そして
さらに免疫反応に影響を与える。

このため、幾つかの悪性新生物の治療のための潜在的に
効果的な手段としてインターフェロンヲ基礎にした薬剤
に注目することが可能である。今まで、ヒトインターフ
ェロンの非常に精製された調製物が製造されており、こ
れらは確かに１３〜１５個の密接に関連する蛋白群であ
り、それぞれが染色体９中のそれ自ＣＦの１１・１造追
伝子によりコードされている。しかしながら、供与体血
液からの白血球インターフェロンのｉｉ’ｔ　ｘｌｔは
、広範囲の臨床的用途のために十分な遣での製造をもた
らさない。なぜなら、血液β当りのインターフェロン含
量は一般に１０’　Ｉ’ｉｔ１以内であり、他方患者に
静脈注射するためのインターフェロンの単位有効投与量
は、試験的な臨床１ｄｌｉから１０ｂＡＵ以上であるか
らである。

技術の現状において、ヒト白血球インターフェロンの種
々のＦ！遣方法が知られており、これらの方法は、ベク
ター分子によりヒトインターフェロンの個々の遺伝子が
導入された微生物の種々の株を生産株として使用するこ
とに基ＫＥを置いている。

特に、生産株としてニジエリシア・コリ　（Ｅｓｃｂｅ
ｒ−ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、バシルス・ズブチ・リ
ス（Ｂａｃｉ　Ｉ　１ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、メチ
ロフィルス・メチロトロブス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ　ｍｅＬｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）等の細面株が使用
される（ヨーロッパ特許ＥＰ隘００６２９７１八２．１
９８２年公表１Ｉｎｔ、ＣＩ’、Ｃｌ２Ｎ　１５１００
を参照のこと）。

ヒト白血球インターフェロンの挿入された遺伝子を有す
るプラスミドを含有する微生物は、資化性炭素源及び窒
素源、無機塩並びに増殖因子を含有する栄養培地中で液
中好気的条件下で培養された場合にインターフェロンを
産生ずる。

ヒト白血球インターフェロンα−２の製造方法が知られ
ており（英国特許ぬ２，０７９．２９１Ａ、　１９８２
年公開、Ｃ１，Ｃｌ２Ｎ　１５１００）、この方法にお
いては、Ｅ。

コリのトリプトファンオペロンの制御頭載の制御のもと
にインターフェロンα−２の遺伝子が存在する組換プラ
スミドｐＬｅｌＦＡけｐ２，５の挿入により得られたＥ
、コリに一１２株２９４が使用される。

前記の株が、炭素源及び窒素源、無機塩並びに増殖促進
因子を含有する栄養培地中で、抗生物質の存在下で液中
条件下で培養される。

前記の生産菌のインターフェロン収量は培養液ｉ当り　
２．５　ｘｌＯ”　Ａ　Ｕテア４゜しかしながら、工業
的生産株としてのＥ、コリの使用は幾つかの欠点を有す
る。Ｅ、コリは従来病原性微生物であると考えられ、他
方この細菌の種々の株はヒトの腸菌叢中に永久的に存在
する。

このことは、Ｅ、コリにより製造される薬剤の精製並び
に蛋白質不純物及びエンドトキシンの完全分層１につい
て特に厳格な要求を課し、今度はこのことがインターフ
ェロンの製造を非常に高価なものとし、そして純最終生
成物の収量に悪い影響を与える。さらに、Ｅ、コリの今
まで知られている実験室株はすべてファージ溶解に対し
て感受性であり、Ｅ、コリに特異的な同定されたファー
ジの株は数百に及ぶ。

さらに、前記の方法においては培養物の生産性が比較的
低く、このため菌体からのインターフェロンの単離、及
びこれに続く、均一状態が得られるまでの精製は手数の
かかる方法である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明の第１の目的は、ヒト白血球インターフェロン
α−２の高い収量及びそのｊ：ｌＬＮのための単純化さ
れた方法を提供することである。

