JPH0417960B2

JPH0417960B2 -

Info

Publication number: JPH0417960B2
Application number: JP58096406A
Authority: JP
Inventors: Shunpei Sakakibara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1983-05-31
Filing date: 1983-05-31
Publication date: 1992-03-26
Also published as: JPS59222457A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、特定酵素活性測定用の蛍光性基質又
はその合成中間体として有用な新規ペプチド誘導
体及びその用途に関する。本発明者は、簡便で高感度に特定酵素の活性を
測定できる酵素の基質を得るため鋭意研究を重ね
た結果、一般式で示されるペプチド誘導体の合成に成功し、更に
この新規ペプチド誘導体が特定の酵素、即ち癌の
診断に使用できる酵素であるジペプチジルアミノ
ペプチターゼタイプ（McDonald.J.K.、Reilly.
T.J.、Zeitman.B.B and Ellis.S；J.Biol.
Chem.2432028−2037（1968））の蛍光性基質とな
り、さらに簡便で高感度にその酵素活性の測定が
できることを見出し、本発明を完成するに至つ
た。本発明のペプチド誘導体は酸付加塩の形でもよ
く、その場合の酸は塩酸、硫酸等の鉱酸、酢酸、
トルエンスルホン酸等の有機酸が採用できる。そ
の遊離形を得るには、上記酸付加塩をアルカリで
中和すればよい。本発明のペプチド誘導体は、ペプチド合成に慣
用されている方法に従い、例えば７−アラニルア
ミノ−４−メチルクマリンとアミノ基を保護した
リジン又はその活性エステルとを縮合剤例えばジ
シクロヘキシルカルボジイミドの存在で反応さ
せ、所望に応じてその反応生成物のアミノ基の保
護基を脱離することによつて容易に製造すること
ができる。上記活性エステルの形として、ｐ−ニトロフエ
ニルエステルやＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを好ましい例としてあげることができる。溶媒を用いる場合は、例えばジメチルホルムア
ミド（DMF）、水を用いるとよい。この反応は室
温で進行するが、所望に応じて加熱し、反応を促
進させることもできる。反応混合物より本発明のペプチド誘導体を単離
するには、例えば反応混合物を濃縮乾固し、残溜
物をカラムクロマトグラフイーにより精製し、次
いで凍結乾燥する。分子を構成するリジン及びアラニンがそれぞれ
Ｌ−体またはＤ−体のいずれか一方のものである
目的化合物を製造するには、目的化合物の製造に
用いる出発原料のリジン、アラニンまたはその誘
導体に光学活性体を採用してもよいし、目的化合
物のDL−体を製造して光学分割に付してもよい。本発明のペプチド誘導体はジペプチジルアミノ
ペプチチターゼタイプにより選択的に加水分解
されるので、この酵素の蛍光性基質として好適で
ある。尚、本発明のペプチド誘導体を基質として使用
する場合、分子を構成するアラニンはＬ−体が好
ましく、他のアミノ酸が分子を構成する場合のそ
のアミノ酸はＬ−体、Ｄ−体のいずれであつても
よいが、特に両者共Ｌ−体であるのが好ましい。本発明のペプチド誘導体による酵素活性測定は
次のようにして行なう。すなわち、所望の酵素を
含有する試料溶液と７−Ｌ−リジル−Ｌ−アラニ
ル−４−メチルクマリンを接触せしめ、次いで、
７−アミノ−４−メチルクマリンを定量すること
により試料溶液中の酵素活性を測定することがで
きる。７−Ｌ−リジル−Ｌ−アマニル−４−メチ
ルクマリンは、試料溶液中に酵素、即ちジペプチ
ジルアミノペプチターゼタイプが存在すれば、
その量に比例してＬ−リジル−Ｌ−アラニルと７
−アミノ−４−メチルクマリンに分解遊離し、
Ex380nｍ、Em460nｍの蛍光下でその７−アミノ
−４−メチルクマリンの蛍光強度を測定すること
により高感度の酵素活性を測定できる。従つて、
本発明のペプチド誘導体により、癌の診断を極め
て正確かつ簡便に行うことができる。本発明のペプチド誘導体は、酵素活性測定用基
質として発癌性等の虞れがない安全な物質であ
り、また基質として不可欠な各種条件即ち酵素作
用をうけた基質量の測定の容易さ、安定性、酵素
量及び接触反応時間に対する直線性等を全て満足
するものであることを確認し、医学上特に癌の診
断において重要な意義を有する酵素活性測定方法
を提供することができる。以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例７−（N〓−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル）アミノ−４−メチルクマリンの合成ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン
18.9ｇを乾燥したテトラヒドロフラン（THF）
100mlにとかし、氷冷撹拌下ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド11.3ｇを乾燥THF50mlにとかし少
しずつ加えた。その後室温にて50分撹拌し、不溶
物を濾去した。濾液に７−アミノ−４−メチルク
マリン8.75ｇのジメチルホルムアミドDMF）50
ml溶液を加え一夜撹拌を続けた。溶媒を溜去し、残さを酢酸エチルにとかし、１
規定塩酸、５％重曹水、水の順に洗浄し、硫酸マ
グネシウムで乾燥した。酢酸エチルを溜去し、残
さを酢酸エチルとｎ−ヘキサンより再結晶し、７
−（N〓−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニル）アミノ−４−メチルクマリン（）12.8ｇ
