JPS6156100A - ジペプチジルアミノペプチダ−ゼ２活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１北立札皿文１ 本発明は、ノベプチノルアミ７ベブチグーゼ■活性の測
定方法の改良に関する。

【＆二重」 ジペプチジルアミ７ベプチグーゼ■（以下、ＤＡＰ■と
略記する。）は、例えば癌の診断域は早期発見上有力な
酵素として知られている（ＭｃＤｏｎａｌｄ。

Ｊ　、に、、Ｒｅ１ｌｌｙ、Ｔ、Ｊ　、＋ＺｅｉＬ＋ａ
ａ＋ｔ、Ｆｉ、ＢａｎｄＥ　１ｌｉｓ、　Ｓ　：　Ｊ　
、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　、２４３．２０２８　
２０３７（１９６８））。

本発明者らは、一般式 （式中、Ｒ，、Ｒ，は水素原子又はアミ／保護基を表す
。）で示されるペプチド誘導体がＤＡＰＩＩの蛍光ｉ主
ｌｔ二およブ／またはその合成中間本となり、これを用
いることによつｒ：Ｊ朗にその酊索活・訃を測定し得ろ
ことを提案した。

しかしなから、実際に癌の診断等を行う場合、酵索月料
として血清などの粗酵素材料を用いざるを得ず、屡々測
定値にバラツキか生じ、その原因か粗酵素材料中に存在
するアミ／ベプチグーゼ（以下、ＡＰと略記する。）に
よる前記ペプチド誘導ＡＰ　　　　　　　　　　　　Ａ
Ｐ 体の分１％（Ｌｙｓ　　Ａｌａ−ＭＣＡ−＋Ａｌａ−Ｍ
ＣＡ−ＩＡ　Ｍ　Ｃ）にあることをつきとめた。

ｌ五二匙跋 本発明者らは上記知見に基づいて、鋭意検討した結果、
上記一般式で示されるペプチド誘導体と動物体白米のＤ
ＡＰ■含有試料とをＡＰの酵素活性阻音剤の存在下水性
溶液中にて接触せしめ、遊離生成する７−７ミ７−４−
メチルクマリンを定量することにより、ＡＰによる影響
を受けず、ＤＡＰ［活性のみを特異的に高感度て゛定量
、測定し得ることを見出し、本発明を完成するに至った
。

本発明で使用する上記一般式で示されるペプチド誘導体
は、酸付加塩の形でもよく、その」り合の酸は塩酸、硫
酸等の鉱酸、酢Ｎ江　トルエンスルホン酸等の有機酸か
採用て゛きる１、その遊離形を４ＨＨるには、上記酸付
加塩をアルカリで中和すればよ′７）。

このペプチド誘導体は、それを構成するリジンのアミノ
基が保護されているものを含み、Ｒ，、Ｒ２がアミ７基
の保護基である場合の保護基としては、カルボベンゾキ
シ基、　し−ブナルオキシ力ルボニル基、　Ｌ−アミル
オキシカルボニル込（、トリチル基、ｐ−ニトロカルボ
ベンゾキシ基、ホルミル９、トリフルオルアセチル基、
７タロイル基等ペプチド合成に慣用されているアミン保
護基や、ベンゾイル基、アセチル基、トシル基、サクシ
ニル基等を挙げることができる。これらの保護基による
保護方法あるいは保護基の脱離方法は、従来ペプチドの
合成の際に慣用されている手段を利用して行なうことが
できる。

このペプチド誘導体は、ペプチド合成に慣用されている
方法に従い、例えば７−７ラニルアミ／−４−メチルク
マリンとアミ７基を保護したリジン又はその活性エステ
ルとをＪ１１°ｉ介剤例えばジシクロへキシルカルボッ
イミドの存在で反応させ、所望に応じてその反応生成物
のアミ７基の保護基を脱離することによって容易に製造
することができる。

上記活性二人チルの形として、　ｐ−二トロ７工二ルエ
ステルやＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを好ま
しい例としてあげることができる。