Ｃ問題点を解決するための手段〕 この発明の上記の目的は次の方法により達成される。す
なわち、ヒト白血球インターフェロンα−２の挿入され
た遺伝子を有するプラスミドを含有する生産株を、炭素
源及び窒素源、無機塩、並びに増殖促進物質を含有する
培地中で、抗生物質の存在下で液中培養し、次に目的生
成物をＪｔｌ離しそして精製することによりヒト白血球
インターフェロンα−２を製造する方法において、この
発明に従えば、生産菌としてプラスミドｐｖｃ３を担持
するシェードモナス（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ）ｓｐ
、ＶＧ−８４（ソ連邦抗生物質研究所（ＵＳＳＲＡｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ　ＲｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
）の微生物培養物収集所に登録番号ＮＱ　１７４２とし
て寄託されている〕を　使用し、この生産株を抗生物質
、すなわちストレプトマイシンもしくはテトラサイクリ
ン、又はこの両者の混合物の存在下で培養する。

テトラサイクリンは３０〜５０ｔａｇ／ｌの量で使用し
、そしてストレプトマイシンを５０〜１５０ａ＋ｇ／　
ｌの量で使用するのが好ましい。

この発明の方法は、シュードモナスｓｐ、ＶＧ−８４の
新規な高生産性味を使用するため、目的生成物の高収量
、及びその単離のための単純化された方法を達成するた
めに有用である。

〔操　作〕

この発明の方法に従えば、新規な菌株シェードモナスｓ
ｐ、ＶＧ−８４が使用され、この菌株においては、ヒト
白血球インターフェロンα−２の遺伝子が多コピープラ
スミドｐＶＧ３の部分として、バクテリオファージφＸ
１７４の遺伝子りの制ＪＢｗｉ域の制御のもとにクロー
ン化されている。

プラスミドｐＶＧ３は、広範囲の宿主の多コピーベクタ
ープラスミドｐＡＹＣ３４と、レプリコンｐＢＲ３２２
及びインターフェロンα−２の遺伝子を含存しそしてテ
トラサイクリン及びアンピシリンに対する細胞の耐性を
担当するプラスミドｐｌＦＮ−α２−Ｐ２との分子雑種
である。プラスミドｐｌＦＮ−α２−Ｐ２中のインター
フェロンα−２の遺伝子はバクテリオファージφＸ１７
４の遺伝子りの制ｍ％Ｘ域の制御のもとにある。９．４
ｋｂのベクタープラスミドｐＡＹＣ３４は不和合性基Ｉ
ｎｃ　Ｐ−４／Ｑに関連し、そしてストレプトマイシン
に対する細胞耐性を決定する。プラスミドｐＡＹＣ３４
及びｐｒＦＮ−α２−Ｐ２のＤＮＡをＰｓ　Ｌｌで処理
し、次に連結混合物を用いてＥ、コリＣ６００株のコン
ピテント細胞を形質転換した０次に形質転換体を、抗生
物質、）なわちアンピシリン（５０μ／１ｌｌ）、スト
レプトマイシン（１００μ／１ｌｌ）及びテトラサイク
リン（２５μ／ｌａｌ　）を含有する完全栄養培地上で
選択した。サイズ及び制限地図に関してプラスミドＲＡ
ＹＣ３４及びｐｌＦＮ−α２−Ｐ２のバイブリドに相当
するρＶＧ３と称するプラスミドＤＮＡが形質転換体ク
ローン中に見出された。プラスミドｐＶＧ３はｐＡＹＣ
３４と同様にストレプトマイシンに対する細胞耐性を決
定し、そしてｐｌＦＮ−α２−Ｐ２と同様にテトラサイ
クリン及びアンピシリンに対する細胞耐性を決定する。

プラスミドｐＶＧ３のサイズは１４．８ｋｂと同じであ
り、そしてプラスミドｐｌＦＮ−α２−　Ｐ　２　（５
，４ｋｂ）及び９＾ＹＣ３４（９，４ｋｂ）のヌクレオ
チドの合計を成す。

接合性（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ）広宿主域プラスミド
Ｒ７５１を、バイブリドプラスミドｐＶＧ３を含有する
Ｅ、コリＣ６００株の１つに挿入した。プラスミドｐＶ
Ｇ３がシュードモナス属の細菌又は幾つかの他のダラム
陰性細菌に移されたのは一連の接合性交差（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｉｖｅ　ｃｒｏｓｓ）を通してである。次に、ト
ランスコンシュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎＬ
）細菌を前記の抗生物質を含有する選択培地から取り出
し、そしてインターフェロンを合成する能力について試
験した。