（73.6％）を得た。このものは、融点193−194℃
（分解）、比旋光度［α］²⁰ _D＝−38.1（ｃ＝1.05、酢
酸）Rf＝0.50（溶媒系；クロロホルム：メタノー
ル：酢酸＝95：５：３）であつた。 N〓，N〓−ジ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−
リジン−ｐ−ニトロフエニルエステルの合成Ｌ−リジン塩酸塩91ｇ（0.5モル）とｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−アジド215ｇ（1.5モル）を
ジオキサン750mlと水250mlにとかし、炭酸ソーダ
210ｇを加え35〜40℃で二日間かきまぜた後、水
750mlを加え生じる油状物をエーテルで抽出して
除く。水層に１規定塩酸を加えPH２とし酢酸エチ
ルで抽出する。酢酸エチル層を水洗、乾燥後濃縮
し残溜物にジシクロヘキシルアミン60ｇを酢酸エ
チル300mlにとかして加え、これを振りまぜた後、
酢酸エチルを溜去する。残溜物にｎ−ヘキサンを
加え結晶化させ、酢酸エチルとｎ−ヘキサンより
再結晶することにより融点141〜141.5℃、比旋光
度［α］²² _D＝8.1（ｃ＝4.06、メタノール）のN〓，
N〓−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジン・ジシクロヘキシルアミン塩（）149ｇ
（56.4％）を得た。（）79.2ｇ（0.15モル）を酢酸エチルにとか
し、１規定硫酸と振りまぜ、ジシクロヘキシルア
ミン硫酸塩を水層に除去した後、酢酸エチル層を
水洗乾燥した。続いて、Ｐ−ニトロフエノール21
ｇ（0.15モル）を加え、氷冷しながらかきまぜ、
ジシクロヘキシルカルボジイミド32ｇ（0.17モ
ル）を加え、室温にて一夜かきまぜた後、不溶物
を濾去し、母液を濃縮し、残溜物に酢酸エチル
100ml、ｎ−ヘキサン300mlを加え、可溶物を除
き、残さをエチルアルコール300mlにとかし再結
晶した。その結果、融点119〜121℃、比旋光度
［α］²² _D＝24.5（ｃ＝1.1、エチルアルコール）のN〓
，
N〓−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジン−ｐ−ニトロフエニルエステル（）を得
た。７−（N〓，N〓−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−Ｌ−リジル−Ｌ−アラニル）アミノ−４−
メチルクマリンの合成（）3.46ｇ（10ミリモル）にトリフロロ酢酸
15mlを加え、室温にて15分かきまぜた後、減圧濃
縮した残溜物にエチルエーテルを加え、白色粉末
とし、濾別乾燥し、７−（N〓−Ｌ−アラニル）ア
ミノ−４−メチルクマリン・トリフロロ酢酸塩
（）を得た。このものはシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーにてRf＝0.05（溶媒系；クロロホル
ム：メタノール：酢酸＝95：５：３）に単一のス
ポツトを示した。（）全量にDMF30mlを加えてとかし、トリ
エチルアミン1.5mlを加えて中和した後、（）
5.6ｇを加え二日間室温で撹拌した。溶媒を溜去
し酢酸エチルにとかし、10％炭酸ソーダ水、0.5
規定塩酸、水でよく洗い、硫酸マグネシウムで乾
燥した後、濃縮した残溜物にエチルエーテル100
mlを加えてとかし、冷して静置することにより結
晶を得た。収量は2.2ｇで、融点179℃（分解）を
示す７−（N〓，N〓−ジ−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リジル−Ｌ−アラニル）アミノ−４−
メチルクマリン（）を得た。このものはシリカ
ゲル薄層クロマトグラフイーにてRf＝0.55（溶媒
系；クロロホルム：メタノール：酢酸＝95：５：
３）に単一のスポツトを示した。又、比旋光度
［α］²⁰ _D＝−59.1（ｃ＝0.77、酢酸）であつた。７（Ｌ−リジル−Ｌ−アラニル）アミノ−４−
メチルクマリン・２トルエンスルホン酸塩の合
成（）1.0ｇに酢酸10mlとトルエンスルホン酸
一水和物1.0ｇを加え、室温にて90分間かきまぜ
た後、エチルエーテルを加え、白色粉状沈澱を得
る。このものを濾別し、酢酸エチルで洗浄するこ
とにより、７−（Ｌ−リジル−Ｌ−アラニル）ア
ミノ−４−メチルクマリン・２トルエンスルホン
酸塩（）1.29ｇを得た。このものは高圧液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）にて１％以上の不純
物は認められず、比旋光度［α］²⁰ _D−28.6（ｃ＝
1.3450％酢酸）であつた。６規定塩酸中110℃、24時間封管中で加水分解
後のアミノ酸分析機による含有組成の実測値はア
ラニン1.00対リジン0.99で理論値１対１とよく一
致した。元素分析実測値Ｃ＝53.09％、Ｈ＝6.11％、Ｎ＝7.17％論理値Ｃ＝53.00％、Ｈ＝6.06％、Ｎ＝7.17％（論理値はC₃₃H₄₂N₄O₁₀S₂・H₂O・AcOH）７−（Ｌ−リジル−Ｌ−アラニル）アミノ−４
−メチルクマリン・２トルエンスルホン酸塩
（Lys−Ala−MCA Tosylate）の蛍光性基質
試験 Lys−Ala−MCA Tosylateを水に２ミリモル
濃度となるように溶解し基質溶液とした。ラツト
腎より均一に精製した前記ジペプチドジアミノペ
プチターゼ（DPPII）を酵素液として用いて表−
１に示す操作を順次行なつた（なお、本発明にお
いて使用された酵素の調製はF.Fukasawaetal.ト
ルオール；Biochimica et Biophysica Acta
（1983）BBA31603記載の方法によつた。）。次い
で同様の操作をインキユベート時間を変化させて
行つた。蛍光分析により(1)PH活性曲線と(2)反応時
間と生成した７−アミノ−４−メチルクマリン
（MCA）量との関係を求めた。