溶媒を用いる場合は、例えばツメチルホルムアミｌ’（
ＤＭＦ）、水を用いるとよい。この反応は室温で進行す
るか、所望に応じて加熱し、反応を促進させることらで
きる。

反応混合物Ｊ、り上記ペプチド誘導体を単離するには、
例えは反１，１５混合物を儂ｌｆＩ咄乾固し、残溜物を
カラムクロマｌグラフィーによりｉｉ’ｉ製し、次いで
！乗率、−・２乞燥する。

分子を？＋Ｙ；成するリジン及び゛アラニンかそれぞ゛
れＬ一体または（）−１本のいずれか一方のちのである
目的化合物を′装造するには、目的化合物の製造に用い
る出発原料のリジン、アラニンまたはその透導本に光学
活性体を採用してもよいし、目的化合物のＤＬ一体を製
造してこれを光学分割に付してもよい。

このペプチド誘導体はＡＰの酵素阻害剤を存在せしめる
ことにＪ：すＤＡＰｎにより進退的に加水分解されるの
で、この酵素の蛍光性基質として好適である。

本発明において使用するＡＰの酵素訛害削としては、例
えばＮ−エチルマレイマイド、ｌ：’：　ｌ）　′ｊ”
　Ａ、ｏ７エナントロリン、ビューロマインン、パーク
ロロマーキュリ−安息香酸、ヨード酢酸等か挙げられる
が、ＤＡＰＩＩの選択特異性の点から０−７エナントロ
リンがより好ましい。

尚、上記ペプチド誘導体を基質として使用する場合、分
子を構成するアラニンは］０、一体が好ましく、他のア
ミノ酸が分子を（β１成する場合のそのアミノ酸はＬ一
体、Ｄ一体のいずれであってらよいが、特に両者共り一
体であるのが好ましい。

本発明によるＤＡＰｎの醇素活性測定は、次のようにし
て行う。

すなわち、人、う／ト、マウス等測ｑ勿由米のＤＡＰＩ
Ｉを含有する試料溶成と７−　Ｌ　−１ｊツルーＬ−ア
ラニル−メチルクマリンとをアミ／ペブチグーゼ（ＡＰ
）の阻害剤の存在下に接触せしめ、次いで′：ｆＬ離生
成する７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａ　Ｍ　Ｃ）
を定量することにより試料溶成中の酵素活性を測定する
ことができる。７−Ｌ−リジル−し−７ラニルー４−メ
チルクマリンは、試料溶成中にアミ／ベブチグーゼ（Ａ
　Ｐ　）が存在しても阻害剤の存在により分角イせず、
専らＤＡＰ［Ｉの作用によりＬ−リジル−し−アラニン
と７−アミノ−４−メチルクマリンとに定量的に分解遊
離し、Ｅｘ３８０旧＾、Ｅ　ｍ　４６　Ｏｎ＋ａの蛍光
下でその７−７ミ７−４−メチルクマリンの蛍光強度を
測定することにより高感度の酵素活性を測定できる。従
って、本発明方法により、癌の診断を極めて正確かつ簡
便に行うことができる。

本発明に使用するペプチド銹導体は、酵素活性測定用基
質として発癌性等の虞れがない安全な物質であり、また
基質として不可欠な各種条件即ち酵素作用をうけた基質
がの測定の容易さ、安定・１１゛、醇素量及び接触反応
時間に対する直線・ヰ等を全て満足するものであること
を確認し、医学上待に癌の診断において重要な意義を有
する酵素活性測定方法を提供することができる。

炙１圧 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

製造例 ｔ−２チルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン　１８．９
８を乾燥したテトラヒドロ７ラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ
にとかし、水冷攪拌下ジシクロへキシルカルボッイミド
１１．３ｇを乾’ＦＡＴ　ＨＦ　５０　＋ｎｌにとかし
少しずつ加えた。その後室温にて５０分攪拌し、不溶物
を濾去した。濾液に７−アミ／−４−メチルクマリン８
．７５ＥのＤＭＦ５０１ｎｌ溶戒を加え一夜攪拌を続け
た。