次に、上記の方法により得られた培養物を、通気及び攪
拌のもとで、３０℃にてＬ−ブロス中で６〜１０時間、
２〜５×１０雫細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるまで培
養する０次に、細菌を遠心分離により集め、超音波によ
り破砕し、そして細胞抽出物中のインターフェロン含量
をラジオイムノアッセイにより決定した。エシェリヒア
（Ｅｎｏｈｅｒｉｃｈｉａ）　、サルモネラ（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ）　、シェードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏ
ｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏ−ｎ＋ｏｎａ
ｓ）　、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）　％及びリゾ
ビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　属に関するダラム陰性
細菌の合計１８株を試験した９ｇｋも高い生産性により
特徴的なのはシェードモナスｓｐ、ＶＧ−８４株であっ
た。す＼なわち、前記の条件下で、この株は培養液１１
当り５×１０９〜ｉ　ｘｉｏ”ａｕのインターフェロン
を生産することが見出された。

シュードモナスｓｐ、ＶＧ−８４株は、ソ連邦抗性物質
研究所（ＵＳＳＲＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｔｔｕｔｅ）の微生物収集所に登録番
号ｆｆ１１７４２のもとに寄託された。プラスミドｐＶ
Ｇ３を担持するシュードモナスｓｐ、　ＶＧ−８４株の
増殖及び形態学的特徴は次の通りである。

顕微鏡的形態：ｉｉＩ！動性グ動性グラム陰性桿菌−５
μｍ。

種々の培地中での形態： 牛肉エキス寒天＝２５℃〜３０℃で２４時間、培養した
後、直径３〜４ｍｍのラ フで不規則な縁を有し、ラ フな表面を有し薄縁色のコ ロニーを形成する。

牛肉エキス液体培地： 穿刺接種の後、培地（基質） の主として表面上で、中程 度の増殖を示す。通気しな ければ弱く増殖する。

グルコースを伴う最小栄養培地閂デ： 培養の２日目に直径２〜３ ｍ１ｔ＋の円形のラフな灰色のコ ロニーを形成する。

生理学的及び生化学的特徴： ｐ　Ｈ７，０において２５℃〜３５ ℃、最適には３０℃におい て増殖する。グルコース及 びアラビノースを資化する。

窒素＃：良く資化する。ア デニンを要求する。テトラ サイ゛クリン及びストレプト マイシンに耐性である。

この発明の方法は、次のようにして行われる。

シュードモナスｓｐ、ＶＧ−８４株を寒天を加えた栄養
培地中で２８℃〜３０°Ｃにて８〜１２時間培養し、次
にこれを液体栄養培地に再接種し、そして接種物十強力
な攪拌及び通気のもとて３〜６時間、２８℃にて培養す
る。発酵は、発酵装置において、この目的のために適当
でありそして炭素源及び窒素源、無機塩、並びに増殖因
子を含有する任意の液体栄養培地中で、例えばグルコー
ス、酵母エキスもしくは自己消化物、トリプトン、ペプ
トン、又はカゼインもしくは酵母の加水分解物、又はこ
れらの混合物を含有する栄養培地中で行う。発酵は、抗
生物質、すなわちストレプトマイシンもしくはテトラサ
イクリン、又はこの両者の混合物の存在下で行う、テト
ラサイクリンを３０〜５ｈｇ／ｊｌの量で使用し、そし
てストレプトマイシンを５０〜１５０ｍｇ／ｌの量で使
用するのが好ましい。発酵過程は６〜１０時間、２８℃
〜３２℃において、そして６．７〜７．１の範囲のｐＨ
値において、強力な攪拌のもとで行う０発酵中、細菌懸
澗液の光学濃度／ｌ５ｓｏを測定する。発酵過程の終り
までに光学濃度の値は５〜７光学光学色なる。

上記の培養条件のもとで、ラジオイムノアッセイにより
、又はヒト線維芽細胞培養に対する抗ウィルス活性の決
定により証明されるインターフェロンの収量は、培養液
１１当り５Ｘ１０’〜１．５×１０”ＡＵの範囲である
。