【表】ン酸カリウム、ホウ酸、バルビタール
380nｍ／460nｍにおける蛍光強度をそれぞれ
測定（Ex／Em）し、酵素により生成したMCA
の量は、次式により求めた。（Ｅ−Ｃ）／（Ｓ−Ｂ）×0.3n mol 結果を表−２および表−３に示した。

【表】

【表】以上の結果から、本基質はPH５〜６とするのが
最適であり、また反応時間に対し比例して（直線
関係）MCAを生成せしめることがわかる。次に、上記の実験を酵素液量を各種変化せしめ
て行ない、37℃、30分間インキユベーシヨンした
後の蛍光強度を同様に測定して、酵素により生成
したMCAの量を求めた。結果を表−４に示した。

【表】

【表】上記の結果から明らかなように、本基質は使用
酵素量に比例してMCAを与えることが確認され
た。従つて、試料溶液に本基質を上記の方法に準
じて作用させ生成するMCA量を測定し、標準関
係と比較すれば、試料溶液中の目的とする酵素量
を正確に測定でき、前述のように病気の診断に役
立つことがわかる。次に、正常人と癌患者について、血清中のLys
−Ala−MCAの加水分解活性を求めた。結果を
表−５に示した。

【表】

【表】上記の結果から明らかなように、正常人と口腔
偏平状皮癌患者とでは酵素活性には１％の危険率
で有意差のある違いがあり、この違いから本発明
のペプチド誘導体を用いることにより、１〜3μ
以下の血清で超微量測定が可能となることがわ
かる。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式で示されるペプチド誘導体及びその酸付加塩。２分子を構成するアラニンがＬ−体である特許
請求の範囲第１項記載のペプチド誘導体及びその
酸付加塩。３分子を構成するリジンがＬ−体である特許請
求の範囲第１項記載のペプチド誘導体及びその酸
付加塩。４一般式で示されるペプチド誘導体及びその酸付加塩の少
なくとも一種を含有することを特徴とする、ジペ
プチジルアミノペプチターゼタイプ含有試料と
を接触せしめ、酵素反応により遊離生成した７−
アミノ−４−メチルクマリンを蛍光法により測定
する上記酵素活性の測定用の蛍光性基質。５酵素反応溶液がPH値４〜８の範囲にある水溶
液である特許請求の範囲第４項記載の基質。６試料が人血清である特許請求の範囲第４項記
載の基質。