溶媒を薄力し、残さを酢酸エチルにとかし、１規定塩酸
、５％重重曹水氷水順に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾
燥した。酢酸エチルを薄力し、残さを酢酸エチルと１１
−ヘキサンより再結晶し、７−（Ｎ’−ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−し−アラニル）アミノ−４−メチルクマ
リン（Ｉ　）１２．８ｇ（７３，６％）を得た。このも
のは、融点１９３−１９４℃（分解）、比旋光度［α］
”−３８，１（ｃ＝１．０５．酢酸）Ｒｆ＝０．５０（
溶媒系；クロロホルム：メタ／−ル：酢酸＝　り　５　
：５　：３　）であった。

Ｌ−リジン塩酸塩９１Ｂ　（０，５モル）と１−ブチル
オキシカルボニル−アンド２１５ｇ（１，５モル）をジ
オキサン７５（ンＩｏｌと水２５０ｍ１にとかし、炭酸
ソーブ２１０８を加え３５〜４０°Ｃで二日開かきまぜ
た後、水７５（’１ｍｌを加え生じる油状物をエーテル
で抽出して除く。水層に１規定塩酸を加えｐＨ２とし酢
酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を水洗、乾燥後）貞
節し残溜物にジシクロヘキシルアミン６０ｇを酢酸エチ
ル３００ｍ１にとかして加え、これを振りまぜた後、酢
酸エチルを薄力する。

残溜物にｎ−ヘキサンを加え結晶化させ、酢酸エチルと
ｎ−ヘキサンより再結晶することにより融点１４１〜１
４１．５°Ｃ１比旋光度［αＨｚ＝３．１（ｃ＝４．０
６．メタノール）の　Ｎ　　、Ｎ　　−ノーし−プチル
オキシカルボニルーＬ−リノン・ジシクロヘキシルアミ
ン塩（Ｉｆ）１４９ｇ（５６，４％）を得た。

（Ｉｔ　）７９．２ｇ（０，１５モル）を酢酸エチルに
とかし、１規定硫酸と振りまぜ、ジシクロヘキシルアミ
ン硫酸塩を水層に除去した後、酢酸エチル層を水洗乾燥
した。続いて、ｌ〕−二トロフェノール２１ｇ（０，１
５モル）を加え、水冷しながらかきまぜ、ジシクロヘキ
シルカルボノイミド３２ｇ　（０゜１７モル）を加え、
室温にて一夜かきまぜた後、不溶物を濾去し、母液を１
農縮し、残雷物に酢酸エチル１００１１１１，１１−ヘ
キサン３００＋ｎｌを加え、可溶物を除き、残さをエチ
ルフルフール３０　（’）　＋ｎｌにとかし再結晶した
。その結果、融点１１９〜〕２〕°Ｃ１比旋光度［αＨ
”＝−２４，５（ｃ＝１．１．エチルアルコール）のＮ
　、Ｎ　−ノー１．−ブチルオキシカルボニル−Ｌ　−
１ｊノン−１〕−二トロフェニルニステル（ＩＩ）を招
な、。

（１）３．４６ｇ　（１０ミリモル）にトリフ０口酢酸
１５＋ｎｌを加え、室温にて１５分がきまぜた後、減圧
；′濃縮した残溜物にエチルエーテルを加え、白色粉末
とし、）ｋｋ別φν操し、７−（Ｎ″−Ｌ−アラニル）
アミ／−４−メチルクマリン・トリフロロ酢酸塩（ＩＶ
）を得た。このものはシリカゾル薄層クロマトグラフィ
ーにてＲ［＝０．０５（溶！ｉ！４系；クロロホルム：
／り７−ル：酢酸”９５：５：３）に単一・のスポット
を示した。