発酵過程が完了しそして前記の光学濃度が達成された後
、細菌細胞を遠心分離に、より集め、適当な緩衝液に再
懸湧し、そして超音波処理により、又は細胞の破砕もし
くは細胞膜の破壊をもたらす他の任意の技法、例えばリ
ゾチームによる処理、ガラス又は金属球を用いる破砕技
法、フレンチプレスの使用等により破砕する。次に、細
胞片を遠心分離し、次にインターフェロンを細胞抽出液
である上清百分から、蛋白質の百分及び精製のための常
法を用いて単離す、る。種々の物理化学的方法により示
される均一なインターフェロンの収率は２０〜６０％で
あり、精製比は２００〜５００倍であり、そしてこうし
て精製された最終生成物の比活性は４　ＸＩＯ”　Ａｌ
ｌである。精製の過程は、チャレンジウィルスとして水
庖性口内炎ウィルスを用いるヒト線維芽細胞培養物に対
する抗ウィルス活性の決定及びＲＩＡ又はＥＬＩＳＡに
より監視する。精製によって得られるインターフェロン
標品の純度は、免疫的方法、電へ泳動法、ゲル濾過法及
び沈降法により、並びに単離された最終生成物のアミノ
酸組成及びＮ−末端アミノ酸配列の決定により試験する
。こうして得られた、ヒト白血球インターフェロンα−
２の均一調製物は、このタイプのインターフェロンに特
異的な構造的及び機能的特徴のすべてを示す。

この発明の方法は、新規な高生産性株の使用により高レ
ベルの活性が達成される点において公知の方法に比べて
有利である。すなわち、少ない量の菌体から同し量のイ
ンターフェロンを得ることができ、このことが、菌体分
離及び破砕、並びに均一な生成物を製造するためのすべ
てのその後の操作のためのコストを低減するために寄与
する。

エドマン自動Ｎ−末端配列決定によれは、生産株シュー
ドモナスｓｐ、ＶＣ−８４の菌体から単離された均一な
インターフェロンはＮ−末端アミノ酸配列Ｃｙｓ−＾５
ｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｉｓ−Ｓｅ
ｒ−・＝を特徴とし、そしてＮ−末端メチオニン残基を
含有せず、従って、ヒト白血球から産生されるインター
フェロン−２と完全に同一である。

〔具体例〕

この発明の理解を助長するため、次に、ヒト白血球イン
ターフェロンα−２の製造方法の実際的な具体例を記載
する。

汎−上 シュードモナス５ｐＪＧ−８４株を２８°Ｃにて１２時
間、次の組成の固体寒天培地上で培養するニドリプトン
Ｌｏｇ／ｊ！、酵母エキス５ｇ／Ｉ！、アデニン８０＋
ｎｇ／ｊ！　、グルコース１０ｇ／（！、ストレプトマ
イシン１５０ｍｇ／ｌ　、テトラサイクリン５０繭ｇ／
ｌ、ＩＥにする蒸留水、寒天１５ｇ／ｌ。上記の寒天培
地上で培養した菌体を使用して接種物を調製する。

この目的のために細胞を、上記の培地（寒天不合）１０
０ｍｌを収容する７５０　ｍ　ｌのエルレンマイヤーフ
ラストに移し、そして激しい攪拌（２４０ｒｐｍ）のも
と２８℃にて６時間、振とう機上で培養する。接種培養
物の光学濃度を２光学単位にする。

培養工程を、温度、ｐＨ，ｍ、拌速度及び通気制御系、
並びに溶存酸素の分圧を測定するための圧力センサーを
装着した発酵装置中で行う、この目的のため、接種培養
物を５％の比率で、上記の組成（寒天不合）を存する栄
養基質を収容する発酵装置に入れ、そして２８±０．５
℃、６．７〜６．９のｐＨ値にて、強い通気及び攪拌の
もとて６時間増殖せしめる。培養物の増殖が溶存酸素の
濃度に限定されないように、この目的のため酵素の分圧
が５〜１０％飽和レベルに維持されるように通気及び攪
拌条件を選択する。ｐＨ値を安定化するためアンモニア
液を使用する。