（ＩＶ）全量にＤＭＦ３０＋＋＋ｌを加えてとかし、ト
リエチルアミン１．５＋ｏｌを加えて中和した後、（［
［［）５．６Ｅを加え二日開室温で攪拌した。溶媒を薄
力し酢酸エチルにとがし、１０％炭酸ソーダ水、０゜５
規定塩酸、水て゛よく洗い、硫酸マグネシウムで乾燥し
た後、濃縮した残溜物にエチルエーテル１００１１１１
を加えてとがし、冷やして装置することにより逮古晶を
得た。’Ｊ’ｌ　’Ｗ（は２．２ｒ、て・、ｒ、Ｉｔ、
＋　点ｉ　７　り　’Ｃ（分解）を示す？　−（Ｎ　　
、Ｎ　　−）”−し−ブチルオキシカルボニル−し一す
ノルーｔ、−アラニル）アミ／−４−メチルクマリン（
Ｖ）を得た。このものはシリカゾル薄層クロマトグラフ
ィーてＲｆ＝０．５５（溶ＷＭ；クロロホルム：メタノ
ール：酢ｐ　＝　９５：５　：３　）に単一のスポ／ト
を示した。又、比旋光度［α］”＝−５９，１（ｃ＝（
Ｌ７７．Ｑｊａ）であツタ。

（Ｖ）１．０ｇに酢酸１０＋ｎｌとトルエンスルホン醍
−永和物１．０ｇを加え、室温にて９０分間かきまぜた
後、エチルエーテルを加え、白色粉末状沈シｑを得る。

このものを濾別し、酢酸エチルで洗浄することにより、
７−（Ｌ−リノルーし一アラニル）アミ／−４−メチル
クマリン・２トルエンスルホン酸塩（Ｖｌ）１．２９ｇ
を得た。このらのは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）にて１％以上の不純物は認められず、比に光度［
α］２ｏ””　　２８　、６（ｃ＝１．３４．５０％酢
酸）であった。

６規定塩酸中１１０℃、２４時間到゛管中で加水分解後
のアミノ酸分折代による含有組成の実測値はアラニン１
．００対リジン０．９９で理論イ直１対１とよく一致し
た。

元素分析 実測値　Ｃ＝５３．０９％劃＝側、１１％、Ｎ＝７，１
７％ＪＩｉｉＱ　イ１α　　Ｃ＝５３．００　％、１１
＝６．０６　％、Ｎ＝７．１７　％（理論イ直はＣ３：
＋１Ｉ（２Ｎ４０１゜Ｓ２・ｌＩ２０・　八ｃＯＨ）実
施例 Ｌｙｓ　　Ａｌａ−ＭＣＡ　　ＴｏｓｙｌａＬｅを水に
２ミリモル又はＱ、５　ミリモル濃度となるようにＢ　
Ｍし基質溶液とした。人血清より均一に精製したＤ　Ａ
　Ｐ■を酵素（皮として用い、これに７ミ／ベプチグー
ゼ（ＡＰ）の阻害剤としてｏ−７エナントロリンを１．
０ミリモル濃度となるように加乏て、表−１に示す繰作
を順次行なった（なお、本発明において使用さ）ｔだ１
１Ｆ索の調製はＫ　、　［’　ｕｋｎｓａｗａ　ｅｔ　
ａｌ、　：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　　ｅｔ　　　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ　　ＡｃＬａ　　（１９８３）　　　Ｂ
ＢＡ３１６０３記載の方法によっｔこ。）。

次いで、（１）蛍光法及び（２）高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）／蛍光法により生成した７−アミノ
−４−メチルクマリン（Ａ　Ｍ　Ｃ）の量を測定し、比
較した。なお、ＡＭＣの生成量は、３８　Ｏｎ　＋ｏ　
／４６０　ｎ　＋ｎにおける蛍ツＣ強度をそれぞれ測定
（Ｅｘ／Ｅｆｎ）し、次式により求められる。

（Ｅ　　　Ｃ）／　（Ｓ　−Ｂ　）Ｘｏ、３ｎ＋ｎｏｌ
但し、Ｅ；実験、Ｃ；コントロール、 Ｓ；スタンダード、 Ｂニブランクのときのそれそ汽の 蛍光強度である。

入−１ を又とイ灸１！（３−木　（ｐｌ＝５　、：ｌ）　　　
　　　　　　　４０　μ２２＋ＩＩＮ（ｏｒ８＋ｎＭ） Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　５４ＣＡ　　　　　２５μ！！（
０，５ｏｒ２．０＋ＪＩ）人血清　　　　　　　　　　
１０Ａｔ２３７°Ｃ１３０分間インキエベーション１、
−ンー１シー二＝＝ニーＡｌａＭＣノ＼→　ｌ、ｙ６　
　　Ａｌａ　＋　ノ＼　ＭＣく蛍范法ン　　　　＜）Ｉ
ＰＣＬ／蛍光法〉Ｅ　ｘ３８０ｎ＋ｎ／　Ｆ　Ｑ　　４
６０旧ｎ　　　　Ｅ　ｘ３８０＋ｕ＋＋／　Ｆ　１　４
８０ｎ＋ｎＡＭＣピーク カラム：　Ｍ　ａＨｎｕｓｐｌ＋ｅｒｅＣ−１８２５０
ｒｖ＋　Ｘ　４　、６＋ｎｍ１、Ｄ 溶媒：０．１Ｍクニン酸塩緩 ｆＪＮｆｌｐＨ４，２／　１５％メク ／−ル 木緩衝欣 ０．１Ｍ＠酸塩緩衝ｉ　　、Ｈ５，３又は広域緩衝液（
０，２Ｍホウ酸、０．０５Ｍクエン酸をリン酸ナトリウ
ムでｐＨ５、３に調整）以上の結果、通常の飲ソＣ法と
ＩＴ　ｐ　ｌ、Ｃ／蛍−゛芝居とて゛は、Ａ　Ｍ　Ｃの
蛍ヅＣ強ｊ支士なわもＡ＼ＩＣの（：：、・反量が異な
り、０−７エナントロリン１．０ミ・；モル、７度では
アミ／べブナダーゼ（ＡＰ）ｔこ、にるＬｙｓ−Ａｌａ
−ＭＣＡの分解を完全に阻害することかできず、またＨ
ＰＬＣと蛍光法のＳＩＬ合せによ’）　Ｄ　Ａ　Ｐ■の
蛍光基質であるＬｙｓ　　Ａｌａ　　ＭＣＡと、その分
解生成物であるＡｌｕ　　ＭＣＡ、ＡＭＣをか８％、定
量しうろことがわかる。

第１図及び第２図は、ぞ汽ぞ汽］’ｔ：’＋連液体クロ
マトグラフィ＝（ＨＰｌ、−（ｌによる゛７−アミ／−
４−メチルクマリン（Ａ　Ｍ　Ｃ）層成と蛍ノ′こ”ｒ
６＞　）支との［計上を示し、蛍光強度はＡ　Ｍ　Ｃの
濃度；二王比例し直線関係が得られる。従って、これら
の倹に１１．線を予成しておけば、試料溶液中のＤ　Ａ
　Ｐｕの酵素活性を定量することができる。表−２に二
のときのｆｌｉ’ｌ定条件を示す。

表−２測定条件 カラム　；　　Ｍ　ａｇｏｕｓｐｈｅｒｃ　　Ｃ−１８
（７μＩｌｌ）２５０ｍ＋ｎ　Ｘ　４．６ｍｍ　Ｉ　、
　Ｄ緩衝液：　　１０ｍＭリン酸カリウム１ｆｆｌ（ｐ
Ｈ３，０）流速　　：　　０，７Ｊ／　＋ｏｉｎ 保持時開；　　Ａ　Ｍ　Ｃ１９，５ｍ１ｎＡ　ｌａ　　
Ｍ　ＣＡ　　　　　６．０＋ｎ１ｎＬ　ｙｓ　　Ａ　ｌ
ａ−Ｍ　ＣＡ　　　４，２＋ｎｉｎ第；３しｌは）（Ｐ
ＬＣ／蛍尤法による０−７工ナントロリン濃度と、へＭ
Ｃビーク（％）との関係を示し、曲１腺Ａ、Ｂ、はそれ
ぞへ７−７ミノー１１−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７
−（Ｌ、−アラニル）アミノ−４−メチルクマリン（Ａ
　ｌｕ　−Ｍ　（’、　Ａ　）を示す。繰作条件は、０
−７工ナントロリン濃度を変えたほかは表−１と同４７
にである。