菌体の増殖を培養液の光学濃度の測定により監視する。

光学濃度は１時間に１回の頻度で測定する。光学濃度Ａ
ｓｓ。が５光学単位に達するとすぐ発酵を停止する。

発酵工程の終了後、ヒト白血球インターフェロンα−２
の濃度は培養液１１当り１．５Ｘ１０１ｏ＾υに等しい
。こうして得られたインターフェロンの濃度を決定する
ため、抗−インターフェロンラビットポリクローナル抗
体及び＋２５１アイソトープによりラベルされたネズミ
モノクローナル　坑体を使用するＲＩＡの固相変法を使
用する。さらに、インターフェロンの抗ウィルス活性を
、ヒト２倍体綿維芽細胞の培養物上に生成した水底性口
内炎ウィルスの細胞変性作用に対する保護効果により決
定する。比較標品としてインターフェロン標準ＭＲＣＢ
６９／１９　（英国）を使用する。

発酵の後に遠心分離により集めた細胞をインターフェロ
ン源として使用する。この細胞を７．５０ｐＨ値を有す
る０、　１　ＩＩ　Ｔｒｉｓ−緩衝液中に懸濁しく５〜
１０ｍ１の緩衝液当り１ｇの細胞）、そして超音波破砕
層中で破砕する。細胞片を３ｏ、ｏｏ６ｘ　ｇでの遠心
分離により分離し、そして上清百分（細胞抽出物）から
均一なヒト白血球インターフェロンα−２を単離する。

これに続く精製の結果として電気泳動的に均一なヒト白
血球インターフェロンα−２を得る。精製比は２１０．
収率４１％（活性について）であり、そして比活性は４
．　ＯＸ　１０”　ＡＵである。添付した図面はヒト白
血球インターフェロンα−２の電気泳動分析のデータを
示し、この図においてＡは精製前のインターフェロン標
品について示し、Ｂは精製後のインターフェロン標品に
ついて示し、そして比較蛋白質の分子量をＫＤとして図
の右側に示す、電気泳動は１２．５％のポリアクリルア
ミドゲル中ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で行う、比
活性、分子ｉｆ　（１８，４ＫＤ）　、アミノ酸組成、
及び他のたヒト白血球α−２と異らない。

■−１ 例１に記載したのと同様の方法を行う、生産菌を、抗生
物質の存在下、すなわち５０ｗｇ／ｌのストレプトマイ
シン及び３０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンの存在下で増
殖せしめる。６時間の発酵経過の後、細菌懸濁液の光学
濃度は４．２光学車位に等しく、他方１１の培養液が７
．５　Ｘ　ｔｏ”　ＡＵのヒト白血球インターフェロン
α−２を含有する。

■−１ 例１と同様の方法を行う、生産株を、５０ｗｇ／ｊ！の
量の抗生物質テトラサイクリンの存在下・で増殖せしめ
る。

５．５時間の発酵経過の後、細菌懸濁液の光学濃度は５
．５光学Ａ１位に等しく、他方Ｈの培養液当りのインタ
ーフェロンの濃度は９．５　Ｘ　１０９　ＡＵである。

〔発明の効果〕

この発明の方法は、目的生成物の高収量及びその単離の
ための単純化された方法を達成するために有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製前（Ａ）及び精製後（Ｂ）のインターフェ
ロン調製物のゲル電気泳動図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト白血球インターフェロンα−２の製造方法であ
   って、ヒト白血球インターフェロンα−２の挿入された
   遺伝子を有するプラスミドｐＶＧ３を担持する生産株シ
   ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．〔ソ連
   邦抗生物質研究所（ＵＳＳＲ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
   　Ｒｅｓ−ｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の微生物
   培養物収集所に登録番号Ｎｏ．１７４２として寄託され
   ている〕を、炭素源及び窒素源、無機塩、並びに増殖促
   進物質を含有する栄養培地中で、通気しながら、抗生物
   質、例えばストレプトマイシンもしくはテトラサイクリ
   ン又はこの両者の混合物の存在下で液内培養し、次に目
   的生成物を単離および精製することを特徴とする方法。 ２、テトラサイクリンを３０〜５０ｍｇ／ｌの量で使用
   し、そしてストレプトマイシンを５０〜１５０ｍｇ／ｌ
   の量で使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。