図から明らかなよ−）に、ｏ−７エナントロリン添ｊＪ
Ｉ已＾の増加と共に、Ａ　ｌ　ａ　　Ｍ　ＣＡの生成機
か］減少しく曲線Ｂ）、これに伴いＡ　Ｍ　Ｃピーク（
％）か減少し、一定となる（曲線Ａ）、このことは、曲
線Ａの０点付近すなわちアミ／ベブチグーゼ（ＡＰ）の
酵素阻害剤としての０　７エナントロリンが存在しない
とき又は低濃度のとき（よ、次式（＋）、（２）のよう
に ＡＰ　ｎ Ｌｙｓ−Δｌ　ａ　−Ｍ　ＣＡ　　　　　　　　　］７
ｙ　ｓ−へｌａ士ＡＭＣ（１）Ｐ Ｌｙｓ−へ１ａ−ＨＣ八　−一一一−−−→　１．ｖｚ
＋Δｌ　ａ　−？Ｉ　Ｃ、’＋ノ＼Ｐ −）　１．ｙｓ十八へ　上＋　ｒ＼ｉ（Ｃ（２）Ｌｙｓ
　　Ａｌａ−ＭＣＡのＤ　Ａ　ＰＩｆ及びＡＰによる分
解が併発していることを示す。一方、０−７工ナントロ
リン濃度が一定以上になると、その阻；１；：作用によ
りＡＰの酵素活性が失われ、（１）式の≦ｆ　ｌｊ、：
（反応のみが起こることを示している。

第４図（イ）、（ロ）はそれそ゛れラットの（仏１弔文
）刀と視床下部から均一に精製したＤＡしＩＩ含有試料
につき、０−７エナントロリン無添加および添加の場合
のＨＰ　１．０号４）ｉ結果を示す。図中、ＡはＡｌａ
−Ｎ４ｃＡ、Ｂｌｊ：１．、ｙｓ　　Ａｌａ　　ＭＣＡ
、ＣはＡ　Ｍ　Ｃを示す。その他の測定条件及び結果は
表−３に示す。

表−３ 実験動物　；　ウィスターラット（生後９週問）、雄、
１１＝５ ｏ−７工ナントロリン濃反　；　　１＋ｎＭ視床下部　
；　　Ｉ、Ｃ３±０．２６（ｎ＋ｎｏｌ／ｌ６ｉｎ／ｍ
Ｈ７白）１：ニー　１．１５±０．２５（ｎ＋ｎｏｌ　
　＋ｎｉｎ／ｍ□−”　白　）図から明らかなように（
イ）、（ロ）何れの場合ら○−７エナントロリンを添加
しｒこものでは、Ａ　Ｐによる分解生成物Ａ　ｌａ　−
Ｍ　ＣＡ　（Ａ　）のピークは完全に消失し、未反応の
Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡ（Ｂ）と分解生成したＡＭＣ（
Ｃ）のピークのみが表れる。

上記の結果から明らかなように、アミノペプチグーゼ（
Ａ　Ｐ　）の阻害剤を添加することにより、蛍光性基質
であるＬｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡのＡＰによる分解が完全
に抑制され、しがもこの基質は使用するＤ　Ａ　Ｐ　Ｈ
の量に比例してＡ　Ｍ　Ｃ・２勺えることかｒＸｃ認さ
れた。

従って、試料溶液に本基質を上、−己の方法に１１：１
璽−で作用させ生成するＡ　Ｍ　Ｃ量をａｌ：Ｉ　’ｉ
ビし、（：λ！（１関係と比較すれば、試料溶液中の目
的とする酵素量を正確に測定でき、前途のように柄バの
診断に役立つことがわかる。

人に、正常人と癌忠渚°について、血清中のｊ−ｙＳ−
Ａｌａ−ＭＣＡの加水分ｊ！、Ｔ活・ごＩ：、Ｑ　；ｌ
＜ぬた５結果を表−４に示した。

表−４ 正常人（血清）； Ｌｙｓ−Δｌａ−ＭＣ八　　酵素活性末０．５ｎ＋Ｍ　
　Ｏ，２２±０．０２ ２　、Ｏｎ＋８　　１．３５　±０．１０８、Ｏｎ＋８
　２．（５３±０．１９ 癌忠者； ＤＡＰ−１１＊　　　　　　　　　ＤＡｒ’−ＩＶ　　
木　　　ＤＡＰ　ＩＩ　／ＤＡＰ　ＩＶＬｙｓ　−Ａｌ
ａ　　　ｔ４ｃ　Δ　　　（＋Ｉｙ　　　ｌ’ｒｏ　−
トＩＣΔ２、Ｏｈ＋Ｍ　　　　　　Ｏ，５＋計 コントロール 血清（ｎ＝５） １．３５±０．１０　　　４２．７３±１．５２　　０
．０３２弁Ｉ血清（ｎ＝７） 上記の結果から明らかなように、正常人と癌患者とでは
、［）　Ａ　Ｐ　ＩＩ活性には１％の危険率で有意差の
ある違いがあり、また、癌患者では正常人に比べてＤＡ
Ｐｎ／ＤＡＰＩＶ値が上昇している。従って、本発明方
法によれば数μり以Ｆの血清で高感度で超微量測定が可
能となる。

ｌ五へ肱ｉ 本発明は以上説明したように、酵素阻害剤の存在により
アミ／ベブチグーゼ（Ａｒ’）による蛍ツＣ基貿の分解
が完全に抑制されるので、ＤＡＰ［］の酵酵素性のみを
特異的に高感度て゛定量することができ、癌の診断や早
期発見に有力な方法となる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例を示し、第１図及び第２図はそれ
ぞれ７−７ミ／−４−メチルクマリン濃度と蛍光強度と
の関係を示すグラフ、第３図は。 −７工ナントロリン濃度とＡＭＣピーク（％）との関係
を示すグラフであって、曲線ＡはＡＭＣ１曲線ＢはＡｌ
ａＭＣＡを示す。第４図（イ）、（ロ）はそれそ゛れう
／トのＩＦ、Ｇ、紋筋と視床下部から均一；二稍製した
ＤＡＰｌ含有試料についての。−７エナントロリン無添
加およ１添加の場合の）（ＰＬＯ分析（、−果を示すグ
ラフで゛あって、ＡはＡ　ｌ　ａ−Ｎ’Ｉ　Ｃ’　Ａ、
ＢはＬｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡ、ＣはＡ　Ｍ　Ｃを各々示
干。 持＋ｉ’ｌ出願人　味の累株式会社 第１図 ７−７ミ／−４−メチルクマリン、ａ６１〔−１−ｎｃ
１〕第１〕 ７−アミノ−４−メチルクマリン、り度［１ｍ０１］第
３図 −１０９［０−フェナントロリン〕 第４図 （イ）　　　　　（ロ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は水素原子又はアミノ保護基を
   表す。）で示されるペプチド誘導体及びその酸付加塩の
   少なくとも一種と、動物体由来のジペプチジルアミノペ
   プチダーゼII含有試料とをアミノペプチダーゼの酵素活
   性阻害剤の存在下水性溶液中にて接触せしめ、次いで遊
   離生成する７−アミノ−４−メチルクマリンを定量する
   ことを特徴とするジペプチジルアミノペプチダーゼII活
   性の測定方法。
2. （２）請求の範囲第１項記載の阻害剤がｏ−フェナント
   ロリンであるジペプチジルアミノペプチダーゼII活性の
   測定方法。